Komórki progenitorowe naczyń wieńcowych i rozpuszczalne biomarkery w rokowaniu sercowo-naczyniowym po angioplastyce wieńcowej

Podsumowanie

Na rozwój poważnych niekorzystnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, które wpływają na rokowanie sercowo-naczyniowe po angioplastyce wieńcowej, wpływa zakres uszkodzenia naczyń wieńcowych i naprawy naczyń krwionośnych. Zastosowanie nowych biomarkerów wieńcowych i rozpuszczalnych, reagujących na uszkodzenia i naprawę naczyń krwionośnych, jest przydatne do przewidywania rozwoju MACE i rokowania.

Streszczenie

Poważne niepożądane zdarzenia sercowo-naczyniowe (MACE) negatywnie wpływają na rokowania sercowo-naczyniowe pacjentów poddawanych angioplastyce wieńcowej z powodu uszkodzenia niedokrwiennego naczyń wieńcowych. Stopień uszkodzenia naczyń wieńcowych i mechanizmy naprawy naczyń krwionośnych są czynnikami wpływającymi na przyszły rozwój MACE. Wewnętrzne cechy naczyniowe, takie jak charakterystyka blaszki miażdżycowej i złożoność tętnic wieńcowych, dostarczyły informacji prognostycznych dla MACE. Jednak stosowanie biomarkerów krążących wewnątrzwieńcowych jest postulowane jako wygodna metoda wczesnej identyfikacji i prognozowania MACE, ponieważ lepiej odzwierciedlają one dynamiczne mechanizmy związane z uszkodzeniem i naprawą naczyń wieńcowych. Określenie biomarkerów krążących naczyń wieńcowych podczas angioplastyki, takich jak liczba subpopulacji jednojądrzastych komórek progenitorowych (MPC), a także stężenie rozpuszczalnych cząsteczek odzwierciedlających stan zapalny, adhezję i naprawę komórek, pozwala na ocenę przyszłego rozwoju i rokowania MACE 6 miesięcy po angioplastyce wieńcowej. Metoda ta charakteryzuje się charakterem translacyjnym i lepszą wydajnością niż biomarkery krążące we krwi obwodowej w zakresie przewidywania MACE i jej wpływu na rokowanie sercowo-naczyniowe, co może być stosowane do stratyfikacji ryzyka pacjentów z chorobą wieńcową poddawanych angioplastyce.

Wprowadzenie

Angioplastyka wieńcowa i stentowanie stanowią procedurę ratunkową dla pacjentów z chorobą wieńcową (CAD). Jednak poważne niepożądane zdarzenia sercowo-naczyniowe (MACE), w tym zgon z przyczyn sercowo-naczyniowych, zawał mięśnia sercowego, restenoza wieńcowa oraz epizody dławicy piersiowej lub dekompensacji niewydolności serca, mogą wystąpić kilka miesięcy po interwencji wieńcowej, powodując nieplanowane wizyty w szpitalu. MACE są powszechne na całym świecie, a ich śmiertelność morbi jest wysoka¹.

Uszkodzenie niedokrwienne naczyń wieńcowych wywołuje wczesną reakcję naczyniową i mechanizmy naprawcze obejmujące mobilizację MPC ze względu na ich zdolność do różnicowania i/lub potencjał angio-reparacyjny, a także produkcję rozpuszczalnych cząsteczek, takich jak międzykomórkowe cząsteczki adhezyjne (ICAM), metaloproteinazy macierzy (MMP) i reaktywne formy tlenu, odzwierciedlające adhezję komórek, przebudowę tkanek i stres oksydacyjny. Chociaż wewnętrzne cechy naczyniowe, takie jak charakterystyka blaszki miażdżycowej i złożoność tętnic wieńcowych, zostały wykorzystane do przewidywania MACE, niektóre badania sugerują, że biomarkery związane z mechanizmami uszkodzenia i naprawy zachodzącymi w śródbłonku wieńcowym mogą być bardzo przydatne do wczesnej identyfikacji i prognozowania zdarzeń sercowo-naczyniowych u pacjentów z CAD poddanych angioplastyce wieńcowej^{2, 3,4,5}.

