Dereplikacja antybiotyków przy użyciu platformy oporności na antybiotyki

Podsumowanie

Opisujemy platformę, która wykorzystuje bibliotekę izogenicznych antybiotykoopornych Escherichia coli do dereplikacji antybiotyków. Tożsamość antybiotyku wytwarzanego przez bakterie lub grzyby można wywnioskować na podstawie wzrostu E. coli wyrażającego odpowiedni gen oporności. Ta platforma jest ekonomicznie efektywna i oszczędza czas.

Streszczenie

Jednym z głównych wyzwań w poszukiwaniu nowych antybiotyków z naturalnych ekstraktów produktów jest ponowne odkrycie powszechnie występujących związków. Aby sprostać temu wyzwaniu, na próbkach będących przedmiotem zainteresowania przeprowadza się dereplikację, czyli proces identyfikacji znanych związków. Metody dereplikacji, takie jak separacja analityczna, a następnie spektrometria mas, są czasochłonne i wymagają dużych zasobów. Aby usprawnić proces dereplikacji, opracowaliśmy platformę oporności na antybiotyki (ARP). ARP to biblioteka około 100 genów oporności na antybiotyki, które zostały indywidualnie sklonowane do Escherichia coli. Ta kolekcja szczepów ma wiele zastosowań, w tym opłacalną i łatwą metodę dereplikacji antybiotyków. Proces ten polega na fermentacji drobnoustrojów wytwarzających antybiotyki na powierzchni prostokątnych szalek Petriego zawierających pożywkę stałą, umożliwiając w ten sposób wydzielanie i dyfuzję metabolitów wtórnych przez pożywkę. Po 6-dniowym okresie fermentacji biomasa mikrobiologiczna jest usuwana, a do szalki Petriego dodaje się cienką nakładkę agarową, aby uzyskać gładką powierzchnię i umożliwić wzrost szczepów wskaźnikowych E. coli. Nasza kolekcja szczepów ARP jest następnie przypinana do powierzchni płytki Petriego zawierającej antybiotyk. Płytka jest następnie inkubowana przez noc, aby umożliwić wzrost E. coli na powierzchni nakładki. Na tej powierzchni rosną tylko szczepy odporne na określony antybiotyk (lub klasę), co umożliwia szybką identyfikację wyprodukowanego związku. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana do identyfikacji producentów znanych antybiotyków oraz jako środek do identyfikacji tych, którzy wytwarzają nowe związki.

Wprowadzenie

Od czasu odkrycia penicyliny w 1928 roku, naturalne produkty pochodzące z mikroorganizmów środowiskowych okazały się bogatym źródłem związków przeciwdrobnoustrojowych¹. Około 80% antybiotyków będących produktami naturalnymi pochodzi z bakterii z rodzaju Streptomyces i innych promieniowców, podczas gdy pozostałe 20% jest wytwarzane przez gatunki grzybów¹. Niektóre z najczęstszych rusztowań antybiotykowych stosowanych w klinice, takie jak β-laktamy, tetracykliny, ryfamycyny i aminoglikozydy, zostały pierwotnie wyizolowane z drobnoustrojów². Jednak ze względu na wzrost liczby bakterii wielolekoopornych (MDR), nasz obecny panel antybiotyków stał się mniej skuteczny w leczeniu^3,4. Należą do nich patogeny "ESKAPE" (tj. enterokoki oporne na wankomycynę i oporne na β-laktamy Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii i Enterobacter sp.), które są podzbiorem bakterii uznanych za związane z najwyższym ryzykiem przez szereg głównych organów zdrowia publicznego, takich jak Światowa Organizacja Zdrowia^3,4,5. Pojawienie się i globalne rozprzestrzenianie się tych patogenów MDR powoduje ciągłe zapotrzebowanie na nowe antybiotyki^3,4,5. Niestety, ostatnie dwie dekady pokazały, że odkrycie nowych antybiotyków ze źródeł mikrobiologicznych jest coraz trudniejsze⁶. Obecne podejścia do odkrywania leków obejmują wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków bioaktywnych, w tym biblioteki ekstraktów produktów naturalnych, co pozwala na testowanie tysięcy ekstraktów w danym czasie². Jednak po wykryciu aktywności przeciwdrobnoustrojowej następnym krokiem jest analiza zawartości surowego ekstraktu w celu zidentyfikowania składnika aktywnego i wyeliminowania tych zawierających znane lub nadmiarowe związki^7,8. Proces ten, określany jako dereplikacja, jest niezbędny, aby zapobiec i/lub znacznie skrócić czas poświęcony na ponowne odkrycie znanych antybiotyków^7,9. Chociaż jest to niezbędny krok w odkrywaniu leków naturalnych, dereplikacja jest notorycznie pracochłonna i wymaga dużych zasobów¹⁰.

