Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Summary

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Abstract

Ubikwitynacja, jako posttranslacyjna modyfikacja białek, odgrywa ważną rolę regulacyjną w homeostazie komórek eukariotycznych. Kowalencyjne przyłączenie 76 aminokwasowych modyfikatorów ubikwityny do białka docelowego, w zależności od długości i topologii łańcucha poliubikwityny, może skutkować różnymi wynikami, od degradacji białka po zmiany w lokalizacji i / lub aktywności zmodyfikowanego białka. Trzy enzymy sekwencyjnie katalizują proces ubikwitynacji: enzym aktywujący ubikwitynę E1, enzym sprzęgający ubikwitynę E2 i ligaza ubikwityny E3. Ligaza ubikwityny E3 określa specyficzność substratową i dlatego stanowi bardzo interesujący temat badań. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowe podejście do badania związku między aktywnością enzymatyczną a funkcją ligazy ubikwityny typu E3 typu RING. Ten czteroetapowy protokół opisuje: 1) jak wygenerować mutanta z niedoborem ligazy E3 poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce ukierunkowaną na konserwatywną domenę RING; 2–3) jak badać aktywność ubikwitynacji zarówno in vitro, jak i in planta; 4) jak powiązać te analizy biochemiczne z biologicznym znaczeniem badanego białka. Wytwarzanie mutanta z niedoborem ligazy E3, który nadal oddziałuje ze swoim substratem, ale już go nie ubikwitynuje w celu degradacji, ułatwia testowanie interakcji enzym-substrat in vivo. Co więcej, mutacja w konserwatywnej domenie RING często nadaje dominujący negatywny fenotyp, który może być wykorzystany w badaniach funkcjonalnego nokautu jako alternatywne podejście do podejścia opartego na interferencji RNA. Nasze metody zostały zoptymalizowane pod kątem biologicznej roli efektora RHA1B pasożytniczego nicieni pasożytniczych roślin, który przejmuje kontrolę nad systemem ubikwitynacji gospodarza w komórkach roślinnych w celu promowania pasożytnictwa. Przy niewielkiej modyfikacji systemu ekspresji in vivo, protokół ten można zastosować do analizy dowolnej ligazy E3 typu RING, niezależnie od jej pochodzenia.

Introduction

Zdecydowana większość ligaz ubikwityny E3 należy do białek typu RING (Really Interesting New Gene). Domena palca serdecznego została pierwotnie zidentyfikowana przez Freemonta i wsp. ¹ i funkcjonalnie opisany jako domena pośrednicząca w interakcji białko-białko². Kanoniczny palec serdeczny jest specjalnym rodzajem domeny koordynującej zdefiniowanej jako konsensusowa sekwencja ośmiu konserwatywnych Cys (C) i His (H) specyficznie rozmieszczonych przez inne reszty aminokwasowe (X), C-X 2-C-X_{9-39-C-X 1-3-H-X 2-3-C}/H-X _{2-C-X 4-48-C-X 2-C}. Dwa jony Zn²⁺ są stabilizowane przez reszty rdzenia C i H poprzez unikalną topologię "krzyżowego klamrowania", przy czym C₁/C₂ i C/H₅/C₆ koordynują pierwszy jon Zn²⁺, podczas gdy C₃/H₄ i C₇/C₈ wiążą drugi (Rysunek 1A)^3,4. W zależności od obecności C lub H w piątym miejscu koordynacyjnym Zn²⁺ zdefiniowano dwie podklasy kanoniczne białek palca serdecznego: C3HC4 i C3H2C3 (odpowiednio RING-HC i RING-H2). Ponieważ domena RING ligazy ubikwityny E3 pośredniczy w interakcji między enzymami sprzęgającymi E2 a substratami, wykazano, że mutacja tych niezbędnych reszt C i H zakłóca aktywność ligazy⁵. Opisano dodatkowe pięć mniej powszechnych podklas ligaz RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T i RING-G)⁶. Ligazy ubikwityny E3 typu RING można dalej podzielić na proste i złożone enzymy E3. Proste ligazy RING E3 z pojedynczą podjednostką zawierają zarówno miejsce rozpoznawania substratu, jak i domenę RING wiążącą E2. W przeciwieństwie do tego, wielopodjednostkowy kompleks E3 typu RING albo rekrutuje substrat lub pośredniczy w wiązaniu pośredniego E2-ubikwityny z kompleksem E3. Pozostałości Lys w domenie RING, które służą jako główne miejsce przyłączenia ubikwityny do samoubikwitynacji, mogą być również ważne dla aktywności ligazy E3.

