Artykuł metodologiczny

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

DOI:

10.3791/60510

⸱

27 października 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Axe Neurosciences, Centre de Recherche du CHU de Québec-Université Laval, 2Département de Médecine Moléculaire, Faculté de Médecine, Université Laval, 3Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 4Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest protokół do podwójnej wizualizacji mikrogleju i infiltracji makrofagów w tkance mózgowej myszy. TMEM119 (która selektywnie znakuje mikroglej), w połączeniu z IBA1 (który zapewnia wyjątkową wizualizację ich morfologii), umożliwia badanie zmian w gęstości, rozmieszczeniu i morfologii. Kwantyfikacja tych parametrów jest ważna dla uzyskania wglądu w role odgrywane przez mikroglej, makrofagi rezydujące w mózgu. W normalnych warunkach fizjologicznych mikroglej jest regularnie rozmieszczony w wzór przypominający mozaikę i przedstawia małą somę z rozgałęzionymi procesami. Niemniej jednak, w odpowiedzi na czynniki środowiskowe (tj. uraz, infekcję, chorobę lub uraz), gęstość, rozmieszczenie i morfologia mikrogleju są zmieniane na różne sposoby, w zależności od zniewagi. Dodatkowo opisana metoda podwójnego barwienia pozwala na wizualizację naciekających makrofagów w mózgu na podstawie ich ekspresji IBA1 i bez kolokalizacji z TMEM119. Podejście to pozwala zatem na rozróżnienie między mikroglejem a infiltrującymi makrofagami, co jest niezbędne do uzyskania funkcjonalnego wglądu w ich wyraźny udział w homeostazie mózgu w różnych kontekstach zdrowia i choroby. Protokół ten integruje najnowsze odkrycia w dziedzinie neuroimmunologii, które odnoszą się do identyfikacji markerów selektywnych. Służy również jako użyteczne narzędzie zarówno dla doświadczonych neuroimmunologów, jak i badaczy dążących do zintegrowania neuroimmunologii z projektami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czy to ostre, czy przewlekłe, zapalenie nerwów jest ściśle uzależnione od mikrogleju, makrofagów rezydujących w mózgu. Wizualizacja mikrogleju za pomocą barwienia immunologicznego jest cenna dla badania zapalenia nerwów przy użyciu mikroskopii świetlnej, która jest bardzo dostępną techniką. W warunkach homeostatycznych mikroglej jest zwykle rozmieszczony w nienakładającym się na siebie, przypominającym mozaikę wzorze. Wykazują małe somy, które rozszerzają rozgałęzione procesy1, które czasami kontaktują się ze sobą2. Rozgałęzione procesy mikrogleju dynamicznie badają miąższ mózgu, wchodząc w interakcje z neuronami, innymi komórkami glejowymi i naczyniami krwionośnymi w normalnych warunkach fizjologicznych3. Mikroglej jest wyposażony w arsenał receptorów, które pozwalają im wykonywać zadania immunologiczne i reagować na zmiany w środowisku mózgowym, śmierć komórki lub uszkodzenie tkanek. Ponadto pełnią kluczowe funkcje fizjologiczne, w szczególności w tworzeniu, utrzymywaniu i eliminacji synapty4,5.

Wśród dostępnych markerów używanych do badania mikrogleju, zjonizowana cząsteczka adaptora wiążącego wapń 1 (IBA1) jest jedną z najczęściej używanych. IBA1 jest białkiem wiążącym wapń, które zapewnia wyjątkową wizualizację morfologii mikrogleju, w tym drobnych procesów dystalnych, co potwierdza mikroskopia elektronowa6. Narzędzie to odegrało zasadniczą rolę w scharakteryzowaniu transformacji mikrogleju, wcześniej nazywanej "aktywacją", w szerokim zakresie modeli chorób zwierzęcych7,8,9. W obecności zapalenia układu nerwowego odpowiedź mikrogleju obejmuje: mikroglejozę, którą definiuje się jako wzrost gęstości komórek, zmiany w dystrybucji, które czasami prowadzą do grupowania, powiększenie ciała komórki, a także pogrubienie i skrócenie procesów związanych z bardziej ameboidalnymi kształtami10,11,12,13.

