Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Uwolnienie ET z neutrofili zostało po raz pierwszy zidentyfikowane jako wrodzona odpowiedź immunologiczna wywołana przez infekcję bakteryjną¹. Składają się ze szkieletu DNA, z którym związane są różne ziarniste białka o właściwościach przeciwbakteryjnych, w tym elastaza neutrofilowa i mieloperoksydaza². Podstawową rolą neutrofili ET (NET) jest wychwytywanie patogenów i ułatwianie ich eliminacji³. Jednak oprócz ochronnej roli ET w obronie immunologicznej, coraz więcej badań odkrywa również rolę w patogenezie chorób, szczególnie podczas rozwoju chorób wywołanych stanem zapalnym (tj. reumatoidalne zapalenie stawów i miażdżyca⁴). Uwalnianie ET może być wywołane przez różne cytokiny prozapalne, w tym interleukinę 8 (IL-8) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα)^5,6, a zlokalizowane nagromadzenie ET może zwiększyć uszkodzenie tkanek i wywołać reakcję prozapalną⁷. Na przykład, istoty pozaziemskie są zaangażowane jako odgrywające przyczynową rolę w rozwoju miażdżycy⁸, promując zakrzepicę⁹ i przewidując ryzyko sercowo-naczyniowe¹⁰.

Teraz uznaje się, że oprócz neutrofili, inne komórki odpornościowe (np. komórki tuczne, eozynofile i makrofagi) mogą również uwalniać ET po ekspozycji na stymulację mikrobiologiczną lub prozapalną^11,12. Może to być szczególnie istotne w przypadku makrofagów, biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w rozwoju, regulacji i rozwiązywaniu przewlekłych chorób zapalnych. Dlatego ważne jest, aby lepiej zrozumieć potencjalny związek między uwalnianiem ET z makrofagów a rozwojem chorób związanych ze stanem zapalnym. Ostatnie badania wykazały obecność MET i NET w nienaruszonych ludzkich blaszkach miażdżycowych i zorganizowanych skrzeplinach¹³. Podobnie, MET są zaangażowane w prowadzenie do uszkodzenia nerek poprzez regulację reakcji zapalnych¹⁴. Jednak w przeciwieństwie do neutrofili istnieją ograniczone dane na temat mechanizmów powstawania MET z makrofagów. Ostatnie badania z wykorzystaniem ludzkich modeli powstawania MET in vitro pokazują pewne różnice w szlakach zaangażowanych w każdy typ komórki (tj. w odniesieniu do braku cytrulinacji histonów z makrofagami)⁶. Jednak niektóre wykazały, że uwolnienie NET może również wystąpić przy braku cytrulinacji histonów¹⁵.

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie prostej i bezpośredniej metody oceny uwalniania MET w klinicznie istotnym modelu makrofagów. Istnieje wiele różnych modeli komórek makrofagów in vitro, które zostały wykorzystane do badania MET (tj. linii komórkowej ludzkich monocytów THP-1 i różnych linii komórek mysich makrofagów)¹⁶. Istnieją pewne ograniczenia związane z tymi modelami. Na przykład różnicowanie monocytów THP-1 do makrofagów zwykle wymaga etapu primingu, takiego jak dodanie octanu mirystynianu forbolu (PMA), który sam aktywuje szlaki zależne od kinazy białkowej C (PKC). Wiadomo, że ten proces wyzwala uwalnianie ET ⁴ i powoduje niskie podstawowe uwalnianie MET z komórek THP-1. Inne badania wykazały pewne różnice w bioaktywności i reakcjach zapalnych wywoływanych przez makrofagi in vivo w porównaniu z komórkami THP-1 traktowanymi PMA¹⁷.

Podobnie, zachowanie i reakcje zapalne różnych linii komórkowych podobnych do mysich makrofagów nie reprezentują w pełni spektrum odpowiedzi pierwotnych makrofagów ludzkich¹⁸. Dlatego, w celu zbadania tworzenia makrofagów ET w warunkach klinicznych, uważa się, że pierwotne makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów (HMDM) są bardziej odpowiednim modelem niż monocytowe lub mysie linie komórkowe podobne do makrofagów.

