Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60533

⸱

5 grudnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Plant Pathology and Nematology, University of Idaho, 2Department of Plant Sciences, University of Idaho

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Streszczenie

Ubikwitynacja, jako posttranslacyjna modyfikacja białek, odgrywa ważną rolę regulacyjną w homeostazie komórek eukariotycznych. Kowalencyjne przyłączenie 76 aminokwasowych modyfikatorów ubikwityny do białka docelowego, w zależności od długości i topologii łańcucha poliubikwityny, może skutkować różnymi wynikami, od degradacji białka po zmiany w lokalizacji i / lub aktywności zmodyfikowanego białka. Trzy enzymy sekwencyjnie katalizują proces ubikwitynacji: enzym aktywujący ubikwitynę E1, enzym sprzęgający ubikwitynę E2 i ligaza ubikwityny E3. Ligaza ubikwityny E3 określa specyficzność substratową i dlatego stanowi bardzo interesujący temat badań. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowe podejście do badania związku między aktywnością enzymatyczną a funkcją ligazy ubikwityny typu E3 typu RING. Ten czteroetapowy protokół opisuje: 1) jak wygenerować mutanta z niedoborem ligazy E3 poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce ukierunkowaną na konserwatywną domenę RING; 2–3) jak badać aktywność ubikwitynacji zarówno in vitro, jak i in planta; 4) jak powiązać te analizy biochemiczne z biologicznym znaczeniem badanego białka. Wytwarzanie mutanta z niedoborem ligazy E3, który nadal oddziałuje ze swoim substratem, ale już go nie ubikwitynuje w celu degradacji, ułatwia testowanie interakcji enzym-substrat in vivo. Co więcej, mutacja w konserwatywnej domenie RING często nadaje dominujący negatywny fenotyp, który może być wykorzystany w badaniach funkcjonalnego nokautu jako alternatywne podejście do podejścia opartego na interferencji RNA. Nasze metody zostały zoptymalizowane pod kątem biologicznej roli efektora RHA1B pasożytniczego nicieni pasożytniczych roślin, który przejmuje kontrolę nad systemem ubikwitynacji gospodarza w komórkach roślinnych w celu promowania pasożytnictwa. Przy niewielkiej modyfikacji systemu ekspresji in vivo, protokół ten można zastosować do analizy dowolnej ligazy E3 typu RING, niezależnie od jej pochodzenia.

Wprowadzenie

Zdecydowana większość ligaz ubikwityny E3 należy do białek typu RING (Really Interesting New Gene). Domena palca serdecznego została pierwotnie zidentyfikowana przez Freemonta i wsp. 1 i funkcjonalnie opisany jako domena pośrednicząca w interakcji białko-białko2. Kanoniczny palec serdeczny jest specjalnym rodzajem domeny koordynującej zdefiniowanej jako konsensusowa sekwencja ośmiu konserwatywnych Cys (C) i His (H) specyficznie rozmieszczonych przez inne reszty aminokwasowe (X), C-X 2-C-X9-39-C-X 1-3-H-X 2-3-C/H-X 2-C-X 4-48-C-X 2-C. Dwa jony Zn2+ są stabilizowane przez reszty rdzenia C i H poprzez unikalną topologię "krzyżowego klamrowania", przy czym C1/C2 i C/H5/C6 koordynują pierwszy jon Zn2+, podczas gdy C3/H4 i C7/C8 wiążą drugi (Rysunek 1A)3,4. W zależności od obecności C lub H w piątym miejscu koordynacyjnym Zn2+ zdefiniowano dwie podklasy kanoniczne białek palca serdecznego: C3HC4 i C3H2C3 (odpowiednio RING-HC i RING-H2). Ponieważ domena RING ligazy ubikwityny E3 pośredniczy w interakcji między enzymami sprzęgającymi E2 a substratami, wykazano, że mutacja tych niezbędnych reszt C i H zakłóca aktywność ligazy5. Opisano dodatkowe pięć mniej powszechnych podklas ligaz RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T i RING-G)6. Ligazy ubikwityny E3 typu RING można dalej podzielić na proste i złożone enzymy E3. Proste ligazy RING E3 z pojedynczą podjednostką zawierają zarówno miejsce rozpoznawania substratu, jak i domenę RING wiążącą E2. W przeciwieństwie do tego, wielopodjednostkowy kompleks E3 typu RING albo rekrutuje substrat lub pośredniczy w wiązaniu pośredniego E2-ubikwityny z kompleksem E3. Pozostałości Lys w domenie RING, które służą jako główne miejsce przyłączenia ubikwityny do samoubikwitynacji, mogą być również ważne dla aktywności ligazy E3.

