Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hepatocyty są centralnymi komórkami wątroby odpowiedzialnymi za jej funkcje metaboliczne. W związku z tym tworzą wyjątkowo spolaryzowany nabłonek, w którym dwa lub więcej hepatocytów przyczynia się do powstania błon wierzchołkowych, tworząc sieć kanałów żółciowych, przez którą wydzielana jest żółć. Polaryzacja hepatocytów jest niezbędna do prawidłowego tworzenia kanałów i zależy od interakcji między cytoszkieletem hepatocytów, kontaktami komórka-komórka i macierzą zewnątrzkomórkową. Badania in vitro udziału cytoszkieletu hepatocytów w tworzeniu kanalików i jego odpowiedzi na sytuacje patologiczne są utrudnione ze względu na brak hodowli komórkowej, która bardzo przypominałaby strukturę sieci kanalików in vivo. Opisano tutaj protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłej myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również produkcję kultury w warunkach kanapki kolagenowej 3D, która jest używana do znakowania immunologicznego składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie in vitro. Wykazano, że kultury kanapkowe kolagenu 3D hepatocytów reagują na leczenie toksynami (etanolem) lub lekami zmieniającymi cytoszkielet aktynowy (np. Blebbistatyna) i służą jako cenne narzędzie do badań in vitro tworzenia i funkcji kanałów żółciowych.
Wprowadzenie
Hepatocyty, centralne struktury komórkowe wątroby, które są odpowiedzialne za jej funkcje metaboliczne, są wyjątkowo spolaryzowanymi komórkami nabłonkowymi. Ich polaryzacja, pojawiająca się u ssaków wkrótce po urodzeniu, powoduje powstanie sieci kanałów żółciowych i jest niezbędna do prawidłowego wydzielania żółci. Błony wierzchołkowe hepatocytów wspólnie tworzą kanaliki żółciowe, podczas gdy błony podstawne pozostają w kontakcie ze śródbłonkiem sinusoid. Utrata polaryzacji hepatocytów prowadzi do redystrybucji transporterów żółci i skutkuje procesami patologicznymi związanymi z zatrzymywaniem żółci w wątrobie (tzw. cholestazą).
Ustanowienie i utrzymanie polaryzacji hepatocytów oraz rozwój kanalików żółciowych pociągają za sobą złożone mechanizmy. Podstawowe procesy zależą od zbiorowego oddziaływania cytoszkieletu hepatocytów, kontaktów komórka-komórka i interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową1. Cytoszkielet hepatocytów składa się ze wszystkich trzech sieci włókien, cytoszkieletu aktynowego, mikrotubul i włókien pośrednich, które zapewniają strukturalne wsparcie dla tworzenia kanałów. Różnicowa rola składników cytoszkieletu w regeneracji i utrzymaniu sieci kanałów żółciowych została wcześniej zilustrowana in vitro w hodowlach hepatocytów 3D kolagenowo-kanapkowych2.
Mikrofilamenty i mikrotubule aktyny są ważne podczas początkowych etapów polaryzacji błony hepatocytów w miejscach powstawania kanalików2. Cytoszkielet aktynowy ustanawia strukturę i funkcję kanałów żółciowych, tworząc mikrowłókna związane z błoną i pierścień obwodowy, wspierając w ten sposób architekturę kanalików i wprowadzając cytoszkielet aktyny do ciasnych i przylegających połączeń3. Pierścień pośrednich włókien keratynowych na zewnątrz cytoszkieletu aktynowego dodatkowo stabilizuje strukturę kanału3.
Znaczenie białek w kompleksach połączeniowych hepatocytów w organizacji architektury kanalików żółciowych zostało dobrze udokumentowane w kilku modelach mysich knock-out, które wykazują zniekształcone kanaliki u myszy pozbawionych zarówno ścisłych, jak i/lub przylegających białek połączeniowych4,5,6. Wykazano, że delecja białka połączenia adherens α-kateniny prowadzi do dezorganizacji cytoszkieletu aktynowego hepatocytów, poszerzenia światła kanału żółciowego, nieszczelnych połączeń ścisłych i skutecznie do fenotypu cholestatycznego4. Ponadto badania in vitro wykazały znaczenie składników połączenia adherens, E-kadheryny i β-kateniny, w przebudowie światła wierzchołka wątrobowokomórkowego i transporcie białek7.
