Cytofast to narzędzie do wizualizacji używane do analizy wyników z grupowania. Cytofast może być używany do porównywania dwóch metod grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Cytofast może szybko wygenerować ilościowy i jakościowy przegląd danych z cytometrii masowej i podkreślić główne różnice między różnymi algorytmami grupowania.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja i kwantyfikacja danych z cytometrii wielowymiarowej przy użyciu Cytofast i metod grupowania FlowSOM i Cytosplore
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Złożoność danych generowanych przez cytometrię masową wymagała nowych narzędzi do szybkiej wizualizacji wyników analiz. Metody grupowania, takie jak Cytosplore lub FlowSOM, są wykorzystywane do wizualizacji i identyfikacji klastrów komórek. Na potrzeby dalszej analizy nowo opracowany pakiet języka R, Cytofast, może generować szybką wizualizację wyników z metod grupowania. Cytofast bierze pod uwagę charakterystykę fenotypową klastrów komórkowych, oblicza liczebność klastrów komórkowych, a następnie ilościowo porównuje grupy. Protokół ten wyjaśnia zastosowania Cytofast do wykorzystania danych z cytometrii masowej w oparciu o modulację układu odpornościowego w mikrośrodowisku guza (tj. odpowiedź komórek NK [NK]) po prowokacji guza, a następnie immunoterapii (blokada PD-L1). Pokazano przydatność Cytofast z FlowSOM i Cytosplore. Cytofast szybko generuje wizualne reprezentacje klastrów komórek odpornościowych związanych z grupą i korelacji ze składem układu odpornościowego. W analizie grupowania obserwuje się różnice, ale separacja między grupami jest widoczna przy obu metodach grupowania. Cytofast wizualnie pokazuje wzorce indukowane przez leczenie PD-L1, które obejmują większą obfitość aktywowanych podzbiorów komórek NK, wyrażających większą intensywność markerów aktywacji (tj. CD54 lub CD11c).
Wprowadzenie
Cytometria masowa (cytometria według czasu przelotu lub CyTOF) umożliwia wykrywanie szerokiego zakresu wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych biomarkerów w milionach pojedynczych komórek. Wielowymiarowy charakter danych z cytometrii masowej wymaga pewnych narzędzi analizy, takich jak techniki grupowania komórek, takie jak SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5 i scaffold maps6. Ponadto opracowano różne techniki oparte na redukcji wymiarowości (tj. analiza głównych składowych [PCA]7, t-rozłożone stochastyczne osadzanie sąsiadów [t-SNE]8, hierarchiczne osadzanie stochastycznych sąsiadów [HSNE]9, jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości [UMAP]10 oraz mapy dyfuzji11) w celu poprawy szybkości, interpretacji i wizualizacji wielowymiarowych zbiorów danych.
Dalsza analiza danych cytometrycznych o wysokim przepływie i masie często nie ma automatycznych procesów do przeprowadzania testów statystycznych dotyczących częstości występowania klastrów i powiązań z wynikami klinicznymi. Wcześniej opracowaliśmy przepływ pracy oparty na języku R, znany jako Cytofast12, który pozwala na wizualne i ilościowe analizy technik grupowania za pomocą Cytosplore lub FlowSOM.
Opisany tutaj protokół wyjaśnia użycie Cytofast w R i pokazuje, jak generować ilościowe i jakościowe mapy cieplne i wykresy. Ponadto ułatwia określenie powiązań między obserwowanymi fenotypami immunologicznymi a wynikami klinicznymi. W raporcie opisano również analizę określonego zestawu danych cytometrii masowej przy użyciu dwóch różnych procedur grupowania: FlowSOM i Cytosplore. Stosując Cytofast z obiema metodami grupowania, wykazano odpowiednio, że na fenotyp aktywacji komórek NK wpływa blokada immunologicznego punktu kontrolnego PD-L1.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach LUMC i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi LUMC dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach, zgodnie z wytycznymi komitetów holenderskich i europejskich.