Nie wszystkie białka zawierające RING funkcjonują jako ligazy E3. W związku z tym przewidywania bioinformatyczne dotyczące domeny palca serdecznego i zdolności do ubikwitynacji białek zależnych od E2 muszą zostać zweryfikowane biochemicznie i powiązane z biologiczną rolą badanego białka. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół określający, w jaki sposób wykrywać i funkcjonalnie charakteryzować aktywność enzymatyczną ligaz ubikwityny RING typu E3, zarówno in vitro, jak i in planta, za pomocą podejścia mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Reprezentatywne wyniki z tego rurociągu przedstawiono dla ligazy E3 RHA1B typu RING. RHA1B jest białkiem efektorowym wytwarzanym przez pasożytniczego nicienia cystowego Globodera pallida w celu tłumienia odporności roślin i manipulowania morfologią komórek korzeniowych roślin. Aby chronić się przed inwazją patogenów/pasożytów, rośliny wyewoluowały domenę wiążącą nukleotydy i receptory immunologiczne bogate w powtórzenia leucyny (NB-LRR), które wykrywają obecność patogenu lub pasożyta iw konsekwencji rozwijają reakcję nadwrażliwości (HR), która jest formą szybkiej i zlokalizowanej śmierci komórki występującej w miejscu infekcji w celu zatrzymania kolonizacji patogenów. Jednym z takich receptorów immunologicznych jest białko Gpa2 ziemniaka, które nadaje odporność na niektóre izolaty G. pallida (populacje polowe D383 i D372)7.

Korzystając z przedstawionych protokołów, ostatnio odkryto, że RHA1B zakłóca sygnalizację immunologiczną roślin w sposób zależny od E3, kierując immunoreceptor roślinny Gpa2 do ubikwitynacji i degradacji8.

Protokół

1. Mutageneza kierowana na stronę (Rysunek 1)

  1. Zidentyfikuj konserwatywne aminokwasy Cys i His w domenie RING (Rysunek 1A) i zaprojektuj startery niosące interesujący nas kodon podstawienia otoczony 15 parami zasad po obu stronach miejsca mutacji (Rysunek 1B).
  2. Wprowadzić pożądaną mutację poprzez amplifikację plazmidu zawierającego gen będący przedmiotem zainteresowania metodą PCR, przy użyciu starterów mutagennych i polimerazy DNA o wysokiej wierności zawierającej Pfu w 50 μl całkowitej objętości reakcji PCR, jak pokazano w Tabeli 1 i Tabeli 2, zgodnie z protokołem producenta.
  3. Trawić rodzicielskie metylowane i częściowo zmetylowane DNA pochodzące z Escherichia coli, dodając 3 μl enzymu restrykcyjnego DpnI bezpośrednio do reakcji PCR (etap 1.2) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 2 h.
    UWAGA: Metylacja to potranskrypcyjna modyfikacja białka, która jest dodawana do plazmidu wytworzonego i wyizolowanego z bakterii. Nowe kopie plazmidu generowanego przez PCR nie mają metylacji, dlatego nowe kopie pozostaną nienaruszone podczas leczenia DpnI.
  4. Oczyść zmutagizowane plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA opartego na technologii kolumny wirowej i wymyj DNA za pomocą 50 μl wody.
  5. Przekształć chemicznie kompetentne komórki DH5α E. coli za pomocą 0,5 μl odzyskanego mutagenizowanego plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, inkubuj kompetentne komórki z DNA na lodzie przez 30 minut, a następnie poddawaj je szokowi cieplnemu przez 20 s w temperaturze 42 °C i ponownie umieść probówki na lodzie na 2 minuty. Inkubować komórki z 500 μl pożywki LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy 250 obr./min, a następnie rozprowadzać je na selektywnych pasztetach.
  6. Sprawdź pożądaną mutację przez sekwencjonowanie Sanger plazmidów DNA wyizolowanych z E. coli.

