Artykuł metodologiczny

Obrazowanie uwalniania DPP z dysku skrzydła Drosophila

DOI:

10.3791/60528

⸱

30 października 2019

 , 
1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czas ekspozycji na ligandy może mieć wpływ na ich konsekwencje rozwojowe. Tutaj pokazujemy, jak obrazować uwalnianie białka morfogenetycznego kości Drosophila (BMP) o nazwie Dpp z komórek dysku skrzydła.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transformująca się nadrodzina czynnika wzrostu beta (TGF-β) jest niezbędna do wczesnego tworzenia wzorców embrionalnych i rozwoju dorosłych struktur w organizmach wielokomórkowych. Nadrodzina TGF-β obejmuje TGF-β, białka morfogenetyczne kości (BMP), aktywiny, czynniki wzrostu i różnicowania oraz węzły węzłowe. Od dawna wiadomo, że ilość liganda wystawionego na działanie komórek jest ważna dla jego działania. Sądzono, że gradienty stężeń dalekiego zasięgu tworzą wzorzec embrionalny. Jednak ostatnio stało się jasne, że czas ekspozycji na te ligandy jest również ważny dla ich dalszych konsekwencji transkrypcyjnych. Ligand nadrodziny TGF-β nie może mieć konsekwencji rozwojowych, dopóki nie zostanie uwolniony z komórki, w której został wyprodukowany. Do niedawna trudno było określić, kiedy te ligandy zostały uwolnione z komórek. Tutaj pokazujemy, jak zmierzyć uwalnianie Drosophila BMP zwanego Decapentaplegic (Dpp) z komórek zawiązka skrzydła lub dysku skrzydła. Metoda ta może być modyfikowana dla innych systemów lub ligandów sygnalizacyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka morfogenetyczne kości (BMP) są niezbędne do wczesnej embriogenezy i kształtowania struktur dorosłych. BMP są wytwarzane i wydzielane w celu wpływania na transkrypcję docelowych genów potrzebnych do wzrostu i różnicowania komórek w reagujących komórkach. Dekapentaplegiczny (Dpp) jest homologiem Drosophila BMP4, który jest ważny dla rozwoju struktur embrionalnych i dorosłych, takich jak wing1,2,3,4. Kilka grup skupiło się na roli Dpp w kształtowaniu skrzydeł dorosłych much, ponieważ: 1) skrzydła składają się z dwóch przezroczystych arkuszy nabłonka o spójnym wzorze żyłkowania, który można łatwo ocenić; 2) dyski skrzydeł są również dość płaskie, mogą być hodowane poza larwą i są łatwe do zobrazowania i ilościowego określenia różnic we wzorze; oraz 3) rozwój wzoru skrzydeł jest wrażliwy na Dpp, tak że małe zakłócenia w ścieżce wpłyną na wzór żyłkowania skrzydeł.

Dpp jest wytwarzany w komórkach znajdujących się na przedniej/tylnej granicy dysku skrzydła5,6,7,8. Dpp wiąże się z kompleksem receptorów kinazy serynowo-treoninowej typu 1 i typu 29,10. Po związaniu Dpp receptor typu 2 fosforyluje receptor typu 1, który następnie fosforyluje matki przeciwko Dpp (Mad), homologowi Smad 1/5/8. Fosforylowany SMAD rekrutuje dodatkowy co-Smad (Medea), który umożliwia mu wejście do jądra, gdzie reguluje docelowe geny, prowadząc do dalszych efektów, takich jak proliferacja lub różnicowanie4,11.

Ostatnio laboratorium Batesa wykazało, że niewłaściwe uwalnianie Dpp w krążku skrzydła może prowadzić do zmniejszenia fosforylacji Mad, zmniejszenia ekspresji genu docelowego i wad wzoru skrzydeł12,13. Kilka kanałów jonowych wpływa na rozwój skrzydła Drosophila i związanych z nim struktur14,15. Te kanały jonowe mogą być również zaangażowane w uwalnianie Dpp. W określaniu mechanizmu uwalniania morfogenu ważne jest, aby istniała metoda wizualizacji zdarzeń uwalniania.

