Method Article

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

DOI:

10.3791/60541

⸱

November 1st, 2019

 ,  ,  , 
1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwalnianie pułapek zewnątrzkomórkowych (ET) przez neutrofile zostało zidentyfikowane jako czynnik przyczyniający się do rozwoju chorób związanych z przewlekłym stanem zapalnym. Neutrofile ET (NET) składają się z siatki DNA, białek histonowych i różnych białek ziarnistych (tj. mieloperoksydazy, elastazy i katepsyny G). Inne komórki odpornościowe, w tym makrofagi, mogą również wytwarzać ET; jednak w jakim stopniu dzieje się to in vivo i czy pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów (MET) odgrywają rolę w mechanizmach patologicznych, nie zostało szczegółowo zbadane. Aby lepiej zrozumieć rolę MET w patologiach zapalnych, opracowano protokół wizualizacji uwalniania MET z pierwotnych ludzkich makrofagów in vitro, który można również wykorzystać w eksperymentach immunofluorescencyjnych. Pozwala to na dalszą charakterystykę tych struktur i porównanie ich z istotami pozaziem uwalnianymi z neutrofili. Ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów (HMDM) wytwarzają MET po ekspozycji na różne bodźce zapalne po różnicowaniu do fenotypu prozapalnego M1. Uwalnianie MET można uwidocznić za pomocą mikroskopii przy użyciu zielonego fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym, który jest nieprzepuszczalny dla żywych komórek (np. zielony SYTOX). Stosowanie świeżo wyizolowanych pierwotnych makrofagów, takich jak HMDM, jest korzystne w modelowaniu zdarzeń zapalnych in vivo, które są istotne dla potencjalnych zastosowań klinicznych. Protokół ten może być również wykorzystany do badania uwalniania MET z ludzkich linii komórkowych monocytów (np. THP-1) po różnicowaniu do makrofagów z octanem mirystynianu forbolu lub innych linii komórkowych makrofagów (np. mysich komórek podobnych do makrofagów J774A.1).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwolnienie ET z neutrofili zostało po raz pierwszy zidentyfikowane jako wrodzona odpowiedź immunologiczna wywołana przez infekcję bakteryjną1. Składają się ze szkieletu DNA, z którym związane są różne ziarniste białka o właściwościach przeciwbakteryjnych, w tym elastaza neutrofilowa i mieloperoksydaza2. Podstawową rolą neutrofili ET (NET) jest wychwytywanie patogenów i ułatwianie ich eliminacji3. Jednak oprócz ochronnej roli ET w obronie immunologicznej, coraz więcej badań odkrywa również rolę w patogenezie chorób, szczególnie podczas rozwoju chorób wywołanych stanem zapalnym (tj. reumatoidalne zapalenie stawów i miażdżyca4). Uwalnianie ET może być wywołane przez różne cytokiny prozapalne, w tym interleukinę 8 (IL-8) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα)5,6, a zlokalizowane nagromadzenie ET może zwiększyć uszkodzenie tkanek i wywołać reakcję prozapalną7. Na przykład, istoty pozaziemskie są zaangażowane jako odgrywające przyczynową rolę w rozwoju miażdżycy8, promując zakrzepicę9 i przewidując ryzyko sercowo-naczyniowe10.

Teraz uznaje się, że oprócz neutrofili, inne komórki odpornościowe (np. komórki tuczne, eozynofile i makrofagi) mogą również uwalniać ET po ekspozycji na stymulację mikrobiologiczną lub prozapalną11,12. Może to być szczególnie istotne w przypadku makrofagów, biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w rozwoju, regulacji i rozwiązywaniu przewlekłych chorób zapalnych. Dlatego ważne jest, aby lepiej zrozumieć potencjalny związek między uwalnianiem ET z makrofagów a rozwojem chorób związanych ze stanem zapalnym. Ostatnie badania wykazały obecność MET i NET w nienaruszonych ludzkich blaszkach miażdżycowych i zorganizowanych skrzeplinach13. Podobnie, MET są zaangażowane w prowadzenie do uszkodzenia nerek poprzez regulację reakcji zapalnych14. Jednak w przeciwieństwie do neutrofili istnieją ograniczone dane na temat mechanizmów powstawania MET z makrofagów. Ostatnie badania z wykorzystaniem ludzkich modeli powstawania MET in vitro pokazują pewne różnice w szlakach zaangażowanych w każdy typ komórki (tj. w odniesieniu do braku cytrulinacji histonów z makrofagami)6. Jednak niektóre wykazały, że uwolnienie NET może również wystąpić przy braku cytrulinacji histonów15.