Barwienie immunologiczne jest ograniczone przez dostępność przeciwciał skierowanych przeciwko określonym markerom. Co ważne, IBA1 jest wyrażany przez mikroglej, ale także przez makrofagi obwodowe, które infiltrują mózg14. Podczas gdy obserwacja komórek IBA1-dodatnich w mózgu stała się markerem mikrogleju w tej dziedzinie badań, infiltracja makrofagów obwodowych została zgłoszona w różnych warunkach, nawet marginalnie w zdrowym mózgu15,16,17,18. W związku z tym samo zastosowanie IBA1 nie pozwala na selektywną wizualizację mikrogleju. Ponadto makrofagi przyjmują molekularne i morfologiczne cechy rezydującego mikrogleju po infiltracji mózgu, utrudniając w ten sposób różnicowanie19. Stanowi to wyzwanie podczas badania funkcji zarówno mikrogleju, jak i naciekających makrofagów.

Chociaż mikroglej i makrofagi obwodowe mają różne pochodzenie (np. odpowiednio z embrionalnego woreczka żółtkowego i szpiku kostnego20,21), istnieje coraz więcej wyników wskazujących, że te dwie populacje komórek pełnią różne role w mózgu19. Dlatego tak ważne jest stosowanie metod, które rozróżniają te dwie populacje bez inwazyjnych manipulacji (tj. chimer szpiku kostnego lub parabiozy), które mogą modulować ich gęstość, rozmieszczenie, morfologię i funkcję. TMEM119 pojawił się jako marker specyficzny dla mikrogleju w różnych stanach zdrowotnych i chorobowych22. W połączeniu z IBA1 marker ten staje się przydatny do różnicowania tych komórek od naciekających makrofagów, które są TMEM119-ujemne i IBA1-dodatnie. Chociaż jest regulowany rozwojowo, TMEM119 wyraża się już w 3 (P3) i 6 dniu po urodzeniu (P6), stale rosnąc, aż do osiągnięcia dorosłego poziomu między P10 a P1422. IBA1 ulega ekspresji już w 10,5 dniu embrionalnym (E10,5)23. Proponowany protokół podwójnego znakowania jest zatem przydatny do badania tych dwóch populacji przez całe życie pourodzeniowe.

Ten protokół zapewnia krok po kroku procedurę barwienia immunologicznego, która pozwala na rozróżnienie między mikroglejem a makrofagami obwodowymi. Wyjaśnia również, jak przeprowadzić analizę ilościową gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także analizę infiltracji makrofagów obwodowych. Podczas gdy badanie mikrogleju i makrofagów obwodowych jest przydatne samo w sobie, protokół ten dodatkowo umożliwia lokalizację neurozapalnych foyer; W związku z tym służy również jako platforma do identyfikacji konkretnych regionów do zbadania, przy użyciu uzupełniających (ale bardziej czasochłonnych) technik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnych Komisji Etyki Zwierząt, zgodnie z Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami oraz Komisją ds. Opieki nad Zwierzętami Université Laval.