2. Oczyszczanie białek rekombinowanych i test ubikwitynacji in vitro

  1. Sklonuj dzikie geny RING i zmutowane geny RING będące przedmiotem zainteresowania do wektora pMAL-c2 (postępuj zgodnie z protokołem producenta; Tabela 3) w celu połączenia tych genów ze znacznikiem epitopu MBP, który umożliwia jednoetapowe oczyszczanie przy użyciu żywicy amylozy. Powstałe konstrukty wprowadzić do szczepu E. coli BL21 zgodnie z opisem w kroku 1.5.
  2. Hoduj szczep E. coli BL21 zawierający pożądany konstrukt w 50 ml płynnego podłoża LB w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny, aż osiągnie fazę logarytmiczną (OD600 0,4-0,6).
  3. Dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1–1 mM w celu wywołania ekspresji interesującego nas białka rekombinowanego znakowanego MBP i inkubować kulturę E. coli przez 2–3 godziny w temperaturze 28 °C. Po inkubacji umieścić kulturę na lodzie.
    UWAGA: Wykonaj kroki 2.4–2.13 na lodzie, aby chronić białka przed degradacją.
  4. Aby sprawdzić skuteczność indukcji, zbierz 1,5 ml indukowanych komórek, odwiruj je w temperaturze 13 000 x g przez 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 20 μl bufora ładującego 2x SDS-PAGE (24 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glicerol, 4 mM DTT, 0,04% (w/v) błękit bromofenolowy).
  5. Gotuj próbki przez 5 minut i umieść je na 10% żelu SDS-PAGE. Aby wizualnie ocenić akumulację białka fuzyjnego MBP (masa cząsteczkowa białka będącego przedmiotem zainteresowania + 42,5 kDa MBP), należy wybarwić żel przez 20 minut, mieszając buforem barwiącym Coomassie (50% metanolu, 10% kwasu octowego, 0,1% błękitu Coomassie) i odbarwiając przez noc buforem odbarwiającym (20% metanolu, 10% kwasu octowego).
  6. Pozostałe komórki E. coli zebrać przez odwirowanie przy 1,350 x g przez 6 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml buforu kolumnowego (20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, inhibitor proteazy bakteryjnej).
    UWAGA: Jest to dobre miejsce na zatrzymanie protokołu na noc. Zamrożone komórki można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze -20 °C.
  7. Rozbij komórki E. coli, umieszczając probówkę zawierającą bakterie w łaźni lodowo-wodnej i stosując 10 cykli sonikacji: 10-sekundowa sonikacja przy 30% amperze, a następnie 20-sekundowe przerwy.
  8. Odwirować próbkę o masie 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zachować supernatant (ekstrakt surowy).
  9. Przygotuj 500 μl żywicy amylozowej w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć żywicę, dodając 10 ml buforu do zimnej kolumny i odwirowując w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 5 minut. Zrób to 2x.
  10. Dodać 5 ml surowego ekstraktu do probówki z żywicą amylozową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  11. Odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  12. Dodać 10 ml buforu kolumnowego do osadu żywicy i inkubować przez 20 minut. Następnie odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Powtórz ten krok 2 razy.
  13. Białko fuzyjne należy wypłukać 0,5 ml buforu kolumnowego zawierającego 10 mM maltozy, inkubując próbkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Odwirować przy 1,800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zebrać eluowane białko. Powtórz ten krok 2 razy.
  14. Dializuj 1 ml frakcji białkowej w stosunku do zimnego PBS. Porcję białka przelać do jednorazowych probówek (10–20 μl), aby uniknąć zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.
  15. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda9.
  16. Ustawić reakcję ubikwitynacji in vitro w całkowitej objętości 30 μl, mieszając 40 ng E1 (np. AtUBA1), 100 ng E2 (np. AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg białka typu MBP-RING i 2 μg FLAG-Ub (lub HA-Ub) w buforze ubikwitynacyjnym (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 30 mM fosforan kreatyny, 50 μg/ml fosfokinaza kreatynowa). Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 2 godz
    UWAGA: Przygotuj 20x bufor ubikwitynacyjny i przechowuj go do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C w małych porcjach do jednorazowego użytku. Fosfokinaza kreatynowa łatwo traci swoją aktywność enzymatyczną, gdy bufor jest wielokrotnie rozmrażany i zamrażany.
  17. Zakończyć reakcję, mieszając 30 μl próbek z 7,5 μl 5x buforu ładującego SDS-PAGE (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,1% (w/v) błękit bromofenolowy) i gotując przez 5 min.
  18. Oddziel białka za pomocą 7,5% elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie przenieś na błonę PDVF i wykryj ubikwitynację przez Western blot za pomocą anty-FLAG (lub anty-HA).
  19. Wybarwić membranę PVDF kolorem Coomassie na niebiesko, aby sprawdzić równe obciążenie badanego białka typu MBP-RING.

