Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
To jest protokół do podwójnej wizualizacji mikrogleju i infiltracji makrofagów w tkance mózgowej myszy. TMEM119 (która selektywnie znakuje mikroglej), w połączeniu z IBA1 (który zapewnia wyjątkową wizualizację ich morfologii), umożliwia badanie zmian w gęstości, rozmieszczeniu i morfologii. Kwantyfikacja tych parametrów jest ważna dla uzyskania wglądu w role odgrywane przez mikroglej, makrofagi rezydujące w mózgu. W normalnych warunkach fizjologicznych mikroglej jest regularnie rozmieszczony w wzór przypominający mozaikę i przedstawia małą somę z rozgałęzionymi procesami. Niemniej jednak, w odpowiedzi na czynniki środowiskowe (tj. uraz, infekcję, chorobę lub uraz), gęstość, rozmieszczenie i morfologia mikrogleju są zmieniane na różne sposoby, w zależności od zniewagi. Dodatkowo opisana metoda podwójnego barwienia pozwala na wizualizację naciekających makrofagów w mózgu na podstawie ich ekspresji IBA1 i bez kolokalizacji z TMEM119. Podejście to pozwala zatem na rozróżnienie między mikroglejem a infiltrującymi makrofagami, co jest niezbędne do uzyskania funkcjonalnego wglądu w ich wyraźny udział w homeostazie mózgu w różnych kontekstach zdrowia i choroby. Protokół ten integruje najnowsze odkrycia w dziedzinie neuroimmunologii, które odnoszą się do identyfikacji markerów selektywnych. Służy również jako użyteczne narzędzie zarówno dla doświadczonych neuroimmunologów, jak i badaczy dążących do zintegrowania neuroimmunologii z projektami.
Wprowadzenie
Czy to ostre, czy przewlekłe, zapalenie nerwów jest ściśle uzależnione od mikrogleju, makrofagów rezydujących w mózgu. Wizualizacja mikrogleju za pomocą barwienia immunologicznego jest cenna dla badania zapalenia nerwów przy użyciu mikroskopii świetlnej, która jest bardzo dostępną techniką. W warunkach homeostatycznych mikroglej jest zwykle rozmieszczony w nienakładającym się na siebie, przypominającym mozaikę wzorze. Wykazują małe somy, które rozszerzają rozgałęzione procesy1, które czasami kontaktują się ze sobą2. Rozgałęzione procesy mikrogleju dynamicznie badają miąższ mózgu, wchodząc w interakcje z neuronami, innymi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnych Komisji Etyki Zwierząt, zgodnie z Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami oraz Komisją ds. Opieki nad Zwierzętami Université Laval.
1. Barwienie immunologiczne
- Wybierz trzy sekcje mózgu myszy zawierające obszar zainteresowania (ROI) (tj. hipokamp) za pomocą atlasu mózgu. Umieścić skrawki na plastikowej płytce wielodołkowej i przykryć je 350 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (Tabela 1).
UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, mózgi należy przetoczyć perfuzją 4% paraformaldehydu i przyciąć do....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia podwójne znakowanie mikrogleju przy użyciu IBA1 i TMEM119 w przekroju czołowym grzbietowej części hipokampa, obrazowanym przy 20-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Prawidłowe barwienie ujawnia ciała komórek mikrogleju oraz ich cienkie wypustki (Rysunek 1A−C). Barwienie to pozwala na określenie gęstości i rozmieszczenia mikrogleju oraz identyfikację skupisk mikroglej.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten można podzielić na dwie krytyczne części: jakość barwienia i analizę. Jeśli barwienie nie jest optymalne, nie będzie w stanie odpowiednio reprezentować komórek mikrogleju, wpływając w ten sposób na pomiary gęstości, rozmieszczenia i morfologii. Ponadto odsetek naciekających obwodowych komórek szpikowych może być niedoszacowany. Jest to zoptymalizowana wersja protokołu barwienia, ale istnieje kilka czynników, które mogą skutkować nieoptymalnymi obrazami. Nawet jeśli perfuzja zwierzęcia nie jest uwzględniona w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Nathalie Vernoux za jej wskazówki i pomoc w eksperymentach. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Emmanuelowi Planelowi i Serge'owi Rivestowi za użycie ich mikroskopów fluorescencyjnych i konfokalnych. Praca ta została częściowo sfinansowana ze stypendiów Meksykańskiej Rady Nauki i Technologii (CONACYT; dla F.G.I.), Fondation Famille-Choquette i Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; dla K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (dla M.B.) i Shastri Indo-Canadian Institute (dla K.B.), a także z grantu Discovery od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) dla M.E.T. M.E.T. posiada kanadyjską Kierownik ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 osioł anty-myszy | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 koza anty-królik | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well wielodaniowy | Thermo Fisher | 930186 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Kwas cytrynowy | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Bejca kwasem nuceleinowym | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Szkło nakrywkowe mikroskopu | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Mikroszkiełka dodatnio naładowane | VWR | 48311-703 | |
| Mysz monoklonalna Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4· H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normalna surowica osła (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normalna surowica kozia (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Królik monoklonalny anty-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Wanna z wzajemnym wytrząsaniem model 25 | Precyzyjna | ||
| TRS002/TRS004 | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
Bibliografia
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