UWAGA: Dla konfiguracji eksperymentalnej, myszy C57BL/6 zostały podskórnie zaszczepione na prawym skrzydle mysim guzem jelita grubego MC38 w stężeniu 0,3 x 106 komórek/200 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Po 10 dniach, gdy guzy były wyczuwalne palpacyjnie, myszy leczono przeciwciałami blokującymi PD-L1 (klon MIH-5, 200 μg / mysz, wstrzyknięcie dootrzewnowe) lub leczono pozorowanie. Guzy wycięto 3 dni później po wstrzyknięciu PD-L1, przetworzono ex vivo i przeanalizowano za pomocą cytometrii masowej CyTOF przy użyciu 38 markerów13.
1. Sprzęt i oprogramowanie do analizy danych
UWAGA: Użyj komputera (Windows 7 lub nowszy) i procesora I5 o częstotliwości 2,4 GHz lub równoważnej, zainstalowanej pamięci RAM 6 GB i 10 GB wolnego miejsca na dysku twardym. Pakiet R Cytofast wykorzystuje istniejące funkcje: głównie flowCore, pheatmap i ggplot. Wiersze poleceń, które mają być wykonywane w R, są zawarte w protokole. Zasób instrukcji języka R można znaleźć pod adresem https://education.rstudio.com/.
- Aby zainstalować pakiet Cytofast, uruchom R (wersja "3.6") i zainstaluj Bioconductor w wersji 3.9, wprowadzając następujący kod:
if (!requireNamespace("BiocManager", cicho = PRAWDA))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("cytofast") - Upewnij się, że pakiet został załadowany w żądanym środowisku, uruchamiając następujące polecenie:
Biblioteka(Cytofast)
2. Tworzenie klastrów
UWAGA: Aby zaprezentować dwie metody grupowania Cytosplore i FlowSOM z Cytofast, analizowane są komórki NK (CD161+) w mikrośrodowisku guza 3 dni po leczeniu PD-L1.
- Grupowanie wykonywane przez Cytosplore
- Po pobraniu i zainstalowaniu Cytosplore, hostowanego pod adresem Cytosplore.org>, prześlij pliki .fcs (Pliki uzupełniające 1.1–1.8 [Pliki wejściowe Cytosplore]), klikając Plik | Otwórz plik(i) FCS w Cytosplore. Dodaj unikalny przykładowy tag jako kanał, klikając Dodaj unikalny przykładowy tag jako kanał po wyświetleniu monitu i wybierz kofaktor dla hiperbolicznej transformacji łuku (domyślnie 5).
- Wybierz opcję Uruchom H-SNE, uruchom poziom HSNE 3 i poczekaj na wygenerowanie mapy.
UWAGA: Ten krok może zająć trochę czasu, w zależności od liczby analizowanych komórek i wybranego poziomu HSNE. - Na pierwszym poziomie HSNE sprawdź komórki, które są dodatnie dla CD161. Zaznacz komórki CD161+ i kliknij prawym przyciskiem myszy opcję Powiększ zaznaczenie. Na drugim poziomie powtórz procedurę, aby dotrzeć do trzeciego poziomu z samymi zdarzeniami CD161+.
- Po wygenerowaniu ostatniej mapy tSNE zapisz klastry zdefiniowane przez Cytosplore, klikając prawym przyciskiem myszy mapę tSNE i wybierając polecenie Zapisz klastry. Wybierz katalog plików wyjściowych zgodnie z monitem Cytosplore i zanotuj tę lokalizację, ponieważ ten katalog będzie następnie używany do ładowania plików .fcs do R.
UWAGA: Liczbę podzbiorów można zmienić ręcznie, zmieniając wartość sigma. Wartość sigma jest domyślnie ustawiona na 30; Jednak rzeczywista liczba podzbiorów zależy od danych wejściowych. W tym przypadku Cytosplore wykrył 10 różnych podzbiorów, z których każdy plik reprezentuje jeden podzbiór. - Użyj prostej nazwy (tylko znaki) podczas zmiany nazw plików wyjściowych, co ułatwi identyfikację i dalszą obsługę. Zapisz pliki wyjściowe, wybierając pozycję Save.
