Wizualizacja i kwantyfikacja danych z cytometrii wielowymiarowej przy użyciu Cytofast i metod grupowania FlowSOM i Cytosplore

Summary

Cytofast to narzędzie do wizualizacji używane do analizy wyników z grupowania. Cytofast może być używany do porównywania dwóch metod grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Cytofast może szybko wygenerować ilościowy i jakościowy przegląd danych z cytometrii masowej i podkreślić główne różnice między różnymi algorytmami grupowania.

Abstract

Złożoność danych generowanych przez cytometrię masową wymagała nowych narzędzi do szybkiej wizualizacji wyników analiz. Metody grupowania, takie jak Cytosplore lub FlowSOM, są wykorzystywane do wizualizacji i identyfikacji klastrów komórek. Na potrzeby dalszej analizy nowo opracowany pakiet języka R, Cytofast, może generować szybką wizualizację wyników z metod grupowania. Cytofast bierze pod uwagę charakterystykę fenotypową klastrów komórkowych, oblicza liczebność klastrów komórkowych, a następnie ilościowo porównuje grupy. Protokół ten wyjaśnia zastosowania Cytofast do wykorzystania danych z cytometrii masowej w oparciu o modulację układu odpornościowego w mikrośrodowisku guza (tj. odpowiedź komórek NK [NK]) po prowokacji guza, a następnie immunoterapii (blokada PD-L1). Pokazano przydatność Cytofast z FlowSOM i Cytosplore. Cytofast szybko generuje wizualne reprezentacje klastrów komórek odpornościowych związanych z grupą i korelacji ze składem układu odpornościowego. W analizie grupowania obserwuje się różnice, ale separacja między grupami jest widoczna przy obu metodach grupowania. Cytofast wizualnie pokazuje wzorce indukowane przez leczenie PD-L1, które obejmują większą obfitość aktywowanych podzbiorów komórek NK, wyrażających większą intensywność markerów aktywacji (tj. CD54 lub CD11c).

Introduction

Cytometria masowa (cytometria według czasu przelotu lub CyTOF) umożliwia wykrywanie szerokiego zakresu wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych biomarkerów w milionach pojedynczych komórek. Wielowymiarowy charakter danych z cytometrii masowej wymaga pewnych narzędzi analizy, takich jak techniki grupowania komórek, takie jak SPADE¹, FlowMaps², FlowSOM³, Phenograph⁴, VorteX⁵ i scaffold maps⁶. Ponadto opracowano różne techniki oparte na redukcji wymiarowości (tj. analiza głównych składowych [PCA]⁷, t-rozłożone stochastyczne osadzanie sąsiadów [t-SNE]⁸, hierarchiczne osadzanie stochastycznych sąsiadów [HSNE]⁹, jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości [UMAP]¹⁰ oraz mapy dyfuzji¹¹) w celu poprawy szybkości, interpretacji i wizualizacji wielowymiarowych zbiorów danych.

Dalsza analiza danych cytometrycznych o wysokim przepływie i masie często nie ma automatycznych procesów do przeprowadzania testów statystycznych dotyczących częstości występowania klastrów i powiązań z wynikami klinicznymi. Wcześniej opracowaliśmy przepływ pracy oparty na języku R, znany jako Cytofast¹², który pozwala na wizualne i ilościowe analizy technik grupowania za pomocą Cytosplore lub FlowSOM.

Opisany tutaj protokół wyjaśnia użycie Cytofast w R i pokazuje, jak generować ilościowe i jakościowe mapy cieplne i wykresy. Ponadto ułatwia określenie powiązań między obserwowanymi fenotypami immunologicznymi a wynikami klinicznymi. W raporcie opisano również analizę określonego zestawu danych cytometrii masowej przy użyciu dwóch różnych procedur grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Stosując Cytofast z obiema metodami grupowania, wykazano odpowiednio, że na fenotyp aktywacji komórek NK wpływa blokada immunologicznego punktu kontrolnego PD-L1.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach LUMC i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi LUMC dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach, zgodnie z wytycznymi komitetów holenderskich i europejskich.