Nie wszystkie białka zawierające RING funkcjonują jako ligazy E3. W związku z tym przewidywania bioinformatyczne dotyczące domeny palca serdecznego i zdolności do ubikwitynacji białek zależnych od E2 muszą zostać zweryfikowane biochemicznie i powiązane z biologiczną rolą badanego białka. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół określający, w jaki sposób wykrywać i funkcjonalnie charakteryzować aktywność enzymatyczną ligaz ubikwityny RING typu E3, zarówno in vitro, jak i in planta, za pomocą podejścia mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Reprezentatywne wyniki z tego rurociągu przedstawiono dla ligazy E3 RHA1B typu RING. RHA1B jest białkiem efektorowym wytwarzanym przez pasożytniczego nicienia cystowego Globodera pallida w celu tłumienia odporności roślin i manipulowania morfologią komórek korzeniowych roślin. Aby chronić się przed inwazją patogenów/pasożytów, rośliny wyewoluowały domenę wiążącą nukleotydy i receptory immunologiczne bogate w powtórzenia leucyny (NB-LRR), które wykrywają obecność patogenu lub pasożyta iw konsekwencji rozwijają reakcję nadwrażliwości (HR), która jest formą szybkiej i zlokalizowanej śmierci komórki występującej w miejscu infekcji w celu zatrzymania kolonizacji patogenów. Jednym z takich receptorów immunologicznych jest białko Gpa2 ziemniaka, które nadaje odporność na niektóre izolaty G. pallida (populacje polowe D383 i D372)⁷.

Korzystając z przedstawionych protokołów, ostatnio odkryto, że RHA1B zakłóca sygnalizację immunologiczną roślin w sposób zależny od E3, kierując immunoreceptor roślinny Gpa2 do ubikwitynacji i degradacji⁸.

Protocol

1. Mutageneza kierowana na stronę (Rysunek 1)

1. Zidentyfikuj konserwatywne aminokwasy Cys i His w domenie RING (Rysunek 1A) i zaprojektuj startery niosące interesujący nas kodon podstawienia otoczony 15 parami zasad po obu stronach miejsca mutacji (Rysunek 1B).
2. Wprowadzić pożądaną mutację poprzez amplifikację plazmidu zawierającego gen będący przedmiotem zainteresowania metodą PCR, przy użyciu starterów mutagennych i polimerazy DNA o wysokiej wierności zawierającej Pfu w 50 μl całkowitej objętości reakcji PCR, jak pokazano w Tabeli 1 i Tabeli 2, zgodnie z protokołem producenta.
3. Trawić rodzicielskie metylowane i częściowo zmetylowane DNA pochodzące z Escherichia coli, dodając 3 μl enzymu restrykcyjnego DpnI bezpośrednio do reakcji PCR (etap 1.2) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 2 h.
   UWAGA: Metylacja to potranskrypcyjna modyfikacja białka, która jest dodawana do plazmidu wytworzonego i wyizolowanego z bakterii. Nowe kopie plazmidu generowanego przez PCR nie mają metylacji, dlatego nowe kopie pozostaną nienaruszone podczas leczenia DpnI.
4. Oczyść zmutagizowane plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA opartego na technologii kolumny wirowej i wymyj DNA za pomocą 50 μl wody.
5. Przekształć chemicznie kompetentne komórki DH5α E. coli za pomocą 0,5 μl odzyskanego mutagenizowanego plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, inkubuj kompetentne komórki z DNA na lodzie przez 30 minut, a następnie poddawaj je szokowi cieplnemu przez 20 s w temperaturze 42 °C i ponownie umieść probówki na lodzie na 2 minuty. Inkubować komórki z 500 μl pożywki LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy 250 obr./min, a następnie rozprowadzać je na selektywnych pasztetach.
6. Sprawdź pożądaną mutację przez sekwencjonowanie Sanger plazmidów DNA wyizolowanych z E. coli.