Doktorzy Aurelio Teleman i Stephen Cohen stworzyli białko fuzyjne Dpp-GFP, które jest w stanie uratować utratę Dpp, co oznacza, że jest biologicznie aktywne i jest uwalniane w biologicznie istotny sposób16. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób wizualizujemy zdarzenia wydania Dpp przy użyciu tego Dpp-GFP. To białko fuzyjne jest szczególnie przydatne, ponieważ GFP jest wrażliwe na pH, więc gdy znajduje się w kwaśnych pęcherzykach, fluorescencja jest wygaszana17. Dlatego, gdy białko oznaczone GFP jest uwalniane z pęcherzyka do bardziej neutralnego środowiska zewnątrzkomórkowego, intensywność fluorescencji GFP wzrasta17. Wykorzystaliśmy czułość pH GFP, aby określić, czy Dpp-GFP znajduje się w kwaśnych pęcherzykach. Zobrazowaliśmy dyski skrzydeł wyrażające Dpp-GFP przed i po dodaniu chlorku amonu, który neutralizuje pęcherzyki wewnątrzkomórkowych kompartmentów18. Stwierdziliśmy znaczny wzrost fluorescencji puncta po dodaniu chlorku amonu, co sugeruje, że wewnątrzkomórkowy Dpp-GFP jest wygaszany przed dodaniem chlorku amonu18. Wnioskujemy, że wewnątrzkomórkowy Dpp-GFP znajduje się w kwaśnych przedziałach związanych z błoną, takich jak pęcherzyki, i jest niegaszony po dodaniu chlorku amonu w celu zneutralizowania pH przedziałów wewnątrzkomórkowych18. To sprawia, że obrazowanie na żywo Dpp-GFP jest przydatną techniką do wizualizacji dynamiki Dpp w dysku skrzydła Drosophila, gdy jest on uwalniany z kwaśnych przedziałów do środowiska zewnątrzkomórkowego.

Tutaj opisujemy metodę, której używamy do wizualizacji zdarzeń wydania Dpp za pomocą Dpp-GFP. Dpp-GFP może być wyrażony w swoim natywnym wzorcu w dyskach skrzydeł Drosophila za pomocą systemu UAS-GAL419. Jest to metoda, która została użyta do określenia, czy kanały Irk mają wpływ na DPP release18. Zwalidowaliśmy tę metodę za pomocą obrazowania na żywo z-stacków. Nie widzimy, aby punkty Dpp-GFP poruszały się w płaszczyźnie ostrości w szeregach czasowych, jeśli uzyskaliśmy w jednej płaszczyźnie ostrości. Nie widzimy również ruchu puncta Dpp-GFP, jeśli obrazowaliśmy w stosie z. Wnioskujemy, że punkty Dpp-GFP obserwowane przy użyciu tej metody to zdarzenia uwalniania, a nie ruch pęcherzyków wewnątrzkomórkowo. Ta metoda obrazowania na żywo Dpp-GFP może być potencjalnie wykorzystana do testowania innych przypuszczalnych modyfikatorów uwalniania Dpp pod kątem ich wpływu na dynamikę Dpp lub może być modyfikowana w celu przyjrzenia się dynamice innych ligandów

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie jaj w celu wytworzenia larw do sekcji

  1. Krzyż 30-40 dziewiczych samic Dpp-GAL4 / TM6 Tb Hu leci do 10-15 samców Sp / CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
    nuta: Można stosować dowolne dwa genotypy zawierające Dpp-GAL4 i UAS-Dpp-GFP, o ile równoważniki posiadają markery larwalne pozwalające na selekcję odpowiedniego potomstwa w stadium larwalnym.
  2. Aby zebrać jaja, przełóż skrzyżowane muchy do świeżej fiolki z jedzeniem i pozwól im złożyć jaja przez 3-4 godziny przed wyjęciem ich z fiolki. Aby zachęcić do składania jaj, niewielką ilość pasty drożdżowej wykonanej z granulowanych drożdży zmieszanych z niewielką ilością wody można dodać do górnej części karmy przed wprowadzeniem much do fiolki. Ten sam zestaw skrzyżowanych much może być przechowywany i używany przez okres do 7 dni zbierania jaj.
    nuta: Każdy standardowy przepis na mąkę kukurydzianą Drosophila powinien być akceptowalny. Użyto tutaj przepisu na jedzenie opisanego przez Hazegha i Reisa20.
  3. Przechowywać fiolki z jajami w temperaturze 25 °C przez około 144 godziny, aż larwy znajdą się w trzecim stadium rozwojowym (wędrującym).
  4. Aby wybrać odpowiednie larwy do sekcji (te wyrażające zarówno Dpp-GAL4, jak i UAS-Dpp-GFP), najpierw wybierz larwy, które nie są Tb. Larwy te będą miały normalną długość, a nie krótkie i grube.
  5. Wśród larw niebędących Tb znajdą się larwy wykazujące ekspresję CyO-GFP oraz larwy wykazujące ekspresję Dpp-GFP. Aby wybrać larwy wykazujące ekspresję Dpp-GFP, obejrzyj je pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Podczas gdy zarówno larwy wykazujące ekspresję Dpp-GFP, jak i CyO-GFP będą miały pewną fluorescencję GFP, larwy wyrażające Dpp-GFP można odróżnić w tym, że GFP jest ograniczony do dysków skrzydeł, a fluorescencja jest znacznie mniej jasna niż larwy eksprymujące CyO-GFP. Wybierz te mniej jasne larwy do sekcji.