3. Przejściowa ekspresja białka za pośrednictwem Agrobacterium w liściach Nicotiana benthamiana i w teście ubikwitynacji planta

  1. Szczepy Agrobacterium tumefaciens należy umieścić w odpowiednich smugach przenoszących gen znakowany epitopem (np. HA-RHA1B, HA-RHA1BC135S, HA-RHA1BK146R, HA-Ub) i pusty wektor jako kontrolę na pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki selekcyjne.
  2. Po 2 dniach wzrostu w temperaturze 28 °C należy zebrać pojedyncze kolonie i hodować je w płynnym podłożu LB z odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 28 °C/250 obr./min przez kolejne 24 godziny.
  3. Przenieść 100 μl kultury agrobakteryjnej do 3 ml świeżego LB z odpowiednimi antybiotykami i inkubować kulturę przez dodatkowe 4–6 godzin w temperaturze 28 °C z rotacją (250 obr./min) do późnej fazy wzrostu wykładniczego.
  4. Odwirować komórki agrobakteryjne przy 1,800 x g przez 6 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 3 ml buforu do płukania (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukozy, 2 mM NaH2PO4). Powtórz ten krok 2 razy.
  5. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić komórki w buforze indukcyjnym (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukozy, 2 mM NaH2PO4, 200 μM acetosyringonu, 37 mM NH4Cl, 5 mM MgSO4,7H 2O, 4 mM KCl, 18 μM FeSO4,7H 2O, 2 mM CaCl2). Inkubować komórki z buforem indukcyjnym przez dodatkowe 10–12 godzin w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Acetosyringon indukuje transfer T-DNA.
  6. Odwirować komórki przy 1 800 x g przez 6 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml buforu infiltracyjnego (10 mM MES pH 5,5, 200 μM acetosyringonu).
    UWAGA: Jeśli agrobakterie agregują się po inkubacji z buforem indukcyjnym, pozwól zagregowanym komórkom opaść na dno probówki, pozostawiając ją na stole na kilka minut, a następnie przenieś klarowną zawiesinę Agrobacterium do nowej probówki przed przystąpieniem do kroku 3.6.
  7. Zmierzyć stężenie bakterii przy użyciu wartości OD600 (gęstość optyczna przy absorbancji 600 nm). Dostosuj wartości OD600 do żądanych.
    UWAGA: Zwykle wartość OD600 między 0,2 a 0,4 najlepiej sprawdza się w przypadku pojedynczego odcisku plamy agrobakteryjnej. W przypadku zastosowania kombinacji różnych szczepów agrobakteryjnych, całkowite wartości OD600 szczepów agrobakteryjnych nie powinny przekraczać 1.
  8. Agroinfiltrować 4-tygodniowe liście N. bethamiana, delikatnie nakłuwając je igłą, a następnie ręcznie wstrzykując Agrobacterium za pomocą strzykawki bez igły. Zakreśl markerem obszar naciekanego liścia (zwykle o średnicy 1–2 cm).
  9. Zbierz naciekane tkanki liścia 36 godzin po infiltracji. Zmiel tkankę na drobny proszek z ciekłym azotem.
  10. Zawieszony proszek tkankowy z 300 μl buforu do ekstrakcji białek (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glicerolu, 1% poliwinylopolipirolidonu, 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteazy roślinnej) i odwirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE do końcowego stężenia 1x i gotować przez 5 min.
  12. Oddziel surowe białka od 10% żeli SDS-PAGE, przenieś na membrany PVDF i sonduj anty-HA w celu wykrycia ubikwitynacji roślin.

4. Ustalenie związku między aktywnością enzymatyczną a funkcją planty

UWAGA: Na przykład, RHA1B wspomaga degradację opornego białka Gpa2 w celu zahamowania śmierci komórek HR. Ten krok pokazuje, jak sprawdzić, czy te zjadliwe działania RHA1B są zależne od E3.

  1. Szczepy Agrobacterium tumefaciens należy umieścić w smugach przenoszących oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania (w tym przykładzie HA-RHA1B, HA-RHA1BC135S, HA-RHA1BK146R, myc-Gpa2, RBP1) i pusty wektor jako kontrolę. Postępuj zgodnie z krokami 3.1–3.8 dla przygotowania Agrobacterium i wstrzyknięcia na liście N. bethamiana.
  2. W przypadku zależnej od E3 degradacji białka substratowego należy postępować zgodnie z krokami 3.9–3.12 i przeprowadzić Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu wykrycia akumulacji białka w komórkach roślinnych (np. anty-HA i anty-MYC).
  3. W przypadku zahamowania śmierci komórki za pośrednictwem odpowiedzi nadwrażliwości zależnej od E3 (HR), należy monitorować liście agroinfiltrowane pod kątem objawów śmierci komórek HR 2-4 dni po infiltracji.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki dla protokołu wykorzystanego do badania jednowarstwowej ligazy ubikwitynowej E3 RHA1B, która posiada domenę typu RING-H2 przewidywaną przez PROSITE (aminokwasy 132–176)10. Jak pokazano na Rysunku 1, aby uzyskać białko mutanta z deficytem E3, należy poddać mutagenezie co najmniej jedną z ośmiu konserwatywnych reszt C lub H w domenie RING (Rysunek 1A) (Rysunek 1B). W związku z tym, w pierwszym kroku wygenerowano dwie wersje mutanta RHA1B: RHA1BC135S (podstawienie Cys przez Ser w konserwatywnej reszcie C3 domeny RING) oraz RHA1BK146R (podstawienie Lys przez Arg w jedynej reszcie Lys obecnej w RHA1B). Chociaż jednowarstwowe ligazy E3 pośredniczą w przenoszeniu ubikwityny z przenoszącego ją E2 na substrat, zamiast bezpośrednio oddziaływać z ubikwityną, autoubikwitynacja E3 w miejscu Lys może być wymagana dla jej maksymalnej aktywności enzymatycznej.