Odkąd Beutler et al. po raz pierwszy ukuli termin "dereplikacja", podjęto intensywne wysiłki w celu opracowania innowacyjnych strategii szybkiej identyfikacji znanych antybiotyków^11,12. Obecnie najpowszechniejszymi narzędziami używanymi do dereplikacji są analityczne systemy chromatograficzne, takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa, spektrometria mas i metody wykrywania oparte na magnetycznym rezonansie jądrowym^11,13. Niestety, każda z tych metod wymaga użycia drogiego sprzętu analitycznego i wyrafinowanej interpretacji danych.

Próbując opracować metodę dereplikacji, która może być szybko przeprowadzona bez specjalistycznego sprzętu, stworzyliśmy platformę oporności na antybiotyki (ARP)¹⁰. ARP może być wykorzystany do odkrywania adiuwantów antybiotykowych, profilowania nowych związków antybiotykowych przeciwko znanym mechanizmom oporności oraz dereplikacji znanych antybiotyków w ekstraktach pochodzących z promieniowców i innych drobnoustrojów. W tym miejscu skupiamy się na jego zastosowaniu w dereplikacji antybiotyków. ARP wykorzystuje bibliotekę izogenicznych szczepów Escherichia coli wykazujących ekspresję indywidualnych genów oporności, które są skuteczne przeciwko najczęściej ponownie odkrywanym antybiotykom^14,15. Gdy biblioteka E. coli jest hodowana w obecności wtórnego organizmu wytwarzającego metabolity, tożsamość związku można wywnioskować na podstawie wzrostu szczepów E. coli, które wyrażają powiązany z nim gen odporności¹⁰. Kiedy po raz pierwszy opisano ARP, biblioteka składała się z >40 genów nadających oporność na 16 klas antybiotyków. Pierwotny szablon dereplikacji został zaprojektowany tak, aby obejmował podzbiór genów oporności na każdą klasę antybiotyków, aby dostarczyć informacji na temat podklasy antybiotyków podczas procesu dereplikacji. Obecnie ARP składa się z >90 genów, które nadają oporność na 18 klas antybiotyków. Korzystając z naszej obszernej kolekcji genów oporności, opracowano wtórny szablon dereplikacji, który jest znany jako platforma minimalnej oporności na antybiotyki (MARP). Ten szablon został stworzony w celu wyeliminowania nadmiarowości genów i po prostu dostarczenia informacji dotyczących ogólnej klasy antybiotyków, z którą związany jest zdereplikowany metabolit. Dodatkowo, matryca MARP posiada zarówno typ dziki, jak i hiperprzepuszczalny/niedobór wypływu szczep E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC), w porównaniu z pierwotnym wcieleniem ARP, który wykorzystuje tylko szczep hiperprzepuszczalny. Ten unikalny aspekt tworzy dodatkowe fenotypy podczas dereplikacji, co wskazuje na zdolność związków do przenikania przez zewnętrzną błonę bakterii Gram-ujemnych. W tym miejscu opisujemy solidny protokół, którego należy przestrzegać podczas dereplikacji za pomocą ARP i/lub MARP, podkreślamy najważniejsze kroki, które należy wykonać, i omawiamy różne możliwe wyniki.

Protokół

1. Przygotowanie zapasów glicerolu w bibliotece E. coli (ze skosów agarowych)

1. Szczepy ARP/MARP E. COLI należy rozprowadzić na szalkach Petriego zawierających agar LB i odpowiedni marker do wyboru (Tabela 1).
2. Przygotować kultury dla każdego ze szczepów E. coli, zaszczepiając 3 ml LB zawierającego odpowiedni marker do wyboru pojedynczą kolonią. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem (250 obr./min).
3. Połącz 800 μl kultury i 200 μl sterylnego 80% glicerolu w 1,8 ml kriowialu. Wymieszać, odwracając probówki 3−4 razy i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie płyty biblioteki mrożonych papierów wartościowych ARP/MARP