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie prostej i bezpośredniej metody oceny uwalniania MET w klinicznie istotnym modelu makrofagów. Istnieje wiele różnych modeli komórek makrofagów in vitro, które zostały wykorzystane do badania MET (tj. linii komórkowej ludzkich monocytów THP-1 i różnych linii komórek mysich makrofagów)16. Istnieją pewne ograniczenia związane z tymi modelami. Na przykład różnicowanie monocytów THP-1 do makrofagów zwykle wymaga etapu primingu, takiego jak dodanie octanu mirystynianu forbolu (PMA), który sam aktywuje szlaki zależne od kinazy białkowej C (PKC). Wiadomo, że ten proces wyzwala uwalnianie ET 4 i powoduje niskie podstawowe uwalnianie MET z komórek THP-1. Inne badania wykazały pewne różnice w bioaktywności i reakcjach zapalnych wywoływanych przez makrofagi in vivo w porównaniu z komórkami THP-1 traktowanymi PMA17.

Podobnie, zachowanie i reakcje zapalne różnych linii komórkowych podobnych do mysich makrofagów nie reprezentują w pełni spektrum odpowiedzi pierwotnych makrofagów ludzkich18. Dlatego, w celu zbadania tworzenia makrofagów ET w warunkach klinicznych, uważa się, że pierwotne makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów (HMDM) są bardziej odpowiednim modelem niż monocytowe lub mysie linie komórkowe podobne do makrofagów.

ET uwalnianie z HMDM spolaryzowanych M1 zostało wykazane po ekspozycji tych komórek na szereg różnych bodźców zapalnych, w tym oksydacyjny kwas podchlorawy pochodzący z mieloperoksydazy, PMA, TNFα i IL-86. Opisano tutaj protokół polaryzacji HMDM do fenotypu M1 i wizualizacji późniejszego uwolnienia MET po ekspozycji na te bodźce zapalne. PMA jest stosowany jako bodziec uwalniania MET, aby ułatwić porównania z poprzednimi badaniami, w których wykorzystano neutrofile. Co ważne, HOCl, IL-8 i TNFα są również wykorzystywane do stymulowania uwalniania MET, które uważa się za lepsze modele środowiska zapalnego in vivo. Mikroskopowa metoda wizualizacji uwalniania ET polega na barwieniu zewnątrzkomórkowego DNA w żywych kulturach komórkowych przy użyciu SYTOX green, nieprzepuszczalnego fluorescencyjnego zielonego barwnika kwasem nukleinowym, który został z powodzeniem zastosowany w poprzednich badaniach neutrofili. Metoda ta pozwala na szybką i jakościową ocenę uwalniania istot pozaziemskich, ale nie jest odpowiednia jako samodzielna metoda do ilościowego określania zakresu uwolnienia istot pozaziem. Alternatywna metodologia powinna być stosowana, jeżeli wymagana jest kwantyfikacja w celu porównania zakresu uwalniania ET wynikającego z różnych warunków leczenia lub interwencji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HMDM zostali odizolowani od preparatów do kożucha ludzkiego dostarczanych przez bank krwi z aprobatą etyczną Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney.

1. Kultura HMDM

  1. Wyizolować monocyty z preparatów kożuchy przygotowanych z krwi obwodowej zdrowych dawców ludzkich przy użyciu dostępnego na rynku preparatu do izolacji limfocytów, a następnie przeprowadzić przeciwprądową elutriację odśrodkową19,20.
  2. Potwierdź obecność monocytów poprzez cytoprzędzenie i barwienie zmodyfikowanym barwnikiem Giemsa do charakterystyki monocytów19.
  3. W sterylnych warunkach dostosuj gęstość monocytów do 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki RPMI-1640 bez surowicy. Dodać 1 ml tej zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Hodowla w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 2 godziny w celu ułatwienia przylegania do płytki do hodowli tkankowej.
  4. W sterylnych warunkach usuń pożywkę komórkową i zastąp ją kompletną pożywką hodowlaną RPMI-1640 zawierającą 10% (v/v) zebranej ludzkiej surowicy i 20 mM L-glutaminy.
  5. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym przez 8 dni, zmieniając pożywkę co 2 dni.

