Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60501

⸱

31 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia liczby proliferujących i martwych komórek w hodowanych enteroidach myszy. Metoda ta jest pomocna w ocenie wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację organoidów i przeżycie.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy działa jak bariera, która zapobiega przedostawaniu się do reszty ciała zawartości światła, takiej jak patogenna mikrobiota i toksyny. Funkcja bariery nabłonkowej wymaga integralności komórek nabłonka jelitowego. Podczas gdy proliferacja komórek nabłonkowych utrzymuje ciągłą warstwę komórek, która tworzy barierę, uszkodzenie nabłonka prowadzi do dysfunkcji bariery. W rezultacie, zawartość światła może przenikać przez barierę jelitową przez nieograniczoną drogę. Dysfunkcja bariery jelitowej jest związana z wieloma chorobami jelit, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit. Izolowane krypty jelitowe myszy mogą być hodowane i utrzymywane jako struktury przypominające kosmki kryptowe, które są nazywane organoidami jelitowymi lub "enteroidami". Enteroidy są idealne do badania proliferacji i śmierci komórek nabłonka jelitowego in vitro. W tym protokole opisujemy prostą metodę ilościowego określania liczby komórek proliferacyjnych i martwych w hodowanych enteroidach. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) i jodek propidyny są używane do znakowania proliferujących i martwych komórek w enteroidach, a proporcja proliferujących i martwych komórek jest następnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej. Jest to przydatne narzędzie do testowania wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację komórek nabłonka jelitowego i przeżycie komórek.

Wprowadzenie

Podstawową funkcją komórek nabłonka jelitowego jest ochrona przed przedostawaniem się zawartości światła, takiej jak chorobotwórcze bakterie i toksyny1,2. Aby pełnić taką funkcję, jelitowe komórki macierzyste stale namnażają się i różnicują w różne komórki nabłonkowe, w tym enterocyty i komórki wydzielnicze, które tworzą barierę, tworząc ścisłe połączenia3. Szybka odnowa komórek nabłonka jelitowego wymaga ścisłej koordynacji proliferacji komórek, różnicowania komórek i śmierci komórki4,5. Zmniejszona proliferacja komórek lub nadmierna śmierć komórek prowadzi do uszkodzenia nabłonka i upośledzenia funkcji bariery1,6. Dysfunkcja bariery jelitowej jest związana z chorobami zapalnymi jelit7,8.

Metoda hodowli krypt jelitowych została już wcześniej opracowana. Korzystając z tej techniki, izolowane krypty myszy wyrastają na organoidy jelitowe (enteroidy), które mają struktury przypominające kosmki kryptowe i zawierają całą linię komórek nabłonka jelitowego9,10. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) jest analogiem tymidyny, który jest zdolny do zastąpienia tyminy (T) w DNA przechodzącym replikację podczas proliferacji komórek. Komórki proliferacyjne można szybko i dokładnie oznaczyć za pomocą barwienia EdU. Jodek propidyny (PI) jest analogiem bromku etydyny, który uwalnia czerwoną fluorescencję po wprowadzeniu do dwuniciowego DNA. PI specyficznie wykrywa martwe komórki, ponieważ przechodzi tylko przez uszkodzoną błonę komórkową.

W tym protokole najpierw opisujemy, jak wyizolować krypty z mysiego jelita cienkiego, a następnie hodować je jako enteroidy in vitro. Następnie opisujemy, jak analizować komórki proliferacyjne i martwe w enteroidach za pomocą inkorporacji EdU i PI oraz cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) na Uniwersytecie Soochow.