ET uwalnianie z HMDM spolaryzowanych M1 zostało wykazane po ekspozycji tych komórek na szereg różnych bodźców zapalnych, w tym oksydacyjny kwas podchlorawy pochodzący z mieloperoksydazy, PMA, TNFα i IL-8⁶. Opisano tutaj protokół polaryzacji HMDM do fenotypu M1 i wizualizacji późniejszego uwolnienia MET po ekspozycji na te bodźce zapalne. PMA jest stosowany jako bodziec uwalniania MET, aby ułatwić porównania z poprzednimi badaniami, w których wykorzystano neutrofile. Co ważne, HOCl, IL-8 i TNFα są również wykorzystywane do stymulowania uwalniania MET, które uważa się za lepsze modele środowiska zapalnego in vivo. Mikroskopowa metoda wizualizacji uwalniania ET polega na barwieniu zewnątrzkomórkowego DNA w żywych kulturach komórkowych przy użyciu SYTOX green, nieprzepuszczalnego fluorescencyjnego zielonego barwnika kwasem nukleinowym, który został z powodzeniem zastosowany w poprzednich badaniach neutrofili. Metoda ta pozwala na szybką i jakościową ocenę uwalniania istot pozaziemskich, ale nie jest odpowiednia jako samodzielna metoda do ilościowego określania zakresu uwolnienia istot pozaziem. Alternatywna metodologia powinna być stosowana, jeżeli wymagana jest kwantyfikacja w celu porównania zakresu uwalniania ET wynikającego z różnych warunków leczenia lub interwencji.

HMDM zostali odizolowani od preparatów do kożucha ludzkiego dostarczanych przez bank krwi z aprobatą etyczną Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney.

1. Kultura HMDM

1. Wyizolować monocyty z preparatów kożuchy przygotowanych z krwi obwodowej zdrowych dawców ludzkich przy użyciu dostępnego na rynku preparatu do izolacji limfocytów, a następnie przeprowadzić przeciwprądową elutriację odśrodkową^19,20.
2. Potwierdź obecność monocytów poprzez cytoprzędzenie i barwienie zmodyfikowanym barwnikiem Giemsa do charakterystyki monocytów¹⁹.
3. W sterylnych warunkach dostosuj gęstość monocytów do 1 x 10⁶ komórek/ml za pomocą pożywki RPMI-1640 bez surowicy. Dodać 1 ml tej zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Hodowla w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ przez 2 godziny w celu ułatwienia przylegania do płytki do hodowli tkankowej.
4. W sterylnych warunkach usuń pożywkę komórkową i zastąp ją kompletną pożywką hodowlaną RPMI-1640 zawierającą 10% (v/v) zebranej ludzkiej surowicy i 20 mM L-glutaminy.
5. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym przez 8 dni, zmieniając pożywkę co 2 dni.

2. Polaryzacja HMDM

1. W sterylnych warunkach przygotować pożywkę gruntującą M1, dodając γ interferonu (IFNγ; 20 ng/ml) i lipopolisacharyd (LPS; 1 μg/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Przygotować pożywkę kondycyjną M2, dodając interleukinę 4 (IL-4; 20 ng/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640.
2. W sterylnych warunkach należy odsysać pożywkę z dołków na płytki do hodowli tkankowych, które zawierają HMDM, które zostały wysiane i wyhodowane zgodnie z opisem w sekcji 1.
3. Ostrożnie umyć studzienki zawierające komórki 3x sterylnym PBS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), używając 1 ml porcji PBS.
4. Dodać 1 ml pożywki gruntującej M1 lub M2 do każdej studzienki zawierającej HMDM (w zależności od tego, która z nich jest odpowiednia dla eksperymentu).
5. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.