2. Polaryzacja HMDM

  1. W sterylnych warunkach przygotować pożywkę gruntującą M1, dodając γ interferonu (IFNγ; 20 ng/ml) i lipopolisacharyd (LPS; 1 μg/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Przygotować pożywkę kondycyjną M2, dodając interleukinę 4 (IL-4; 20 ng/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640.
  2. W sterylnych warunkach należy odsysać pożywkę z dołków na płytki do hodowli tkankowych, które zawierają HMDM, które zostały wysiane i wyhodowane zgodnie z opisem w sekcji 1.
  3. Ostrożnie umyć studzienki zawierające komórki 3x sterylnym PBS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), używając 1 ml porcji PBS.
  4. Dodać 1 ml pożywki gruntującej M1 lub M2 do każdej studzienki zawierającej HMDM (w zależności od tego, która z nich jest odpowiednia dla eksperymentu).
  5. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.

3. Stymulacja HMDM w celu wywołania uwolnienia MET

  1. W sterylnych warunkach przygotuj pożywki hodowlane zawierające różne stymulatory uwalniania MET (w zależności od tego, który jest odpowiedni dla eksperymentu) do kompletnych pożywek RPMI-1640: PMA (25 nM), ludzki rekombinowany TNFα (25 ng / ml) lub ludzka rekombinowana IL-8 (50 ng / ml).
  2. W przypadku eksperymentów ze stymulacją HOCl należy przygotować HOCl (200 μM) w HBSS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), bezpośrednio przed dodaniem do komórek. Upewnij się, że HOCl nie jest przygotowany w kompletnym nośniku komórkowym.
    nuta: Stężenie roztworu podstawowego HOCl określa się ilościowo, mierząc absorbancję UV roztworu przy 292 nm i pH = 116 i stosując współczynnik ekstynkcji 350 M-1 cm-1 21.
  3. Po poddaniu działaniu polaryzacji opisanej w sekcji 2, należy odessać pożywkę komórkową z każdej studzienki i ostrożnie przemyć komórki 3x podwielokrotnościami po 1 ml jałowego PBS (dla PMA, TNFα i IL-8) lub HBSS (dla HOCl), które zostały wstępnie podgrzane do 37 °C.
  4. W przypadku eksperymentów z PMA, TNFα lub IL-8: dodać 1 ml kompletnej pożywki zawierającej PMA, TNFα lub IL-8 po usunięciu PBS w końcowym etapie mycia.
  5. W przypadku doświadczeń z TNFα inkubować komórki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym. W przypadku doświadczeń z PMA i IL-8 inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
  6. W przypadku eksperymentów z HOCl dodaj 1 ml HOCl do HBSS po usunięciu HBSS w końcowym etapie mycia. Następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
    1. Ostrożnie odessać supernatant komórek i przemyć komórki 3x 1 ml porcji HBSS, jak opisano w kroku 3.3.
    2. Po wyjęciu HBSS z ostatniego etapu mycia, dodaj 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Następnie inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.