2. Przygotowanie roztworu do obrazowania i sekcji larw

  1. Do obrazowania na żywo krążków skrzydeł przygotuj zmodyfikowane podłoża HL321 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 dyhydrat, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalozy dwuwodnej, 115 mM sacharozy, 5 mM HEPES). Ten nośnik pozwala na utrzymanie dysku skrzydła przy życiu podczas obrazowania21.
  2. Dostosuj pH do 7,1 za pomocą HEPES i przefiltruj filtrem 0,22 μm. Nośnika tego należy używać zarówno do sekcji dysku skrzydła, jak i jako nośnika montażowego do obrazowania na żywo.

3. Przygotowanie prowadnic do montażu tarczy skrzydłowej

  1. Umieść dwa kawałki bezbarwnej taśmy dwustronnej w poprzek szkiełka mikroskopowego wzdłuż, pozostawiając między nimi odstęp około 5 mm. Kawałki taśmy powinny być na tyle długie, aby końce taśmy leżały równo z krawędziami szkiełka mikroskopowego.
  2. Użyj płaskiej krawędzi (takiej jak koniec uchwytu kleszczy preparacyjnych), aby mocno docisnąć taśmę do suwaka, aby żaden nośnik nie mógł się pod nią przedostać.
  3. Umieść 25 μl zmodyfikowanego nośnika HL3 między dwoma kawałkami taśmy. Tarcza skrzydełkowa zostanie zamontowana w tym upuszczeniu nośnika między kawałkami taśmy, tak aby taśma zapobiegała zgnieceniu dysku przez szkiełko nakrywkowe (Rysunek 1A).

4. Preparowanie i montaż tarcz skrzydłowych do obrazowania

  1. Wypreparuj larwy w przygotowanym zmodyfikowanym pożywce HL326.
  2. Delikatnie rozerwij larwy na pół za pomocą dwóch par kleszczy i odrzuć tylną połowę larwy.
  3. Chwyć środek przedniej połowy larwy jedną parą kleszczy i użyj drugiej pary zamkniętych kleszczy, aby wepchnąć haczyki ustne z powrotem do larwy, aż larwa zostanie całkowicie odwrócona.
  4. Krążki skrzydeł można najłatwiej znaleźć, szukając ostrych zagięć w dwóch ciemniejszych gałęziach pierwotnych tchawicy, które biegną po obu stronach larw. Dyski skrzydeł leżą bezpośrednio pod tymi zagięciami tchawicy w odwróconej larwie.
  5. Delikatnie wyjmij krążki skrzydełkowe i przenieś je do 25 μl pożywki HL3 na przygotowanym szkiełku mikroskopowym. Ważne jest, aby upewnić się, że żadne kawałki tchawicy nie pozostały przyczepione do wypreparowanych krążków skrzydeł, ponieważ może to spowodować unoszenie się krążków, utrudniając obrazowanie.
  6. Ułóż tarczę skrzydła tak, aby perypodialna strona kieszeni skrzydłowej była skierowana do góry od szkiełka mikroskopowego, a dysk leżał płasko (patrz Rysunek 1A,B).
  7. Przykryj tarczę skrzydełkową i taśmę szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru natychmiast przejdź do poniższych kroków obrazowania.

