Artykuł metodologiczny

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

DOI:

10.3791/60503

⸱

18 grudnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodysekcja laserowa (LCM) to potężne narzędzie do izolowania określonych typów komórek lub obszarów zainteresowania z heterogenicznych tkanek. Złożoność komórkowa i molekularna elementów szkieletowych wzrasta wraz z rozwojem. Niejednorodność tkanek, na przykład na granicy elementów chrzęstnych i kostnych ze sobą lub z otaczającymi tkankami, jest jedną z przeszkód w badaniu rozwoju chrząstki i kości. Nasz protokół zapewnia szybką metodę przetwarzania tkanek i izolacji chrząstki i kości, która daje wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów. Świeżo zamrożone tkanki zarodków myszy są cięte na sekcje, a krótkie barwienie fioletem krezylowym służy do wizualizacji chrząstki i kości o kolorach różniących się od otaczających tkanek. Szkiełka są następnie szybko odwadniane, a następnie chrząstki i kości są izolowane za pomocą LCM. Minimalizacja ekspozycji na roztwory wodne podczas tego procesu pozwala zachować integralność RNA. Chrząstka i kość żuchwy myszy Meckel w E16,5 zostały pomyślnie pobrane, a analiza ekspresji genów wykazała zróżnicowaną ekspresję genów markerowych dla osteoblastów, osteocytów, osteoklastów i chondrocytów. Wyizolowano również wysokiej jakości RNA z różnych tkanek i w różnym wieku embrionalnym. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie próbki do LCM, w tym krioemnację, cięcie, barwienie i odwadnianie świeżo zamrożonych tkanek oraz precyzyjną izolację chrząstki i kości za pomocą LCM, co skutkuje wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ mięśniowo-szkieletowy to wieloskładnikowy układ złożony z mięśni, tkanki łącznej, ścięgien, więzadeł, chrząstki i kości, unerwiony przez nerwy i unaczyniony przez naczynia krwionośne1. Tkanki szkieletowe rozwijają się wraz ze wzrostem niejednorodności komórkowej i złożoności strukturalnej. Chrząstka i kość rozwijają się z tej samej linii osteochondroprogenitora i są silnie spokrewnione. Chrząstka i kość embrionalna rozwijają się w połączeniu z mięśniami, nerwami, naczyniami krwionośnymi i niezróżnicowaną mezenchymą. Chrząstka może być również otoczona kością, taką jak chrząstka Meckla i chrząstka kłykciowa w kości żuchwy. Tkanki te są anatomicznie powiązane i oddziałują ze sobą poprzez sygnały zewnątrzkomórkowe podczas rozwoju. W badaniach nad ekspresją genów w rozwoju chrząstki i kości jedną z przeszkód jest niejednorodność struktur szkieletowych złożonych z wielu typów tkanek. Precyzyjna izolacja konkretnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie dla udanej analizy transkrypcyjnej.

Mikrodysekcja laserowa (LCM) jest potężnym narzędziem do izolowania typów komórek lub obszarów zainteresowania w heterogenicznych tkankach, jest odtwarzalna i wrażliwa na poziom pojedynczej komórki2. Może precyzyjnie celować i przechwytywać interesujące komórki dla szerokiego zakresu dalszych testów w transkryptomice, genomice i proteomice3,4. Jakość wyizolowanego RNA, DNA lub białka można ocenić za pomocą bioanalizatora lub równoważnej platformy. Na przykład jakość RNA jest wskazywana przez numer integralności RNA (RIN)5.

Tutaj udostępniamy protokół szybkiego barwienia i izolacji chrząstki i kości za pomocą LCM ze świeżo zamrożonych tkanek. Używamy zarodka myszy, aby wykazać, że ten protokół daje wysokiej jakości RNA do późniejszej analizy transkryptomicznej, takiej jak sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanki od myszy zostały uzyskane zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły badań zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Icahn School of Medicine na Górze Synaj.