1. Szczepy ARP/MARP z zapasów glicerolu przygotowanych w sekcji 1 należy umieścić na nowym zestawie szalek Petriego zawierających agar LB i odpowiedni marker do wyboru. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Stosując technikę aseptyczną, odpipetować 500 μl bulionu Muellera Hintona (MHB) wyregulowanego kationowo ze sterylnego zbiornika do każdego dołka sterylnej płytki głębokiej 96.
3. Z płytkami przygotowanymi w kroku 2.1 użyć aplikatora w sztyfcie, aby zaszczepić płytkę z 96 dołkami głębokimi zgodnie z mapą ARP/MARP (Rysunek Uzupełniający 1 i Rysunek Uzupełniający 2). Upewnij się, że do każdej studzienki dodano odpowiedni znacznik do wyboru. Umieścić oddychającą membranę uszczelniającą na powierzchni płytki studzienki głębinowej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (250 obr./min).
4. Upewnij się, że nie ma zanieczyszczonych studni, odwołując się do mapy ARP/MARP. Powtórz tę czynność, jeśli jest zanieczyszczony. Za pomocą pipetora wielokanałowego przenieść 100 μl z każdej studzienki płytki głębokiej na sterylną 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Powtórz ten krok, aby utworzyć wiele zamrożonych płyt biblioteki zapasów.
   nuta: Najlepiej jest przygotować co najmniej 5 tablic bibliotecznych na raz, aby nie powtarzać kroków 2.1−2.4 w przypadku zamrożonego zanieczyszczenia płyty bibliotecznej.
5. Zakończ wytwarzanie mrożonych płytek z biblioteki ARP/MARP, pipetując 100 μl sterylnego 50% glicerolu do każdego dołka i mieszając, delikatnie pipetując w górę i w dół.
6. Przykryj płytki sterylnymi aluminiowymi uszczelkami i upewnij się, że każda studzienka jest indywidualnie uszczelniona.
7. Ponumeruj płytki i przeznacz tylko jedną zamrożoną płytę biblioteki zapasów na zaszczepienie nowych szablonów w danym momencie. Pozostałą część należy zachować jako kopię zapasową na wypadek zamarznięcia płyty bibliotecznej.
8. Umieść pokrywę płyty na aluminiowej uszczelce i przechowuj w temperaturze -80 °C.

3. Hodowla nasion i przygotowanie płytki dereplikacyjnej

1. Używając aplikatora w sztyfcie, zaszczepić 3 ml pożywki antybiotykowej Streptomyces (SAM) (lub innej odpowiedniej pożywki dla badanego organizmu) w probówce zawierającej jeden sterylny szklany kulkę (w celu rozbicia grzybni) szczepem wytwarzającym, który ma być zdereplikowany. W przypadku Streptomyces delikatnie zeskrob zarodniki z powierzchni kolonii.
2. Używając tego samego drewnianego aplikatora w sztyfcie, nałóż smugę kontroli sterylności na szalce Petriego zawierającej agar Bennetta.
3. Inkubować kulturę nasion w temperaturze 30 °C z napowietrzaniem przez 6 dni (250 obr./min) i inkubować płytkę kontrolną sterylności w temperaturze 30 °C przez 6 dni.
   nuta: Zapoznaj się z tabelą 2, aby zapoznać się z przepisami na media SAM i Bennetta. Powyższe instrukcje są odpowiednie dla większości promieniowców. W razie potrzeby zmień pożywkę wzrostową dla innych bakterii i grzybów.
4. Przygotować płytki do dereplikacji, zasysając 23 ml ciepłego agaru Bennetta do pipety serologicznej i równomiernie rozprowadzić 20 ml na powierzchni prostokątnej szalki Petriego (tabela materiałów), pozostawiając pozostałą część pożywki w pipecie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
   nuta: Upewnij się, że powierzchnia używana do nalewania talerzy jest równa i wykonaj ten krok, zanim agar zbytnio ostygnie; Płaska powierzchnia jest niezbędna do przypinania biblioteki w kolejnych etapach.
5. Delikatnie obracaj płytkę, aż podłoże pokryje wszystkie obszary płytki i nie przeszkadzaj jej, dopóki agar całkowicie nie stwardnieje.
6. Przygotować arkusze membrany nitrocelulozowej (tabela materiałów), używając prostokątnej pokrywki szalki Petriego jako szablonu do kreślenia, tak aby arkusze pasowały do powierzchni płytki do dereplikacji. Pokrój arkusze i sterylizuj je w autoklawie w sterylnej torebce.
   nuta: Błona ta pozwala organizmom na zarodnikowanie na jej powierzchni, podczas gdy metabolity wtórne mogą być wydalane do pożywki poniżej. Po wyhodowaniu membrana jest usuwana, aby zapewnić czystą powierzchnię do dereplikacji. Im ściślejsze dopasowanie papieru membranowego do powierzchni agaru Bennetta, tym czystszy wynik dereplikacji.
7. Sprawdź płytkę kontrolną sterylności, aby upewnić się, że po 6 dniach inkubacji nie ma żadnych zanieczyszczeń. Jeśli jest wolna od zanieczyszczeń, zdjąć pokrywkę z prostokątnej szalki Petriego i odpipetować 200 μl kultury siewnej na powierzchnię agaru Bennetta.
8. Równomiernie rozprowadź kulturę na powierzchni całej płytki za pomocą sterylnego bawełnianego wacika.
9. Umieścić membranę nitrocelulozową przygotowaną w kroku 3.6 na wierzchu kultury na powierzchni szalki Petriego. Zacznij od wyrównania dolnej krawędzi membrany do dolnej krawędzi szalki Petriego i powoli nakładaj membranę od dolnej krawędzi do górnej krawędzi płytki.
10. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wygładzić wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły powstać między powierzchnią membrana-agar, upewniając się, że membrana jest równo z agarem.
11. Załóż pokrywkę z powrotem na prostokątną szalkę Petriego i umieść ją do góry nogami w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 6 dni.