3. Stymulacja HMDM w celu wywołania uwolnienia MET

1. W sterylnych warunkach przygotuj pożywki hodowlane zawierające różne stymulatory uwalniania MET (w zależności od tego, który jest odpowiedni dla eksperymentu) do kompletnych pożywek RPMI-1640: PMA (25 nM), ludzki rekombinowany TNFα (25 ng / ml) lub ludzka rekombinowana IL-8 (50 ng / ml).
2. W przypadku eksperymentów ze stymulacją HOCl należy przygotować HOCl (200 μM) w HBSS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), bezpośrednio przed dodaniem do komórek. Upewnij się, że HOCl nie jest przygotowany w kompletnym nośniku komórkowym.
   nuta: Stężenie roztworu podstawowego HOCl określa się ilościowo, mierząc absorbancję UV roztworu przy 292 nm i pH = 11⁶ i stosując współczynnik ekstynkcji 350 ^{M-1 cm-1 21}.
3. Po poddaniu działaniu polaryzacji opisanej w sekcji 2, należy odessać pożywkę komórkową z każdej studzienki i ostrożnie przemyć komórki 3x podwielokrotnościami po 1 ml jałowego PBS (dla PMA, TNFα i IL-8) lub HBSS (dla HOCl), które zostały wstępnie podgrzane do 37 °C.
4. W przypadku eksperymentów z PMA, TNFα lub IL-8: dodać 1 ml kompletnej pożywki zawierającej PMA, TNFα lub IL-8 po usunięciu PBS w końcowym etapie mycia.
5. W przypadku doświadczeń z TNFα inkubować komórki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym. W przypadku doświadczeń z PMA i IL-8 inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.
6. W przypadku eksperymentów z HOCl dodaj 1 ml HOCl do HBSS po usunięciu HBSS w końcowym etapie mycia. Następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.
   1. Ostrożnie odessać supernatant komórek i przemyć komórki 3x 1 ml porcji HBSS, jak opisano w kroku 3.3.
   2. Po wyjęciu HBSS z ostatniego etapu mycia, dodaj 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Następnie inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.

4. Wizualizacja MET w żywej hodowli komórkowej

1. Przygotować zielony barwnik SYTOX w HBSS o stężeniu 40 μM.
2. Pod koniec zabiegów opisanych w sekcji 3 w celu wywołania uwalniania MET, należy bezpośrednio dodać 25 μl z 40 μM barwnika do każdej studzienki zawierającej HMDM.
3. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w ciemności.
4. Umieścić HMDM w studzienkach do hodowli tkankowych na stoliku mikroskopu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania.
5. Zabiegi mikroskopowe
   1. Włącz fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum działania, źródło światła jasnego pola i mikroskop odwrócony zainstalowany z kolorową kamerą cyfrową o wysokiej rozdzielczości (patrz Tabela materiałów).
   2. Obrócić koło filtra do pozycji "numer 2" dla zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm) do obrazowania próbek barwionych na zielono zawartych w studzienkach do hodowli tkankowych.
   3. Korzystając z obiektywu 5x, ustaw ostrość obrazu za pomocą zgrubnej ostrości, a następnie pokręteł precyzyjnego ustawiania ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry, gdy będzie oglądany przez okular mikroskopu.
   4. Przełącz mikroskop w tryb aparatu.
   5. Uruchom skojarzone oprogramowanie.
   6. Wybierz kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu.
   7. Kliknij przycisk Odtwórz, aby wyświetlić podgląd obrazu i wyreguluj pokrętło precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry w oknie podglądu oprogramowania.
   8. Kliknij przycisk Przechwyć.
      nuta: Przechwycony obraz zostanie automatycznie wyświetlony w dołączonym oprogramowaniu.
   9. W oprogramowaniu kliknij Plik | Zapisz jako wymagany typ pliku obrazu.
   10. W mikroskopie obróć koło filtra do pozycji "numer 5" do obrazowania w jasnym polu i powtórz kroki 4.5.2–4.5.9, aby uzyskać odpowiedni obraz w jasnym polu.
   11. Powtórz kroki 4.5.2–4.5.10 w razie potrzeby w celu późniejszego uzyskania obrazu.

Obrazy w jasnym polu pokazujące zmiany morfologiczne HMDM w odpowiedzi na bodźce do różnicowania komórek są pokazane w Rysunek 1. Makrofagi spolaryzowane M1 z eksperymentów z HMDM wystawionych na działanie IFNγ i LPS wykazały wydłużony i wrzecionowaty kształt komórki, jak wskazują czarne strzałki w Rysunek 1 (środkowy panel). Dla porównania, morfologia spolaryzowanych makrofagów M2 po ekspozycji HMDM na IL-4 przez 48 godzin była zazwyczaj okrągła i płaska, na co wskazują czarne strzałki w Rysunek 1 (skrajny prawy panel).