UWAGA: Dla konfiguracji eksperymentalnej, myszy C57BL/6 zostały podskórnie zaszczepione na prawym skrzydle mysim guzem jelita grubego MC38 w stężeniu 0,3 x 10⁶ komórek/200 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Po 10 dniach, gdy guzy były wyczuwalne palpacyjnie, myszy leczono przeciwciałami blokującymi PD-L1 (klon MIH-5, 200 μg / mysz, wstrzyknięcie dootrzewnowe) lub leczono pozorowanie. Guzy wycięto 3 dni później po wstrzyknięciu PD-L1, przetworzono ex vivo i przeanalizowano za pomocą cytometrii masowej CyTOF przy użyciu 38 markerów¹³.

1. Sprzęt i oprogramowanie do analizy danych

UWAGA: Użyj komputera (Windows 7 lub nowszy) i procesora I5 o częstotliwości 2,4 GHz lub równoważnej, zainstalowanej pamięci RAM 6 GB i 10 GB wolnego miejsca na dysku twardym. Pakiet R Cytofast wykorzystuje istniejące funkcje: głównie flowCore, pheatmap i ggplot. Wiersze poleceń, które mają być wykonywane w R, są zawarte w protokole. Zasób instrukcji języka R można znaleźć pod adresem https://education.rstudio.com/.

1. Aby zainstalować pakiet Cytofast, uruchom R (wersja "3.6") i zainstaluj Bioconductor w wersji 3.9, wprowadzając następujący kod:
   
   if (!requireNamespace("BiocManager", cicho = PRAWDA))
   install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("cytofast")
2. Upewnij się, że pakiet został załadowany w żądanym środowisku, uruchamiając następujące polecenie:
   
   Biblioteka(Cytofast)

2. Tworzenie klastrów

UWAGA: Aby zaprezentować dwie metody grupowania Cytosplore i FlowSOM z Cytofast, analizowane są komórki NK (CD161⁺) w mikrośrodowisku guza 3 dni po leczeniu PD-L1.

1. Grupowanie wykonywane przez Cytosplore
   1. Po pobraniu i zainstalowaniu Cytosplore, hostowanego pod adresem , prześlij pliki .fcs (Pliki uzupełniające 1.1–1.8 [Pliki wejściowe Cytosplore]), klikając Plik | Otwórz plik(i) FCS w Cytosplore. Dodaj unikalny przykładowy tag jako kanał, klikając Dodaj unikalny przykładowy tag jako kanał po wyświetleniu monitu i wybierz kofaktor dla hiperbolicznej transformacji łuku (domyślnie 5).
   2. Wybierz opcję Uruchom H-SNE, uruchom poziom HSNE 3 i poczekaj na wygenerowanie mapy.
      UWAGA: Ten krok może zająć trochę czasu, w zależności od liczby analizowanych komórek i wybranego poziomu HSNE.
   3. Na pierwszym poziomie HSNE sprawdź komórki, które są dodatnie dla CD161. Zaznacz komórki CD161⁺ i kliknij prawym przyciskiem myszy opcję Powiększ zaznaczenie. Na drugim poziomie powtórz procedurę, aby dotrzeć do trzeciego poziomu z samymi zdarzeniami CD161⁺.
   4. Po wygenerowaniu ostatniej mapy tSNE zapisz klastry zdefiniowane przez Cytosplore, klikając prawym przyciskiem myszy mapę tSNE i wybierając polecenie Zapisz klastry. Wybierz katalog plików wyjściowych zgodnie z monitem Cytosplore i zanotuj tę lokalizację, ponieważ ten katalog będzie następnie używany do ładowania plików .fcs do R.
      UWAGA: Liczbę podzbiorów można zmienić ręcznie, zmieniając wartość sigma. Wartość sigma jest domyślnie ustawiona na 30; Jednak rzeczywista liczba podzbiorów zależy od danych wejściowych. W tym przypadku Cytosplore wykrył 10 różnych podzbiorów, z których każdy plik reprezentuje jeden podzbiór.
   5. Użyj prostej nazwy (tylko znaki) podczas zmiany nazw plików wyjściowych, co ułatwi identyfikację i dalszą obsługę. Zapisz pliki wyjściowe, wybierając pozycję Save.
      UWAGA: Po zapisaniu Cytosplore tworzy folder z plikami .fcs, przy czym każdy plik odpowiada zidentyfikowanym klastrom w Cytosplore. Następnym krokiem będzie załadowanie plików do R za pomocą Cytofast. W tym miejscu wygenerowane pliki wyjściowe są dostarczane w plikach uzupełniających 2.1–2.10 (pliki wyjściowe Cytosplore).
   6. Załaduj pliki wyjściowe wygenerowane przez Cytosplore do języka R za pomocą wyznaczonej funkcji: readCytosploreFCS.
      