Uderzająco, ablacja białka sieciującego cytoszkielet plektyny, które jest głównym organizatorem keratyny, ujawniła fenotypy porównywalne do tych związanych z cytoszkieletem aktyny8. Sugeruje to kluczową rolę pośrednich włókien keratynowych we wspieraniu struktury kanałowej. Badania in vitro z wykorzystaniem kanapek z kolagenem hepatocytów 3D wykazały również znaczenie kinazy białkowej aktywowanej przez AMP i jej aktywatora LKB1 w tworzeniu sieci kanałów żółciowych9. Wyniki te zostały następnie potwierdzone w kolejnych badaniach in vivo10,11. W związku z tym stało się jasne, że badania in vitro są niezbędne do dalszego zrozumienia procesów sygnalizacyjnych związanych z ustalaniem polaryzacji hepatocytów, prawidłowym tworzeniem sieci kanałów i wydzielaniem żółci.
Głównym wyzwaniem w badaniu procesów związanych z tworzeniem się kanałów żółciowych i ich reakcji na patologiczne sytuacje in vitro jest wykorzystanie warunków hodowli komórkowej, które bardzo przypominają sytuację in vivo12. Świeżo wyizolowane hepatocyty pierwotne nie są spolaryzowane; w ten sposób tracą swoją funkcję, morfologię i funkcjonalne kanaliki żółciowe w warunkach hodowli 2D (np. zmiany w regulacji genów, polaryzacja i deróżnicowanie13,14,15). Pomimo tego faktu, świeżo wyizolowane hepatocyty najwierniej odzwierciedlają naturę wątroby in vivo, w przeciwieństwie do linii komórkowych pochodzących z wątroby16. Mimo że były używane w przeszłości, unieśmiertelnione linie komórkowe nie wywierają charakterystycznej morfologii hepatocytów podobnej do nabłonka, a światła kanałów żółciowych utworzone przez te komórki słabo przypominają kanaliki wątrobowe7. Ostatnio hodowle 3D pierwotnych hepatocytów, zarówno od myszy, jak i szczurów, stały się użytecznym narzędziem do badania procesów związanych z tworzeniem sieci kanałów żółciowych in vitro9. Pierwotne hepatocyty hodowane między dwiema warstwami kolagenu (określane jako kultura kanapkowa kolagenu 3D) mogą ulec repolaryzacji w ciągu kilku dni. Ze względu na wysokie wymagania techniczne wymagane podczas hodowli hepatocytów myszy w kanapkach z kolagenem 3D, tutaj przedstawiamy złożony protokół izolacji, hodowli i znakowania immunologicznego hepatocytów myszy osadzonych w kanapkach z kolagenem 3D w celu scharakteryzowania udziału składników cytoszkieletu podczas tworzenia kanałów żółciowych.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63/UE i zostały zatwierdzone przez Czeską Centralną Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt.
1. Materiały
- Zwierzęta trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi Federacji Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych z bezpłatnym dostępem do regularnej karmy i wody pitnej. Zwierzęta trzymane w cyklu 12 godzin/12 godzin ciemności/światła. Do izolacji i hodowli hepatocytów należy użyć 8–12 tygodniowych zwierząt.
- Roztwory podstawowe A i B
- Przygotować wcześniej roztwór podstawowy A i roztwór podstawowy B zgodnie odpowiednio z tabelą 1 i tabelą 2. Rozpuścić wszystkie składniki w 1 l destylowanegoH2O(dH2O).
- Dostosować pH roztworów do 7,2 i przefiltrować roztwory przez filtr 0,2 μm. Oba roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
- Roztwór podstawowy C
- Przygotować roztwór C w dniu pierwotnej izolacji hepatocytów.
- Dodać wszystkie składniki zgodnie z tabelą 3, napełnić do całkowitej objętości 50 mldH2Oi rozpuścić. Dostosować pH do 7,3.
- Podaniec 50 ml roztworu w probówkach o pojemności 50 ml. Użyj jednej rurki na zwierzę. Umieścić wszystkie wymagane porcje w podgrzanej łaźni wodnej (37 °C).
- Roztwór podstawowy D
- Przygotować roztwór D w dniu pierwotnej izolacji hepatocytów.
- Dodać wszystkie składniki zgodnie z tabelą 4, napełnić do całkowitej objętości 30 mldH2Oi rozpuścić. Dostosować pH do 7,3.
