Artykuł metodologiczny

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

DOI:

10.3791/60542

⸱

24 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Angiogenesis and Ocular Cell Transplantation, University of Lübeck, 2Department of Ophthalmology, University of Lübeck, 3Institute of Biomedical Optics, University of Lübeck

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nd:YAG lasery są używane do wykonywania nieinwazyjnych operacji wewnątrzgałkowych, takich jak kapsulotomia już od kilkudziesięciu lat. Efekt sieczny opiera się na przebiciu optycznym w ognisku lasera. Generowane są akustyczne fale uderzeniowe i pęcherzyki kawitacyjne, które powodują pękanie tkanek. Rozmiary pęcherzyków i amplitudy ciśnienia różnią się w zależności od energii impulsu i położenia punktu ogniskowego. W tym badaniu wyłuszczone oczy świń umieszczono przed dostępnym na rynku laserem Nd:YAG. Badano zmienne energie impulsów, a także różne położenie ognisk za rogówką. Powstałe zmiany oceniano za pomocą mikroskopii dwufotonowej i histologii w celu określenia najlepszych parametrów dla wyłącznego odwarstwienia komórek śródbłonka rogówki (CEC) przy minimalnych uszkodzeniach ubocznych. Zaletami tej metody jest precyzyjna ablacja CEC, zmniejszenie szkód ubocznych, a przede wszystkim leczenie bezdotykowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przezroczystość rogówki jest niezbędna do transmisji światła do siatkówki i jej fotoreceptorów1. W związku z tym względny stan odwodnienia ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowego wyrównania włókien kolagenowych w zrębie rogówki. Ta homeostaza jest utrzymywana przez komórki śródbłonka rogówki (CEC) znajdujące się na błonie Descemeta (DM)2. Śródbłonek jest najbardziej wewnętrzną warstwą rogówki. Pełni ważną funkcję bariery i pompy, która ma kluczowe znaczenie dla przezroczystości rogówki3. W przeciwieństwie do nabłonka, śródbłonek nie jest w stanie samoodnawiać się4. W związku z tym każde uszkodzenie komórek spowodowane chorobą lub urazem stymuluje pozostałe komórki śródbłonka do powiększania się i migracji, do pokrywania powstałych wad i utrzymania funkcjonalności rogówki5. Jeśli jednak gęstość CEC spadnie poniżej progu krytycznego, dekompensacja śródbłonka prowadzi do obrzęku, skutkującego niewyraźnym widzeniem i dyskomfortem, a nawet silnym bólem4. Pomimo dostępności leków łagodzących objawy, obecnie jedynym ostatecznym leczeniem w tych przypadkach jest przeszczep rogówki, który można wykonać w postaci przeszczepu pełnej grubości lub przeszczepu śródbłonka blaszkowatego. Ta ostatnia procedura jest dostępna jako keratoplastyka śródbłonka błony Descemeta (DMEK), a także automatyczna keratoplastyka śródbłonka Descemeta (DSAEK)6. Jednak ochrona pozostałych CEC i zwiększenie ich przeżywalności może być alternatywnym celem, który wymaga odpowiedniego modelu choroby do testowania potencjalnych leków terapeutycznych.

Obecne modele chorób utraty CEC koncentrują się na niszczeniu śródbłonka poprzez wstrzykiwanie środków toksycznych (np. chlorku benzalkoniowego) do przedniej komory lub przez mechaniczne ścieranie komórek przy użyciu inwazyjnej techniki descemetorhexis7,8. Chociaż modele te są dobrze ugruntowane, istnieją wady, takie jak ogólna reakcja zapalna i nieprecyzyjne uszkodzenia uboczne. Dlatego bardziej prawdopodobne jest, że modele te reprezentują końcowe etapy choroby, kiedy wyżej wymienione opcje chirurgiczne są nieuniknione.

Dzięki postępom w strategiach leczenia komórkowego, takich jak komórki macierzyste i terapia genowa, zastosowanie tych terapii komórkowych może być przydatne we wczesnych stadiach utraty CEC9. W związku z tym potrzebujemy modelu, który bardziej adekwatnie przedstawi te wcześniejsze stadia choroby. Pod tym względem modele hodowli komórkowych poprawiły się w ciągu ostatniej dekady, ale ich ważność jest nadal ograniczona, ponieważ komórki in vitro nie mogą zbliżyć się do replikacji złożonych interakcji, które zachodzą między różnymi typami komórek w obrębie rogówki10. W związku z tym modele chorób ex vivo i in vivo są nadal bardzo poszukiwane, a ulepszenie istniejących modeli jest niezwykle interesujące.