UWAGA: Po zapisaniu Cytosplore tworzy folder z plikami .fcs, przy czym każdy plik odpowiada zidentyfikowanym klastrom w Cytosplore. Następnym krokiem będzie załadowanie plików do R za pomocą Cytofast. W tym miejscu wygenerowane pliki wyjściowe są dostarczane w plikach uzupełniających 2.1–2.10 (pliki wyjściowe Cytosplore). - Załaduj pliki wyjściowe wygenerowane przez Cytosplore do języka R za pomocą wyznaczonej funkcji: readCytosploreFCS.
dirFCS <- "C:\\Użytkownicy\\nazwa_użytkownika\\Pulpit\\donauki"
cfData <- readCytosploreFCS(dir = dirFCS, colNames = "opis") - Wyczyść dane, usuwając niektóre parametry, takie jak "Czas" i "Tło". Sprawdź położenie kolumny w odniesieniu do jej niepotrzebnych parametrów i usuń ją z macierzy.
colnames(cfData@expr)
cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)]
UWAGA: Niepotrzebne kolumny można zobaczyć, odczytując nazwy kolumn wygenerowanej macierzy. Uruchamiając colnames(cfData@expr) jeszcze raz, upewnij się, że uzyskane są tylko żądane parametry. - Zmień kolejność znaczników tak, aby znaczniki pochodzenia były wyświetlane jako pierwsze, a następnie znaczniki funkcjonalne.
cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20,
29,40,5,30,33,11,34,14,19,
32,28,6,7,4,12,13,17,16,15,
21,22,24,25,26,27,38,39)]
UWAGA: Krok 2.1.8 jest opcjonalny. - Połącz plik metadanych z danymi wygenerowanymi z Cytosplore, przesyłając metaplik arkusza kalkulacyjnego zawierający informacje kliniczne (plik uzupełniający 3).
biblioteka(readxl)
meta <- read_excel("C:\\Użytkownicy\\nazwa_użytkownika\\Pulpit\\sample_id.xlsx")
cfData@samples <- data.frame(meta)
UWAGA: Grupowanie wykonywane przez Cytosplore zostało zakończone. Alternatywną opcją grupowania dla Cytosplore jest FlowSOM i jest opisana w sekcji 2.2. Po wykonaniu jednego z dwóch kroków grupowania przejdź do kroku wizualizacji (sekcja 3).
- Grupowanie wykonywane przez FlowSOM
- Najpierw zainstaluj FlowSOM w języku R, uruchamiając następujące polecenie:
if (!requireNamespace("BiocManager", cicho = PRAWDA))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("FlowSOM")
biblioteka (FlowSOM) - Zainstaluj pakiet flowCore przy użyciu podobnej metody i załaduj go do środowiska, uruchamiając następujące polecenia:
if (!requireNamespace("BiocManager", cicho = PRAWDA))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("flowCore")
biblioteka (FlowSOM) - Załaduj nieprzetworzone dane podane w plikach uzupełniających 4.1–4.8 (dane wejściowe FCS FlowSOM), które były wcześniej bramkowane na zdarzeniach CD161+, w języku R za pomocą funkcji read.flowSet.
fcs_raw <- read.flowSet(path="C:\\Users\\username\\Desktop\\tocluster", wzorzec = ".fcs", transformacja = FALSE, truncate_max_range = FALSE, seed=123) - Wybierz odpowiednie markery biologiczne (usuń "Tło" lub "Czas"), wybierając odpowiednie kolumny i przekształć dane w sposób arcsinh5, jak pokazano w poniższym kodzie (tutaj usuń kolumny 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, które nie odpowiadają żadnemu markerowi biologicznemu). Zastosuj kofaktor 5, tak jak wcześniej zastosowano z Cytosplore, wybierając kofaktor = 5 w poniższej funkcji.
fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, function(x, cofactor=5){
colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc
wyrażenie <- wyrażenia(x)
wyrażenie <- Asinh(wyrażenie[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ kofaktor)
wyrażenia(x) <-wyrażenie
return(x)}) - Grupowanie danych za pomocą funkcji FlowSOM. Aby porównać FlowSOM i Cytosplore, wybierz grupowanie danych w dziesięciu podzbiorach jako dane wyjściowe wcześniej uzyskane przez Cytosplore.
fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction = FALSE, scale = FALSE,
scaled.center = FALSE, scaled.scale = FALSE, silent = FALSE, colsToUse = c(1:37),
nClus = 10, maxMeta = 10, ważność = NULL, seed = 123)
UWAGA: Może to zostać zmienione ręcznie przez użytkownika. - Przypisz każdą komórkę do zidentyfikowanego podzbioru i identyfikatora próbki.
subset_id <- as.factor(fsom$FlowSOM$mapping[,1])
poziomy(subset_id) <- fsom$metaclustering
głowa(subset_id) - Załaduj plik metadanych w języku R (dostępny w pliku uzupełniającym 5) zawierający przypisanie grupy i połącz go z plikami .fcs.
sampleid <- read_excel("C:\\Users\\username\\Desktop\\sample_id.xlsx")
sampleid <- na.omit(sampleid)
sampleid$sampleID <- as.factor(sampleid$sampleID)
sampleid$group <- as.factor(sampleid$group)
sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(sampleid$CSPLR_ST)
sampleid <- as.data.frame(sampleID)
names(sampleID)[3] <- "sampleID"
sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$metaData, function(x){rep(x[1], each = length(x[1]:x[2]))})
attr(sampleID, 'nazwy') <- NULL
sampleID <- as.factor(unlist(sampleID))
sampleid <- data.frame(sampleid)
levels(sampleID) <- paste("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep="_")
df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c(1:37)])
zmień nazwę <- data.frame(colpar=fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc)
colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", rename$colpar[c(1:37)])
df$ clusterID <- as.factor(df$ clusterID)
df$sampleID <- as.factor(df$sampleID) - Utwórz cfList na podstawie ramki danych uzyskanej z FlowSOM, uruchamiając następujący skrypt:
cfData <- cfList(samples = sampleid,
wyrażenie = df) - Zmień kolejność markerów, aby wyglądały podobnie do danych wyjściowych z analizy Cytosplore.
cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22,
38,15,8,3,27,9,11,28,35,26,
14,33,17,20,21,18,25,29,13,
30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)]
UWAGA: Grupowanie przez FlowSOM zostało zakończone. Następnie wykonaj wizualizację danych wyjściowych klastrowania.
- Najpierw zainstaluj FlowSOM w języku R, uruchamiając następujące polecenie:
3. Wizualizacja: Analiza grupowa po przetwarzaniu
UWAGA: Ten krok jest metodą wspólną dla obu metod grupowania. Dlatego można go wykonać po klastrowaniu za pomocą FlowSOM lub Cytosplore.
- Przed utworzeniem map cieplnych wygeneruj tabelę zliczania dla próbki przy użyciu funkcji cellCounts, jak pokazano w poniższym kodzie. Ponieważ niektóre klastry zawierają mniej komórek niż inne, przeskaluj dane na klaster, określając "scale = TRUE" wewnątrz funkcji cellCounts, aby można było łatwo zobaczyć rozproszenie między próbkami.
cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = TRUE)
UWAGA: Dane można teraz wizualizować. - Wizualizacja za pomocą heatmap.
UWAGA: Jedną z głównych funkcji tego pakietu jest cytoHeatmaps, który służy do wizualizacji fenotypu utworzonych klastrów, a także ich niejednorodności w stosunku do próbek.
cytoHeatmaps (cfData, group="group", legend=TRUE) - Wizualizacja z wykresami skrzynkowymi
UWAGA: Dane można przedstawić w sposób ilościowy, wywołując funkcję cytoBoxplots. Dane wyjściowe tej funkcji reprezentują proporcję każdej próbki dla każdego klastra.- Wygeneruj liczbę komórek zgodnie z instrukcją w kroku 3.1, ale nie skaluj danych w celu uzyskania częstotliwości każdego klastra.
cfData <- cellCounts(cfData, frequency = TRUE, scale = FALSE)
cytoBoxplots(cfData, group = "grupa")
- Wygeneruj liczbę komórek zgodnie z instrukcją w kroku 3.1, ale nie skaluj danych w celu uzyskania częstotliwości każdego klastra.