Wyniki analizy Western blot przedstawione na Rysunku 2A ukazują typowy pozytywny wynik testu ubikwitynacji in vitro, z charakterystycznym rozmazaniem (smear) z wieloma prążkami, rozpoczynającym się od masy cząsteczkowej badanego białka (np. RHA1B połączone z MBP ~100 kDa) i rozszerzającym się w górę. Przeciwciało anty-HA rozpoznało Ub z tagiem HA wbudowane w łańcuchy poliubikwitynacji o różnych długościach, co stworzyło typowy dla ubikwitynacji obraz rozmazania przypominający drabinę. Aby potwierdzić pozytywne wyniki, na Rysunku 2A przedstawiono również wszystkie istotne kontrole negatywne, w których brakowało poszczególnych składników (E1, E2, Ub lub MBP-RHA1B) lub w których zastosowano MBP jako kontrolę; w tych przypadkach sygnał rozmazania ubikwitynacji nie wystąpił. Ponadto barwienie błony PVDF błękitem Coomassie wykazało równą ilość naniesionego MBP-RHA1B lub MBP we wszystkich kontrolach.

Rycina 2B przedstawia, jak wyniki ubikwitynacji in vitro różniły się w zależności od konkretnej kombinacji E2/E3. W tym przykładzie przetestowano 11 różnych enzymów E2 reprezentujących 10 różnych rodzin E2. Wykryta aktywność ubikwitynacji wahała się od braku sygnału (brak rozmycia) do wielopasmowego rozmycia rozpoczynającego się od różnych mas cząsteczkowych, co wskazuje na różne wzorce ubikwitynacji.

Rysunek 3 przedstawia wyniki testu ubikwitynacji dla wersji z mutacjami w domenach RING i K badanego białka. Brak aktywności enzymatycznej RHA1BC135S potwierdza jego niezdolność do generowania wielopasmowego rozmazania in vitro (Rysunek 3A) oraz do promowania sygnału polibikwitynacji in planta (Rysunek 3B). Warto zauważyć, że sama nadekspresja Ub z tagiem HA in planta spowodowała ubikwitynację na poziomie podstawowym we wszystkich badanych próbkach, w tym w kontroli wektorowej, w przeciwieństwie do silnego sygnału ubikwitynacji wynikającego z aktywności enzymatycznej RHA1B typu dzikiego. Co więcej, analiza mutanta RHA1BK146R sugeruje, że reszta K146 jest również niezbędna dla aktywności E3 białka RHA1B. Chociaż in vitro wykryto marginalny sygnał autoubikwitynacji (Rysunek 3A), test in planta wykazał, że mutant wykazuje deficyt aktywności E3 (Rysunek 3B, wykryto jedynie sygnał ubikwitynacji tła).

Po wygenerowaniu i biochemicznej walidacji mutanta z niedoborem E3 można zaplanować badania funkcjonalne w celu określenia biologicznej roli związanej z E3 badanej ligazy ubikwityny RING E3. W przypadku RHA1B efektor ten u nicieni tłumi sygnalizację odpornościową roślin, co objawia się hamowaniem śmierci komórkowej HR wywołanej przez Gpa2. Jak przedstawiono na Rysunku 4A, w przeciwieństwie do typu dzikiego RHA1B, mutant RHA1BC135S pozbawiony aktywności ligazy E3 nie zakłócał śmierci komórkowej HR. Biorąc pod uwagę, że najczęstszym wynikiem ubikwitynacji białka jest jego degradacja zapśredniczona przez proteasom, mutacje znajdujące się w domenie RING mogą być również wykorzystane do weryfikacji zależnej od E3 zdolności do wywoływania degradacji ich bezpośrednich i/lub pośrednich substratów. Zatem, co istotne, wyniki Western blotting na Rysunku 4B potwierdzają, że Gpa2 nie ulegał akumulacji w obecności typu dzikiego RHA1B, natomiast RHA1BC135S nie miał wpływu na stabilność białka Gpa2.