1. Barwienie immunologiczne

  1. Wybierz trzy sekcje mózgu myszy zawierające obszar zainteresowania (ROI) (tj. hipokamp) za pomocą atlasu mózgu. Umieścić skrawki na plastikowej płytce wielodołkowej i przykryć je 350 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (Tabela 1).
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, mózgi należy przetoczyć perfuzją 4% paraformaldehydu i przyciąć do grubości 50 μm za pomocą wibratomu. W przypadku 24-dołkowej płytki wielodołkowej każda studzienka może pomieścić do sześciu sekcji. Zalecana objętość roztworu dla każdej studzienki wynosi 350 μl (dla maksymalnie trzech sekcji) i 500 μl dla studzienek zawierających sześć sekcji. W przypadku większej liczby sekcji zaleca się użycie płytki wielodołkowej z 12 otworami. Upewnij się, że wybrana objętość roztworu dla każdej studzienki całkowicie zakrywa tkankę i pozwala skrawkom unosić się na wodzie. Zalecane objętości mają zastosowanie do każdego rozwiązania użytego w pozostałej części protokołu.
  2. Umyć próbki, przykrywając je 350 μl PBS i pozostawić do spoczynku, umieszczając płytkę wielodołkową na górze wielofunkcyjnej wytrząsarki w temperaturze pokojowej (RT). Usuń PBS po 5 minutach i zastąp go 5x nowym PBS.
    UWAGA: Aby usunąć roztwory, zalecana jest pipeta transferowa. Podczas nalewania jakiegokolwiek roztworu należy upewnić się, że końcówka pipety przylega do ścianki studzienki, aby chronić integralność tkanki. Upewnij się również, że używasz nowej pipety do każdego nowego roztworu.
  3. Usunąć PBS i dodać 350 μl 10 mM buforu cytrynianu sodu o pH = 6,0 (Tabela 1).
  4. Uszczelnić płytkę wielodołkową folią parafinową i pozostawić ją na uprzednio podgrzanej łaźni wodnej przez 40 minut w temperaturze 70 °C.
  5. Pozostawić płytkę wielodołkową do ostygnięcia przez około 15 minut.
  6. Usunąć bufor cytrynianu sodu i umyć skrawki w PBS, jak to opisano w kroku 1.2.
  7. Usunąć PBS i dodać 350 μl świeżo przygotowanego 0,1% NaBH4 (Tabela 1) i pozostawić do inkubacji na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć roztwór 0,1% NaBH4 i umyć skrawki w PBS, jak to opisano w kroku 1.2.
  9. Usunąć PBS i dodać bufor blokujący (Tabela 1) na 1 godzinę przy suchym natężeniu ruchu na górze uniwersalnego wytrząsarki.
    UWAGA: Upewnij się, że przygotowałeś podwójne objętości bufora blokującego, ponieważ ten sam roztwór zostanie użyty w następnym kroku.
  10. Usunąć bufor blokujący i zastąpić buforem blokującym zawierającym mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych (1:150 mysz IBA1 + 1:300 TMEM119). Uszczelnić płytkę folią parafinową i pozostawić na noc do inkubacji w temperaturze 4 °C.
  11. Następnego dnia należy ogrzać próbki w temperaturze pokojowej przez około 15 minut.
  12. Przemyć skrawki 5x po 5 minut w PBS z trytonem (PBST) (Tabela 1).
  13. Usunąć PBST i dodać bufor blokujący zawierający mieszaninę przeciwciał drugorzędowych (1:300 anty-mysi Alexa 488 dla IBA1; 1:300 kozioł anty-królik Alexa 568 dla TMEM119) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Począwszy od tego punktu, chronić próbki przed światłem.
  14. Usuń bufor blokujący i umyj sekcje 5 razy, tak jak to zrobiono w kroku 1.2, z wyjątkiem tym razem z PBST.
  15. Usunąć PBST i dodać 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) [1:20000] przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Usuń DAPI i myj sekcje 3x po 5 minut w buforze fosforanowym (PB).
  17. Zamontuj sekcje na szkiełku mikroskopowym. Pozwól im wyschnąć, będąc chronionymi przed światłem.
  18. Po wysuszeniu dodaj kilka kropli montażowego podłoża fluorescencyjnego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym, unikając tworzenia się pęcherzyków.
    UWAGA: Szkiełka należy przechowywać w osłonie przed światłem, w pudełku ze szkiełkami histologicznymi, w temperaturze 4 °C. Próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy.