      dirFCS <- "C:\\Użytkownicy\\nazwa_użytkownika\\Pulpit\\donauki"
      cfData <- readCytosploreFCS(dir = dirFCS, colNames = "opis")
   7. Wyczyść dane, usuwając niektóre parametry, takie jak "Czas" i "Tło". Sprawdź położenie kolumny w odniesieniu do jej niepotrzebnych parametrów i usuń ją z macierzy.
      
      colnames(cfData@expr)
      cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]
      
      UWAGA: Niepotrzebne kolumny można zobaczyć, odczytując nazwy kolumn wygenerowanej macierzy. Uruchamiając colnames(cfData@expr) jeszcze raz, upewnij się, że uzyskane są tylko żądane parametry.
   8. Zmień kolejność znaczników tak, aby znaczniki pochodzenia były wyświetlane jako pierwsze, a następnie znaczniki funkcjonalne.
      
      cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,
      29,40,5,30,33,11,34,14,19,
      32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,
      21,22,24,25,26,27,38,39)]
      
      UWAGA: Krok 2.1.8 jest opcjonalny.
   9. Połącz plik metadanych z danymi wygenerowanymi z Cytosplore, przesyłając metaplik arkusza kalkulacyjnego zawierający informacje kliniczne (plik uzupełniający 3).
      
      biblioteka(readxl)
      meta <- read_excel("C:\\Użytkownicy\\nazwa_użytkownika\\Pulpit\\sample_id.xlsx")
      cfData@samples <- data.frame(meta)
      
      UWAGA: Grupowanie wykonywane przez Cytosplore zostało zakończone. Alternatywną opcją grupowania dla Cytosplore jest FlowSOM i jest opisana w sekcji 2.2. Po wykonaniu jednego z dwóch kroków grupowania przejdź do kroku wizualizacji (sekcja 3).
2. Grupowanie wykonywane przez FlowSOM
   1. Najpierw zainstaluj FlowSOM w języku R, uruchamiając następujące polecenie:
      
      if (!requireNamespace("BiocManager", cicho = PRAWDA))
      install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install("FlowSOM")
      biblioteka (FlowSOM)
   2. Zainstaluj pakiet flowCore przy użyciu podobnej metody i załaduj go do środowiska, uruchamiając następujące polecenia:
      
      if (!requireNamespace("BiocManager", cicho = PRAWDA))
      install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install("flowCore")
      biblioteka (FlowSOM)
   3. Załaduj nieprzetworzone dane podane w plikach uzupełniających 4.1–4.8 (dane wejściowe FCS FlowSOM), które były wcześniej bramkowane na zdarzeniach CD161+, w języku R za pomocą funkcji read.flowSet.
      
