Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie transkryptów RNA białka antysensownego (ASP) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) u pacjentów za pomocą RT-PCR swoistego dla nici

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60511

⸱

27 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Spinki i pętle RNA mogą funkcjonować jako startery do odwrotnej transkrypcji (RT) w przypadku braku starterów specyficznych dla sekwencji, zakłócając badanie nakładających się na siebie transkryptów antysensownych. Opracowaliśmy technikę zdolną do identyfikacji swoistego dla nici RNA i wykorzystaliśmy ją do badania białka antysensownego HIV-1 ASP.

Streszczenie

W retrowirusach transkrypcja antysensowna została opisana zarówno u ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), jak i u ludzkiego wirusa T-limfotropowego 1 (HTLV-1). W HIV-1 gen antysensownego białka ASP znajduje się na ujemnej nici env, w ramce odczytu -2, obejmującej złącze gp120 / gp41. W orientacji zmysłowej koniec 3' otwartej ramki odczytu ASP nakłada się na hiperzmienne regiony gp120 V4 i V5. Badania nad RNA ASP zostały udaremnione przez zjawisko znane jako samozasysanie RT, w którym struktury drugorzędowe RNA mają zdolność do inicjowania RT przy braku specyficznego startera, generując niespecyficzne cDNA. Połączone zastosowanie wysokiej denaturacji RNA z biotynylowanymi starterami odwrotnymi w reakcji RT, wraz z oczyszczaniem powinowactwa cDNA do kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną, pozwoliło nam na selektywną amplifikację RNA ASP w limfocytach T CD4 + pochodzących od osób zakażonych HIV-1. Nasza metoda jest stosunkowo tania, prosta do wykonania, wysoce niezawodna i łatwa do odtworzenia. Pod tym względem stanowi potężne narzędzie do badania transkrypcji antysensownej nie tylko w HIV-1, ale także w innych układach biologicznych.

Wprowadzenie

Gen białka antysensownego (ASP) jest otwartą ramką odczytu (ORF) umieszczoną na ujemnej nici genu otoczki (env) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), obejmującą skrzyżowanie gp120/gp411. W ciągu ostatnich 30 lat kilka raportów wykazało, że gen ASP HIV jest rzeczywiście transkrybowany i tłumaczony2,3,4,5,6,7,8,9. Chociaż transkrypty antysensowne ASP zostały w pełni scharakteryzowane in vitro, do niedawna nadal brakowało informacji na temat faktycznej produkcji RNA ASP u pacjentów.

Sekwencja ASP jest odwrotna i komplementarna do env. Stanowi to główną przeszkodę przy próbie wykrycia transkryptów dla ASP. Standardowe metody reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) wykorzystują specyficzne dla genu startery antysensowne do syntezy komplementarnych DNA (cDNA) o odpowiedniej polarności. Takie podejście nie pozwala jednak na określenie orientacji (sensu lub antysensu) początkowej matrycy RNA, ponieważ spinki do włosów lub pętle RNA mogą zagruntować RT w obu kierunkach przy braku starterów10, zjawisko znane jako samozasysanie RT. Większość badaczy ASP omija problem samozasysania RT za pomocą starterów oznaczonych sekwencjami, które nie są związane z HIV-111,12. Strategia ta nie eliminuje jednak występowania tego zjawiska i może prowadzić do potencjalnego przeniesienia nieswoistych cDNA do klasy PCR11.

Niedawno opracowaliśmy nowatorski test RT-PCR specyficzny dla nici do badania antysensownego RNA i użyliśmy go do wykrywania RNA ASP w kohorcie sześciu pacjentów zakażonych wirusem HIV, jak pokazano w Tabeli 1. Opisana poniżej procedura została wcześniej opublikowana przez Antonio Mancarella et al.13. W naszym protokole unikamy produkcji niespecyficznych cDNA poprzez podwójne podejście. Po pierwsze, eliminujemy drugorzędowe struktury RNA poprzez denaturację RNA w wysokiej temperaturze (94 °C), a po drugie, odwracamy transkrypcję RNA ASP za pomocą biotynylowanego startera specyficznego dla ASP i oczyszczamy powstałe cDNA pod względem powinowactwa. Dzięki takiemu podejściu jesteśmy w stanie amplifikować tylko nasze docelowe cDNA, ponieważ inne niespecyficzne produkty RT są albo zapobiegane przed generowaniem (denaturacja RNA w wysokiej temperaturze), albo eliminowane przed PCR (oczyszczanie powinowactwa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