Schemat mutagenezy celowanej; etapy z użyciem starterów, PCR, metylacji, oczyszczania plazmidów, E. coli.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie zasady i etapów mutagenezy celowanej. (A) Domena RING-CH/H2 z zaznaczonymi konserwatywnymi aminokwasami Cys i His. (B) Przykład projektu starterów mutagennych. (C) Etapy mutagenezy celowanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Test ubikwitynacji białek; western blot i barwienie Coomassie; detekcja MBP-RHA1B.
Rysunek 2: Reprezentatywny test ubikwitynacji in vitro. (A) Górny żel przedstawia test ubikwitynacji obejmujący wszystkie kontrole negatywne, a dolny żel pokazuje równą ilość naniesionego materiału. (B) Zakres oczekiwanych wyników w zależności od enzymów E2. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Kud i wsp.8. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza Western blot wykazująca ubikwitynację MBP-RHA1B; wyniki eksperymentu dotyczącego oddziaływań białkowych.
Rysunek 3: Wyniki testu ubikwitynacji dla mutantów RING i K (RHA1BC135S oraz RHA1BK146R). (A) Wyniki ubikwitynacji in vitro dla RHA1BC135S oraz RHA1BK146R. (BWyniki analizy ubikwitynacji in planta dla RHA1BC135S oraz RHA1BK146RRycina została zmodyfikowana na podstawie opracowania Kud i wsp.8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Test odporności roślin na choroby (A) oraz analiza Western blot (B) w celu oceny ekspresji białek; biologia molekularna.
Rycina 4: Reprezentatywne badanie funkcjonalne funkcji biologicznych zależnych od E3. Przykład badań funkcjonalnych wykazujących funkcję biologiczną zależną od E3. (A) zależna od E3 supresja śmierci komórkowej typu HR oraz (B) degradacja roślinnego immunoreceptora Gpa2. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Kud et al8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przygotowanie reakcji PCR
1 µLplazmid (~100 ng)
1,5 µLforwardowy starter mutagenny (10 µM)
1,5 µLreverse'owy starter mutagenny (10 µM)
1 µLdNTPs (10 mM)
5 µLbufor (10x)
1 µLpolimeraza Ultra Pfu (2,5 U/µl)
39 µLddH2O
50 µLOBJĘTOŚĆ CAŁKOWITA

Tabela 1: Konfiguracja reakcji PCR

program termocyklera
195 ˚C30 s
295 ˚C30 s
360 ˚C30 s
472 ˚C5 minpowtórz kroki 2-4 30 razy
572 ˚C5 min

Tabela 2: Program termocyklera PCR

przygotowanie reakcji ligacji dla przykładu RHA1B
1.5 µLzlinearyzowany wektor pMAL-c2::MBP otrzymany poprzez trawienie enzymami BamHI i SalI (60 ng)
7 µLWstawka RHA1B/RHA1BC135S lub RHA1BK146R poddana trawieniu BamHI i SalI (25 ng)
1 µLBufor do ligazy T4 (10x)
0.5 µLligaza T4 (400 J/µL)
10 µLOBJEKTOŚĆ CAŁKOWITA

Tabela 3: Konfiguracja reakcji ligacji dla przykładu RHA1B.

Dyskusja

Wyjaśnienie biochemicznych i mechanistycznych podstaw ligaz ubikwityny typu E3 RING może znacznie przyczynić się do naszego zrozumienia ich biologicznego znaczenia w rozwoju, sygnalizacji stresu i utrzymaniu homeostazy. Opisany tutaj protokół łączy podejście mutagenezie z badaniami funkcjonalnymi in vitro i in planta. Wprowadzając substytucję pojedynczego aminokwasu w konserwatywnych resztach domeny RING poprzez mutagenezę bezpośrednią, powstały mutant z niedoborem E3 można testować równolegle z białkiem typu dzikiego, aby powiązać aktywność enzymatyczną z funkcjonalnością.

Bardzo ważne jest prawidłowe zidentyfikowanie domeny RING, a w szczególności jej konserwatywnych pozostałości Cys i His His. W tym celu można skorzystać z narzędzi internetowych, takich jak PROSITE10. Aby zdestabilizować domenę RING odpowiedzialną za rekrutację enzymu E2, Cys jest zwykle podstawiany przez Ser, który jest jego najbliższym strukturalnym zamiennikiem pozbawionym zdolności do tworzenia wiązania dwusiarczkowego używanego do koordynacji. Lorick i in. wykazali, że mutacja w którejkolwiek z tych krytycznych reszt Cys zniosłaby aktywność ubikwitynacyjną pojedynczej podjednostki RING ligazE3 5. Chociaż niektóre reszty Cys są również ważne dla wielojednostkowych kompleksów ligazy E3 zawierających białka typu RING, ze względu na wieloaspektową i dynamiczną trójwymiarową strukturę tych kompleksów ubikwitynacji i różną rolę białek typu RING, pojedyncze substytucje konserwatywnych reszt w domenie RING w wielojednostkowej ligazie E3 nie odniosły sukcesu w generowaniu fenotypu11 z niedoborem ligazy.