Ciągłe zainteresowanie zrozumieniem mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń i naprawy CAD zmotywowało badaczy do zbadania wewnątrzwieńcowych biomarkerów krążących, ponieważ pobieranie próbek wieńcowych lepiej odzwierciedla uszkodzenia i naprawę naczyń krwionośnych⁶. Jednak charakterystyka biomarkerów wieńcowych w badaniach na ludziach była rzadka^7,8,9. Dlatego celem niniejszego badania było opisanie metody określania ilości krążących w naczyniach wieńcowych MPC i rozpuszczalnych cząsteczek, odzwierciedlających zarówno uszkodzenie naczyń krwionośnych, jak i naprawę, oraz wykazanie, czy te biomarkery są związane z MACE i rokowaniem klinicznym pacjentów z CAD, którzy przeszli angioplastykę wieńcową. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu krążących w naczyniach krwionośnych MPC i rozpuszczalnych cząsteczek otrzymanych przez pobieranie próbek z miejsc znajdujących się najbliżej uszkodzenia naczynia. Może być również przydatny w badaniach klinicznych dotyczących niedokrwienia kończyn dolnych, udaru, zapalenia naczyń, zakrzepicy żylnej i innych urazów związanych z uszkodzeniem i naprawą naczyń krwionośnych.

Protokół

Ten protokół spełnia wytyczne instytucjonalne Komisji Etyki ds. Badań na Ludziach.

1. Koronarografia, ultradźwięki i pobieranie próbek krwi

1. Poproś o podstawowe informacje kliniczne i demograficzne przed interwencją wieńcową. Zbierz dane osoby: wiek, płeć, aktualne palenie tytoniu, wskaźnik masy ciała (BMI), wysokie ciśnienie krwi, dyslipidemię, cukrzycę, przyjmowane leki oraz wskazania do aktualnej koronarografii.
2. Wykonaj koronarografię poprzez cewnikowanie serca przy użyciu dostępu promieniowego. Zabieg ten powinien być wykonywany pod przewodnikiem fluoroskopii w gabinecie hemodynamicznym przez biegłych kardiologów.
   UWAGA: Zidentyfikuj naczynia nadające się do oceny. W niniejszym badaniu naczynia podlegające ocenie zdefiniowano jako tętnice o odcinkach większych niż 1,5 mm i zwężeniu światła powyżej 50%.
3. Przesuń wewnątrznaczyniowy cewnik ultrasonograficzny do obszaru zainteresowania i zarejestruj obrazy. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby zlokalizować i zmierzyć najmniejszy obszar świetlny.
4. Użyj cewnika wieńcowego, aby pobrać 10 ml krwi z miejsca znajdującego się najbliżej blaszki miażdżycowej.
5. Po wypisaniu pacjenta ze szpitala należy zaplanować okresowe oceny medyczne w celu sprawdzenia punktów końcowych badania. Jeśli kontakt telefoniczny nie jest możliwy lub wizyta lekarska opóźnia się o więcej niż 2 miesiące, należy zwrócić się do upoważnionej osoby (wcześniej wyznaczonej) w celu weryfikacji punktów końcowych badania.
   UWAGA: Rozważ którykolwiek z następujących MACE: 1) zgon z przyczyn sercowo-naczyniowych, 2) nowy zawał mięśnia sercowego, 3) niestabilna dławica piersiowa powodująca nieplanowaną wizytę lekarską w ciągu 24 godzin, 4) restenoza stentu wykazana przez koronarografię, 5) epizody niewyrównanej niewydolności serca wymagające pomocy klinicznej.