1. Zakażenie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) szczepemHIV-1 HXB2

  1. Dzień 1: STYMULACJA PBMC
    1. Odizoluj PBMC od zdrowej kożuchy dawcy.
    2. Policz i ponownie zawieś PBMC w stężeniu 1x106/ml w kompletnym pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (R-10), z dodatkiem 50 U/ml interleukiny-2 (IL-2) i 3 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA).
    3. Pipetować w górę i w dół i podzielić komórki na dwie sześciodołkowe płytki (3 ml zawiesiny komórek/dołka).
    4. Inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Dzień 3: ZAKAŻENIE PBMC
    UWAGA: Użyj jednej z dwóch płytek, jak w kroku 1.1.3, jako kontroli ujemnej (nie infekuj tych komórek).
    UWAGA: Całą procedurę należy wykonać w laboratorium o III poziomie bezpieczeństwa biologicznego (P3).
    1. Zebrać PBMC z jednej płytki do probówki sokoła o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 10 minut.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2,2 ml R-10 zawierającym 20 U/ml IL-2 i 2 μg/ml polibrenu.
    3. Rozmrozić fiolki zawierające wirusaHIV-1 HXB2 i dodać 1,8 ml zawiesiny wirusa (0,376 ng/μl) do komórek.
    4. Inkubować komórki przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, delikatnie obracając probówkę co 30 minut.
    5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut.
    6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w dawce 1x106/ml w R-10 zawierającym IL-2 (50 U/ml).
    7. Przenieść zawiesinę komórkową na 24-dołkową płytkę o stężeniu 1 ml/basenik i inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    8. Zbierz 1 dołek każdego dnia i przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 ml (oznaczonej dniem infekcji).
      UWAGA: Przed odwirowaniem przenieść 150 μl zawiesiny komórkowej do probówki cytometrii przepływowej w celu kontroli jakości infekcji PBMC (patrz krok 1.3)
    9. Odwirować probówki o sile 400 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
    10. Zamrażać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  3. Zakażenie PBMC: kontrola jakości
    1. Na każdy dzień infekcji należy pobrać 150 μl zakażonych PBMC i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.
    2. Dodać 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
    3. Odrzucić sklarowany osad i dodać 50 μl PBS zawierającego 1 μl żywego/martwego barwnika Aqua (uprzednio rozcieńczonego w stosunku 1:10 z PBS).
    4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    5. Dodać 1 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    6. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego/przepuszczalnego i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    7. Dodać 1 ml 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania (10x roztwór podstawowy zawierający zarówno FBS, jak i saponinę, rozcieńczony w stosunku 1:10) i odwirować przy 400 x g przez 5 min.
    8. Odrzucić supernatant i dodać 50 μl PBS zawierającego przeciwciało sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) HIV Gag p24 (rozcieńczone w stosunku 1:10).
    9. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    10. Dodać 1 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    11. Dodać 150 μl x CellFIX (10x roztwór podstawowy zawierający 10% formaldehydu, 3,55% metanolu, 0,93% azydku sodu rozcieńczony w stosunku 1:10) i przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej.

2. Stymulacja ludzkich limfocytów T CD4+ przeciwciałami anty-CD3/CD28

  1. Wyizoluj limfocyty T CD4 + z PBMC zarówno pacjentów zakażonych wirusem HIV-1, jak i zdrowych dawców.
  2. Przygotować mieszaninę ludzkich przeciwciał anty-CD3/CD28, rozcieńczając anty-CD3 (1:100) i anty-CD28 (1:50) w PBS.
  3. Pokryć 48-dołkową płytkę, dodając 200 μl mieszaniny przeciwciał na basenik do odpowiedniej liczby dołków i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  4. Odessać roztwór przeciwciała i dodać 1 ml limfocytów T CD4 + w proporcji 1x106 / ml do studzienek pokrytych przeciwciałem anty-CD3 / CD28.
    UWAGA: Stymuluj limfocyty T CD4 + do 5 dni.