2. Oczyszczanie białek rekombinowanych i test ubikwitynacji in vitro

1. Sklonuj dzikie geny RING i zmutowane geny RING będące przedmiotem zainteresowania do wektora pMAL-c2 (postępuj zgodnie z protokołem producenta; Tabela 3) w celu połączenia tych genów ze znacznikiem epitopu MBP, który umożliwia jednoetapowe oczyszczanie przy użyciu żywicy amylozy. Powstałe konstrukty wprowadzić do szczepu E. coli BL21 zgodnie z opisem w kroku 1.5.
2. Hoduj szczep E. coli BL21 zawierający pożądany konstrukt w 50 ml płynnego podłoża LB w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny, aż osiągnie fazę logarytmiczną (OD₆₀₀ 0,4-0,6).
3. Dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1–1 mM w celu wywołania ekspresji interesującego nas białka rekombinowanego znakowanego MBP i inkubować kulturę E. coli przez 2–3 godziny w temperaturze 28 °C. Po inkubacji umieścić kulturę na lodzie.
   UWAGA: Wykonaj kroki 2.4–2.13 na lodzie, aby chronić białka przed degradacją.
4. Aby sprawdzić skuteczność indukcji, zbierz 1,5 ml indukowanych komórek, odwiruj je w temperaturze 13 000 x g przez 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 20 μl bufora ładującego 2x SDS-PAGE (24 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glicerol, 4 mM DTT, 0,04% (w/v) błękit bromofenolowy).
5. Gotuj próbki przez 5 minut i umieść je na 10% żelu SDS-PAGE. Aby wizualnie ocenić akumulację białka fuzyjnego MBP (masa cząsteczkowa białka będącego przedmiotem zainteresowania + 42,5 kDa MBP), należy wybarwić żel przez 20 minut, mieszając buforem barwiącym Coomassie (50% metanolu, 10% kwasu octowego, 0,1% błękitu Coomassie) i odbarwiając przez noc buforem odbarwiającym (20% metanolu, 10% kwasu octowego).
6. Pozostałe komórki E. coli zebrać przez odwirowanie przy 1,350 x g przez 6 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml buforu kolumnowego (20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, inhibitor proteazy bakteryjnej).
   UWAGA: Jest to dobre miejsce na zatrzymanie protokołu na noc. Zamrożone komórki można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze -20 °C.
7. Rozbij komórki E. coli, umieszczając probówkę zawierającą bakterie w łaźni lodowo-wodnej i stosując 10 cykli sonikacji: 10-sekundowa sonikacja przy 30% amperze, a następnie 20-sekundowe przerwy.
8. Odwirować próbkę o masie 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zachować supernatant (ekstrakt surowy).
9. Przygotuj 500 μl żywicy amylozowej w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć żywicę, dodając 10 ml buforu do zimnej kolumny i odwirowując w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 5 minut. Zrób to 2x.
10. Dodać 5 ml surowego ekstraktu do probówki z żywicą amylozową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
11. Odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
12. Dodać 10 ml buforu kolumnowego do osadu żywicy i inkubować przez 20 minut. Następnie odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Powtórz ten krok 2 razy.
13. Białko fuzyjne należy wypłukać 0,5 ml buforu kolumnowego zawierającego 10 mM maltozy, inkubując próbkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Odwirować przy 1,800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zebrać eluowane białko. Powtórz ten krok 2 razy.
14. Dializuj 1 ml frakcji białkowej w stosunku do zimnego PBS. Porcję białka przelać do jednorazowych probówek (10–20 μl), aby uniknąć zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.
15. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda⁹.
16. Ustawić reakcję ubikwitynacji in vitro w całkowitej objętości 30 μl, mieszając 40 ng E1 (np. AtUBA1), 100 ng E2 (np. AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg białka typu MBP-RING i 2 μg FLAG-Ub (lub HA-Ub) w buforze ubikwitynacyjnym (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 30 mM fosforan kreatyny, 50 μg/ml fosfokinaza kreatynowa). Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 2 godz
    UWAGA: Przygotuj 20x bufor ubikwitynacyjny i przechowuj go do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C w małych porcjach do jednorazowego użytku. Fosfokinaza kreatynowa łatwo traci swoją aktywność enzymatyczną, gdy bufor jest wielokrotnie rozmrażany i zamrażany.
17. Zakończyć reakcję, mieszając 30 μl próbek z 7,5 μl 5x buforu ładującego SDS-PAGE (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,1% (w/v) błękit bromofenolowy) i gotując przez 5 min.
18. Oddziel białka za pomocą 7,5% elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie przenieś na błonę PDVF i wykryj ubikwitynację przez Western blot za pomocą anty-FLAG (lub anty-HA).
19. Wybarwić membranę PVDF kolorem Coomassie na niebiesko, aby sprawdzić równe obciążenie badanego białka typu MBP-RING.

