Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Summary

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Abstract

Organoidy i trójwymiarowe (3D) hodowle komórkowe pozwalają na badanie złożonych mechanizmów biologicznych i regulacji in vitro, co wcześniej nie było możliwe w klasycznych monowarstwach hodowli komórkowych. Co więcej, jednowarstwowe hodowle komórkowe są dobrymi systemami modelowymi in vitro, ale nie reprezentują złożonych procesów i funkcji różnicowania komórkowego, które opierają się na strukturze 3D. Do tej pory było to możliwe tylko w eksperymentach na zwierzętach, które są pracochłonne, czasochłonne i trudne do oceny za pomocą technik optycznych. W tym miejscu opisujemy test do ilościowego określenia integralności bariery w czasie w żywych organoidach myszy z jelita cienkiego. Aby zweryfikować nasz model, zastosowaliśmy interferon gamma (IFN-γ) jako pozytywną kontrolę niszczenia bariery i organoidy pochodzące z receptora IFN-γ 2 nokautującego myszy jako kontrolę negatywną. Test pozwolił nam określić wpływ IFN-γ na integralność bariery jelitowej i indukowaną przez IFN-γ degradację białek połączeń ścisłych klaudyny-2, -7 i -15. Test ten może być również wykorzystany do zbadania wpływu związków chemicznych, białek, toksyn, bakterii lub sond pochodzących od pacjentów na integralność bariery jelitowej.

Introduction

Integralność bariery nabłonkowej jest utrzymywana przez kompleks połączeń wierzchołkowych (AJC), który składa się z białek złącza ścisłego (TJ) i połączenia adherencji (AJ)¹. Spolaryzowana struktura AJC ma kluczowe znaczenie dla jego funkcji in vivo. Rozregulowanie AJC występuje w różnych chorobach i podejrzewa się, że jest ważnym czynnikiem wyzwalającym patogenezę nieswoistych zapaleń jelit. Utrata funkcji bariery jelitowej stanowi zdarzenie inicjujące chorobę. Następujące translokacje bakterii komensalnych i reakcje zapalne są bolesnymi konsekwencjami².

Różne modele in vitro i in vivo zostały opracowane w celu zbadania regulacji AJC. Test Transwell opiera się na dwuwymiarowych (2D) monowarstwach komórek, które pochodzą z linii komórek nowotworowych. Systemy te są dobre do oceny metodami optycznymi i biochemicznymi i umożliwiają analizę wielu próbek w tym samym czasie, ale brakuje im wielu cech komórek pierwotnych i procesów różnicowania zachodzących in vivo. Badanie integralności bariery jest również możliwe w modelach zwierzęcych. W eksperymentach terminalnych można określić ilościowo wpływ określonych zabiegów in vivo na przepuszczalność całego jelita. Modele te wymagają jednak dużej liczby zwierząt i nie pozwalają na szczegółową wizualizację leżących u ich podstaw procesów molekularnych. Obecnie dostępne są ulepszone modele 3D in vitro, które dokładnie podsumowują procesy różnicowania komórek, polaryzację komórek i reprezentują strukturę krypty i kosmków jelita³. Zastosowanie organoidów jelitowych 3D do analiz funkcjonalnych wymaga adaptacji dostępnych metod z modeli 2D. W tym miejscu opisujemy model do badania integralności bariery jelitowej w żywych organoidach myszy z jelita cienkiego. Test został opracowany w celu zbadania wpływu IFN-γ na integralność bariery i odpowiednie białka połączeń ścisłych⁸.