3. Odwrotna transkrypcja

UWAGA: Aby uzyskać startery specyficzne dla pacjenta, prowirusowe DNA wyizolowane z limfocytów T CD4+ od każdego pacjenta zostało amplifikowane za pomocą starterów HIV-1HXB2 Pan ASP. Startery specyficzne dla pacjenta zostały zaprojektowane przy użyciu sekwencji prowirusowej wewnętrznej dla starterów Pan ASP. Wszystkie startery i sondy użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 2.

  1. Izolowanie całkowitego RNA z komórek
    1. Określ ilościowo RNA i wyeliminuj zanieczyszczenie DNA, traktując próbki DNazą.
    2. Przeprowadzić reakcje RT w objętości 50 μl. Przenieść 0,1-1 μg całkowitego RNA do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki PCR. Przygotować mieszaninę RNA, dodając do RNA następujące składniki:
      5 μl biotynylowanego startera odwróconego ASP (20 μM)
      2,5 μl trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM)
      25 μl wody destylowanej (dH2O) uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC).
      Przygotować endogenne kontrole RT, dodając 5 μl wody wolnej od nukleaz w miejsce biotynylowanego startera odwrotnego ASP.
    3. Umieścić 96-dołkową płytkę PCR w termocyklerze i podgrzewać mieszaninę RNA do 94 °C przez 5 minut.
    4. Mieszaninę RNA należy natychmiast schłodzić w lodowatej wodzie przez co najmniej 1 minutę.
    5. Przygotować mieszaninę reakcyjną, dodając następujące składniki do probówki o pojemności 1,5 ml (obliczyć całkowitą liczbę próbek plus 1):
      10 μL 5x bufor RT
      2,5 μl z 0,1 M 1,4-ditiotreitolu (DTT)
      2,5 μl RNazy (40 jednostek/μL)
      2,5 μl enzymu RT (200 jednostek/μl)
    6. Przenieść 17,5 μl tej mieszaniny do każdej z studzienek zawierających RNA. Przygotuj kontrole RT-minus, zastępując odwrotną transkryptazę 2,5 μl wody wolnej od nukleaz
      7. .
    7. Delikatnie wymieszać i inkubować płytkę w temperaturze 55 °C przez 60 minut za pomocą termocyklera.
    8. Dezaktywować reakcje przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 15 min.

4. Oczyszczanie powinowactwa biotynylowanego cDNA ASP

UWAGA: Nie oczyszczaj reakcji RT-minus.

  1. Przygotować 1 l 2x buforu płuczącego/wiążącego zawierającego 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 2 M NaCl. Przefiltruj roztwór.
    1. Przygotuj 50 ml 1x buforu do mycia/wiązania przy użyciu wody klasy PCR.
    2. Do każdej reakcji użyj 10 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną. W zależności od liczby reakcji przenieś odpowiednią objętość kulek do probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Umyj koraliki, dodając równą objętość 2x bufora do prania/wiązania i wiruj przez 15 s.
    4. Umieść probówkę w magnetycznym stojaku separacyjnym i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania kulek i dodać taką samą objętość bufora do mycia/wiązania 2x, jak początkowa objętość kulek.
    6. Wirować przez 30 s i przenieść 10 μl zawiesiny kulek do odpowiedniej liczby probówek o pojemności 1,5 ml.
    7. Umieść probówki w stojaku do separacji magnetycznej i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    8. Odrzucić sklarowany osad i dodać 50 μl roztworu do przemywania/wiązania 2x buforu.
    9. Dodaj 50 μl biotynylowanego cDNA do odpowiednich probówek zawierających kulki.
    10. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie obracając.
    11. Oddzielić kulki od supernatantu za pomocą magnetycznego stojaka do separacji na 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    12. Umyj kulki, dodając 200 μL 1x buforu do prania/wiązania. Umieść probówki w stojaku do separacji magnesów na 3 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant. Powtórz dwa razy.
    13. Ponownie zawiesić kulki w 10 μl wody klasy PCR.