Nieinwazyjna, wewnątrzgałkowa chirurgia poprzez fotozakłócenia przy użyciu lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) stała się rutynową procedurą dla okulistów na całym świecie od czasu jego wprowadzenia pod koniec lat siedemdziesiątych11. Fotozakłócenia polegają na nieliniowej absorpcji światła prowadzącej do tworzenia plazmy, generowania akustycznych fal uderzeniowych i tworzenia pęcherzyków kawitacyjnych, gdy miejsce aplikacji znajduje się w środowisku płynnym12. Ogólnie rzecz biorąc, procesy te przyczyniają się do uzyskania zamierzonego efektu, jakim jest precyzyjne cięcie tkanek. Mogą jednak być również źródłem niepotrzebnych szkód ubocznych, ograniczając miejscowe ograniczenie chirurgii laserowej13.

Przewidywanie wynikających z nich efektów mechanicznych znacznie się poprawiło dzięki charakterystyce przebiegu rozchodzenia się fali uderzeniowej i kawitacji. Naszym celem jest celowanie w CEC z jak najmniejszymi uszkodzeniami otaczających tkanek, aby zapewnić nieinwazyjny, wspomagany laserowo eksperymentalny model choroby dla wczesnych stadiów utraty CEC. W tym celu konieczne jest określenie optymalnych energii impulsów i położenia ognisk lasera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z tkankami zwierzęcymi są zgodne z wytycznymi lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki.

1. Przygotowanie hodowli narządowej i leczenie laserowe

  1. Pobrać świeżo wyłuszczone oczy świni z lokalnej rzeźni. Utrzymuj je w chłodzie (4 °C) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej L-glutaminą, pirogronianem sodu, penicyliną/streptomycyną (1%) i surowicą świńską (10%), zwaną dalej w tym artykule pełną pożywką.
  2. Usuń tkanki zewnątrzkomórkowe nożyczkami i namocz oczy w 5% roztworze okulistycznym z jodowidonem na 5 minut przed umieszczeniem ich w wysterylizowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do czasu użycia.
  3. Monitoruj oczy pod kątem głównych patologii przedniego odcinka, takich jak bliznowacenie rogówki, obrzęk i inne zmętnienia za pomocą urządzenia do optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (tabela materiałów).
  4. Ustaw oczy przed lampą szczelinową wyposażoną w laser Nd:YAG (Tabela materiałów), który ma długość fali 1,064 nm i średnicę ogniska 10 μm w powietrzu.
    UWAGA: Do optymalnego pozycjonowania używany jest wydrukowany w 3D aparat podtrzymujący, który został zaprojektowany tak, aby mocno trzymać oko, bez wywierania na nie zbyt dużego nacisku (Rysunek 1).
  5. Użyj 12-krotnego powiększenia i odchyl oświetlenie, aby uwidocznić poszczególne warstwy rogówki.
  6. Ustaw energię impulsu (np. 1.6 mJ) i punkt ostrości (np. 0.16 mm) do selektywnej ablacji komórek śródbłonka.
  7. Umieść przezroczystą paracentezę rogówki w pobliżu rąbka i wstrzyknij lepkosprężystość (tabela materiałów), aby ustabilizować przednią komorę.
  8. Wyciąć centralną rogówkę poddaną obróbce laserowej za pomocą trepanacji o średnicy 8 mm.
  9. Umieścić wyciętą rogówkę w studzience na 12-dołkowej płytce ze śródbłonkiem skierowanym do góry i inkubować próbkę w 3 ml pełnej pożywki w temperaturze 37 °C przez okres do 3 dni.
    UWAGA: Na tym etapie do pożywki można dodać potencjalne środki cytoprotekcyjne.