2. Obrazowanie do analizy gęstości i rozkładu

  1. Za pomocą szerokokątnego mikroskopu epifluorescencyjnego użyj małego powiększenia i kanału DAPI, aby zlokalizować ROI (tj. region CA1 hipokampa).
  2. Uzyskuj obrazy z powiększeniem 20x, przy aperturze numerycznej (NA) 0,5, z kanałami DAPI, 488 i 568 oraz filtrami, w rozdzielczości 0,3 μm/piksel. Zrób mozaikowe zdjęcie pokrywające zwrot z inwestycji. Możesz też zrobić pojedyncze zdjęcia, które zostaną połączone w większy obraz.
    UWAGA: Obraz mozaiki to super obraz składający się z mniejszych obrazów. Obrazy mozaikowe są zwykle używane do pokonywania ograniczonego obszaru pola widzenia dużych powiększeń. Niektóre programy zawierają funkcję mozaiki; Niemniej jednak obrazy można również ręcznie łączyć z innym oprogramowaniem do edycji zdjęć, łącząc poszczególne obrazy w jeden. Pamiętaj, aby dodać informacje o skali do pliku. W przypadku tego typu analizy zaleca się zobrazowanie co najmniej 300 komórek mikrogleju na ROI/zwierzę (co odpowiada około 10-15 obrazom na przykład dla hipokampa), przy czym co najmniej pięć zwierząt na warunki eksperymentalne. Rysunek 1A−C pokazuje obrazy współznakowanego mikrogleju.
  3. Zapisz obraz jako plik TIFF.

3. Obrazowanie do analizy morfologicznej

  1. Używając mikroskopu konfokalnego lub oświetlenia strukturalnego, użyj kanału DAPI, aby zlokalizować ROI przy małym powiększeniu.
  2. Używając obiektywu 40x (tj. oleju NA 1.4), zlokalizuj komórkę IBA1 + / TMEM119 + wewnątrz ROI. Podczas obrazowania na żywo poruszaj się w osi Z. Gdy tylko sygnał losowo wybranego mikrogleju zniknie, ustaw ten poziom Z jako początek stosu Z. Poruszaj się wzdłuż osi Z w przeciwnym kierunku, aż sygnał mikrogleju zniknie i ustaw ten punkt jako koniec stosu Z.
    UWAGA: Rysunek 2A−C pokazuje obrazy mikrogleju IBA1+/TMEM119+.
  3. Utwórz stos Z we wszystkich trzech kanałach (DAPI, 488, 568) przy użyciu interwału Z 0,33 μm i rozmiaru piksela 0,15 μm/piksel. Dodaj informacje o skali do pliku.
    UWAGA: Zalecany interwał Z zależy od zdolności rozdzielczej obiektywu (np. dla obiektywu 40x, takiego jak olej NA 1,4, wynosi on 0,33 μm). Do analizy morfologicznej zaleca się posiadanie co najmniej 20 komórek na zwierzę, przy czym co najmniej pięć zwierząt na warunki doświadczalne.
  4. Zapisz plik jako plik TIFF.