4. Nakładka MHB na płytkę dereplikacyjną i przygotowanie płytki biblioteki ARP/MARP

1. Po 6 dniach wyjąć płytkę do dereplikacji z inkubatora w temperaturze 30 °C. Za pomocą sterylnej pęsety (autoklawowanej lub dokładnie spryskanej 70% etanolem) ostrożnie usuń membranę nitrocelulozową z powierzchni agaru Bennetta.
   nuta: Ten krok usunie hydrofobowe zarodniki i grzybnię wyhodowane na powierzchni błony, aby zapewnić czystą powierzchnię do dereplikacji, ułatwiając krok 4.2.
2. Jak opisano w kroku 3.4, upewnij się, że powierzchnia robocza jest równa i użyj pipety serologicznej, aby zassać 23 ml ciepłego agaru MHB z regulacją kationową. Utwórz nakładkę, dozując 20 ml równomiernie na powierzchni płytki do dereplikacji, pozostawiając pozostałą część pożywki w pipecie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
3. Delikatnie obracaj płytkę, aż podłoże pokryje wszystkie obszary i nie przeszkadzaj jej, dopóki agar całkowicie nie stwardnieje. Po schłodzeniu i zestaleniu należy umieścić płytkę do dereplikacji z powrotem w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie i przechowywać ją do góry nogami w temperaturze 4 °C przez noc.
   nuta: Ten etap pozwala na dyfuzję metabolitów wtórnych ze sfermentowanej pożywki Bennetta do nakładki agarowej MHB. Jeśli membrana nitrocelulozowa nie została odpowiednio przygotowana, wokół krawędzi płytki pojawią się zarodniki, które mają właściwości hydrofobowe, które odpychają agar MHB. Nie wylewaj nakładki na te zarodniki, ponieważ może to spowodować zanieczyszczenie nakładki.
4. W tym samym dniu, w którym wylewa się nakładkę, zaszczepić świeżą matrycę ARP/MARP, pipetując 100 μl MHB dostosowanego do kationów do każdego dołka na płytce 96-dołkowej.
   nuta: Aby zmniejszyć ryzyko rozprzestrzeniania się zanieczyszczeń podczas dereplikacji, należy użyć pojedynczej płytki biblioteki ARP/MARP do dereplikacji tylko 2-3 płytek dereplikacji. Dlatego zaszczepij wystarczającą liczbę 96-dołkowych płytek ARP/MARP w oparciu o liczbę szczepów, które zostaną zdereplikowane.
5. Wyjmij zamrożoną płytę biblioteczną ARP/MARP z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Usuń aluminiową uszczelkę, zanim na jej spodniej stronie zacznie tworzyć się kondensacja, zmniejszając w ten sposób ryzyko zanieczyszczenia sąsiednich studni w płycie bibliotecznej.
6. Używając sterylnych 96-dołkowych narzędzi do przypinania (lub innych form sprzętu do zaszczepiania), ostrożnie wypij z zamrożonej płytki biblioteki ARP/MARP i zaszczepij świeże 96-dołkowe płytki zawierające MHB. Aby zminimalizować zanieczyszczenie podczas dereplikacji, przygotuj tyle płytek biblioteki ARP lub MARP, ile potrzeba do dereplikacji tylko 2-3 płytek dereplikacyjnych na płytkę biblioteczną. Sterylizuj narzędzia do przypinania między zaszczepianiem każdej płytki.
7. Po zakończeniu umieść nową sterylną aluminiową uszczelkę na zamrożonym szablonie i włóż go z powrotem do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Umieścić zaszczepione 96-dołkowe płytki w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie i inkubować w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem (250 obr./min) przez 18 h.
   nuta: Na tym etapie można przygotować nowe zamrożone płyty biblioteczne po upewnieniu się, że nie ma w nich zanieczyszczeń. Dodać glicerol do płytki przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C, jak opisano w kroku 2.5.