2. Przygotowanie do histologii

  1. Przygotować bufor Sorensena o pH 7,4 zawierający 19,6 ml 133 mM KH2PO4 i 80,4 ml 133 mM Na2HPO4.
  2. Usunąć pożywkę ze studzienki zawierającej rogówkę i utrwalić tkankę przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą paraformaldehydu bez metanolu (4%) w buforze Sorensena.
  3. Umieścić tkankę w 20% sacharozie w PBS, aż tkanka opadnie (1 godzina), a następnie w 30% sacharozie w PBS na noc w temperaturze pokojowej. Uważaj, aby uniknąć kontaktu z pęcherzykami i powierzchnią powierzchni. Zanurzyć tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Ciąć odcinki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu w temperaturze -27 °C.
    UWAGA: Szczotka do włosów wielbłąda jest przydatna, aby pomóc w prowadzeniu wyłaniającej się części po ostrzu noża.
  5. Przenieś wycinek na szkiełko mikroskopowe, dotykając szkiełka do tkanki w ciągu 1 minuty od jej przecięcia, aby uniknąć liofilizacji tkanki. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.

3. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Suszyć sekcje na powietrzu przez kilka minut, aby usunąć wilgoć.
  2. Barwienie przefiltrowaną 0,1% hematoksyliną Mayersa przez 10 minut w probówce o pojemności 50 ml.
  3. W słoiku Coplin płucz w chłodnym działaniu ddH2O przez 5 minut i zanurz w 0,5% eozynie 10x.
  4. Zanurz w ddH2O, aż eozyna przestanie się smugać, a następnie zanurz w 50% (10x) i 70% (10x) EtOH.
  5. Zrównoważyć 95% EtOH (30 s) i 100% EtOH (60 s) przed kilkukrotnym zanurzeniem w ksylenie.
  6. Na koniec zamontuj i nakryj preparat przed wykonaniem zdjęć za pomocą mikroskopu świetlnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, leczyliśmy oczy laserem Nd:YAG, oceniając różne energie impulsów (1,0−4,6 mJ) i pozycje ognisk (odległość od tylnej powierzchni rogówki: 0,0−0,2 mm), aby znaleźć optymalne parametry. Oceniano wiele powtórzeń (n = 3) dla każdej konstelacji parametrów lasera (12 x 21).

Oprócz wyżej wymienionego protokołu, próbka została przeanalizowana za pomocą mikroskopu dwufotonowego przed fiksacją i barwieniem H&E. Mikroskop dwufotonowy wykorzystywał jako źró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki tego badania pilotażowego wskazują, że laser Nd:YAG może być używany do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki po wybraniu odpowiednich parametrów dawki energii i położenia punktu skupienia.

Ponieważ funkcja śródbłonka jest ważna dla przezroczystości rogówki i ochrony rogówki przed obrzękiem zrębu, modele dysfunkcji śródbłonka odgrywają ważną rolę w opracowywaniu leków przeciwobrzękowych lub zabiegów chirurgicznych. Istnieje kilka uznanych modeli in vitro do naśladowania sytuacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Christine Örün i Janowi A. M. Sochurek za pomoc w metodach eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BARRON VACUUM TREPHINEKatenaK20-2058
KriostatLeicaCM 3050S
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium - high glucosePAAE-15009
Uchwyt na okoSelfN/A
Mikroskop odwróconyLeicaDMI 6000 B
KH2PO4Merck529568
Na2HPO4Merck1065860500
Nd:YAGZeiss MeditecvisuLAS YAG II plus
OCT Tissue TekSakura Finetechnical4583
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010056
Surowica świńskaSigma-Aldrich12736C
Optyczna tomograf koherentny w domenie spektralnejHeidelberg EngineeringSpectralis Płytka
do hodowli tkankowych 12-dołkowymikroskop dwufotonowy Sarstedt833921
JenLabDermaInspect
LepkosprężystyOmniVisionMethocel

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
  3. Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).
  4. Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
  5. He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047(2016).
  6. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  7. Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
  8. Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
  9. Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
  10. Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
  11. Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
  12. Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
  13. Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
  14. Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
  15. Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
  16. Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
  17. Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
  18. Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).
  19. Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
  20. Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
  21. McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
  22. Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ablacja laserem Nd YAGnieinwazyjna chirurgia wewn trzga kowamodel winimikroskopia dwufotonowaanaliza histologicznaselektywna ablacja kom rekoptymalizacja parametr w laseraprotok fiksacji tkanekci cie w kriosztacie

Powiązane artykuły