2. Wyznaczanie krążących MPC (Rysunek 2)

1. Przetwarzaj krew w ciągu 1 godziny od pobrania. Przenieść 6 ml pobranej krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i rozcieńczyć w stosunku 1:1 (v/v) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), pH = 7,4.
2. Dodaj 2 ml pożywki o gradiencie gęstości do trzech probówek. Ostrożnie przenieść trzy równe objętości podwielokrotności rozcieńczonej krwi do każdej probówki zawierającej pożywkę o gradiencie gęstości.
   UWAGA: Całkowita objętość pożywki o gradiencie gęstości i rozcieńczonej krwi nie powinna przekraczać trzech czwartych maksymalnej pojemności probówki.
3. Wirować w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 30 min. Przenieść pasmo na granicy warstw do nowej probówki. Dodać 2 ml PBS i odwirować w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 6 min. Granulka będzie zawierała MPC.
4. Umyj pellet kilka razy. Odessać poprzedni roztwór i delikatnie zawiesić osad komórkowy w świeżym PBS. Przy kolejnych płukaniach odwirować w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 2 min. Powtórz proces 6 razy.
5. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS. Zmieszać 20 μl zawiesiny komórek z 0,4% błękitem trypanowym, rozcieńczonym w stosunku 1:1 (v/v). Nałóż kroplę na hemocytometr i policz niebarwione komórki pod mikroskopem świetlnym.
6. Przejdź do określenia MPC. Oznaczyć 5 ml probówek do cytometrii przepływowej i podzielić na porcje 1 x 10⁶ komórek na probówkę. Przygotować odpowiednie przeciwciała kontrolne dopasowane do izotypu. Odwirować w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 6 minut i odrzucić supernatant.
7. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało rozcieńczone w 100 μl roztworu do inkubacji przeciwciał składającego się z 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Zawiesić na 10 s i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w stanie ochrony przed światłem. Na tym etapie protokół można wstrzymać, wiążąc limfocyty w 4% paraformaldehydzie w PBS i przechowując próbki do 24 godzin w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Końcowe stężenia pierwszorzędowych przeciwciał stosowanych w niniejszym protokole to CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
8. Odwirować w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Zawiesić w 500 μL 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM EDTA.
9. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej. Użyj przeciwciał kontrolnych dopasowanych do izotypu, aby ustawić barwienie tła. Następnie wybierz limfocyty rozprzestrzeniające się na powierzchni FSC/SSC, starając się wykluczyć resztkowe granulocyty, szczątki komórkowe i inne cząstki, które zwykle znajdują się w dolnym, lewym rozmieszczeniu na wykresie. Taki rozkład jest uważany za 100%.
10. Użyj bramki zawierającej dużą liczbę komórek o wspólnym immunofenotypie CD45⁺ i CD34⁺. W przypadku podwójnie dodatnich immunofenotypów należy użyć bramki wcześniej identyfikującej CD45 ⁺, CD34 ⁺ z dodatkiem KDR (VEGFR-2) ⁺, CD133 ⁺ lub CD184 ⁺. Zidentyfikuj subpopulacje MPC na podstawie ich specyficznych markerów powierzchni komórek. Raportuj jako procent zdarzeń z bramką.
11. Zidentyfikuj główne subpopulacje MPC. W niniejszym badaniu głównymi immunofenotypami były: CD45⁺CD34⁺CD133⁺, CD45⁺CD34⁺CD184+, CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ oraz CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184.
    UWAGA: Stosowane markery powierzchniowe komórek to CD45 (limfocyty), CD34 (komórki śródbłonka i/lub naczyń), KDR (VEGFR-2, marker błonowy komórek śródbłonka), CD133 (śródbłonkowe komórki progenitorowe) i CD184 (hematopoetyczne komórki macierzyste i komórki śródbłonka).

3. Oznaczanie biomarkerów rozpuszczalnych w osoczu

1. Użyj testu immunoenzymatycznego (ELISA), aby określić stężenie SICAM-1 i MMP-9 (Rysunek 3, górny wiersz).
   1. Odwirować próbki krwi w temperaturze pokojowej 3 000 x g przez 5 minut i zebrać osocze.
   2. Oznacz wzorce, probówki na próbki i probówki kontrolne. Zrównoważyć wstępnie powlekane studzienki na płytce testowej, przemłukując 2x buforem płuczącym dostarczonym w zestawie ELISA.
   3. Przenieś wzorce, próbki i kontrole do studni. Uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min.
      UWAGA: Nie pozwól, aby studzienki całkowicie wyschły.
   4. Odrzucić zawartość i dodać przeciwciało wykrywające biotynę. Uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
   5. Wyrzucić zawartość i przemyć 3 razy. Uszczelnić płytkę nazębną i inkubować sekwencyjnie z roztworem roboczym streptawidyny, a następnie substratem tetrametylobenzydyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut, chronionym przed światłem. Umyć 3x między inkubacjami. Gdy kolor się rozwinie, dodaj roztwór zatrzymujący i odczytaj absorbancję gęstości optycznej w czytniku ELISA na mikropłytce.
2. Użyj immunomagnetycznego testu multipleksowania, aby określić stężenie czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFα) i interleukiny 1 beta (IL-1β) (Rysunek 3, dolny wiersz).
   1. Oznacz wzorce, probówki na próbki i probówki kontrolne.
   2. Wirować fiolki z kulkami magnetycznymi przez 30 sekund. Przenieść zawiesinę kulek do probówek o odpowiedniej wielkości, a następnie do studzienek na płytce do multipleksowania. Okresowe wirowanie pozwala uniknąć wytrącania się kulek.
   3. Bezpiecznie włóż ręczną magnetyczną podkładkę do płyt. Odczekaj 2 minuty, aż koraliki zgromadzą się na dnie każdej studzienki i szybko odwróć zarówno ręczną magnetyczną podkładkę do płyt, jak i zespół płyt, nad zlewem lub pojemnikiem na odpady. Pamiętaj, aby użyć ręcznej magnetycznej podkładki do płyt, aby utrzymać koraliki wewnątrz studzienek.
   4. Dodaj 150 μl buforu do płukania do każdej studzienki i odczekaj 30 sekund, aby kulki zgromadziły się na dnie. Odrzucić zawartość jak w kroku 3.2.3. Następnie dodaj 25 μl uniwersalnego buforu testowego (dostarczonego w zestawie), a następnie 25 μl przygotowanych wzorców, próbek i kontroli.
   5. Uszczelnić płytkę i inkubować przez co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, z ciągłym wytrząsaniem przy prędkości 500 obr./min. Alternatywnie, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, w osłonie przed światłem, z ciągłym wytrząsaniem przy 500 obr./min, jeśli to możliwe.
   6. Przemyć 2x dodając 150 μL buforu do płukania i odczekać 30 sekund. Wyrzuć zawartość, wkładając ręczną magnetyczną podkładkę do płyt. Odczekaj 2 minuty i odwróć nad zlewem lub pojemnikiem na odpady.
   7. Inkubować sekwencyjnie z 25 μl mieszaniny przeciwciał wykrywających, a następnie z 25 μl roztworu streptawidyny-PE w temperaturze pokojowej przez 30 minut, szczelnie zamknięty i chroniony przed światłem, ze stałym wytrząsaniem przy 500 obr./min. Przemyć 2x między inkubacjami, jak opisano w kroku 3.2.6.
   8. Uzyskaj odczyty. Dodać 120 μl buforu odczytującego. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, ze stałym wstrząsaniem przy 500 obr./min. Uruchom odczyt na czytniku testów multipleksowych. Dostosuj parametry odczytu do każdego analitu.