      fcs_raw <- read.flowSet(path="C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", wzorzec = ".fcs", transformacja = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed=123)
   4. Wybierz odpowiednie markery biologiczne (usuń "Tło" lub "Czas"), wybierając odpowiednie kolumny i przekształć dane w sposób arcsinh5, jak pokazano w poniższym kodzie (tutaj usuń kolumny 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, które nie odpowiadają żadnemu markerowi biologicznemu). Zastosuj kofaktor 5, tak jak wcześniej zastosowano z Cytosplore, wybierając kofaktor = 5 w poniższej funkcji.
      
      fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, function(x, cofactor=5){
      colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc
      wyrażenie <- wyrażenia(x)
      wyrażenie <- Asinh(wyrażenie[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ kofaktor)
      wyrażenia(x) <-wyrażenie
      return(x)})
   5. Grupowanie danych za pomocą funkcji FlowSOM. Aby porównać FlowSOM i Cytosplore, wybierz grupowanie danych w dziesięciu podzbiorach jako dane wyjściowe wcześniej uzyskane przez Cytosplore.
      
      fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, scale = FALSE,
      scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),
      nClus = 10, maxMeta = 10, ważność = NULL, seed = 123)
      
      UWAGA: Może to zostać zmienione ręcznie przez użytkownika.
   6. Przypisz każdą komórkę do zidentyfikowanego podzbioru i identyfikatora próbki.
      
      subset_id <- as.factor(fsom$FlowSOM$mapping[,1])
      poziomy(subset_id) <- fsom$metaclustering
      głowa(subset_id)
   7. Załaduj plik metadanych w języku R (dostępny w pliku uzupełniającym 5) zawierający przypisanie grupy i połącz go z plikami .fcs.
      
      sampleid <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")
      sampleid <- na.omit(sampleid)
      
      sampleid$sampleID <- as.factor(sampleid$sampleID)
      sampleid$group <- as.factor(sampleid$group)
      sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(sampleid$CSPLR_ST)
      
      sampleid <- as.data.frame(sampleID)
      names(sampleID)[3] <- "sampleID"
      sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$metaData, function(x){rep(x[1], each = length(x[1]:x[2]))})
      attr(sampleID, 'nazwy') <- NULL
      sampleID <- as.factor(unlist(sampleID))
      sampleid <- data.frame(sampleid)
      levels(sampleID) <- paste("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep="_")
      
      df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c(1:37)])
      zmień nazwę <- data.frame(colpar=fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc)
      colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", rename$colpar[c(1:37)])
      df$ clusterID <- as.factor(df$ clusterID)
      df$sampleID <- as.factor(df$sampleID)
   8. Utwórz cfList na podstawie ramki danych uzyskanej z FlowSOM, uruchamiając następujący skrypt:
      
      cfData <- cfList(samples = sampleid,
      wyrażenie = df)
   9. Zmień kolejność markerów, aby wyglądały podobnie do danych wyjściowych z analizy Cytosplore.
      
      cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,
      38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,
      14,33,17,20,21,18,25,29,13,
      30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]
      
      UWAGA: Grupowanie przez FlowSOM zostało zakończone. Następnie wykonaj wizualizację danych wyjściowych klastrowania.

3. Wizualizacja: Analiza grupowa po przetwarzaniu

UWAGA: Ten krok jest metodą wspólną dla obu metod grupowania. Dlatego można go wykonać po klastrowaniu za pomocą FlowSOM lub Cytosplore.