1. Izolacja i hodowla organoidów jelitowych

  1. Izolacja krypt jelitowych i hodowla enteroidów
    1. Poddaj eutanazji 8-tygodniową mysz typu dzikiego za pomocą wdychania CO2 . Użyj kleszczyków do tkanek i cienkich nożyczek do tęczówki, aby wyciąć około 8 cm jelita krętego.
    2. Za pomocą strzykawki z igłą do karmienia przez zgłębnik wypłukać około 40 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, a następnie przeciąć wzdłuż nożyczkami i otworzyć jelito kręte.
    3. Pokrój jelito kręte na małe (0,5−1,0 cm) kawałki. Umieść kawałki w 5 ml sterylnego, lodowatego DPBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie kołysz się przez 5 minut na lodzie.
    4. Użyj kontrolera pipet, aby zassać DPBS i zastąp go 10 ml zimnego buforu 1 (2 mM EDTA w DPBS). Kołysz się przez 30 minut na lodzie.
    5. Za pomocą kontrolera pipet odessać bufor 1 i zastąpić go 10 ml zimnego buforu 2 (54,9 mM D-sorbitolu, 43,4 mM sacharozy w DPBS). Wstrząsaj ręcznie przez 2-3 minuty (~80 wstrząsów/min).
    6. Pobrać 20 μl kropli zawartości buforu 2 po wstrząśnięciu i sprawdzić pod mikroskopem.
    7. Przefiltrować zawartość buforu 2 za pomocą sterylnego sitka komórkowego o pojemności 70 μm, a następnie zebrać przefiltrowany bufor za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    8. Odpipetować 20 μl filtratu na szkiełko, aby policzyć krypty. Przenieś wystarczającą ilość bufora 2 z kroku 1.1.7, aby upewnić się, że jest ~500 krypt/studnię.
    9. Wirować przy 150 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania ostrożnie odessać supernatant.
    10. Zawiesić krypty w 50 μl matrycy błony podstawnej (np. Matrigel) na 500 krypt, pipetować w górę i w dół (uważając, aby uniknąć pęcherzyków), a następnie umieścić 50 μl kropli mieszaniny matrycy błony podstawnej/krypty w środku jednej studzienki w 24-dołkowej płytce. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu polimeryzacji matrycy błony podstawnej.
    11. Po 30 minutach polimeryzacji ostrożnie dodać 600 μL pożywki dla minijelit (zaawansowane zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanino-L-glutamina, długopis/paciorkowiec [100 jednostek/ml], 10 mM Hepes, suplement N2 [1:100], suplement B27 [1:50] z naskórkowym czynnikiem wzrostu [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondyna [500 ng/mL] i Y27632 [10 μM]), następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obserwuj pod mikroskopem każdego dnia i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.
  2. Pasażowanie jelit
    UWAGA: W przypadku długich kultur enteroidy należy dzielić mniej więcej co tydzień.
    1. Aby przejść przez enteroidy, umieść płytkę do hodowli tkankowej na lodzie. Odessać pożywkę i dodać 1 ml zimnego DPBS do każdej studzienki. Użyj końcówki P1000 do pipetowania w górę i w dół, aż nie pozostaną żadne stałe kawałki matrycy membrany podstawnej.
    2. Przepuścić raz w górę i w dół przez strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml (27 g) i do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 150 x g w temperaturze 4 °C.
    3. Użyj pipety, aby usunąć DPBS. Zawiesić w 50 μl matrycy/studzienki membrany podstawnej.
    4. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzystej matrycy membranowej. Pokryj każdą studzienkę 600 μl pożywki ENR (pożywka dla minijelita, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondyny), a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.

2. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek EdU-dodatnich w enteroidach

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje przebieg analizy metodą cytometrii przepływowej komórek EdU-dodatnich w enteroidach.