- Wizualizacja z histogramem sygnału mediany intensywności
UWAGA: Dane można również wizualizować, przedstawiając histogram sygnału mediany intensywności.- Wizualizuj intensywność ekspresji trzech markerów: CD45, CD11c i CD54.
- Sprawdź nazwy żądanych znaczników, wywołując następujący wiersz. Zanotuj nazwy znaczników i dołącz je do funkcji msiPlot.
nazwy(cfData@expr)
UWAGA: Tutaj skup się na CD45, CD11c i CD54. Sprawdź dokładną pisownię znaczników i dostosuj w razie potrzeby:
msiPlot(cfData, markers = c("89Y_CD45", "167Er_CD11c","164Dy_CD54"), byGroup='grupa')
Wyniki
Przepływ pracy Cytofast (Rycina 1) ma na celu zapewnienie ilościowego i jakościowego przeglądu danych pierwotnie zgrupowanych przez oprogramowanie analityczne (np. FlowSOM lub Cytosplore). Cytofast generuje kilka możliwych wyników, w tym mapę ciepła wszystkich klastrów zidentyfikowanych w analizie na podstawie ekspresji markerów (Rycina 2 oraz Rycina 3). Dendrogram na górze przedstawia hierarchiczne podobieństwo między zidentyfikowanymi klastrami. Górny panel wyświetla kolejną mapę ciepła, pokazującą względną ilość odpowiadających im podzbiorów w każdej próbce. Dendrogram po prawej stronie pokazuje podobieństwo między próbkami i opiera się na grupowaniu hierarchicznym wykonanym na podstawie odległości euklidesowych między próbkami. Połączone mapy ciepła są przedstawione dla FlowSOM a następnie Cytofast na Rycynie 2 oraz dla Cytosplore a następnie Cytofast na Rycynie 3. Cytofast może być również wykorzystywany do ilościowego przedstawienia danych i wyświetlania wyników w postaci wykresów pudełkowych (za pomocą funkcji cytoBoxplots), co pokazano na Rycynie 4 i Rycynie 5.
Podobne klastry zidentyfikowano w obu różnych metodach (np. klaster 8 z Cytosplore odpowiada klastrowi 10 z FlowSOM), a koekspresja niektórych markerów inhibicyjnych, takich jak PD-1 i LAG-3, była nadal widoczna w obu metodach). Obie metody klastrowania pozwoliły na rozróżnienie PD-L1 kontramyszy traktowane PBS. W przeciwieństwie do tego można wskazać pewne różnice między obiema metodami. FlowSOM identyfikuje 2 klastry (MHC-II+), podczas gdy Cytosplore wykazuje tylko jeden klaster (MHC-II+wymiar). Wynika to z początkowej strategii bramowania, w której komórki NK były bramowane ręcznie na podstawie markeru CD161+ komórek, a następnie poddane dalszej obróbce przez FlowSOMJednakże, Cytosplore automatycznie bramkowane komórki z populacji CD45+ populacja na pierwszym poziomie HSNE, która następnie została zgrupowana na wyższym poziomie hierarchicznym. Zatem, Cytosplore podsubsety komórek NK zostały zdefiniowane precyzyjniej niż podczas manualnego bramkowania skoncentrowanego na CD161. Niemniej jednak zachowano hierarchiczne grupowanie próbek, co obrazuje dendrogram po prawej stronie, wskazując, że segregacja między dwiema grupami (PD-L1 i PBS) nie była zależna od wybranej metody klastrowania.