1. Przygotowanie świeżo zamrożonej próbki

  1. Przeprowadź sekcję zarodka lub tkanki, która jest przedmiotem zainteresowania. Osadź próbkę w jednorazowej formie do zatapiania ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Dostosuj orientację próbki za pomocą końcówki lub igły.
  2. Szybko zamrozić próbki w kąpieli suchego lodu/metylo-2-butanu. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj w temperaturze -80 °C.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Kriosekcja do laserowego przechwytywania Mikrodysekcja

  1. Rozmrozić kriostat i oczyść powierzchnie wewnętrzne 70% etanolem. Potraktuj płytkę zabezpieczającą przed przewróceniem i parę kleszczyków środkiem odkażającym RNazy. Ustaw kriostat na żądaną temperaturę cięcia (-18 do -22 °C). Przygotuj pojemnik z pokrywką z suchym lodem, umieszczając arkusz folii aluminiowej na suchym lodzie w celu tymczasowego przechowywania pociętych szkiełek z próbkami podczas kriosekcji.
    ostrożność: Suchy lód jest bardzo zimny. Zawsze ostrożnie obchodź się z suchym lodem i noś izolowane rękawice za każdym razem, gdy go dotykasz.
  2. Przenieś świeżo zamrożoną próbkę do wiadra z suchym lodem. Umieść warstwę związku OCT na uchwycie próbki kriostatu i natychmiast umieść próbkę na wierzchu OCT z delikatnym naciskiem. Gdy OCT jest całkowicie zamrożony, przymocuj uchwyt z próbką do ramienia tnącego kriostatu.
  3. Pozostawić próbkę w kriostacie na 15 minut, aby zrównoważyć się z temperaturą cięcia.
  4. Podzielić tkankę na sekcje i zebrać plastry na szkiełkach membranowych z naftalanu etylenu (PEN) o grubości 12 μm. Wyrównać kolejne sekcje na membranie. Po zakończeniu jednego szkiełka pozostaw sekcje do wyschnięcia na kilka minut i przenieś szkiełko na folię w pojemniku na suchy lód, aż wszystkie wymagane szkiełka zostaną zebrane.
  5. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C w pojemniku na szkiełka.
    UWAGA: Grubość przekroju jest dobierana tak, aby zmaksymalizować ilość pobranej tkanki, umożliwiając jednocześnie efektywne cięcie tkanki i może się różnić w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka należy chronić przed zanieczyszczeniem RNazą. Unikaj zmian temperatury. Chociaż RIN RNA ze szkiełek przechowywanych do 6 miesięcy może nadal wskazywać na wysoką jakość RNA, zalecamy jak najszybsze użycie szkiełek.

3. Przygotowanie próbki do mikrodysekcji laserowej

  1. Przygotuj roztwory do barwienia i odwadniania.
    1. Umieść 45 ml 80% etanolu w każdej z trzech probówek wirówkowych o pojemności 50 ml na lodzie. Oznacz je jako #1, #2 i #3. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz.
    2. Umieść 45 ml 95% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
    3. Umieść 45 ml 100% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
    4. Umieść 45 ml ksylenu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej.
      ostrożność: Ksylen powinien być stosowany w dygestorium.
  2. Rozmrozić na krótko szkiełko z membraną PEN, przykładając je do dłoni w rękawiczce, a następnie umyć dwukrotnie przez 30 sekund w 45 ml 80% etanolu (#1 i #2) z mieszaniem w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml w celu usunięcia OCT.
    nuta: Ważne jest, aby usunąć OCT przed barwieniem, aby zapobiec zasłanianiu skrawków przez OCT poluzowany podczas barwienia. Kleszcze mogą być używane w celu ułatwienia usuwania OCT, który nie jest zmywany przez mieszanie.
  3. Połóż szkiełko na arkuszu folii aluminiowej. Odpipetować 0,8 ml 0,1% fioletu krezylowego w 50% etanolu na szkiełko i barwić przez 30 s. Myć szkiełko w 45 ml 80% etanolu (#3) przez 30 s, a następnie odwadniać przez przejście przez 30 s przez 45 ml 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenu w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
  4. Stojak przesuwa się na delikatnej wycieraczce zadaniowej przez 5 minut, aby opróżnić ksylen i suche sekcje.
    nuta: Szkiełka muszą być całkowicie wysuszone przed LCM.