5. Standardowy PCR

UWAGA: Celem standardowego PCR jest amplifikacja całego genu ORF ASP. Produkty amplifikacji są następnie klonowane do plazmidu pCR2.1 w celu opracowania standardowych krzywych do kwantyfikacji RNA ASP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (patrz paragraf Real Time PCR).

  1. Wykonać wzorcowe PCR w całkowitej objętości 50 μl. Przygotować odpowiednią objętość głównej mieszanki PCR (liczba próbek plus 1). Do każdej próbki dodaj następujące składniki do probówki o pojemności 1,5 ml:
    1 μl starterów 10 μM ASP (do przodu i do tyłu)
    1 μl 10 mM dNTPs
    Chlorek magnezu (MgCl2) (stężenie zależy od zastosowanych starterów)
    dH2O do końcowej objętości 49 μL
    1. Dobrze wymieszaj, szybko odwiruj zawartość i przenieś 49 μl/basenik głównej mieszanki PCR na 96-dołkową płytkę PCR.
    2. Ostrożnie wiruj probówki zawierające kulki używane do oczyszczania powinowactwa cDNA ASP przez 15 s.
    3. Dodaj 1 μl kulek do odpowiednich dołków i uruchom PCR za pomocą następującego programu: 95 °C przez 2 min, 40 cykli 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 40 s, a następnie 68 °C przez 7 min.
    4. Rozdzielić produkty PCR na 1 % żelu agarozowym, odciąć prążki i sklonować amplifikowane produkty do plazmidu pCR2.1.
    5. Sekwencjonuj i analizuj sekwencje każdego klonu.

6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

UWAGA: Opracuj startery i sondy dostosowane do potrzeb pacjenta, korzystając z podejścia opisanego w kroku 3 "Odwrotna transkrypcja". W przypadku qPCR należy uwzględnić rozcieńczenia plazmidu ASP dla krzywych wzorcowych. Plazmidy zawierające wstawki specyficzne dla pacjenta są opracowywane, jak wspomniano w notatce na początku kroku 5 "Standardowy PCR".