  1. Inkubacja enteroidów z EdU
    1. Hoduj enteroidy z kroku 1.2.4 przez 5–7 dni. Enteroidy pasażowe do nowej płytki 24-dołkowej w stosunku podziału 1:2. Dodać 600 μl pożywki ENR do każdej studzienki. Inkubować enteroidy przez 4-5 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Ustawić grupę kontrolną (enteroidy nieleczone) i grupę eksperymentalną (enteroidy leczone interleukiną 22 5 ng / ml [IL-22]). Przygotuj co najmniej trzy powtórzenia dla każdej grupy.
    3. Dodać EdU do pożywki ENR, aby przygotować pożywkę EdU o stężeniu 50 μM. Dodać 600 μl pożywki EdU do każdej studzienki i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Ustaw jedną studzienkę enteroidów bez leczenia EdU jako negatywną kontrolę dla odejmowania tła.
  2. Pobieranie enteroidów z macierzy błony podstawnej
    1. Użyj kontrolera pipet, aby zassać pożywkę EdU i przemyć 1x DPBS. Dodać 1 ml DPBS.
    2. Użyj końcówki pipety P1000 i pipety w górę iw dół, aż nie pozostaną żadne stałe kawałki matrycy membrany podstawnej. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    3. Dodać 500 μl enzymów dysocjacji komórek (tabela materiałów) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Użyć końcówki pipety P200 i pipety w górę i w dół, aby rozbić enteroidy na pojedyncze komórki.
    4. Dodać 3 ml pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kilkakrotnie pipetować końcówką do pipety P1000.
    5. Wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut i odsysać pożywkę sklarowaną nad osadem. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml DPBS.
  3. Utrwalanie i przenikanie komórek
    1. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml, wirować w tempie 300 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
    2. Ponownie zawiesić komórki z 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA), utrwalić na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant za pomocą końcówki pipety, przemyć 1x DPBS i odwirować w dół, aby usunąć supernatant.
    3. Zawieś komórki za pomocą 1 ml 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Przemyć 1x DPBS i odwirować, aby usunąć supernatant.
  4. Wykrywanie EdU
    1. Przygotuj wcześniej roztwory podstawowe dla każdego składnika: 1) roztwór roboczy azydku Alexa Fluor, 2) roztwór roboczy 1x buforu reakcyjnego EdU i 3) 10x roztwór podstawowy dodatku buforowego EdU.
    2. Przygotować 1x dodatek buforowy EdU, rozcieńczając 10x roztwór 1:10 w wodzie dejonizowanej. Przygotuj ten roztwór na świeżo.
    3. Przygotować koktajl reakcyjny zgodnie z tabelą 1.
      UWAGA: Dodaj składniki w kolejności podanej w tabeli. Koktajl reakcyjny należy zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania.
    4. Dodaj 100 μl koktajli reakcyjnych do każdej probówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie zawiesić komórki, chronić przed światłem, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i delikatnie zasysać roztwór reakcyjny końcówką pipety.
    6. Dodaj 0,5% niejonowego penetrantu środka powierzchniowo czynnego do każdej probówki, aby przepłukać 1x w temperaturze pokojowej. Odwirować przy 300 x g przez 5 minut, delikatnie zassać supernatant końcówką pipety i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DPBS.
  5. Analiza komórek za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Przefiltrować zawieszone komórki za pomocą sitka o wielkości 40 μm, a następnie zebrać przefiltrowane komórki za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wykonaj wykrywanie FACS na maszynie tak szybko, jak to możliwe.
      UWAGA: Jeśli warunki są ograniczone, próbki barwione komórkami należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i poddać próbie przepływu w ciągu 3 dni.
    2. Wybierz odpowiedni kanał (w zależności od typu azydku Alexa Fluor w zestawie EdU; tutaj kanał czerwony) i napięcie (tutaj ~150–350 V) do analizy cytometrii przepływowej.
    3. Strategia bramkowania
      1. Narysuj wykres pseudokolorów FSC-A (oś x) i SSC-A (oś y) i rozmieść większość komórek do widocznego zakresu mapy punktowej, dostosowując napięcie. Wybierz populację komórek (R1) i wyklucz resztki komórek w lewym dolnym rogu.
      2. Na podstawie populacji komórek R1 ustal FSC-A (oś x) vs. Wykres pseudokolorów FSC-H (oś y) i ustaw bramkę tak, aby wybierała pojedyncze komórki (R2), aby wykluczyć skupiska komórek.
      3. Na podstawie populacji komórek R2 ustal wykres intensywności fluorescencji (oś x) w funkcji liczby komórek (oś y) i użyj kontroli ujemnej, aby ustawić bramkę. Obszar sygnału fluorescencyjnego jest dodatnim regionem komórki (R3). Porównaj stosunek komórek EdU-dodatnich (R3) między grupą eksperymentalną i kontrolną.

3. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek PI-dodatnich w enteroidach

UWAGA: Rysunek 2 pokazuje przebieg analizy metodą cytometrii przepływowej komórek PI-dodatnich w enteroidach.

  1. Inkubacja komórek enteroidalnych z PI
    1. Hoduj enteroidy z kroku 1.2.4 przez 5–7 dni. Enteroidy pasażowe do nowej płytki 24-dołkowej w stosunku podziału 1:2. Dodać 600 μl pożywki ENR do każdej studzienki. Inkubować enteroidy przez 4-5 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Ustaw grupę kontrolną (nieleczoną) i eksperymentalną (leczoną IL-22), używając co najmniej trzech powtórzeń dla każdej grupy.
    3. Dodać PI do pożywki ENR, aby przygotować pożywkę PI o stężeniu 3 μM.
    4. Dodać 600 μl pożywki PI do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Ustaw jedną studzienkę enteroidów bez leczenia PI jako kontrolę ujemną dla odejmowania tła.
  2. Pobrać enteroidy z macierzy błony podstawnej, wykonując kroki 2.2.1−2.2.5.
  3. Analiza komórek za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Przefiltrować zawieszone komórki za pomocą sitka o wielkości 40 μm i zebrać przefiltrowane komórki za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Wykonaj wykrywanie FACS na maszynie tak szybko, jak to możliwe.
      UWAGA: Jeśli warunki są ograniczone, próbki barwione komórkami należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i poddać próbie przepływu w ciągu 3 dni.
    3. Wybierz odpowiedni kanał (tutaj kanał czerwony) i napięcie (tutaj ~150–350 V) do analizy cytometrii przepływowej.
    4. Należy zastosować tę samą strategię bramkowania, jak opisano w sekcji 2.5.3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Krypty jelita cienkiego zostały wyizolowane i hodowane jako enteroidy w macierzy błony podstawnej. Enteroidy zaczęły tworzyć pączki 2 dni po izolacji. W 6. dniu enteroidy posiadały wiele pączków z dużą ilością debris (martwych komórek) w świetle. Na tym etapie enteroidy były gotowe do pasażowania (Rysunek 3).