4. Mikrodysekcja przechwytywania laserowego

UWAGA: Noś bezpudrowe rękawice nitrylowe podczas wykonywania LCM.

  1. Włącz mikroskop LCM, laser i komputer. Zaloguj się do komputera i uruchom oprogramowanie. Przekręć kluczyk do pozycji "On", aby uruchomić laser. Gdy świeci się zielone światło (Laser), naciśnij czerwony przycisk, aby aktywować laser, a następnie światło (Laser) zmieni kolor na czerwony, wskazując, że laser jest gotowy do użycia.
    nuta: Laser potrzebuje około 10 minut na rozgrzanie.
  2. Ustaw probówki zbiorcze.
    1. Włóż nakrętkę probówki z 0,5 ml polimerazy reakcji łańcuchowej (PCR) do kolektora.
      nuta: Wybierz odpowiedni kolektor dla żądanych probówek PCR (0,2 lub 0,5 ml).
    2. Odpipetować 50 μl buforu ekstrakcyjnego (dostarczonego przez zestaw do izolacji RNA wymieniony w Tabeli Materiałów) do nasadki probówki zbiorczej o pojemności 0,5 ml.
    3. Włóż urządzenie zbierające do mikroskopu.
    4. W oknie Change Collector Device (Zmień urządzenie zbierające) kliknij przycisk Move to Reference Point (Przenieś do punktu odniesienia), aby przesunąć kolektor do punktu odniesienia (RP). Dostosuj ostrość, aby wyraźnie view RP. Kliknij strzałki, aby przesunąć RP do środka widoku.
  3. Załaduj szkiełka do próbek.
    1. Kliknij lewy przycisk Rozładuj na pasku narzędzi, aby opuścić uchwyt suwaka.
    2. Umieść szkiełko w uchwycie, częścią tkanki skierowaną w dół.
      nuta: Ta orientacja zapewnia, że wychwycone skrawki tkanek wpadają grawitacyjnie do nasadki probówki zbiorczej.
    3. Włóż uchwyt z powrotem do stolika.
  4. Ustaw parametry lasera.
    1. Wybierz opcję Sterowanie w menu Laser lub kliknij ikonę Laser.
    2. Dostosuj te parametry zgodnie z potrzebami: Moc, moc lasera; Przysłona, szerokość lasera; i Prędkość, prędkość cięcia w trybie rysowania i cięcia.
      nuta: Przetestuj laser w obszarze nieinteresującym. Większa moc lub większa przysłona ułatwiają cięcie, ale powodują większe uszkodzenia komórek. Dostosuj kombinację mocy, przysłony i prędkości, aby uzyskać wydajne cięcie i minimalne uszkodzenie tkanki. Na przykład Moc = 40, Przysłona = 5 i Prędkość = 7 dla tkanki chrzęstnej na odcinku 12 μm.
  5. Zaznacz i wytnij obszary zainteresowania.
    1. Zacznij od obiektywu 5x i znajdź obszary zainteresowania, a następnie przełącz się na obiektyw (5x, 10x lub 40x), który najlepiej pokazuje obszar zainteresowania.
      nuta: Po barwieniu fioletem krezylowym chrząstki są barwione na kolor purpurowy, a zmineralizowane tkanki wydają się brązowe lub czarne, co odróżnia się od innych tkanek. Obrazy można zapisać za pomocą opcji Zapisz obraz jako z menu Plik.
    2. Wybierz tubę do odbioru (A, B, C, D), klikając znak na kolektorze.
    3. Wybierz opcję Przenieś i wytnij lub Rysuj i wytnij. W trybie Move and Cut próbka jest wycinana ręcznie, za pomocą myszy lub pióra na ekranie dotykowym do odręcznego rysowania kształtów. W trybie rysowania i wycinania kształty można rysować odręcznie za pomocą myszy lub pióra na ekranie dotykowym w celu późniejszego wycinania. Kliknij przycisk Rozpocznij cięcie, aby rozpocząć cięcie laserowe.
    4. Po zakończeniu cięcia tkanka docelowa z membraną PEN wpada grawitacyjnie do nasadki probówki zbiorczej. Powtórz czynności 4.5, aby w razie potrzeby połączyć wiele obszarów zainteresowania.
      nuta: Powtarzanie cięć lub zwiększanie mocy lub apertury może być konieczne, jeśli tkanka nie wpadnie do nasadki probówki zbiorczej z powodu niepełnego cięcia. Zmineralizowana kość (brązowa lub) nie może być cięta bezpośrednio laserem.
  6. Rozładuj kolektor i ostrożnie zamknij probówkę do PCR. Umieść wypreparowane tkanki w suchym lodzie. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj w temperaturze -80 °C.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Powtórzyć czynności od 4.2 do 4.6 dla następnej próbki.