Liczba klastrów może zostać zdefiniowana ręcznie przy użyciu obu metod. Cytofast umożliwia użytkownikowi ocenę heterogeniczności danych i może dostarczyć informacji o tym, jak dobrać liczbę klastrów, na które powinny zostać podzielone dane. Pakiet Cytofast zawiera również inne funkcje, takie jak funkcja msiPlot (krok 3.4.2), wyświetlająca wykres mediany intensywności sygnału (MSI) dla każdego markera w danej grupie (Rysunek 6 i Rysunek 7). Funkcja ta pozwala na wykrycie zmian globalnych, takich jak wzrost ekspresji CD54 lub CD11c w komórkach NK grupy traktowanej PD-L1. W pakiecie Cytofast mogą zostać zaimplementowane opcjonalne funkcje, takie jak wyświetlanie danych na wykresach słupkowych i inne metody reprezentacji danych. Te ostatnie wymagają dodania narzędzi ggplot, które mogą zostać wygenerowane przez R.
Rycina 1: Schemat działania pakietu Cytofast. Dane zostały wygenerowane za pomocą cytometrii masowej z guza 3 dni po zastosowaniu immunoterapii lub bez leczenia. Porównano dwie różne techniki klastrowania: Cytosplore oraz FlowSOM. Pakiet Cytofast został wykorzystany do wizualizacji różnic między tymi dwiema technikami. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Przegląd klastrów oraz liczebność klastrów w grupach analizowana za pomocą Cytofast po zastosowaniu Cytosplore. Mapa ciepła wszystkich klastrów komórek NK (komórek CD161+ zdefiniowanych automatycznie przez Cytosplore), które zidentyfikowano 3 dni po immunoterapii (PD-L1). Przedstawione dane opierają się na grupowaniu Cytosplore i zostały połączone z grup nieleczonej oraz grupy leczonej PD-L1. Poziomy ekspresji markerów po transformacji ArcSinh5 są wyświetlane w skali tęczowej. Na dolnym panelu względna liczebność każdej próbki jest reprezentowana przez skalę od zielonej do fioletowej. Dendrogram po prawej stronie przedstawia podobieństwo między próbkami na podstawie częstości występowania podzbiorów. Skala częstotliwości reprezentuje rozproszenie średniej. Niska lub wysoka częstotliwość jest reprezentowana odpowiednio kolorem zielonym lub fioletowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Przegląd klastrów i liczebność klastrów w grupach analizowana za pomocą Cytofast po FlowSOM. Mapa ciepła wszystkich klastrów komórek NK (wstępnie wyselekcjonowanych na zdarzenia CD161+), które zidentyfikowano 3 dni po immunoterapii (PD-L1). Przedstawione dane opierają się na klasteryzacji FlowSOM i zostały zgromadzone z grupy nieleczonej oraz grupy leczonej PD-L1. Poziomy ekspresji markerów poddane transformacji ArcSinh5 są wyświetlane w skali tęczowej. Na dolnym panelu względna liczebność każdej próbki jest reprezentowana przez skalę od zielonego do fioletowego. Dendrogram po prawej stronie przedstawia podobieństwo między próbkami na podstawie częstotliwości podzbiorów. Skala częstotliwości reprezentuje rozproszenie średniej. Niska lub wysoka częstotliwość jest reprezentowana odpowiednio przez kolor zielony lub fioletowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentacja Cytofast z wykresami pudełkowymi klastrów zdefiniowanych przez Cytosplore. Częstość występowania każdego klastra jest przedstawiona na wykresie pudełkowym, z podziałem na dwie grupy (PBS i PD-L1). Pojedyncza kropka odpowiada jednej myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Prezentacja Cytofast z wykresami pudełkowymi klastrów zdefiniowanych przez FlowSOM. Częstość występowania każdego klastra jest przedstawiona na wykresie pudełkowym, z podziałem na dwie grupy (PBS i PD-L1). Pojedyncza kropka odpowiada jednej myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Wykresy rozkładu intensywności sygnału z komórek NK poddanych automatycznemu bramowaniu za pomocą programu Cytosplore. Rozkłady intensywności sygnałów przedstawiono na histogramach dla trzech specyficznych markerów: CD45, CD11c i CD54. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7: Wykresy rozkładu intensywności sygnału dla komórek NK wygrodzonych automatycznie za pomocą FlowSOM. Rozkłady intensywności sygnałów przedstawiono na histogramie dla trzech specyficznych markerów: CD45, CD11c oraz CD54, z podziałem na grupy PBS i PD-L1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Pliki uzupełniające 1.1–1.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Pliki uzupełniające 2.1–2.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Plik uzupełniający 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Pliki uzupełniające 4.1–4.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Plik uzupełniający 5. Aby wyświetlić ten plik, kliknij tutaj (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
Dyskusja
Cytofast to szybkie narzędzie obliczeniowe, które zapewnia szybką i globalną eksplorację danych cytometrycznych poprzez wyróżnienie i ilościowe określenie podzbiorów komórkowych specyficznych dla leczenia. Opisany protokół ma na celu dalsze przetwarzanie analiz klastrów za pomocą Cytosplore lub FlowSOM. Inne narzędzia do analizy grupowania są odpowiednie dla Cytofast, ale wymaga to użycia Cytofast do przypisania każdej komórki do podzbioru. Cytofast nie jest jednak metodą grupowania i dlatego wymaga procedur grupowania przed użyciem.