3. Przejściowa ekspresja białka za pośrednictwem Agrobacterium w liściach Nicotiana benthamiana i w teście ubikwitynacji planta

1. Szczepy Agrobacterium tumefaciens należy umieścić w odpowiednich smugach przenoszących gen znakowany epitopem (np. HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, HA-Ub) i pusty wektor jako kontrolę na pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki selekcyjne.
2. Po 2 dniach wzrostu w temperaturze 28 °C należy zebrać pojedyncze kolonie i hodować je w płynnym podłożu LB z odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 28 °C/250 obr./min przez kolejne 24 godziny.
3. Przenieść 100 μl kultury agrobakteryjnej do 3 ml świeżego LB z odpowiednimi antybiotykami i inkubować kulturę przez dodatkowe 4–6 godzin w temperaturze 28 °C z rotacją (250 obr./min) do późnej fazy wzrostu wykładniczego.
4. Odwirować komórki agrobakteryjne przy 1,800 x g przez 6 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 3 ml buforu do płukania (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukozy, 2 mM NaH₂PO₄). Powtórz ten krok 2 razy.
5. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić komórki w buforze indukcyjnym (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukozy, 2 mM NaH₂PO_4, 200 μM acetosyringonu, 37 mM NH₄Cl, 5 mM MgSO_{4,7H 2}O, 4 mM KCl, 18 μM FeSO_{4,7H 2}O, 2 mM CaCl₂). Inkubować komórki z buforem indukcyjnym przez dodatkowe 10–12 godzin w temperaturze 28 °C.
   UWAGA: Acetosyringon indukuje transfer T-DNA.
6. Odwirować komórki przy 1 800 x g przez 6 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml buforu infiltracyjnego (10 mM MES pH 5,5, 200 μM acetosyringonu).
   UWAGA: Jeśli agrobakterie agregują się po inkubacji z buforem indukcyjnym, pozwól zagregowanym komórkom opaść na dno probówki, pozostawiając ją na stole na kilka minut, a następnie przenieś klarowną zawiesinę Agrobacterium do nowej probówki przed przystąpieniem do kroku 3.6.
7. Zmierzyć stężenie bakterii przy użyciu wartości OD₆₀₀ (gęstość optyczna przy absorbancji 600 nm). Dostosuj wartości OD₆₀₀ do żądanych.
   UWAGA: Zwykle wartość OD₆₀₀ między 0,2 a 0,4 najlepiej sprawdza się w przypadku pojedynczego odcisku plamy agrobakteryjnej. W przypadku zastosowania kombinacji różnych szczepów agrobakteryjnych, całkowite wartości OD₆₀₀ szczepów agrobakteryjnych nie powinny przekraczać 1.
8. Agroinfiltrować 4-tygodniowe liście N. bethamiana, delikatnie nakłuwając je igłą, a następnie ręcznie wstrzykując Agrobacterium za pomocą strzykawki bez igły. Zakreśl markerem obszar naciekanego liścia (zwykle o średnicy 1–2 cm).
9. Zbierz naciekane tkanki liścia 36 godzin po infiltracji. Zmiel tkankę na drobny proszek z ciekłym azotem.
10. Zawieszony proszek tkankowy z 300 μl buforu do ekstrakcji białek (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glicerolu, 1% poliwinylopolipirolidonu, 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteazy roślinnej) i odwirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
11. Przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE do końcowego stężenia 1x i gotować przez 5 min.
12. Oddziel surowe białka od 10% żeli SDS-PAGE, przenieś na membrany PVDF i sonduj anty-HA w celu wykrycia ubikwitynacji roślin.

4. Ustalenie związku między aktywnością enzymatyczną a funkcją planty

UWAGA: Na przykład, RHA1B wspomaga degradację opornego białka Gpa2 w celu zahamowania śmierci komórek HR. Ten krok pokazuje, jak sprawdzić, czy te zjadliwe działania RHA1B są zależne od E3.