5. Liza mikrowypreparowanych tkanek i izolacja RNA

  1. Rozmrozić mikrowypreparowane tkanki w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 42 °C.
  2. Po inkubacji odwirować bufor do lizy do probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Przeprowadzić obróbkę DNazy i ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przekroje koronalne świeżo zamrożonych tkanek myszy w E16.5 zostały użyte do zademonstrowania izolacji i zbierania chrząstki Meckla (MC), chrząstki kłykciowej i kości żuchwy przez LCM. Zarodki myszy w E16,5 zostały wypreparowane i osadzone w kriogenicznych formach ze związkiem OCT. Próbki w formach szybko zamrażano w kąpieli z suchym lodem i metylo-2-butanem i przechowywano w temperaturze -80 °C.

Aby zademonstrować barwienie chrząstki i kości na fioletowo-kresylowo, przeprowadzono kriosekcję w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM umożliwia izolację wzbogaconych lub jednorodnych populacji komórek z heterogenicznych tkanek. Do jego zalet należy szybkie i precyzyjne przechwytywanie komórek w ich kontekście in vivo , podczas gdy do potencjalnych wad należy czasochłonność, koszty i ograniczenie koniecznością rozpoznawania przez użytkownika odrębnych subpopulacji w określonej próbce30. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat LCM chrząstki i kości embrionalnej myszy, podkreślając zastosowanie barwienia f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) oraz Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Autorzy dziękują Biorepository i Pathology Core za dostęp do platformy Leica LMD 6500 w Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-metylobutanBioanalizator ThermoFisher ScientificO3551-4
Probówka wirówkowaAgilentThermoFisher Scientific 339653 Stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu, 50 ml
octan fioletu krezylowegoSigma-AldrichC5042
Delikatna wycieraczka zadaniowaThermoFisher Scientific06-666
Jednorazowa forma do zatapianiaThermoFisher Scientific1220
Woda destylowanaInvitrogen10977-015wolny od DNaz/RNaz
, absolutny (200 proof)ThermoFisher ScientificBP2818Klasa biologii molekularnej
Szklana szkiełkomembranowe PENSystem LCM 11505158
Microsystems Leica MicrosystemsSzkło
ThermoFisher Scientific12-545FP
Szkiełka mikroskopoweThermoFisher Scientific12-550-15
OCT Mikroskopiaelektronowa Sciences102094-106
Probówka do PCR z płaską nasadką, 0,5 mlProbówki zbiorczeAxygenPCR-05-C
Stałe medium montażoweVector LaboratoriesH-5000
ThermoFisher ScientificKIT0204
Środek do dekontaminacji RNazySigma-AldrichR2020Środek odkażający RNaza do czyszczenia powierzchni
KsylenSigma-Aldrich214736
G2939BA Kriostat Leica Biosystems CM3050 S Etanol Leica pokrywy mikroskopu Leica LMD6500 Szkiełka mikroskopowe LCM Zestaw do izolacji RNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17(2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja tkanki kostnejbarwienie fioletem krezyluzachowanie integralno ci RNAtechnika kriotomiiprotok odwadniania tkankichrz stka Mecklako uchwy

Powiązane artykuły