- Podwielokrotność 30 ml roztworu w probówkach o objętości 50 ml. Dodać kolagenazę I (5 mg/30 ml) do roztworu D. Użyć jednej porcji na zwierzę. Umieścić wszystkie porcje w podgrzanej łaźni wodnej (37 °C).
- Roztwór podstawowy E
- Przygotować roztwór E w dniu pierwotnej izolacji hepatocytów.
- Dodać wszystkie składniki zgodnie z tabelą 5, napełnić do całkowitej objętości 50 mldH2O i rozpuścić. Dostosować pH do 7,3.
- Podaniec 50 ml roztworu w probówkach o pojemności 50 ml. Dodać albuminę V (0,65 g/50 ml) do roztworu E. Użyć jednej porcji na zwierzę. Umieścić wszystkie porcje w podgrzanej łaźni wodnej (37 °C).
2. Przygotowanie kanapek z kolagenem
- Dzień przed pierwotną izolacją hepatocytów przygotuj pierwszą warstwę kanapki z kolagenem I.
UWAGA: Pracuj na lodzie i używaj wstępnie schłodzonych roztworów, końcówek, płytek i tubek, aby zminimalizować niepożądane żelowanie kolagenu I. - Zneutralizuj wymaganą ilość kolagenu I (z ogona szczura) zgodnie z protokołem producenta. Wymagana jest objętość 100 μl zneutralizowanego kolagenu (1,5 mg/ml) na próbkę doświadczalną (naczynie 3,5 cm). Aby przygotować 1 ml zneutralizowanego kolagenu (1,5 mg/ml), dodaj 100 μl 10x DMEM, 1,5 μl 1M NaOH i 48,5 μl dH2O do 500 μl kolagenu (stężenie podstawowe = 3 mg / ml). Sprawdź pH zneutralizowanego kolagenu papierkiem lakmusowym (pH powinno wynosić ~7,5).
- Rozprowadź równomiernie 100 μl zneutralizowanego roztworu kolagenu za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 200 μl na powierzchni 3,5 cm naczynia ustawionego na lodzie.
- Inkubować przez noc w standardowych warunkach hodowli (inkubator z 5% CO2 w temperaturze 37 °C). W dniu pierwotnej izolacji hepatocytów dodać 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) PBS do pierwszej warstwy kolagenu. Pozwól kolagenowi nawodnić się przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Konfiguracja sprzętu
- Przygotuj cały sprzęt zgodnie z tabelą materiałów i ustaw tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
4. Zabieg chirurgiczny
- Znieczulenie myszy przez domięśniowe wstrzyknięcie tiletaminy (60 mg/kg masy ciała), zolazepamu (60 mg/kg) i ksylazyny (4,5 mg/kg). Po kilku minutach potwierdź prawidłowe znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi. Jeśli zwierzę nie reaguje na szczypanie, przejdź do 4.2.
- Umieść znieczuloną mysz na macie preparacyjnej i zaklej taśmą dolną i górną kończynę, aby ustawić mysz w pozycji leżącej. Wymaz z brzucha 70% etanolem i otwórz brzuch z nacięciem w kształcie litery V od okolicy łonowej do przednich nóg. Zawiń skórę na klatce piersiowej, aby odsłonić jamę brzuszną. Umieść matę preparacyjną pod mikroskopem preparacyjnym.
- Zegnij igłę strzykawki insulinowej (30 G) pod kątem 45°. Odsłonić żyłę główną dolną (IVC), przesuwając jelita i okrężnicę w kierunku ogonowym.
- Wlać 2,5 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu C do strzykawki o pojemności 2 ml z kaniulą. Upewnij się, że w kaniuli lub strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
- Przed kaniulacją IVC należy zmienić położenie płatów wątroby, dociskając je do przepony mokrym wacikiem (PBS). Umieść jedwabny szew wokół IVC tuż pod wątrobą (Rysunek 2A,B).
- Wstrzyknąć 10 μl heparyny (5000 U/ml) do żyły wrotnej za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 30 G wygiętą pod kątem 45° (Ryc. 2C).
- Aby kanniulować wątrobę, wykonaj małe nacięcie nożyczkami mikrochirurgicznymi do IVC bezpośrednio obok wątroby (poniżej szwu; Rysunek 2D), która jest wystarczająco duża, aby włożyć kaniulę. Zabezpiecz kaniulę w tej pozycji za pomocą szwów i dwóch węzłów chirurgicznych (Rysunek 2E).