1. Przed utworzeniem map cieplnych wygeneruj tabelę zliczania dla próbki przy użyciu funkcji cellCounts, jak pokazano w poniższym kodzie. Ponieważ niektóre klastry zawierają mniej komórek niż inne, przeskaluj dane na klaster, określając "scale = TRUE" wewnątrz funkcji cellCounts, aby można było łatwo zobaczyć rozproszenie między próbkami.
   
   cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE)
   
   UWAGA: Dane można teraz wizualizować.
2. Wizualizacja za pomocą heatmap.
   UWAGA: Jedną z głównych funkcji tego pakietu jest cytoHeatmaps, który służy do wizualizacji fenotypu utworzonych klastrów, a także ich niejednorodności w stosunku do próbek.
   
   cytoHeatmaps (cfData, group="group", legend=TRUE)
3. Wizualizacja z wykresami skrzynkowymi
   UWAGA: Dane można przedstawić w sposób ilościowy, wywołując funkcję cytoBoxplots. Dane wyjściowe tej funkcji reprezentują proporcję każdej próbki dla każdego klastra.
   1. Wygeneruj liczbę komórek zgodnie z instrukcją w kroku 3.1, ale nie skaluj danych w celu uzyskania częstotliwości każdego klastra.
      
      cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE)
      cytoBoxplots(cfData, group = "grupa")
4. Wizualizacja z histogramem sygnału mediany intensywności
   UWAGA: Dane można również wizualizować, przedstawiając histogram sygnału mediany intensywności.
   1. Wizualizuj intensywność ekspresji trzech markerów: CD45, CD11c i CD54.
   2. Sprawdź nazwy żądanych znaczników, wywołując następujący wiersz. Zanotuj nazwy znaczników i dołącz je do funkcji msiPlot.
      
      nazwy(cfData@expr)
      
      UWAGA: Tutaj skup się na CD45, CD11c i CD54. Sprawdź dokładną pisownię znaczników i dostosuj w razie potrzeby:
      
      msiPlot(cfData, markers = c("89Y_CD45", "167Er_CD11c","164Dy_CD54"), byGroup='grupa')

Results

Przepływ pracy Cytofast (Rysunek 1) ma na celu zapewnienie ilościowego i jakościowego przeglądu danych pierwotnie zgrupowanych przez oprogramowanie analityczne (np. FlowSOM lub Cytosplore). Cytofast uruchamia kilka możliwych wyników, w tym mapę cieplną wszystkich klastrów zidentyfikowanych w analizie i opartych na wyrażeniu znacznika (Rysunek 2 i Rysunek 3). Dendrogram na górze reprezentuje hierarchiczne podobieństwo między zidentyfikowanymi klastrami. Na górnym panelu wyświetlana jest kolejna mapa cieplna przedstawiająca względną liczbę odpowiednich podzbiorów w każdej próbce. Dendrogram po prawej stronie pokazuje podobieństwo między próbkami i opiera się na hierarchicznym grupowaniu przeprowadzonym na euklidesowych odległościach między próbkami. Połączone mapy cieplne są pokazane dla FlowSOM, a następnie Cytofast w Rysunek 2 i dla Cytosplore, a następnie Cytofast w Rysunek 3. Cytofast może być również używany do ilościowego prezentowania danych i wyświetlania wyników na wykresach skrzynkowych (za pomocą funkcji cytoBoxplots), jak pokazano na Rysunek 4 i Rysunek 5.

Podobne klastry znaleziono między dwiema różnymi metodami (np. klaster 8 z Cytosplore odpowiada klastrowi 10 z FlowSOM), a koekspresja niektórych markerów hamujących, takich jak PD-1 i LAG-3, była nadal widoczna w obu metodach). Obie metody grupowania pozwoliły na rozróżnienie między PD-L1 vs. Myszy leczone PBS. Natomiast można podkreślić pewne różnice między obiema metodami. FlowSOM identyfikuje 2 klastry (MHC-II⁺), podczas gdy Cytosplore pokazuje tylko jeden klaster (MHC-II^+dim). Wynika to z początkowej strategii bramkowania, w której komórki NK były ręcznie bramkowane na komórkach CD161⁺, a następnie przetwarzane przez FlowSOM. Jednak Cytosplore automatycznie bramkowane komórki z populacji CD45⁺ na pierwszym poziomie HSNE, które następnie zostały zgrupowane na wyższym poziomie hierarchicznym. W związku z tym Cytosplore zdefiniował podzbiory komórek NK bardziej precyzyjnie niż sposób, w jaki ręczne bramkowanie skupiało się na CD161. Niemniej jednak zachowano hierarchiczne grupowanie próbek, jak pokazano na dendrogramie po prawej stronie, co wskazuje, że segregacja między dwiema grupami (PD-L1 i PBS) nie była zależna od wybranej metody grupowania.