4. Wizualizacja MET w żywej hodowli komórkowej

  1. Przygotować zielony barwnik SYTOX w HBSS o stężeniu 40 μM.
  2. Pod koniec zabiegów opisanych w sekcji 3 w celu wywołania uwalniania MET, należy bezpośrednio dodać 25 μl z 40 μM barwnika do każdej studzienki zawierającej HMDM.
  3. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w ciemności.
  4. Umieścić HMDM w studzienkach do hodowli tkankowych na stoliku mikroskopu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania.
  5. Zabiegi mikroskopowe
    1. Włącz fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum działania, źródło światła jasnego pola i mikroskop odwrócony zainstalowany z kolorową kamerą cyfrową o wysokiej rozdzielczości (patrz Tabela materiałów).
    2. Obrócić koło filtra do pozycji "numer 2" dla zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm) do obrazowania próbek barwionych na zielono zawartych w studzienkach do hodowli tkankowych.
    3. Korzystając z obiektywu 5x, ustaw ostrość obrazu za pomocą zgrubnej ostrości, a następnie pokręteł precyzyjnego ustawiania ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry, gdy będzie oglądany przez okular mikroskopu.
    4. Przełącz mikroskop w tryb aparatu.
    5. Uruchom skojarzone oprogramowanie.
    6. Wybierz kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu.
    7. Kliknij przycisk Odtwórz, aby wyświetlić podgląd obrazu i wyreguluj pokrętło precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry w oknie podglądu oprogramowania.
    8. Kliknij przycisk Przechwyć.
      nuta: Przechwycony obraz zostanie automatycznie wyświetlony w dołączonym oprogramowaniu.
    9. W oprogramowaniu kliknij Plik | Zapisz jako wymagany typ pliku obrazu.
    10. W mikroskopie obróć koło filtra do pozycji "numer 5" do obrazowania w jasnym polu i powtórz kroki 4.5.2–4.5.9, aby uzyskać odpowiedni obraz w jasnym polu.
    11. Powtórz kroki 4.5.2–4.5.10 w razie potrzeby w celu późniejszego uzyskania obrazu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy w jasnym polu pokazujące zmiany morfologiczne HMDM w odpowiedzi na bodźce do różnicowania komórek są pokazane w Rysunek 1. Makrofagi spolaryzowane M1 z eksperymentów z HMDM wystawionych na działanie IFNγ i LPS wykazały wydłużony i wrzecionowaty kształt komórki, jak wskazują czarne strzałki w Rysunek 1 (środkowy panel). Dla porównania, morfologia spolaryzowanych makrofagów M2 po ekspozycji HMDM na IL-4 przez 48 godzin była zazwyczaj okrągła i płaska, na co wskazują ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie i wizualizacja powstawania MET przy użyciu zróżnicowanych M1 HMDM stanowi nowy model in vitro, który może być przydatny do badania potencjalnej patologicznej roli tych struktur makrofagów, szczególnie w przewlekłych stanach zapalnych. Zapewnia solidny protokół stymulacji pierwotnych ludzkich makrofagów do uwalniania MET, który może być również wykorzystany w powiązanych badaniach z ludzkimi liniami komórkowymi monocytów lub mysich makrofagów. Pomyślne wdrożenie tego protokołu do stymulacji tworzenia MET przez...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) oraz Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ potwierdza również otrzymanie australijskiej nagrody podyplomowej przyznanej przez Uniwersytet w Sydney. Chcielibyśmy podziękować Panu Patowi Pisansarakit i Pani Morgan Jones za pomoc w izolacji monocytów i hodowli tkankowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum 120QEXFO Photonic Solutions, Toronto, KanadaSeria x-cite
Corning CellBIND Płytka wielodołkowa (12 dołków)Sigma-AldrichCLS3336Do hodowli komórkowych
Różnicowy zestaw barwników Quik (zmodyfikowany Giemsa)Polysciences Inc.24606Charakterystyka monocytów
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo-Fisher14025050Do etapów mycia i leczenia HOCl
Kwas podchlorawy (HOCl)Sigma-Aldrich320331Do stymulacji MET
Interferon gammaThermo-FisherPMC4031Do gruntowania M1
Interleukina 4Nauki zintegrowanerhil-4Do gruntowania M2
Interleukina 8Miltenyl Biotec130-093-943Do stymulacji MET
L-GlutaminaSigma-Aldrich59202CDodawany do pożywek
hodowlanych LipopolisacharydNauki zintegrowanetlrl-eblps Dogruntowania M1
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544Do izolacji monocytów
Olympus IX71 odwrócony mikroskopOlympus, Tokio, Japonia
12-mirystynian 13-octan (PMA)Sigma-AldrichP8139Do stymulacji MET
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD5652Do etapów mycia
RPMI-1640 MediaSigma-AldrichR8758Do hodowli komórkowych
SYTOX zielonyLife TechnologiesS7020Dla MET wizulaizacja
TH4-200 źródło światła jasnego polaOlimp, Tokio, Japoniaseria x-cite
Czynnik martwicy nowotworu alfaLonza300-01A-50Do stymulacji MET

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639(2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111(2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Trap ReleaseHuman Monocyte derived MacrophagesM1 PolarizationSYTOX Green StainingFluorescence MicroscopyHypochlorous Acid StimulationPMA StimulationTNF Alpha StimulationInterleukin 8 StimulationMET Visualization

Related Articles