W przypadku mutagenezy ukierunkowanej na miejsce stwierdziliśmy, że użycie mniejszych wektorów plazmidowych i niższych cykli amplifikacji zwykle dawało wyższą skuteczność mutagenezy. Enzym Pfu można zastąpić dowolną inną polimerazą DNA o wysokiej wierności i procesowości. Ponadto, jeśli interesujący nas gen zawiera rzadkie kodony, inne barwienie E. coli , Rosetta, może być użyte do osiągnięcia wyższej wydajności rekombinowanego białka. Dodatkowo, zarówno czas inkubacji, jak i temperatura do indukcji IPTG mogą być jeszcze bardziej zoptymalizowane. Niższe temperatury zmniejszają tempo podziału E. coli , co może być korzystne dla ekspresji niektórych białek. Chociaż wyższe stężenie IPTG może poprawić ekspresję białka, hamuje również procesy podziału E. coli i nie jest zalecane.

Ligazy E3 z pojedynczą podjednostką RING nie tylko działają jako rusztowanie molekularne, które umieszcza produkt pośredni E2-Ub w bliskiej odległości od substratu, ale także stymulują aktywność przenoszenia ubikwityny przez pokrewne im E2. Ponadto, biorąc pod uwagę, że kombinacja E2/E3 jest ważna dla długości i wiązań łańcucha poliubikwityny, który decyduje o losie zmodyfikowanego substratu, wszelkie rozważania dotyczące E3 typu RING muszą obejmować ich partnerów enzymatycznych, E2s12. Jak pokazano na rysunku 3B, nie wszystkie badane E2 są kompatybilne z ligazą RHA1B. W związku z tym testy ubikwitynacji in vitro powinny być przeprowadzane równolegle z wieloma enzymami E2 reprezentującymi różne klasy E2, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych.

Przedstawiono test enzymatyczny in vitro, który wykrywa zdolność badanych białek typu RING do samoubikwitynacji. Jednak przy niewielkich modyfikacjach protokół ten można łatwo dostosować do wykrywania ubikwitynacji substratów in vitro. W tym celu mieszaninę ubikwitynacji in vitro z kroku 2.15 należy uzupełnić białkiem rekombinowanym potencjalnego substratu ligazy E3 (500 ng). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 30 °C, ubikwitynowane białko powinno być wychwycone przy użyciu 15 μl matrycy powinowactwa anty-HA (jeśli stosuje się HA-Ub lub matrycy powinowactwa anty-FLAG, jeśli stosuje się FLAG-Ub) przez mieszanie przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Po 4-krotnym umyciu kulek zimnym buforem do płukania Ub (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), wyrzuć wszystko oprócz 40 μL buforu i przejdź do kroku 2.16. Sygnał ubikwitynacji, wykrywany przez przeciwciała specyficzne odpowiednio dla Ub znakowanego epitopem i substratu, wyłaniający się z masy cząsteczkowej białka substratu, potwierdza specyficzność substratu/enzymu.

Ponadto identyfikacja substratów ligazy E3 in vivo zwykle wiąże się z wieloma wyzwaniami wynikającymi z przejściowej interakcji enzym-substrat i szybkiej degradacji ubikwitynowanego białka docelowego. Użycie mutanta z niedoborem ligazy E3, który nadal oddziałuje ze swoim celem, ale już go nie ubikwitynuje13, jest bardzo przydatną alternatywą dla dodania inhibitora proteasomalnego MG132, który nie zawsze wystarczająco zakłóca funkcję proteasomu 26S.