Wyniki

Krew tętnicza wieńcowa, z zatoki wieńcowej oraz krew obwodowa zostały pobrane od 52 pacjentów poddanych angiografii wieńcowej (Rysunek 1), u których stwierdzono wysoką częstość występowania nadciśnienia tętniczego i dyslipidemii. Podczas kontroli klinicznej, 6 miesięcy po angiografii wieńcowej, wystąpiło 1 (21,1%) MACE: zgon (n = 1), dławica piersiowa wymagająca hospitalizacji (n = 6), zawał mięśnia sercowego (n = 2) i/lub objawy niewydolności serca (n = 4).<...

Dyskusja

Pobranie krwi z chorej tętnicy wieńcowej może być trudne. Czasami tętnica wieńcowa jest ledwo dostępna. W takim przypadku alternatywą może być pobranie próbki z zatoki żylnej. Przeprowadziliśmy testy walidacyjne porównujące biomarkery krążące w tętnicy wieńcowej i zatoce żylnej, bez istotnych różnic. Jednak wydajność krążących biomarkerów została zwalidowana tylko w przypadku pobierania próbek naczyń wieńcowych. W związku z tym wydajność biomarkerów uzyskanych z zatoki żylnej pozostaje do zbadania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BSA	Roche	10735086001	albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jako środek buforujący, stabilizator, wzorzec i do mieszania.
Kulki kalibracyjne	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	Kulki kalibracyjne MACQuant są dostarczane w roztworze wodnym zawierającym 0,05% azydku sodu. 3,5 ml na maksymalnie 100 testów
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS#	130-080-801	Przeciwciało sprzężone z R-fikoerytryną w buforze PBS/EDTA
(CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS#	130-103-798	Monoklonalne, rekombinowane izotypowo ludzkie IgG1, sprzężone
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS#	130-093-601	Przeciwciało sprzężone z R-fikoerytryną w buforze PBS/
EDTA CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS#	130-081-001	Klon przeciwciała monoklonalnego AC136 wykrywa epitop klasy III CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS#	130-092-880	Przeciwciało monoklonalne CD45, ludzkie sprzężone
Probówki stożkowe	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml stożkowe probówki wirówkowe
Probówki cytometryczne	FALCON Corning Marka	#352052	5 ml probówka z okrągłym dnem z polistyrenu. Styl 12x75. Sterylny.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Metale ciężkie, (jako Pb) < 10ppm, Fe < 0,01%, As < 1ppm, Nierozpuszczalne < 0,005%
Ulepszony Neubauer	Bez marki	Bez numeru katalogowego	Hemocytometr do zliczania komórek. (zakres 0,1000 mm, 0,0025 mm2)
Probówki do pobierania krwi K2 EDTA	BD Vacutainer	#367863	Liliowa plastikowa rurka próżniowa (K2E) 10,8 mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterylne i sprawdzone na obecność endotoksyn. Gęstość: 1,077 plusmn; 0,001 g / ml
Paraformaldehyd	SIGMA-ALDRICH		Utrwalanie próbek biologicznych, (proszek, 95%)
Transfer pipetą 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	Pipeta transferowa to narzędzie, które ułatwia przenoszenie cieczy z większą dokładnością.
Probówki	KIMBLE CHASE	45060 13100	Probówki żaroodporne. ROZMIAR/NAKRĘTKA 13 x 100 mm

CD184#SZBF0920V