4. Analiza gęstości i rozkładu

  1. Otwórz FIJI/ImageJ z zainstalowaną wtyczką najbliższej odległości sąsiada (NND). Otwórz plik 20x image.
    UWAGA: Użyj wyszukiwarki ze słowem kluczowym "Obliczanie odległości najbliższego sąsiada za pomocą ImageJ", aby znaleźć instrukcję instalacji. Autorem wtyczki jest Yuxiong Mao.
  2. Aby ręcznie ustawić skalę na podstawie skali odciśniętej na obrazie, wybierz narzędzie linii prostej (Rysunek 3E), umieść kursor na krawędzi skali i trzymając Shift narysuj linię jak najbardziej zbliżoną do skali na obrazie (Rysunek 3I), wybierz Analizuj | Ustaw skalę, a następnie wprowadź poprawne informacje (Rysunek 3J).
    UWAGA: Skala może być czasami zawarta w metadanych pliku i ustawiana automatycznie.
  3. Wybierz punkt menu Obraz | Kolor | Utwórz kompozyt, aby utworzyć obraz kompozytowy wszystkich kanałów.
    UWAGA: Podczas akwizycji obrazu FIJI/ImageJ automatycznie utworzy kompozyt w formacie RGB.
  4. Na pasku menu wybierz pozycję Analizuj | Ustaw wymiary. Sprawdź obszar, środek ciężkości i obwód. Na zakładce Przekieruj do kliknij i wybierz otwarty plik (Rysunek 3K).
  5. Przejdź do obrazu | Kolor | Kanał, aby otworzyć narzędzie kanału.
    UWAGA: To menu pozwoli na wyłączenie określonego koloru. Kanał DAPI może być przydatny do identyfikacji ROI i potwierdzania komórek. Można go wyłączyć, aby ułatwić liczenie.
  6. Narysuj przybliżony obwód ROI za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego (Rysunek 3D).
  7. Włącz narzędzie pędzla zaznaczania, klikając dwukrotnie owalne narzędzie na pasku narzędzi i upewnij się, że pole Włącz pędzel wyboru jest zaznaczone (Rysunek 3G). To narzędzie posłuży do dokładniejszego określenia zwrotu z inwestycji. Wybierz odpowiedni rozmiar pędzla w zakresie 200−400.
  8. Za pomocą pędzla wyboru dostosuj obwód, aby jak najlepiej pasował do ROI. Naciśnij T na klawiaturze, aby dodać do menedżera ROI ( Rysunek 3L).
  9. Wybierz pozycję Analizuj | Zmierz lub naciśnij M, a pojawi się okno wyników. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza danych, a następnie zapisz informacje dotyczące obszaru (tj. obszaru ROI; Rysunek 3R).
  10. Po skopiowaniu obszaru ROI usuń informacje z okna wyników, klikając na niego i naciskając Backspace.
  11. Przejdź do okna menedżera ROI (Rysunek 3L), kliknij prawym przyciskiem myszy ślad ROI, zmień nazwę tak, aby pasowała do nazwy obrazu, a następnie zapisz.
  12. Kliknij dwukrotnie narzędzie pędzla na pasku narzędzi. Wybierz kolor i rozmiar pędzla 10. Upewnij się, że opcja Malowanie nakładki jest odznaczona (Rysunek 3H).
  13. W kanale TMEM119 ostrożnie umieść czarną kropkę na środku somy dla każdego TMEM119+ mikrogleju. Umieść białą kropkę na środku komórek, które nie są dodatnie dla TMEM119 (aby zaznaczyć naciekające makrofagi). Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich komórek zawartych w ROI.
    UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie kropki (i biała) znajdowały się w tym samym kanale. Tożsamość kanału można zweryfikować (czerwony, niebieski lub zielony), patrząc na kolor etykiet okna obrazu.
  14. Wybierz punkt menu Obraz | Kolor | Podzielony kanał. Pojawi się okno dla każdego kanału. Następnie zidentyfikuj kanał, który ma adnotacje kropkowe i zamknij pozostałe dwa okna.
  15. Przekieruj nowy obraz podzielonego kanału. Przejdź do punktu Analiza | Ustaw wymiary. Na karcie Przekieruj do kliknij i wybierz obraz podzielonego kanału (Rysunek 3K).