- Przeciąć żyłę wrotną (Rysunek 2F), aby umożliwić przepływ perfuzyjnych z wątroby, aby zapobiec rozszerzaniu się wątroby.
- Ręcznie przeprowadź perfuzję wątroby za pomocą 1,5 ml wstępnie podgrzanego roztworu C, powoli naciskając strzykawkę podłączoną do kaniuli (powinno to zająć ~15 s). Obecnie można zaobserwować usuwanie krwi z wątroby przez przebarwienie wątroby.
- Wstępnie napełnić pompę perystaltyczną wstępnie podgrzanym (37 °C) roztworem C. Sprawdź aparat perfuzyjny i upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
- Ostrożnie odłącz kaniulę od strzykawki i podłącz ją do rurki pompy perystaltycznej pracującej z natężeniem przepływu 2,5 ml/min. Pracuj szybko, ale ostrożnie i upewnij się, że kaniula pozostaje na swoim miejscu i że żadne pęcherzyki nie dostały się do rurki lub kaniuli.
- Perfuzję wątroby roztworem C przez 2 minuty (5 ml roztworu C). Zmienić na roztwór D i kontynuować perfuzję przez dodatkowe 10 minut (25 ml roztworu D).
- Po perfuzji wątroby usuń ją z jamy brzusznej. Wątroba będzie teraz bardzo delikatna i blada (Rysunek 3).
5. Izolacja pierwotnych hepatocytów
- Usuń wątrobę z myszy. Kaniula będzie nadal przywiązana do wątroby, więc użyj kleszczy, aby podnieść kaniulę z wątrobą i ostrożnie odetnij wszystkie połączenia powięziowe. Przenieść wątrobę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml wstępnie podgrzanego roztworu E.
- Przytrzymaj kaniulę z wątrobą za pomocą kleszczy i odłącz tkankę, pocierając wątrobę wokół ściany rurki, aby przenieść izolowane hepatocyty do bufora. Trzymaj odizolowane komórki na lodzie.
UWAGA: Wyizolowane hepatocyty pierwotne są żywotne przez kilka godzin, gdy są trzymane na lodzie. W razie potrzeby użytkownicy mogą powtórzyć kroki od 4.1 do 5.2, izolując pierwotne hepatocyty od innej myszy dawcy lub przejść do następnego kroku. - Umieść nylonowe sitko o pojemności 70 μm na probówce o pojemności 50 ml i przefiltruj izolowane komórki.
- Odwirować probówkę o sile 50 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Aby usunąć martwe komórki i zwiększyć odsetek żywych komórek, ponownie zawieś osad w 20 ml 40% perkolu w DMEM.
- Odwirować probówkę o sile 50 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant zawierający martwe komórki i ponownie zawiesić osad w 20 ml roztworu E.
- Probówki wirować przy 50 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml roztworu E.
- Sprawdź pierwotną wydajność i żywotność hepatocytów za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Policz liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera i dostosuj stężenie komórek do 3,75 x 105 żywych komórek/ml. Utrzymuj komórki na lodzie.
6. Hodowla pierwotnych hepatocytów w kanapkach z kolagenem 3D
- Przygotować pożywkę do hodowli hepatocytów (HCM). Dodać 15 μl glukagonu (1 mg/ml), 15 μl hydrokortyzonu (50 mg/ml) i 40 μl insuliny (10 mg/ml) do 50 ml kompletnej pożywki (DMEM, wysoka glukoza, 10% FBS, 1% penicylina-streptomycyna).
- Równomiernie rozprowadzić 2 ml (5 x 105 komórek/ml) żywotnych pierwotnych hepatocytów w wstępnie powlekanym naczyniu o średnicy 3,5 cm. Inkubować komórki z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Ważne: Równomiernie rozprowadzić komórki, przechylając szalkę we wszystkich kierunkach tuż przed włożeniem naczynia do inkubatora.
- Przygotuj zneutralizowany kolagen I (naczynie 100 μl/3,5 cm; tj. objętość wystarczająca na wszystkie potrawy, jak opisano powyżej [krok 2.1]). Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
- Po 3 godzinach ostrożnie usuń pożywkę i nieprzyłączone komórki i dodaj 100 μl zneutralizowanego kolagenu I do każdej 3,5 cm płytki, aby utworzyć wierzchnią warstwę kolagenu na komórkach. Inkubować kanapkę kolagenową w standardowych warunkach hodowli komórkowej (5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez 1 godzinę. Po 1 godzinnej inkubacji ostrożnie dodaj 2 ml HCM.