Liczba klastrów może być ręcznie zdefiniowana za pomocą obu metod. Cytofast umożliwia użytkownikowi ocenę heterogeniczności jego danych i może zapewnić wgląd w to, jak wybrać liczbę klastrów, na które dane powinny być podzielone. Inne funkcje są zawarte w pakiecie Cytofast, takie jak funkcja msiPlot (krok 3.4.2), pokazująca wykres mediany intensywności sygnału (MSI) dla każdego markera na grupę (Rysunek 6 i Rysunek 7). Funkcja ta umożliwia wykrywanie zmian globalnych, takich jak wzrost ekspresji CD54 lub CD11c w komórkach NK z grupy leczonej PD-L1. W pakiecie Cytofast można włączyć opcjonalne funkcje, takie jak wyświetlanie danych na wykresach słupkowych i inne metody reprezentacji danych. To ostatnie wymaga dodania narzędzi ggplot, które mogą być generowane przez R.

Rysunek 1: Przebieg pracy pakietu Cytofast. Dane zostały wygenerowane za pomocą cytometrii masowej z guza 3 dni po leczeniu immunoterapią lub nieleczonego. Porównano dwie różne techniki grupowania: Cytosplore i FlowSOM. Cytofast został wykorzystany do wizualizacji różnic między tymi dwiema technikami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przegląd klastrów i liczebność klastrów w podziale na grupy analizowane przez Cytofast po Cytosplore. Mapa cieplna wszystkich klastrów komórek NK (komórki CD161⁺ zdefiniowane automatycznie przez Cytosplore), które zostały zidentyfikowane 3 dni po immunoterapii (PD-L1). Przedstawione dane opierają się na grupowaniu Cytosplore i pochodzą z grup nieleczonych i leczonych PD-L1. Poziomy znacznika wyrażenia przekształconego przez ArcSinh5 są wyświetlane w skali tęczy. Na dolnym panelu względna obfitość każdej próbki jest reprezentowana przez skalę od zielonego do fioletowego. Dendrogram po prawej stronie reprezentuje podobieństwo między próbkami w oparciu o częstości podzbiorów. Skala częstotliwości reprezentuje rozproszenie średniej. Niska lub wysoka częstotliwość jest reprezentowana odpowiednio przez kolor zielony lub fioletowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przegląd klastrów i liczebność klastrów w podziale na grupy analizowane przez Cytofast po FlowSOM. Mapa cieplna wszystkich klastrów komórek NK (wstępnie bramkowanych zdarzeniami CD161⁺), które zidentyfikowano 3 dni po immunoterapii (PD-L1). Przedstawione dane są oparte na grupowaniu FlowSOM i zebrane z grup nieleczonych i leczonych PD-L1. Poziomy znacznika wyrażenia przekształconego przez ArcSinh5 są wyświetlane w skali tęczy. Na dolnym panelu względna obfitość każdej próbki jest reprezentowana przez skalę od zielonego do fioletowego. Dendrogram po prawej stronie reprezentuje podobieństwo między próbkami w oparciu o częstości podzbiorów. Skala częstotliwości reprezentuje rozproszenie średniej. Niska lub wysoka częstotliwość jest reprezentowana odpowiednio przez kolor zielony lub fioletowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentacja cytofastu z wykresami skrzynkowymi klastrów zdefiniowanych przez Cytosplore. Częstość występowania każdego klastra jest reprezentowana na wykresie skrzynkowym, podzielonym na dwie grupy (PBS i PD-L1). Jedna pojedyncza kropka odpowiada jednej myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentacja cytofastu z wykresami skrzynkowymi klastrów zdefiniowanych przez FlowSOM. Częstość występowania każdego klastra jest reprezentowana na wykresie skrzynkowym, podzielonym na dwie grupy (PBS i PD-L1). Jedna pojedyncza kropka odpowiada jednej myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Rozkład wykresów intensywności sygnału z komórek NK automatycznie bramkowanych przez Cytosplore. Rozkład natężeń sygnału jest pokazany na histogramie dla trzech konkretnych markerów: CD45, CD11c i CD54. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Rozkład wykresów intensywności sygnału z komórek NK automatycznie bramkowanych przez FlowSOM. Rozkład natężeń sygnału przedstawiono na histogramie dla trzech specyficznych markerów: CD45, CD11c i CD54, posegregowanych według grup PBS i PD-L1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pliki uzupełniające 1.1–1.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Pliki uzupełniające 2.1–2.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Plik uzupełniający 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Pliki uzupełniające 4.1–4.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Plik uzupełniający 5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Discussion