Zdolność zróżnicowanych fenotypów HMDM do uwalniania MET została zwizualizowana przez obrazowanie fluorescencji żywych komórek za pomocą zielonego SYTOX, jak pokazano w Rysunek 2. Rysunek 2A pokazuje dane kontrolne uzyskane z każdego fenotypu HMDM inkubowanego przez 24 godziny przy braku jakichkolwiek bodźców prozapalnych. W tym przypadku zabarwienie na zielono było bardzo ograniczone, jak się spodziewano, biorąc pod uwagę nieprzepuszczalny charakter tego barwnika. Rysunek 2B wykazał dodatnie barwienie dla MET, wynikające z ekspozycji M1 HMDM na HOCl, PMA, IL-8 lub TNFα. MET są oznaczone białymi strzałkami, pokazanymi jako zielone smugi, wynikające z nici zewnątrzkomórkowego DNA. W przypadku HOCl, oprócz barwienia zewnątrzkomórkowego DNA, w komórkach widoczne było pewne zielone zabarwienie. To zabarwienie komórkowe zaobserwowano również do pewnego stopnia w przypadku innych bodźców i uważa się, że odzwierciedla utratę integralności błony wynikającą ze śmierci komórki niezależnej od ET w wyniku warunków leczenia.

Rysunek 2B pokazuje również analogiczne eksperymenty przeprowadzone na HMDM M2, które były wystawione na działanie IL-4. W tym przypadku nie doszło do uwolnienia DNA z komórek, na co wskazuje brak nici/smug zewnątrzkomórkowego DNA; jednak nastąpił pewien wychwyt komórkowy zielonego barwnika fluorescencyjnego z HOCl i TNFα. Dla celów porównawczych, Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne dane wskazujące na uwalnianie MET z makrofagów THP-1 wystawionych na działanie TNFα (50 ng / ml) przez 4 godziny. W tym przypadku należy zauważyć, że użyto niespolaryzowanej populacji komórek, a monocyty THP-1 zróżnicowano do makrofagów przez wstępne traktowanie PMA (50 ng / ml przez 72 godziny), jak opisano wcześniej22.

Ryc. 1: Zmiany morfologiczne spolaryzowanych różnicowo HMDM. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu z niezróżnicowanych i zróżnicowanych HMDM (n ≥5). HMDM hodowano z kompletnymi pożywkami zawierającymi ludzką surowicę i glutaminę przez 8 dni przed przygotowaniem do fenotypu M1 lub M2 po ekspozycji na IFNγ i LPS lub IL-4 odpowiednio przez 48 godzin. Podziałka = 200 μm. Strzałki wskazują przykłady komórek pokazujących cechy morfologiczne HMDM M1 lub M2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: MET wytwarzane przez HMDM M1 po stymulacji HOCl, PMA, IL-8 i TNFα. Jako kontrolę wykorzystano reprezentatywne obrazy zabarwionych na zielono HMDM SYTOX z (A) Niestymulowanych M1 i M2 HMDM inkubowanych przez 24 godziny przy braku jakichkolwiek bodźców zapalnych, wykazując brak uwalniania MET. (B) HMDM M1 i M2 traktowano 1) HOCl (200 μM, 15 min), PMA (25 nM) lub IL-8 (50 ng / ml) z inkubacją przez 24 godziny lub 2) TNFα (25 ng / ml) z inkubacją przez 6 godzin w celu wywołania uwolnienia MET. MET zostały zwizualizowane przez dodanie zielonego SYTOX, na co wskazują białe strzałki w górnym panelu z M1 HMDM. Nie zaobserwowano METS w odpowiednich eksperymentach z M2 HMDM. Dane są reprezentatywne dla replikowanych dołków hodowlanych od n ≥3 indywidualnych dawców. Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: MET wytwarzane przez niespolaryzowane makrofagi THP-1 po stymulacji TNFα. Reprezentatywne obrazy zabarwionych na zielono makrofagów TNP-1 SYTOX, które różnicowano przez wstępne traktowanie PMA (50 ng / ml przez 72 godziny) przed dalszą inkubacją przez 4 godziny przy braku lub obecności TNFα (50 ng / ml) w celu wywołania uwalniania MET. MET zostały zwizualizowane przez dodanie zieleni SYTOX. Dane są reprezentatywne dla studni z replikowanych kultur z n ≥ 3 eksperymentów. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.