Wspólną cechą ligaz E3 typu RING jest tendencja do tworzenia i funkcjonowania jako homo- i/lub heterodimery. Co ciekawe, substytucja w konserwatywnych resztach domeny RING jest zwykle związana z dominującym ujemnym fenotypem, w którym zmutowana ligaza E3 typu RING blokuje aktywność enzymatyczną natywnego białka typu dzikiego13. Tak więc nadekspresja mutantów RING w planta może być alternatywnym podejściem do wyeliminowania genu ligazy E3.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Nasza praca była możliwa dzięki wsparciu finansowemu z konkurencyjnego grantu Inicjatywy Badań nad Rolnictwem i Żywnością (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato Consortium i ISDA Specialty Crop.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma-AldrichA6283
AcetosyringonSigma-AldrichD134406
żywica amylozowaNEBE8021S
ATPSigma-AldrichA1852
Inhibitor proteazy bakteryjnejSigma-AldrichP8465
Błękit bromfenolowyVWR97061-690
CaCl2Sigma-AldrichC1016
WirówkaBeckman Coultermodel: Avanti J-25
Commassie BlueVWR97061-738
Fosforan kreatynySigma-AldrichP7936
Fosfokinaza kreatynowaSigma-AldrichC3755
Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNAZYMO BADANIAD4029
DpnINEBR0176S
DTTSigma-AldrichD0632
E. coli BL21Thermo Fisher ScientificC600003
E. coli DH5α kompetentne komórkiThermo Fisher Scientific18265017
EDTASigma-Aldrich324504
FeSO4 7H2OSigma-AldrichF7002
FLAG-UBBostonBiochemU-120
GlukozaVWR188
GlicerolSigma-AldrichG5516
HA-UBBostonBiochemU-110
Blok grzewczyVWRModel: 10153-318
InkubatorVWRmodel: 1525 Cyfrowy inkubator
Wytrząsarka inkubatoraThermo Fisher Model naukowy: MaxQ 4000
IPTGRoche10724815001
KClSigma-AldrichP9333
LB RosółSigma-AldrichL3022
Liquideazot uniwersytecki chemia
MaltozaSigma-Aldrich63418
MESSigma-AldrichM3671
MetanolSigma-Aldrich34860
MgCl2Sigma-Aldrich63138
MgSO4 7H2OSigma-Aldrich63138
MikrowirówkaModel Eppendorf5424
Zestawdo oczyszczania plazmidu MiniprepZYMO RESEARCHD4015
przeciwciało monoklonalne anty-FLAGSigma-AldrichF3165
przeciwciało monoklonalne anty-HASigma-AldrichH9658
monoklonalne anty-MYCSigma-Aldrich
VWR89038-144
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NanoDropThermo Fisher Model naukowy: 2000 Igła spektrofotometru
Thermo Fisher Scientific14-826-5C
NH4ClSigma-AldrichA9434
Maszyna do PCRBio-RadModel: C1000
TłuczekVWR89038-160
Pfu UltraAgilent Technologies600380
Koktajl inhibitora proteazy roślinnejSigma-AldrichP9599
pMAL-c2NEBN8076S
PMSFSigma-AldrichP7626
PoliwinylopolipirolidonSigma-AldrichP6755
SDSSigma-Aldrich
SonicatorQsonica Sonicatorsmodel: Q125
StrzykawkaThermo Fisher Scientific22-253-260
TrisSigma-AldrichT1503
T4 ligazaNEBM0202S
: przeciwciało Zaprawa WH0004609M2 1614363

Bibliografia

  1. Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. A novel gysteine-rich sequence motif. Cell. 64, 483-484 (1991).
  2. Borden, K. L. B. RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains. Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).
  3. Barlow, P. N., Luisi, B., Milner, A., Elliott, M., Everett, R. Structure of the C3HC4 Domain by 1H-nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: A New Structural Class of Zinc-finger. Journal of Molecular Biology. 237, 201-211 (1994).
  4. Borden, K. L. B., et al. The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML. The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).
  5. Lorick, K. L., et al. RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).
  6. Jiménez-López, D., Muñóz-Belman, F., González-Prieto, J. M., Aguilar-Hernández, V., Guzmán, P. Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes. PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).
  7. Sacco, M. A., et al. The Cyst Nematode SPRYSEC Protein RBP-1 Elicits Gpa2- and RanGAP2-Dependent Plant Cell Death. PLoS Pathogens. 5, 1-14 (2009).
  8. Kud, J., et al. The potato cyst nematode effector RHA1B is a ubiquitin ligase and uses two distinct mechanisms to suppress plant immune signaling. PLoS Pathogens. 15, 1007720(2019).
  9. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  10. Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Research. 41, 344-347 (2013).
  11. Dove, K. K., Stieglitz, B., Duncan, E. D., Rittinger, K., Klevit, R. E. Molecular insights into RBR E3 ligase ubiquitin transfer mechanisms. EMBO Reports. 17, 1221-1235 (2016).
  12. Metzger, M. B., Pruneda, J. N., Klevit, R. E., Weissman, A. M. RING-type E3 ligases: Master manipulators of E2 ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitination. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1843, 47-60 (2014).
  13. Xie, Q., et al. SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals. Nature. 419, 167-170 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ligaza ubikwityny E3 typu RINGMutageneza celowanaUbikwitynacja in vitroUbikwitynacja in plantaMutant z niedoborem ligazy E3Analiza Western blotInfiltracja AgrobacteriumNicotiana benthamianaTest degradacji bia ekOdpowied nadwra liwo ci
Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.