W przeciwieństwie do techniki stosowanej przez Leslie⁴, Zietek⁵, lub Pearce⁶, która mierzy fluorescencję po usunięciu żółcieni lucyferowej (LY) z podłoża, nasze podejście pozwala na ilościowe określenie absorpcji światła przez fluorofor w czasie. W związku z tym wynik reprezentuje kinetykę wychwytu dynamicznego, a nasz test umożliwia zastosowanie dodatkowych bodźców lub inhibitorów w trakcie trwania eksperymentu. Fakt, że oba testy mierzą wychwyt od zewnętrznej strony podstawno-bocznej do wewnętrznej powierzchni wierzchołkowej, wyraźnie kontrastuje z sytuacją in vivo. W modelu opisanym przez Hilla i wsp.⁷, temat ten został zgłębiony. Po mikrowstrzyknięciu fluoroforu do światła organoidu, fluorescencję określono ilościowo. Kierunek dyfuzji reprezentuje kierunek obecny in vivo. Wysiłek techniczny związany z mikroiniekcją wyraźnie zmniejsza przepustowość tej metody. W przeciwieństwie do opisywanego tu modelu, metoda mikroiniekcji umożliwia pomiar efektów wymagających aktywacji biologicznej na powierzchni nabłonka wierzchołkowego.

Prezentowany tutaj model integralności bariery organoidowej opiera się na mikroskopii żywych komórek i umożliwia analizę dynamicznych zmian w regulacji AJC w czasie. Zestaw może być stosowany do badania farmakologicznego wpływu substancji indukujących i hamujących integralność bariery jelitowej. Co więcej, modele oparte na organoidach pomagają zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych do badań farmakologicznych.