- Po 24 godzinach hodowli zmień pożywkę HCM na nową.
- Hodowla przez 3–8 dni, w zależności od tworzenia się kanałów żółciowych. Codziennie sprawdzaj kulturę pod mikroskopem (Rysunek 4). Zmieniaj HCM co drugi dzień.
7. Znakowanie immunologiczne pierwotnych hepatocytów w kanapkach z kolagenem 3D
- Usuń pożywkę z kanapek z hepatocytami, a następnie dokładnie umyj wstępnie podgrzanym PBS. Utrwal kultury kanapkowe za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Po utrwaleniu pierz kanapki 3x przez 10 min w 2 ml PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T).
- Przesiąknąć komórki 1 ml 0,1 M glicyny, 0,2% Triton X-100 w PBS w temperaturze RT przez 1 h. Myć 3x przez 10 min w PBS-T.
- Delikatnie naruszyć wierzchnią warstwę kolagenu za pomocą końcówki ładującej o pojemności 10 μl podłączonej do aspiracji próżniowej, aby zapewnić wystarczającą penetrację przeciwciał.
- Blokować z 1 ml 5% BSA w PBS-T (tj. roztworze blokującym) przez 2 godziny. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 37 °C. Myć 3x przez 15 minut w PBS-T.
- Po umyciu inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze 37 °C przez 5 godzin. Myć 3x przez 15 minut w PBS-T, a następnie 1x przemyć destylowanymH2O.
- Zamontuj za pomocą nośnika montażowego zapobiegającego blaknięciu (patrz tabela materiałów) do mikroskopii.
Wyniki
Pierwotne hepatocyty mysie zostały wyizolowane i wysiane w 3D kolagenowych „sandwichach”. Kanaliki żółciowe między dwiema sąsiednimi komórkami zaczęły formować się w ciągu kilku godzin po wysianiu. Komórki tworzyły klastry i samoorganizowały się w przybliżeniu regularną sieć kanalików żółciowych w ciągu 1 dnia (Rysunek 4). W ciągu 3–6 dni zazwyczaj obserwowano klastry od 5 do 10 komórek, przy czym w pełni spolaryzowane hepatocyty tworzyły sieć kanalikową (Rysunek 4).
Poddanie pierwotnych hepatocytów mysich w 3D collagen sandwiches działaniu toksyny (etanolu) lub leków modyfikujących cytoszkielet (np. blebbistatyny, kwasu okadaikowego) doprowadziło do zmian w cytoszkielecie hepatocytów, szerokości i kształcie kanalików oraz liczbie kanalików żółciowych, co zilustrowano za pomocą immunoznakowania przeciwciałem przeciwko keratynie 8 (najliczniejszej keratynie w hepatocytach), falloidyną (wizualizującą F-aktynę) oraz przeciwciałem przeciwko białku połączeń ścisłych zonula occludens-1 (ZO-1; Rysunek 5).
Opracowanie etanolem miało jedynie niewielki wpływ na organizację keratyny 8; zwiększyło jednak krętość (widoczną na barwieniu F-aktyny) oraz rozkład szerokości kanalików żółciowych (Rysunek 5). Intensywność sygnału barwienia ZO-1 była zmniejszona w kanalikach żółciowych traktowanych etanolem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, co sugeruje utratę połączeń ścisłych po podaniu etanolu. Hamowanie kurczliwości akto-miozyny za pomocą blebbistatyny znacząco wpłynęło na kształt i liczbę kanalików żółciowych. Regularna sieć kanalikowa, w porównaniu z nieleczonymi hepatocytami, została przekształcona w nieuporządkowane kanalik żółciowe z częstszym występowaniem grubych, zaokrąglonych kanalików zamiast cienkich i długich (co widać na histogramie szerokości kanalików).
Dodatkowo, opracowano wcześniej, że traktowanie kwasem okadaicznym (OA), który hamuje fosfatazy, silnie wpływa na właściwości fizyczne keratin8,17. OA zmienia rozpuszczalność filamentów keratynowych; w konsekwencji traktowanie to doprowadziło do głębokiej reorganizacji sieci keratynowej, która zapadła się w duże agregaty perinuklearne. Zarówno F-aktyna, jak i białko ZO-1 połączeń ścisłych nie lokalizowały się w żadnych konkretnych strukturach, co sugeruje niemal całkowity zanik zorganizowanych kanalików żółciowych i całkowitą utratę polarności hepatocytów. Pozostałe kanaliki żółciowe były znacznie zwężone w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, co widoczne jest na histogramie szerokości kanalików (Rysunek 5).