Cytofast to szybkie narzędzie obliczeniowe, które zapewnia szybką i globalną eksplorację danych cytometrycznych poprzez wyróżnienie i ilościowe określenie podzbiorów komórkowych specyficznych dla leczenia. Opisany protokół ma na celu dalsze przetwarzanie analiz klastrów za pomocą Cytosplore lub FlowSOM. Inne narzędzia do analizy grupowania są odpowiednie dla Cytofast, ale wymaga to użycia Cytofast do przypisania każdej komórki do podzbioru. Cytofast nie jest jednak metodą grupowania i dlatego wymaga procedur grupowania przed użyciem.

Przeprowadzona tutaj analiza wykazała, że niektóre podzbiory komórek NK CD161 ⁺ w mikrośrodowisku guza były wrażliwe na blokadę PD-L1. Świadczą o tym zmiany w ich fenotypie i liczebności, które zaobserwowano przy użyciu zarówno Cytosplore , jak i FlowSOM jako metod grupowania. Obie metody rozróżniały główne skupisko komórek NK (CD11b⁺ NKG2A⁺) z nieco różnymi częstościami (15%-20% dla Cytosplore, 30%-40% dla FlowSOM). Różnice w liczebności i to przybliżenie nie wpłynęły na wzorzec globalny, ponieważ oba dendrogramy pokazane w prawych panelach Rysunku 2 i Rysunku 3 wykazały podobne wyniki. Dzięki zastosowaniu Cytofast możliwe jest zatem (niezależnie od wybranej metody grupowania) segregacja myszy leczonych i nieleczonych PD-L1 na podstawie analiz fenotypu i liczebności klastrów komórek NK.

W zależności od zarejestrowanych parametrów konieczne są modyfikacje protokołu. W szczególności niektóre parametry, takie jak czas i tło, muszą zostać usunięte podczas wykonywania analizy grupowania. Ponadto ważne jest, aby każda komórka była przypisana do podzbioru. Funkcja cfData po prostu doda do cfList nieprzetworzoną liczbę komórek na klaster na próbkę. Na tym etapie można zbudować mapę cytotermiczną, jak wyjaśniono w sekcji 3.

Cytofast jest z powodzeniem stosowany jako narzędzie do wizualizacji i kwantyfikacji do porównywania różnych metod grupowania¹³. Ten pakiet języka R jest również kompatybilny z zaawansowanymi funkcjami, takimi jak globaltest¹⁴, który może testować powiązania między grupami klastrów przy użyciu zmiennych klinicznych. W przyszłości narzędzie globaltest i inne algorytmy mogą zostać zintegrowane z Cytofast w celu bardziej dogłębnej wizualizacji i kwantyfikacji.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komputer	Dell	na	NA