Protocol

Wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Poszycie organoidów

1. Wyizoluj organoidy zgodnie z wcześniejszym opisem³. Procedura została pokrótce opisana poniżej.
   1. Zbierz jelito cienkie od myszy.
   2. Otwórz jelito cienkie wzdłużnie i usuń końcówki kosmków, zeskrobując wewnętrzną tkankę jelitową szkiełkiem nakrywkowym.
   3. Pokrój tkankę jelitową na małe kawałki za pomocą nożyczek.
   4. Umyj kawałki 5x w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pipetując kawałki 10x w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml.
   5. Inkubować kawałki tkanek w zimnym roztworze EDTA o stężeniu 2 mM na lodzie przez 30 minut na poziomej platformie wstrząsającej. Pozwól, aby kawałki tkanki opadły.
   6. Zastąp roztwór EDTA buforem PBS, gdy kawałki tkanki osiądą na dnie. Odrzucić sklarowany osad i dodać 20 ml PBS.
   7. Uwolnij krypty jelitowe z tkanki, energicznie pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
   8. Zebrać supernatant w probówkach wirówkowych i sprawdzić go za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Aby to zrobić, dodaj kroplę supernatantu do 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Trzymaj probówki wirówkowe na lodzie.
   9. Powtarzaj kroki 1.1.6–1.1.8, aż liczba krypt jelitowych w pobranym supernatancie zmniejszy się.
   10. Przepuść frakcje zawierające najwięcej krypt przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.
   11. Odwirować zawiesinę krypty w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 5 min.
   12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS w celu umycia krypt. Następnie powtórzyć etap wirowania zgodnie z opisem w ppkt 1.1.11.
   13. Zawiesić osad w sumie 25 μl na studzienkę mieszaniny roztworu macierzy komórkowej i mysiej pożywki do hodowli organoidów w stosunku 1:1 i umieścić organoidy na 48-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych.
   14. Inkubować organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 20 minut^, aby umożliwić zestalenie się roztworu macierzy komórkowej.
   15. Przykryj organoidy 300 μl mysiego podłoża organoidowego na studzienkę.
   16. Hodować organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} zmieniając pożywkę co 2–3 dni.
   17. Użyj organoidów do eksperymentów po 7 dniach hodowli.
2. Przygotować organoidy do pomiaru integralności bariery.
   1. Wszystkie probówki wirówkowe, które będą używane do przechowywania organoidów podczas procesu posiewu, należy wstępnie pokryć albuminą surowicy bydlęcej (BSA), dodając wystarczającą ilość 0,1% roztworu BSA do PBS, aby pokryć wszystkie powierzchnie z tworzywa sztucznego. Następnie ponownie usuń roztwór BSA i przechowuj probówki wirówkowe na lodzie.
   2. Rozmrozić roztwór macierzy komórkowej i pożywkę do hodowli organoidów na lodzie.
3. Aby oddzielić organoidy, ostrożnie wyjmij pożywkę hodowlaną i ponownie zawieś organoidy z jednego dołka 48-dołkowej płytki w 1 ml zimnego PBS. Rozpuść macierz komórkową przez energiczne pipetowanie. Zawiesinę organoidów należy zawsze przechowywać w probówkach wirówkowych wstępnie pokrytych BSA i zawsze przechowywać na lodzie.
   nuta: Na gęstość, rozmiar i położenie organoidów w komorowym szkiełku nakrywkowym ma wpływ współczynnik podziału, stężenie roztworu matrycy komórkowej i obchodzenie się z zawiesiną matrycy organoid-komórka. Zaleca się wcześniejsze przećwiczenie obchodzenia się z roztworem macierzy komórkowej. Zwykle do testu nadaje się osiem szklanych szkiełek nakrywkowych z dobrze komorą. Organoidy pochodzące z jednego dołka z 48-dołkowej płytki konfluentnej można podzielić na dwie studzienki z ośmiokomorowym szkiełkiem nakrywkowym (40 μl osadu matrycy organoidowo-komórkowej na studzienkę).
4. Odwirować zawiesinę organoidów o sile 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
5. Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad z 1 ml zimnego PBS.
6. Odwirować zawiesinę organoidów w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 5 min.
7. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić organoidy pochodzące z jednego dołka z płytki 48-dołkowej w 40 μl zimnego podłoża. Rozdrobnić duże struktury organoidowe, pipetując zawiesinę organoidu 5x przez końcówkę pipety o pojemności 10 μl, aby zebrać struktury o wielkości 40–60 μm do wysiewu.
   nuta: Użyj końcówki 10 μl na końcówce do pipety o pojemności 100 μl do fragmentacji struktur organoidowych i przećwicz wcześniej krok 1.7, aby zapewnić spójne wyniki. Kontrolować wielkość organoidów za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w probówce wirówkowej. Upewnij się, że nie ma już wielogałęziowych organoidów i że fragmenty organoidów mają około 40–60 μm długości.
8. Gdy organoidy osiągną pożądaną wielkość, wymieszaj je z 40 μl roztworu macierzy komórkowej (podłoże: roztwór matrycy komórkowej = 1:1).
   nuta: Stosunek roztworu pożywki do roztworu macierzy komórkowej musi być utrzymywany na stałym poziomie, aby osiągnąć spójne wyniki. Rozcieńczenie roztworu macierzy komórkowej zmniejsza sztywność plamy organoidowej i wpływa na jej właściwości dyfuzyjne. Użyć wstępnie schłodzonych końcówek pipet (-20 °C) do wszystkich zawiesin zawierających roztwór matrycy komórkowej.
9. Umieścić 40 μl zawiesiny roztworu matrycy komórek organoidowych na środku każdego dołka szkiełka nakrywkowego z 8 doładowaniami.
10. Trzymaj szkiełko na woreczku z lodu przez 5 minut. Pozwala to zachować płynną zawiesinę organoidów macierzy komórkowej i grawitacyjnie zwiększa stężenie organoidów na powierzchni szkiełka nakrywkowego.
11. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 w} celu umożliwienia polimeryzacji pęcherzyka macierzy organoidowo-komórkowej.
12. Dodać 150 μl pożywki do hodowli organoidów na basenik i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed przystąpieniem do poddania działaniu substancji eksperymentalnej.
    1. Wykorzystaj ten okres do traktowania organoidów i modulowania ich integralności bariery zgodnie z odpowiednią hipotezą naukową. W celu kontroli pozytywnej należy traktować organoidy przez 48 godzin IFN-γ w celu zbadania związanej z IFN-γ degradacji złączy ścisłych i wzrostu przepuszczalności. Stymulować kontrolę pozytywną za pomocą 10 U/ml (10 ng/ml) rekombinowanego mysiego IFN-γ. Pozostawić organoidy jednego z nich dobrze nieleczone.
13. Hodowla organoidów w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ przez okres do 48 godzin.