Aby skorelować mikroskopowe obserwacje zmian w cytoszkielecie hepatocytów z biochemiczną odpowiedzią hepatocytów na leczenie, w protokole zmierzono również poziomy alaninaminotransferazy (ALT) oraz aspartaminotransferazy (AST) (dwóch enzymów wątrobowych powszechnie stosowanych jako markery uszkodzeń hepatocytów) w supernatancie z 3D collagen sandwiches (Rysunek 6)18. Leczenie etanolem znacząco podniosło poziomy zarówno ALT, jak i AST, co sugeruje ciężkie uszkodzenie hepatocytów. Leczenie blebbistatyną nie doprowadziło do żadnych istotnych zmian w poziomach ALT i AST w porównaniu z leczeniem kwasem okadaikowym, które wywołało łagodne zmiany biochemiczne z podwyższonym poziomem ALT, ale bez zmian w poziomie AST. Zatem biochemiczne markery uszkodzenia hepatocytów zmierzone in vitro z supernatantu hepatocytów korelują ze zmianami cytoszkieletu zaobserwowanymi podczas immunobarwienia.
Rycina 1: Układ eksperymentalny. (A) Mysz unieruchomiona w pozycji grzbietnej, umieszczona pod mikroskopem dissectingowym przed operacją. Wszystkie niezbędne narzędzia chirurgiczne znajdują się na tacy. (B) Zestaw do perfuzji podczas perfuzji wątroby myszy, przedstawiający rurki silikonowe łączące zbiornik z ciepłym buforem z perfundowaną myszą. (C) Schematyczne przedstawienie B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Otwarcie jamy brzusznej i kaniulacja IVC. Brzuch zostaje otwarty za pomocą nacięcia w kształcie litery V od okolicy łonowej do przednich kończyn. Skóra zostaje odchylona w stronę klatki piersiowej, aby odsłonić i powiększyć jamę brzuszną. W celu odsłonięcia IVC jelita cienkie i grube są ostrożnie przesuwane w kierunku ogona. (A, B) Przed kaniulacją IVC należy zmienić położenie płatów wątroby, dociskając je w górę w kierunku przepony za pomocą nasączonego PBS patyczka bawełnianego. Następnie IVC zostaje ostrożnie oddzielone od otaczających tkanek, a wokół IVC, w bliskim sąsiedztwie wątroby, umieszcza się szew jedwabny. Panel B przedstawia schemat jamy brzusznej pokazanej w panelu A. Oznaczone są płaty wątroby, jelita, żyła główna dolna (IVC, kolor czerwony) oraz szwy. (C) Heparyna jest wstrzykiwana do żyły wrotnej (PV, strzałka) za pomocą strzykawki insulinowej (igła 30 G zgięta pod kątem 45°). (D) Aby przeprowadzić kaniulację wątroby, IVC zostaje nacięte bezpośrednio obok wątroby (poniżej szwu). (E) Kaniulę wprowadza się i mocuje szwami poprzez zawiązanie dwóch węzłów chirurgicznych. (F) Żyła wrotna zostaje całkowicie przecięta, aby umożliwić swobodny odpływ buforu, zapobiegając rozszerzaniu się wątroby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy wątroby przed i po perfuzji. (A, B) Kanulowana wątroba została wycięta i poddana perfuzji przez 12 min przy szybkości przepływu 2.5 mL/min. Zauważalne jest znaczne odbarwienie wątroby po perfuzji (B) w porównaniu do świeżo wyciętej wątroby (A). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: 3D hodowla kanapkowa z kolagenu pierwotnych hepatocytów mysich. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu pierwotnych hepatocytów mysich hodowanych przez 1, 2 i 3 dni w warunkach 3D. Należy zauważyć, że po 3 dniach hodowli tworzą się większe skupiska wysoko zorganizowanych komórek. Obramowane obszary przedstawiają powiększenie ok. 3x. Groty strzałek wskazują kanaliki żółciowe. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Ocena odpowiedzi morfologicznej na stres toksyczny za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Pierwotne hepatocyty mysie hodowane w 3D w kanapkach kolagenowych poddano działaniu toksyn (etanolu, blebbistatyny lub kwasu okadaikowego) w 3. dniu hodowli. Utrwalone komórki barwiono w celu wizualizacji składników cytoszkieletu: keratyny 8 (zielony), F-aktyny (czerwony) oraz zonula occludens-1 (ZO-1, purpurowy) metodą immunofluorescencji. Leczenie toksyczne doprowadziło do dezorganizacji wizualizowanych składników cytoszkieletu, zmniejszyło liczbę i zwiększyło krętość kanalików żółciowych. Szerokości kanalików mierzono zarówno w hepatocytach nieleczonych, jak i leczonych; wyniki przedstawiono w formie histogramów rozkładu szerokości. Groty strzałek wskazują kanaliki żółciowe. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Analiza biochemiczna odpowiedzi 3D kolagenowych „kanapek” hepatocytów na uszkodzenie toksyczne in vitro. Poziomy ALT i AST, uznanych markerów uszkodzenia hepatocytów, zmierzono w supernatancie z 3D kolagenowych „kanapek” hepatocytów poddanych działaniu toksyn (etanolu, blebbistatyny i kwasu okadaicznego). Aktywność ALT i AST była podwyższona w komórkach traktowanych w porównaniu do komórek nieleczonych. Dane przedstawiono jako średnie arytmetyczne ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Roztwór zapasowy A (10x) | |
| Odczynnik | Stężenie końcowe (g/litr) |
| NaCl | 80 |
| KCl | 4 |
| MgSO₄4·7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4·2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
Tabela 1: Skład roztworu stokowego A.
| Roztwór zapasowy B (10x) | |
| Odczynnik | Stężenie końcowe (g/litr) |
| NaCl | 69 |
| KCl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4·7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
Tabela 2: Skład roztworu stokowego B.
| Roztwór C | |
| Odczynnik | |
| Roztwór zapasowy A (10x) | 5 mL |
| NaHCO3 | 0.1094 g |
| EGTA | 0.0095 g |
| dH2O | do 50 mL |
Tabela 3: Sposób przygotowania roztworu zapasowego C.
| Roztwór D | |
| Odczynnik | |
| Roztwór zapasowy A (10x) | 3 mL |
| NaHCO3 | 0.065 g |
| CaCl2 | 0.0125 g |
| dH2O | do 30 mL |
Tabela 4: Przepis na roztwór zapasowy D.
| Roztwór E | |
| Odczynnik | |
| Roztwór zapasowy B (10x) | 5 ml |
| NaHCO33 | 0,1 g |
| glukoza | 0,045 g |
| dH2O | do 50 ml |
Tabela 5: Sposób przygotowania roztworu stokowego E.
Dyskusja
Wykorzystanie pierwotnych hodowli hepatocytów myszy jest ważne dla badań in vitro, aby lepiej zrozumieć procesy sygnalizacyjne zaangażowane w ustalanie polaryzacji hepatocytów, prawidłowe tworzenie struktury kanałów i wydzielanie żółci. Wyzwania związane z izolacją i długoterminową hodowlą pierwotnych hepatocytów myszy w hodowli 2D doprowadziły do wynalezienia kilku podejść technicznych o zwiększonej skuteczności izolacji i długowieczności izolowanych komórek, z których każde ma kilka zalet i wad. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że hodowle 2D pierwotnych hepatocytów naśladują tylko ograniczoną liczbę atrybutów biologii wątroby przez krótki okres czasu. Tak więc hodowla 3D w układzie kanapkowym kolagenu szeroko zastępuje warunki 2D, szczególnie gdy koncentruje się na funkcji cytoszkieletu w biologii wątroby (np. Toksyczne działanie leków lub przestrzenna organizacja transportu żółci).
Od lat 80. XX wieku opisano kilka protokołów izolacji hepatocytów myszy z różnymi modyfikacjami. Dwuetapowe podejście do perfuzji kolagenazy stało się szeroko stosowane w wielu laboratoriach. Dodanie wirowania gradientowego do protokołu izolacji pozwala na usunięcie martwych komórek19,20 i znacznie zwiększa liczbę żywych komórek (tutaj rutynowo do ~93%). Mimo że ten etap wydłuża czas obsługi komórek i powoduje zmniejszenie liczby komórek21, krok ten jest postrzegany jako niezbędny w hodowli kanapkowej kolagenu 3D dla prawidłowego tworzenia sieci kanałów żółciowych. Dodatkowo ważniejsze jest szybkie i dokładne postępowanie podczas etapów perfuzji, co skraca czas obsługi komórek.