Liczne badania wykazały, że cytokiny prozapalne są niezbędne dla utrzymania homeostazy nabłonka jelitowego. Nieprawidłowa ekspresja cytokin prozapalnych jest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten szczegółowo opisuje etapy niezbędne do hodowli enteroidów in vitro i kwantyfikacji komórek EdU- i PI-dodatnich w enteroidach za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia ta ma kilka zalet. Po pierwsze, znakowanie EdU służy do wykrywania proliferujących komórek w enteroidach. W porównaniu z tradycyjnym testem BrdU, metoda znakowania EdU jest szybsza, bardziej czuła i dokładniejsza. EdU jest bardzo podobny do tyminy (T), która zastępuje tyminę w syntezie DNA podczas podziału komórki. W porównaniu z przeciwciał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31971062, 31900326 i 31601022), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20190043, BK20180838), Fundusz Badawczy Państwowego Kluczowego Laboratorium Biotechnologii Farmaceutycznej, Uniwersytet w Nankinie (KF-GN-202004). Fundacja Nauk Przyrodniczych Chińskich Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (19KJB320003), Program Źródeł Utrzymania i Technologii miasta Suzhou (SYS2019030) oraz Program Innowacji Badawczych dla Absolwentów Szkół Wyższych w prowincji Jiangsu (KYCX19-1981). Praca ta jest również wspierana przez Tang Scholar z Uniwersytetu Soochow.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 15 mlCorning430791
22 G igła do zgłębnikówVWR20068-608
Płytka 24-dołkowaNunc142475
Sitko do komórek sterylnych 40 mmBD352340
Probówka wirówkowa 50 mlCorning430829
Sitko do komórek sterylnych 70 mmBD352350
Zaawansowany DMEM/F-12GIBCO12634010
Attune NxT Akustyczny cytometr ogniskującyInvitrogenA24863
B-27 SuplementGIBCO17504044
Bufor 12 mM EDTA w DPBS
Bufor 254,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacharoza w myszach
DPBS C57/B6Instytut Badań Biomedycznych Uniwersytetu
Enzymy dysocjacji komórek (TrypLE)Technologie życia12605-010
WirówkaEppendorf5424
WirówkaEppendorf5424R
WirówkaEppendorf5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Zestaw do obrazowaniaŻywotność technologieC10639
Inkubator CO2PanasonicMCO-18AC
DPBSGIBCO
D-sorbitolBBISB0491
EDTABBIEB0185
ENR pożywkaPożywka Minigut, 50 ng / ml EGF, 100 ng / ml Noggin, 500 ng / ml R-spondyna
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco10270-106
Nożyczki do cienkiej tęczówkiTansoole
OlympusFV1000
GlutaMAX SuplementGIBCO35050-061
Kozia surowica Technologieżycia16210-064
Hyklon HDMEMSH30243.01B
HEPESSigmaH4034
MatrigelCorning356231
Minigut mediaAdvanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 jednostek/ml), 10 mM Hepes, suplement N2 (1:100), suplement B27 (1:50)
Suplement N2R& DAR009
Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Triton X)BBITB0198-500ML
Nożyczki operacyjne (12,5 cm)Tansool2025785
Paraformaldehyd (PFA)sigma158127-500g
Penn/StrepInvitrogen15140-148
Mikroskop z kontrastem fazowymNikonTS1000
Jodek propidiumSigmaP4170-25MG
Rekombinowany EGFPeproTech315-09
Rekombinowana mysz NogginPeproTech250-38
Rekombinowana mysz R-Spondin 1R& D3474-RS-050
Rekombinowana mysz IL-22PeproTech210-22-10
SacharozaBBISB0498
Kleszczyki do tkanekTansoole2026704
Y-27632 2HC1SelleckS1049
w Nankinie 14190144 Mikroskop fluorescencyjny 2037454

Bibliografia

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura enteroid wcytometria przep ywowaznakowanie EdUjodek propidynykom rki nab onka jelitowegoproliferacja kom rekmier kom rekizolacja kryptmacierz b ony podstawnejtraktowanie IL 22

Powiązane artykuły