5. Dereplikacja za pomocą ARP/MARP

1. Wyjmij matrycę ARP/MARP z inkubatora i upewnij się, że nie ma w niej żadnych zanieczyszczeń. Zawsze należy wykonać replikację przy użyciu świeżo przygotowanego szablonu, a nie bezpośrednio z zamrożonego bulionu.
2. Wyjąć płytki do dereplikacji z temperatury 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Jeśli dojdzie do kondensacji, otwórz pokrywki i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym środowisku.
3. Za pomocą sterylnych narzędzi do przypinania (lub innego sprzętu do zaszczepiania) przypiąć szpilkę z płytki biblioteki ARP/MARP do powierzchni nakładki agarowej MHB płytek dereplikacyjnych. Uważaj, aby nie przekłuć agaru. Sterylizuj narzędzia do przypinania pomiędzy zaszczepianiem każdej płytki dereplikacyjnej.
4. Po przypięciu matrycy do powierzchni płytek dereplikacyjnych, pozostawić inokulum matrycy do wyschnięcia przez 3-5 minut. Umieścić zaszczepione płytki dereplikacyjne do góry nogami w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
5. Przeanalizuj wyniki dereplikacji następnego dnia, porównując wzrost na płytce dereplikacyjnej z dołkami, które odpowiadają mapie ARP/MARP (Tabela 3 i Tabela 4).

Wyniki

Następujące wyniki uzyskano, gdy zbiór interesujących nas szczepów produkujących antybiotyki został zdereplikowany za pomocą ARP i/lub MARP.

Diagram przepływu pracy dereplikacji ARP/MARP jest przedstawiony w Rysunek 1, a mapy tablic bibliotecznych są pokazane na Rysunku Uzupełniającym 1 i Rysunku Uzupełniającym 2. Rysunek 2 pokazuje pozytywny wynik dereplikacji, w którym ekstrakt środowiskowy WAC 8921...

Dyskusja

Opisany powyżej protokół może być stosowany zarówno do odkrywania nowych związków przeciwdrobnoustrojowych, jak i adiuwantów, które mogą być stosowane w połączeniu z istniejącymi antybiotykami w celu ratowania ich aktywności. Platforma wykorzystuje wysoką specyficzność substratową mechanizmów oporności i pokrewnych im antybiotyków do dereplikacji związków w surowych ekstraktach produktów naturalnych. Chociaż czas potrzebny na przygotowanie płytek dereplikacyjnych jest długi (~ 2 tygodnie), sam proces dereplikacji jest za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Bio Shop	AGR003.5
Folie AlumaSeal CS do przechowywania w chłodni	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sól sodowa	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Rosół (regulowany kationami)	Becton Dickinson	212322
BBL Pepton Fiton (soytone)	Becton Dickinson	211906
Węglan Wapnia	Bio Sklep	CAR303.500
Casamino	acid Bio Basic	3060
Aplikatory z bawełnianą końcówką	Fisher Scientific	23-400-101
Tubka CryoPure 1,8 ml mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Jednorazowa probówka hodowlana, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Alkohol etylowy Bezwodne	alkohole handlowe	P016EAAN
Koraliki szklane, stałe	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Kwas solny	Fisher	Scientific A144-212
Błyskawicznie uszczelniająca saszetka do sterylizacji	Fisher Scientific	01-812-54
Siarczan żelaza (II) siedmiowodny	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Siarczan Kanamycyny	Bio Sklep	KAN201.50
LB Bulion Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Siarczan magnezu siedmiowodny	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Filtr membranowy, 0,45 i mikro; m wielkość porów	Millipore-Sigma	HAWP00010	rolka 10 FT, hydrofilowa, biała, gładka
Płytka mikrotestowa 96 dołków, okrągła	podstawa Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova  44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Płytka jednodołkowa	Thermo Fisher Scientific	264728	z pokrywką, sterylna, nieobrobiona
szalka Petriego 92 mm x 16 mm z krzywkami	Sarstedt	82.1473.001
Narzędzia do przypinania	ETH Zurych-Na		zamówienie
Chlorek potasu	Fisher Scientific	P217-500
Skrobia ziemniaczana	Bulk Barn	279
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-10
Azotan sodu	Fisher Scientific	S343-500
Aplikatory do drewna	Dukal Corporation	9000
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422-2