Innymi ważnymi czynnikami, które zwiększają żywotność komórek i ich zdolność do tworzenia sieci kanałowych w 3D, jest stosowanie świeżo przygotowanych roztworów i unikanie pęcherzyków podczas perfuzji. Dlatego roztwory należy przygotować w dniu izolacji hepatocytów myszy, a pompę perystaltyczną i rurki należy sprawdzić przy zmianie roztworów. Jeśli protokół jest ściśle przestrzegany, izolacja pierwotnych hepatocytów powinna zakończyć się sukcesem z wysoką wydajnością żywotnych komórek.
Innym krytycznym czynnikiem w długoterminowej hodowli hepatocytów 3D jest początkowe źródło pierwotnych hepatocytów, które są używane. Ważne jest, aby używać zwierząt w wieku 8–12 tygodni, które służą jako optymalni dawcy hepatocytów. Wykorzystanie hepatocytów ze starszych zwierząt nie było tak skuteczne w długotrwałej hodowli, ponieważ hepatocyty te częściej zmieniały swoją morfologię, ulegały depolaryzacji i przestawały tworzyć sieci kanałowe. Istotnym krokiem jest również posiew hepatocytów na odpowiednio zneutralizowanym żelu kolagenowym utworzonym ze stosunkowo wysoko stężonego roztworu. W większości protokołów stosuje się stężenia około 1 mg/ml. Po wielu optymalizacjach stężenie 1,5 mg/ml jest optymalne dla długotrwałej hodowli hepatocytów i zapewnia wysoce zorganizowane hepatocyty z uformowanymi kanalikami żółciowymi.
Ten łatwy do naśladowania protokół pozwala na długotrwałą hodowlę pierwotnych hepatocytów myszy. Reprezentatywne wyniki wskazują na szerokie spektrum zastosowania pierwotnych hepatocytów myszy hodowanych w 3D podczas badania roli składników cytoszkieletu w tworzeniu kanalików żółciowych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Agencję Grantową Republiki Czeskiej (18-02699S); Agencję Grantową Ministerstwa Zdrowia Republiki Czeskiej (17-31538A); Instytucjonalny Projekt Badawczy Czeskiej Akademii Nauk (RVO 68378050) oraz projekty MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, oraz OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Uniwersytet Karola (stypendium osobiste dla K.K.) oraz projekt w ramach Programu Operacyjnego Praga – Konkurencyjność (CZ.2.16/3.1.00/21547). Dziękujemy Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Republika Czeska (wspierane projekty MEYS CR LM2015062 i LO1419) za wsparcie w zakresie prezentowanego obrazowania mikroskopowego.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie hodowlane 35 mm z powłoką TC | Corning | 430165 | |
| 50 ml Probówki wirówkowe, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µ m Nylonowe sitko komórkowe | Biologix | 15-1070 | |
| Frakcja albuminy V | ROTH | 8076.4 | |
| Kaniula arterotomii (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Kolagen I. z ogona szczura (3 mg / ml) | Corning | 354249 | |
| Kolagenaza (z Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glukoza jednowodna | ROTH | 6780.1 | |
| Mikroskop preparacyjny | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, wysoka glukoza | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparyna (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Strzykawka insulinowa (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | ROTH | T888.1 | |
| kleszcze mikrochirurgiczne | FST | 11252-20 | |
| kleszcze mikrochirurgiczne | FST | 11251-35 | |
| nożyczki mikrochirurgiczne | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Pompa perystaltyczna Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Chlorek potasu | ROTH | 6781.1 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade | Mountant Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Wirówka z chłodzeniem | Eppendorf | 5810 R | |
| Okrągłe okulary nakrywkowe, 30 mm, grubość 1,5 | VWR | 630-2124 | |
| Jedwabny pleciony | Chirmax | EP 0,5 – USP 7/0 | |
| Chlorek sodu | ROTH | 3957.1 | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Fosforan sodu dwuwodny | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Strzykawka 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Łaźnia wodna | Nuve | NB 9 | |
| Filtry membranowe Whatman nylon, wielkość porów 0,2 i mu; m, średnica 47 mm | Bibułki wskaźnikowe pH Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman, pH 6,0-8,1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
Bibliografia
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835(2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. Repolarization of hepatocytes in culture. Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315(2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542(2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
Przedruki i uprawnienia