Przeprowadzona tutaj analiza wykazała, że niektóre podzbiory komórek NK CD161 + w mikrośrodowisku guza były wrażliwe na blokadę PD-L1. Świadczą o tym zmiany w ich fenotypie i liczebności, które zaobserwowano przy użyciu zarówno Cytosplore , jak i FlowSOM jako metod grupowania. Obie metody rozróżniały główne skupisko komórek NK (CD11b+ NKG2A+) z nieco różnymi częstościami (15%-20% dla Cytosplore, 30%-40% dla FlowSOM). Różnice w liczebności i to przybliżenie nie wpłynęły na wzorzec globalny, ponieważ oba dendrogramy pokazane w prawych panelach Rysunku 2 i Rysunku 3 wykazały podobne wyniki. Dzięki zastosowaniu Cytofast możliwe jest zatem (niezależnie od wybranej metody grupowania) segregacja myszy leczonych i nieleczonych PD-L1 na podstawie analiz fenotypu i liczebności klastrów komórek NK.
W zależności od zarejestrowanych parametrów konieczne są modyfikacje protokołu. W szczególności niektóre parametry, takie jak czas i tło, muszą zostać usunięte podczas wykonywania analizy grupowania. Ponadto ważne jest, aby każda komórka była przypisana do podzbioru. Funkcja cfData po prostu doda do cfList nieprzetworzoną liczbę komórek na klaster na próbkę. Na tym etapie można zbudować mapę cytotermiczną, jak wyjaśniono w sekcji 3.
Cytofast jest z powodzeniem stosowany jako narzędzie do wizualizacji i kwantyfikacji do porównywania różnych metod grupowania13. Ten pakiet języka R jest również kompatybilny z zaawansowanymi funkcjami, takimi jak globaltest14, który może testować powiązania między grupami klastrów przy użyciu zmiennych klinicznych. W przyszłości narzędzie globaltest i inne algorytmy mogą zostać zintegrowane z Cytofast w celu bardziej dogłębnej wizualizacji i kwantyfikacji.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Potwierdzamy przyznanie przez Komisję Europejską nagrody MSCA w ramach programu H2020 pod numerem propozycji 675743 (ISPIC). Dziękujemy Tetje van der Sluis i Iris Pardieck za przetestowanie protokołu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komputer | Dell | na | NA |
Bibliografia
- Anchang, B., et al. Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE. Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).
- Van Gassen, S., et al. FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).
- Levine, J. H., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., et al. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425(2015).
- Hotelling, H. Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. , (2008).
- Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding. Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).
- Becht, E., et al. Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP. Nature Biotechnology. 37, 38(2018).
- Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data. Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).
- Beyrend, G., Stam, K., Höllt, T., Ossendorp, F., Arens, R. Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).
- Beyrend, G., et al. PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217(2019).
- Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome. Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).
Przedruki i uprawnienia