  1. Przygotować krzywą wzorcową, używając seryjnych rozcieńczeń plazmidu ASP 1:10, zaczynając od 3 x 106 kopii/μl do 3 kopii/μl.
    1. Pierwsza runda PCR (przedwzmacniacz). Przeprowadzić reakcje w całkowitej objętości 25 μl. Przygotować odpowiednią objętość wzorcowej mieszaniny PCR (liczba próbek plus 1). Do każdej próbki dodaj następujące składniki do probówki o pojemności 1,5 ml:
      0,5 μl mieszanki gruntującej ASP lub env (końcowe stężenie 0,2 μM każdy) (do przodu i do tyłu)
      0,5 μL mieszanki dNTP (końcowe stężenie 0,2 mM każdy)
      MgCl2 (stężenie zależy od par starterów)
      dH2O do końcowej objętości 24 μL
    2. Przenieść 24 μl głównej mieszanki PCR do odpowiedniej liczby dołków na 96-dołkowej płytce PCR.
    3. Ostrożnie wiruj probówki zawierające kulki z cDNA przez 15 s.
    4. Dodaj 1 μl koralików do odpowiednich studzienek. Zrób to samo dla rozcieńczeń plazmidu.
    5. Przeprowadzić PCR przy użyciu następującego algorytmu: denaturacja przez 2 minuty w temperaturze 95 °C; 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 40 s w temperaturze 68 °C przez 18 cykli; przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 7 minut.
    6. Rozcieńczyć pierwszą rundę reakcji PCR w stosunku 1:5 wodą klasy PCR.
    7. Druga runda qPCR. Przeprowadzić reakcje w całkowitej objętości 20 μl. Przygotować odpowiednią objętość wzorcowej mieszaniny PCR (liczba próbek plus 1). Do każdej próbki dodaj następujące składniki do probówki o pojemności 1,5 ml:
      1,8 μL 10 μM startery (do przodu i do tyłu)
      1 μL sondy 5 μM
      6,2 μL dH2O
    8. Przenieść 19 μl głównej mieszanki qPCR do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki qPCR i dodać 1 μl rozcieńczonych reakcji PCR pierwszej rundy do odpowiednich studzienek. Zrób to samo dla rozcieńczeń plazmidu.
    9. Przeprowadzić qPCR z następującym algorytmem: denaturacja przez 10 minut w temperaturze 95 °C; 15 s w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C przez 40 cykli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Denaturacja RNA w wysokiej temperaturze połączona z oczyszczaniem powinowactwa biotynilowanego cDNA zapobiega amplifikacji nieswoistych produktów ASP podczas PCR w PBMC zainfekowanych in vitro oraz w limfocytach T CD4+ izolowanych od pacjentów. Wykazano, że podczas odwrotnej transkrypcji RNA antysensownego dochodzi do samoprimingu RT10,14,15,16,17. Ab...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym raporcie opisujemy test RT specyficzny dla nici stosowany do wykrywania RNA ASP w limfocytach T CD4 + wyizolowanych od osób zakażonych wirusem HIV-1. Występowanie niespecyficznego primingu podczas RT utrudnia wykrywanie transkryptów RNA o odpowiedniej polarności, co prowadzi do błędnej interpretacji wyników. Poprzednie grupy opracowały kilka strategii mających na celu zapobieganie niezależnej od starterów syntezie cDNA podczas reakcji RT. Znakowanie odwróconego startera na końcu 3' sekwencjami niezwiązanymi z HIV o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Patrizii Amelio, Alessandrze Noto, Craigowi Fenwickowi i Matthieu Perreau za to, że zawsze są dostępni, aby omówić naszą pracę oraz wszystkim ludziom z Laboratorium Immunopatogenezy AIDS za ich cenną pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Johnowi i Aaronowi Weddle'om z VSB Associated Inc., którzy przyczynili się do powstania doskonałej grafiki. Na koniec bardzo szczególne podziękowania dla wszystkich Pacjentów, bez których ta praca nie byłaby możliwa. Prace te nie otrzymały żadnej konkretnej dotacji od żadnej agencji finansującej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
zestaw dNTP (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptawidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Ludzka komórka T CD4+ Zestaw do izolacjiStemcell Technologies19052
Płodowa surowica bydlęcaBiowestS1010-500
Zestaw roztworu do utrwalania/przepuszczalnościBecton Dickinson554714
HIV Gag Przeciwciało cytometrii przepływowej p24 - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
Ludzka IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Lektyna z Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy żółtego barwienia martwych komórek, do wzbudzenia 405 nmInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Mysz anty-ludzka CD28Becton Dickinson55725
Mysz anty-ludzka CD3Becton Dickinson55329
Startery i sondyZintegrowane DNA Technologie (IDT)
Penicylina-StreptomycynaBioConcept4-01F00-H
Platynowa polimeraza DNA Taq High FidelityInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenuSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression MasterMix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific
Zestaw do klonowania TOPO TA do subklonowania, z One Shot TOP10 chemicznie kompetentnych komórek E. coliInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNaza (2 U/µ L)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786
Zestaw do sekwencjonowania cykli 4369016

Bibliografia

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74(2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71(2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38(2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221(2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Startery biotylowanedenaturacja RNAmagnetyczne kulki streptawidynowedetekcja RNA ASPlimfocyty T CD4zapobieganie niespecyficznemu cDNAanaliza qPCRelektroforeza w elu
Wykrywanie transkryptów RNA białka antysensownego (ASP) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) u pacjentów za pomocą RT-PCR swoistego dla nici
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.