1. Szczepy Agrobacterium tumefaciens należy umieścić w smugach przenoszących oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania (w tym przykładzie HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, myc-Gpa2, RBP1) i pusty wektor jako kontrolę. Postępuj zgodnie z krokami 3.1–3.8 dla przygotowania Agrobacterium i wstrzyknięcia na liście N. bethamiana.
2. W przypadku zależnej od E3 degradacji białka substratowego należy postępować zgodnie z krokami 3.9–3.12 i przeprowadzić Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu wykrycia akumulacji białka w komórkach roślinnych (np. anty-HA i anty-MYC).
3. W przypadku zahamowania śmierci komórki za pośrednictwem odpowiedzi nadwrażliwości zależnej od E3 (HR), należy monitorować liście agroinfiltrowane pod kątem objawów śmierci komórek HR 2-4 dni po infiltracji.

Results

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki dla protokołu użytego do badania pojedynczej podjednostki E3 ligazy ubikwityny RHA1B, która ma przewidywaną przez PROSITE domenę typu RING-H2 (132–176 aminokwasów)¹⁰. Jak pokazano na Rysunek 1, aby uzyskać zmutowane białko z niedoborem E3, co najmniej jedno z ośmiu konserwatywnych Cs lub Hs w domenie RING (Rysunek 1A) musi zostać zmutagizowane (Rysunek 1B). W ten sposób w pierwszym etapie wygenerowano dwie zmutowane wersje RHA1B, RHA1B^C135S (podstawienie Cys przez Ser w konserwatywnym C₃ domeny RING) i RHA1B^K146R (podstawienie Lys przez Arg w jedynym Lys obecnym w RHA1B). Chociaż pojedyncze podjednostki E3 ligaz pośredniczą w przenoszeniu ubikwityny z ubikwityny zawierającej E2 do substratu, a nie bezpośrednio oddziałują z ubikwityną, samoubikwitynacja E3 w Lys może być wymagana dla jej maksymalnej aktywności enzymatycznej.

Wyniki Western blot w klasie Rysunek 2A pokazują typowy pozytywny wynik testu ubikwitynacji in vitro, z wielopasmowym rozmazem rozpoczynającym się od masy cząsteczkowej badanego białka (np. RHA1B z fuzją MPB ~100 kDa) i postępującym w górę. Przeciwciało anty-HA rozpoznało Ub znakowane HA, włączone do łańcucha poliubikwitynacji o różnych długościach, tworząc ten typowy rozmaz podobny do drabinki związany z ubikwityną. Aby potwierdzić pozytywne wyniki, Rysunek 2A przedstawia również wszystkie ważne kontrole negatywne, w których brakuje poszczególnych składników (E1, E2, Ub lub MBP-RHA1B) lub które używają MBP jako kontroli i nie mają rozmazanego sygnału ubikwitynacji. Co więcej, niebieskie zabarwienie membrany PVDF Coomassie wykazało równe obciążenie MBP-RHA1B lub MBP we wszystkich kontrolach.

Rysunek 2B pokazuje, jak wyniki ubikwitynacji in vitro różniły się w zależności od konkretnej kombinacji E2/E3. W tym przykładzie przetestowano 11 różnych E2 reprezentujących 10 różnych rodzin E2. Wykryta aktywność ubikwitynacji wahała się od braku sygnału (brak rozmazu) do rozmazu wielopasmowego rozpoczynającego się przy różnych masach cząsteczkowych, co wskazuje na różne wzorce ubikwitynacji.

Rysunek 3 pokazuje wyniki testów ubikwitynacji dla wersji RING i K testowanego białka. Brak aktywności enzymatycznej RHA1B^C135S jest wspierany przez jego niezdolność do generowania wielopasmowego rozmazu in vitro (Rysunek 3A) lub promowania sygnału poli-ubikwitynacji w planta (Rysunek 3B). Warto zauważyć, że nadekspresja Ub znakowanego HA w roślinie sama w sobie dawała ubikwitynację na poziomie podstawowym we wszystkich badanych próbkach, w tym w kontroli wektora, w przeciwieństwie do silnego sygnału ubikwitynacji nadawanego przez aktywność enzymatyczną dzikiego typu RHA1B. Ponadto analiza mutanta^{RHA1B K146R} sugeruje, że reszta K146 jest również niezbędna dla aktywności E3 RHA1B. Chociaż w in vitro wykryto marginalny sygnał samoubikwitynacji (Figura 3A), test in planta wykazał, że mutant ma niedobór E3 (Rysunek 3B, wykryto tylko sygnał ubikwitynacji tła).