5. Zwolnienie obrazowania Dpp

  1. Zobrazuj zamontowaną tarczę skrzydła za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 40-krotnym obiektywem olejowym i laserem 488 nm. Dpp-GFP powinien pojawić się jako pasek fluorescencji GFP wzdłuż środka dysku skrzydła z małymi punktami Dpp-GFP uwalnianymi z tego środkowego paska komórek.
  2. Zbieraj obrazy z prędkością 2 Hz przez 2 minuty, aby zobrazować zwolnienie DPP. Aby uzyskać najlepsze wyniki, ustaw laser na wystarczająco mocnym ustawieniu, aby uzyskać wyraźny obraz komórek uwalniających Dpp, aby uniknąć nadmiernego wybielania podczas zbierania obrazu. Obrazy mogą być zbierane jako szeregi czasowe, które można następnie eksportować jako pliki AVI (bez kompresji, 3 klatki/s) w celu uzyskania plików wideo w wersji Dpp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki obrazowania na żywo tego protokołu. Gdy protokół się powiedzie, Dpp-GFP może być widziany jako pasek wzdłuż środka dysku skrzydła z jądrami widocznymi jako niefluorescencyjne okręgi w obszarze Dpp-GFP (Rysunek 2). Uwolnienie Dpp-GFP jest widoczne jako fluorescencyjne punkty, które pojawiają się i znikają. Zaobserwowaliśmy fluorescencję Dpp-GFP pojawiającą się i zanikającą w ciałach komórkowych i daleko od ciał komórkowych. Sygnali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BMP, takie jak Dpp, wywierają znaczący wpływ, gdy wiążą kompleks receptorów związanych z błoną, aby wywołać kaskadę sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w sąsiednich lub pozornie odległych komórkach. Laboratorium dr Thomasa Kornberga wykazało, że komórki, które wytwarzają sygnał Dpp, kontaktują się z komórkami, które odbierają sygnał za pomocą cienkich struktur podobnych do filapodiów na bazie aktyny, zwanych cytonemami 15,24,25. Dan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować dr Sarala Pradhan za pracę nad wcześniejszą wersją tego protokołu. Chcielibyśmy podziękować 1354282 NSF-IOS za finansowanie podczas opracowywania tego protokołu. Chcielibyśmy podziękować NIH-NIDCR RO1DE025311 za finansowanie naszego laboratorium w chwili obecnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drożdże piekarskieRed Star   
CaCl2 dyhydratFisher ScientificC79-500
Szkiełka nakrywkoweVWR484-457
Taśma dwustronnaScotch
Drosophila Agar Typ IIApex66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb HuStado to zostanie wkrótce udostępnione w Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 Tb HuTen materiał będzie wkrótce dostępny w Bloomington Drosophila Stock Center
Pęseta Dumont #5World Precision Instruments500233Kleszcze do preparowania
HEPESSigma AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
Jasny syrop kukurydzianyKaro
Ekstrakt słodowyBreiss
MgCl2Fisher ScientificAC223210010
Szkiełka mikroskopoweSigma AldrichS8400
NaClFisher ScientificS271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
Lakier do paznokciNauka o mikroroskopii elektronowej72180
Kwas propionowyVWRU330-09
Mąka sojowaADM Składniki specjalne062-100
SacharozaFisherScientific S5-3
SacharozaFisherS512
TegoseptGenesee Scientific20-259
Trehaloza dyhydratChem-Impex Międzynarodowy, Inc.00766
Żółta mączka kukurydzianaMikroskop
LSM 780Mikroskop Zeissdo obrazowania na żywo
Mikroskop Zeiss SteREO Discovery.V8Mikroskop Zeissdo sekcji
konfokalny Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
  2. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
  3. Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
  4. Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
  5. Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
  6. Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
  7. de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
  10. Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
  11. Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
  12. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  13. Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
  14. George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
  15. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  16. Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
  17. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  18. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  19. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  20. Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744(2016).
  21. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  22. Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
  23. Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
  24. Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
  25. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  26. Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnaobrazowanie fluorescencyjnesygnalizacja BMPznakowanie GFPdynamika cytonem wdysekcja kr ka skrzyd owegoobrazowanie time lapseczynniki genetyczne

Powiązane artykuły