  16. Wybierz punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy. Przejdź do obrazu | Dostosuj i wybierz Próg (Rysunek 3O). Aby dostosować próg, przesuń przycisk drugiego paska maksymalnie w lewo (wartość progowa = 0) w obu paskach.
    UWAGA: Spowoduje to, że na obrazie pozostaną tylko czarne kropki, które będą białe.
  17. Wybierz ROI w oknie Menedżer ROI. Wybierz pozycję Analizuj | Analizuj cząstkę (Rysunek 3N). W polu Rozmiar (calˆ2): wpisz 1−20. Pozostaw jednostkę pikseli niezaznaczoną, zaznacz opcję Wyświetl, podsumuj i dodaj do menedżera, a następnie naciśnij OK. Pojawi się okno podsumowania z liczbą punktów (Rysunek 3P). Skopiuj informacje i wklej je do arkusza danych.
  18. Wybierz Wtyczki | NND. Pojawi się okno NND (Rysunek 3Q). Skopiuj/wklej wszystkie informacje do arkusza danych. Każda liczba reprezentuje odległość, jaką każdy mikroglej ma do najbliższego sąsiedniego mikrogleju.
  19. Wróć do okna progu i przesuń pierwszy pasek maksymalnie w prawo (wartość progowa = 255 w obu słupkach), co spowoduje wyświetlenie wszystkich białych kropek, które staną się białe (Rysunek 3M).
  20. Wybierz pozycję Analizuj | Analizuj cząstkę. Pojawi się okno podsumowania, które podaje liczbę punktów (Rysunek 3P). Skopiuj informacje i wklej je do arkusza danych.
  21. Przejdź do menedżera ROI, zaznacz wszystkie punkty, kliknij prawym przyciskiem myszy i zapisz z nazwą obrazu. Umożliwi to zapisanie wszystkich punktów w pliku zip (Rysunek 3L). Wybierz punkt menu Plik | Zapisz jako i zapisz plik o nazwie umożliwiającej identyfikację analizowanego obrazu.
  22. Uzyskaj gęstość mikrogleju (dla każdego obrazu), dzieląc liczbę podwójnie dodatnich komórek IBA1+/TMEM119+ przez obszar ROI.
    UWAGA: Wartości dla każdego zdjęcia można uśrednić dla każdego zwierzęcia. Dane można następnie przedstawić jako błąd średni ± błąd standardowy średniej (SEM) wszystkich zwierząt.
  23. Określ NND, uzyskując średnią na obraz wartości NND wszystkich komórek TMEM119+.
    UWAGA: Dane można następnie przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt.
  24. Oblicz wskaźnik odstępu za pomocą wzoru: NND2 x gęstość.
    UWAGA: Dane można następnie przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt. Jednostki tego pomiaru będą jednostkami dowolnymi.
  25. Ilościowe określenie klastrów mikrogleju poprzez identyfikację komórek, które mają NND poniżej 12 μm.
    UWAGA: Tutaj wybiera się 12 μm, ponieważ jest to przybliżona odległość między dwiema bezpośrednio zestawionymi komórkami mikrogleju stykającymi się ze sobą za pomocą arboryzacji. Jeśli istnieją więcej niż trzy mikrogleje, które spełniają ten warunek, wróć do obrazu i sprawdź, czy te komórki są częścią jednego, czy wielu klastrów.
  26. Po potwierdzeniu liczby klastrów wpisz liczbę klastrów w arkuszu danych.
    UWAGA: Liczbę klastrów można podzielić przez obszar ROI, aby uzyskać gęstość komórek/mm2 dla każdego zwierzęcia. Dane można następnie przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt.
  27. Aby określić procent nacieku obwodowych komórek szpikowych, oblicz % komórek IBA1+/TMEM119- w stosunku do całkowitej liczby komórek szpikowych (TMEM119+/IBA1+ + TMEM119-/IBA1+) dla każdego zwierzęcia.
    UWAGA: Dane można następnie przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt.