Po wygenerowaniu i biochemicznej walidacji mutanta z niedoborem E3, można zaprojektować badania funkcjonalne w celu określenia biologicznej roli testowanej ligazy ubikwityny RING E3 związanej z E3. W przypadku RHA1B ten efektor nicieni hamuje roślinną sygnalizację immunologiczną, co objawia się supresją śmierci komórek HR wywołanej przez Gpa2. Jak przedstawiono w Rysunek 4A, w przeciwieństwie do dzikiego typu RHA1B, mutant^{RHA1B C135S} pozbawiony aktywności ligazy E3 nie ingerował w śmierć komórek HR. Biorąc pod uwagę, że najczęstszym wynikiem ubikwitynacji białka jest jego degradacja za pośrednictwem proteasomu, mutacje znajdujące się w domenie RING można również wykorzystać do zweryfikowania zależnej od E3 zdolności do wywoływania degradacji ich bezpośrednich i/lub pośrednich substratów. Tak więc, co istotne, wyniki Western blot w Rysunek 4B potwierdza, że Gpa2 nie gromadził się w obecności dzikiego typu RHA1B, ale RHA1B^C135S nie miał wpływu na stabilność białka Gpa2.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie zasady i etapów związanych z mutagenezą ukierunkowaną na miejsce. (A) Domena RING-CH/H2 z zaznaczonymi konserwatywnymi aminokwasami Cys i J. (B) Przykład projektu starterów mutagennych. (C) Etapy mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywny test ubikwitynacji in vitro. (A) Górny żel wykazuje test ubikwitynacji obejmujący wszystkie kontrole ujemne, a dolny żel wykazuje równe obciążenie. (B) Zakres oczekiwanych wyników w zależności od enzymów E2. Ten rysunek został zmodyfikowany z Kud et al⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyniki testu ubikwitynacji dla mutantów RING i K (RHA1B^C135S i RHA1B^K146R). (A) Wyniki ubikwitynacji in vitro dla RHA1B^C135S i RHA1B^K146R. (B) Wyniki testu ubikwitynacji w roślinach dla RHA1B^C135S i RHA1B^K146R. Ten rysunek został zmodyfikowany z Kud et al⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Reprezentatywne badanie funkcjonalne dla funkcji biologicznych zależnych od E3. Przykład badań funkcjonalnych pokazujących funkcję biologiczną zależną od E3. (A) zależna od E3 supresja śmierci komórek HR i (B) degradacja immunoreceptora roślinnego Gpa2. Ten rysunek został zmodyfikowany z Kud et al⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Konfiguracja PCR
1 μL	plazmid (~100 ng)
1,5 μL	F składnik mutagenny (10 μM)
1,5 μL	R starter mutagenny (10 μM)
1 μL	dNTP (10 mM)
5 μL	bufor (10x)
1 μL	Polimeraza Ultra Pfu (2,5 U/μl)
39 μL	ddH2O
50 μL	CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ

Tabela 1: Konfiguracja reakcji PCR

program termocyklera
1	95 °C	30 sekund
cyfra arabska	95 °C	30 sekund
3	60 °C	30 sekund
4	72 °C	Czas trwania: 5 min	powtórz 2-4 30 razy
5	72 °C	Czas trwania: 5 min

Tabela 2: Program termocyklera PCR

reakcja na podwiązanie ustawiona dla przykładu RHA1B
1,5 μL	pMAL-c2::MBP linearyzowany wektor przez trawienie z BamHI i SalI (60 ng)
7 μL	RHA1B/RHA1BC135S lub RHA1BK146R wkładka strawiona przez BamHI i SalI (25 ng)
1 μL	bufor ligazy T4 (10x)
0,5 μL	Ligaza T4 (400 U/μL)
10 μL	CAŁKOWITA OBJĘTOŚĆ

Tabela 3: Reakcja na podwiązanie ustawiona dla przykładu RHA1B.

Discussion

Wyjaśnienie biochemicznych i mechanistycznych podstaw ligaz ubikwityny typu E3 RING może znacznie przyczynić się do naszego zrozumienia ich biologicznego znaczenia w rozwoju, sygnalizacji stresu i utrzymaniu homeostazy. Opisany tutaj protokół łączy podejście mutagenezie z badaniami funkcjonalnymi in vitro i in planta. Wprowadzając substytucję pojedynczego aminokwasu w konserwatywnych resztach domeny RING poprzez mutagenezę bezpośrednią, powstały mutant z niedoborem E3 można testować równolegle z białkiem typu dzikiego, aby powiązać aktywność enzymatyczną z funkcjonalnością.

Bardzo ważne jest prawidłowe zidentyfikowanie domeny RING, a w szczególności jej konserwatywnych pozostałości Cys i His His. W tym celu można skorzystać z narzędzi internetowych, takich jak PROSITE¹⁰. Aby zdestabilizować domenę RING odpowiedzialną za rekrutację enzymu E2, Cys jest zwykle podstawiany przez Ser, który jest jego najbliższym strukturalnym zamiennikiem pozbawionym zdolności do tworzenia wiązania dwusiarczkowego używanego do koordynacji. Lorick i in. wykazali, że mutacja w którejkolwiek z tych krytycznych reszt Cys zniosłaby aktywność ubikwitynacyjną pojedynczej podjednostki RING ligaz^E3 5. Chociaż niektóre reszty Cys są również ważne dla wielojednostkowych kompleksów ligazy E3 zawierających białka typu RING, ze względu na wieloaspektową i dynamiczną trójwymiarową strukturę tych kompleksów ubikwitynacji i różną rolę białek typu RING, pojedyncze substytucje konserwatywnych reszt w domenie RING w wielojednostkowej ligazie E3 nie odniosły sukcesu w generowaniu fenotypu¹¹ z niedoborem ligazy.

W przypadku mutagenezy ukierunkowanej na miejsce stwierdziliśmy, że użycie mniejszych wektorów plazmidowych i niższych cykli amplifikacji zwykle dawało wyższą skuteczność mutagenezy. Enzym Pfu można zastąpić dowolną inną polimerazą DNA o wysokiej wierności i procesowości. Ponadto, jeśli interesujący nas gen zawiera rzadkie kodony, inne barwienie E. coli , Rosetta, może być użyte do osiągnięcia wyższej wydajności rekombinowanego białka. Dodatkowo, zarówno czas inkubacji, jak i temperatura do indukcji IPTG mogą być jeszcze bardziej zoptymalizowane. Niższe temperatury zmniejszają tempo podziału E. coli , co może być korzystne dla ekspresji niektórych białek. Chociaż wyższe stężenie IPTG może poprawić ekspresję białka, hamuje również procesy podziału E. coli i nie jest zalecane.

Ligazy E3 z pojedynczą podjednostką RING nie tylko działają jako rusztowanie molekularne, które umieszcza produkt pośredni E2-Ub w bliskiej odległości od substratu, ale także stymulują aktywność przenoszenia ubikwityny przez pokrewne im E2. Ponadto, biorąc pod uwagę, że kombinacja E2/E3 jest ważna dla długości i wiązań łańcucha poliubikwityny, który decyduje o losie zmodyfikowanego substratu, wszelkie rozważania dotyczące E3 typu RING muszą obejmować ich partnerów enzymatycznych, E2s¹². Jak pokazano na rysunku 3B, nie wszystkie badane E2 są kompatybilne z ligazą RHA1B. W związku z tym testy ubikwitynacji in vitro powinny być przeprowadzane równolegle z wieloma enzymami E2 reprezentującymi różne klasy E2, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych.

Przedstawiono test enzymatyczny in vitro, który wykrywa zdolność badanych białek typu RING do samoubikwitynacji. Jednak przy niewielkich modyfikacjach protokół ten można łatwo dostosować do wykrywania ubikwitynacji substratów in vitro. W tym celu mieszaninę ubikwitynacji in vitro z kroku 2.15 należy uzupełnić białkiem rekombinowanym potencjalnego substratu ligazy E3 (500 ng). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 30 °C, ubikwitynowane białko powinno być wychwycone przy użyciu 15 μl matrycy powinowactwa anty-HA (jeśli stosuje się HA-Ub lub matrycy powinowactwa anty-FLAG, jeśli stosuje się FLAG-Ub) przez mieszanie przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Po 4-krotnym umyciu kulek zimnym buforem do płukania Ub (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), wyrzuć wszystko oprócz 40 μL buforu i przejdź do kroku 2.16. Sygnał ubikwitynacji, wykrywany przez przeciwciała specyficzne odpowiednio dla Ub znakowanego epitopem i substratu, wyłaniający się z masy cząsteczkowej białka substratu, potwierdza specyficzność substratu/enzymu.