5. Analiza morfologiczna

  1. Otwórz plik FIJI/ImageJ.
  2. Otwórz obraz 40x za pomocą obrazu J lub FIJI. Wybierz Pojawi się wyskakujące okienko z pytaniem, czy obrazy powinny być otwierane w stosie. Kliknij przycisk OK. Następnie wybierz Obraz | Stosy | Z, aby otworzyć okno Projekcja Z. Uwzględnij wszystkie plasterki, od pierwszego do ostatniego plasterka. Upewnij się, że w obszarze Typ projekcji wybrano opcję Maksymalna intensywność, a następnie kliknij przycisk OK
  3. Kliknij nowe okno z projektem Z. Wybierz punkt menu Obraz | Zabarwienie | Podziel kanały. Wykonaj ślady na obrazach kanału IBA1.
    UWAGA: Pozostałe kanały (TMEM119 i DAPI) mogą być otwarte i konsultowane w razie potrzeby podczas analizy morfologii mikrogleju.
  4. Na pasku menu wybierz pozycję Analizuj | Ustaw wymiary. Sprawdź obszar, środek ciężkości i obwód. Na zakładce Przekieruj do wybierz otwarty plik (Rysunek 3K).
  5. Ustaw skalę zgodnie z opisem w krokach 4.2.
  6. Aby zmierzyć rozmiar somy w kanale IBA1, narysuj przybliżony obwód somy za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego (Rysunek 3D).
  7. Włącz narzędzie pędzla zaznaczania, klikając dwukrotnie narzędzie owalne na pasku narzędzi, a następnie zaznaczając pole Włącz pole pędzla wyboru (Rysunek 3G). Wybierz rozmiar pędzla wyboru między 10−20 (Rysunek 3B).
  8. Za pomocą pędzla zaznaczającego dostosuj ślad, aby jak najlepiej pasował do somy. Powiększenie umożliwi precyzję podczas tego kroku (Rysunek 2I).
  9. Naciśnij T, aby dodać ślad somy do menedżera ROI ( Rysunek 3L).
  10. Wybierz pozycję Analizuj | Zmierz lub naciśnij M. Pojawi się okno wyników. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza danych (Rysunek 3R).
  11. Aby zapisać informacje dotyczące obszaru soma, przejdź do okna menedżera ROI, kliknij prawym przyciskiem myszy ROI, zmień nazwę tak, aby była zgodna z nazwą obrazu, określ, że ślad jest dla somy, a następnie zapisz plik.
  12. Aby zmierzyć obszar arboryzacji w kanale IBA1, kliknij na koniec procesu mikroglejowego za pomocą narzędzia do wyboru wielokątów, co rozpocznie kształt wielokąta (Rysunek 3C).
  13. Podążając za wskazówkami procesów mikrogleju, omijaj mikroglej, klikając na końce każdego końca procesu, aby utworzyć wielokąt, który najlepiej reprezentuje obszar pokryty arboryzacją mikrogleju (Rysunek 2D−H).
    UWAGA: Upewnij się, że wielokąt łączy wszystkie kończyny procesu mikrogleju. Linie tworzące wielokąt nigdy nie powinny się przecinać. Klikając wokół końcówki procesu mikrogleju, należy uważać, aby nie odciąć żadnej części procesu. Czasami przydatne jest dodanie dodatkowych punktów, aby obejść proces. Liczba punktów tworzących wielokąt nie jest bezpośrednio związana z liczbą wyrostków dystalnych, a zatem nie ma znaczenia dla badania.
  14. Aby zamknąć wielokąt, kliknij punkt początkowy wielokąta.
  15. Naciśnij T, aby dodać ślad do menedżera ROI ( Rysunek 3L). Wybierz pozycję Analizuj | Zmierz lub naciśnij M. Pojawi się okno wyników. Skopiuj i wklej wyniki do arkusza danych (Rysunek 3R).
  16. Aby zapisać informacje dotyczące obszaru arboryzacji, przejdź do okna menedżera ROI, kliknij prawym przyciskiem myszy ROI, zmień nazwę tak, aby pasowała do nazwy obrazu, określ arboryzację, a następnie zapisz plik.
  17. Określ obszar somy, uśredniając wszystkie obszary somy dla każdego zwierzęcia.
    UWAGA: Dane można przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt.
  18. Określ obszar arboryzacji, uśredniając wszystkie obszary arboryzacji dla każdego zwierzęcia.
    UWAGA: Dane można przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt.