Ponadto identyfikacja substratów ligazy E3 in vivo zwykle wiąże się z wieloma wyzwaniami wynikającymi z przejściowej interakcji enzym-substrat i szybkiej degradacji ubikwitynowanego białka docelowego. Użycie mutanta z niedoborem ligazy E3, który nadal oddziałuje ze swoim celem, ale już go nie ubikwitynuje¹³, jest bardzo przydatną alternatywą dla dodania inhibitora proteasomalnego MG132, który nie zawsze wystarczająco zakłóca funkcję proteasomu 26S.

Wspólną cechą ligaz E3 typu RING jest tendencja do tworzenia i funkcjonowania jako homo- i/lub heterodimery. Co ciekawe, substytucja w konserwatywnych resztach domeny RING jest zwykle związana z dominującym ujemnym fenotypem, w którym zmutowana ligaza E3 typu RING blokuje aktywność enzymatyczną natywnego białka typu dzikiego¹³. Tak więc nadekspresja mutantów RING w planta może być alternatywnym podejściem do wyeliminowania genu ligazy E3.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	A6283
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406
żywica amylozowa	NEB	E8021S
ATP	Sigma-Aldrich	A1852
Inhibitor proteazy bakteryjnej	Sigma-Aldrich	P8465
Błękit bromfenolowy	VWR	97061-690
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
Wirówka	Beckman Coulter	model: Avanti J-25
Commassie Blue	VWR	97061-738
Fosforan kreatyny	Sigma-Aldrich	P7936
Fosfokinaza kreatynowa	Sigma-Aldrich	C3755
Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA	ZYMO BADANIA	D4029
DpnI	NEB	R0176S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
E. coli BL21	Thermo Fisher Scientific	C600003
E. coli DH5α kompetentne komórki	Thermo Fisher Scientific	18265017
EDTA	Sigma-Aldrich	324504
FeSO4 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002
FLAG-UB	BostonBiochem	U-120
Glukoza	VWR	188
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
HA-UB	BostonBiochem	U-110
Blok grzewczy	VWR	Model: 10153-318
Inkubator	VWR	model: 1525 Cyfrowy inkubator
Wytrząsarka inkubatora	Thermo Fisher Model naukowy	: MaxQ 4000
IPTG	Roche	10724815001
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
LB Rosół	Sigma-Aldrich	L3022
Liquide	azot uniwersytecki chemia
Maltoza	Sigma-Aldrich	63418
MES	Sigma-Aldrich	M3671
Metanol	Sigma-Aldrich	34860
MgCl2	Sigma-Aldrich	63138
MgSO4 7H2O	Sigma-Aldrich	63138
Mikrowirówka	Model Eppendorf	5424
Zestaw	do oczyszczania plazmidu MiniprepZYMO RESEARCH	D4015
przeciwciało monoklonalne anty-FLAG	Sigma-Aldrich	F3165
przeciwciało monoklonalne anty-HA	Sigma-Aldrich	H9658
monoklonalne anty-MYC			Sigma-Aldrich
	VWR	89038-144
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NanoDrop	Thermo Fisher Model naukowy	: 2000 Igła spektrofotometru
	Thermo Fisher Scientific	14-826-5C
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Maszyna do PCR	Bio-Rad	Model: C1000
Tłuczek	VWR	89038-160
Pfu Ultra	Agilent Technologies	600380
Koktajl inhibitora proteazy roślinnej	Sigma-Aldrich	P9599
pMAL-c2	NEB	N8076S
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Poliwinylopolipirolidon	Sigma-Aldrich	P6755
SDS	Sigma-Aldrich
Sonicator	Qsonica Sonicators	model: Q125
Strzykawka	Thermo Fisher Scientific	22-253-260
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
T4 ligaza	NEB	M0202S