  19. Obliczyć wskaźnik morfologii, korzystając ze wzoru obszar somy/obszar arboryzacji dla każdej komórki mikrogleju i średnią na zwierzę.
    UWAGA: Dane można przedstawić jako średnią ± SEM wszystkich zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje jednoczesne znakowanie mikrogleju za pomocą IBA1 i TMEM119 w koronalnym odcinku grzbietowego hipokampa zobrazowanym 20x za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Udane barwienie ujawnia ciała komórek mikrogleju i ich drobne procesy (Ryc. 1A−C). Barwienie to pozwala na określenie gęstości i rozmieszczenia mikrogleju oraz identyfikację klastrów mikrogleju (Rysunek 1I) ora...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten można podzielić na dwie krytyczne części: jakość barwienia i analizę. Jeśli barwienie nie jest optymalne, nie będzie w stanie odpowiednio reprezentować komórek mikrogleju, wpływając w ten sposób na pomiary gęstości, rozmieszczenia i morfologii. Ponadto odsetek naciekających obwodowych komórek szpikowych może być niedoszacowany. Jest to zoptymalizowana wersja protokołu barwienia, ale istnieje kilka czynników, które mogą skutkować nieoptymalnymi obrazami. Nawet jeśli perfuzja zwierzęcia nie jest uwzględniona w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Nathalie Vernoux za jej wskazówki i pomoc w eksperymentach. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Emmanuelowi Planelowi i Serge'owi Rivestowi za użycie ich mikroskopów fluorescencyjnych i konfokalnych. Praca ta została częściowo sfinansowana ze stypendiów Meksykańskiej Rady Nauki i Technologii (CONACYT; dla F.G.I.), Fondation Famille-Choquette i Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; dla K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (dla M.B.) i Shastri Indo-Canadian Institute (dla K.B.), a także z grantu Discovery od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) dla M.E.T. M.E.T. posiada kanadyjską Kierownik Katedry Badawczej (Poziom II) Plastyczności Neuroimmunologicznej w Zdrowiu i Terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 osioł anty-myszyInvitrogen/ThermofisherA21202
Alexa Fluor 568 koza anty-królikInvitrogen/ThermofisherA11011
Biolite 24 Well wielodaniowyThermo Fisher930186
Albumina surowicy bydlęcejEMD Millipore Corporation2930
Kwas cytrynowySigma-AldrichC0759-500G
DAPI Bejca kwasem nuceleinowymInvitrogen/ThermofisherMP 01306
Fine BrushArt store
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnychSigma-AldrichG7765
Szkło nakrywkowe mikroskopuFisher Scientific1254418
Mikroszkiełka dodatnio naładowaneVWR48311-703
Mysz monoklonalna Anti-IBA1MilliporeMABN92
Na2H2PO4· H2OBioShop Canada Inc.SPM306, SPM400
Na2HPO4BioShop Canada Inc.SPD307, SPD600
NaBH4Sigma-Aldrich480886
NaClFisher ScientificS642500
Normalna surowica osła (NDS)Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.017-000-121
Normalna surowica kozia (NGS)Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.005-000-121
Parafilm-MParafilmPM-999
Królik monoklonalny anty-TMEM119Abcamab209064
Wanna z wzajemnym wytrząsaniem model 25Precyzyjna
TRS002/TRS004
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
pipeta do transferu naukowego Chlorowodorek buforu Tris BioShop Canada Inc.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359(2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915(2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.

The name was corrected from:

Maude Bordelau

to:

Maude Bordeleau

Tagi

Analiza g sto ci mikroglejumarker TMEM119marker IBA1mikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnaanaliza w programie ImageJtkanka m zgu myszyledzenie morfologii kom rek

Powiązane artykuły