2. Test przepuszczalności organoidu

1. Doprowadzić komorę inkubacyjną mikroskopu do temperatury 37 °C co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu w celu zmniejszenia dryftu termicznego podczas obrazowania organoidów.
2. Przygotować 100 mM roztwór LY w PBS. Przechowywać na lodzie chronionym przed światłem.
3. Przygotować 200 mM roztwór EGTA w PBS. Przechowuj go na lodzie.
4. Przenieść szkiełko nakrywkowe z komorą wraz z organoidami do komory inkubacyjnej odwróconego mikroskopu konfokalnego i włączyć inkubację CO₂ (5%). Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe z komorą jest szczelnie zablokowane w stoliku mikroskopu.
5. Używając organoidów w jednym dołku jako odniesienia, dostosuj ustawienia obrazowania mikroskopu. Dodać LY (3 μL ze 100 mM LY w 150 μL pożywki), aby uzyskać końcową objętość 1 mM LY w 300 μL pożywki. Inkubować pod mikroskopem przez 1 godzinę i dostosować ostrość do obrazowania światła organoidów. Określ wymaganą energię lasera dla wzbudzenia LY (488 nm) i odpowiednią czułość wykrywania instrumentu i spróbuj zobrazować fluorescencję LY przy 30–40% dostępnego zakresu dynamiki używanego instrumentu.
   nuta: Dostosuj energię wzbudzenia lasera i skuteczność wykrywania na organoidach niepoddanych działaniu substancji 70 minut po dodaniu LY. Upewnij się, że energia wzbudzenia jest wystarczająco wysoka, aby uzyskać dobrze naświetlony obraz. Aby uniknąć nasycenia fluorescencji LY w obrazach mikroskopowych, zaleca się dostosowanie tych ustawień po osiągnięciu stanu ustalonego przez dyfuzję LY.
6. Określ położenie organoidów za pomocą obrazowania na żywo z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC). Spróbuj zobrazować organoidy o porównywalnych średnicach (80 ± 30 μm) i skup się na centralnym wycinku organoidów, aby zobrazować ich światło. Zdefiniuj około 10 organoidów na studzienkę i spróbuj zobrazować tylko organoidy znajdujące się blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego o kulistej strukturze.
   nuta: Liczba organoidów, które można zobrazować w jednym przebiegu, zależy od prędkości mikroskopu. Zaleca się obrazowanie organoidów w odstępie 5 minut. W zwykłym laserowym mikroskopie skaningowym 40 pozycji to rozsądny punkt wyjścia.
7. Zapisać DIC i fluorescencję LY w każdej pozycji, aby udokumentować kształt organoidu i autofluorescencję przed dodaniem LY do studzienek, wykorzystywanych do oznaczania integralności bariery.
8. Nie należy obrazować organoidów, które wykazują wysoką autofluorescencję. Wynika to z nagromadzenia martwych komórek w świetle organoidu, a wyniki organoidów autofluorescencyjnych są trudne do późniejszej analizy.
9. Rozcieńczyć 3 μl przygotowanego roztworu LY (100 mM LY w 150 μl pożywki) i dodać go ostrożnie do każdej studzienki, nie dotykając szkiełka nakrywkowego z komorą. Zalecane stężenie LY na studzienkę wynosi 1 mM. Ostateczna objętość na studzienkę powinna wynosić 300 μl.
10. Szybko sprawdź ostrość zdefiniowanych pozycji i skoryguj w razie potrzeby.
    nuta: LY szybko dyfunduje przez macierz komórkową. Dlatego obrazowanie konfokalne należy rozpocząć w ciągu 3 minut po dodaniu fluoroforu.
11. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe pod mikroskopem. Wykonuj obraz fluorescencyjny każdej pozycji co 5 minut, co daje łącznie 70 minut.
    nuta: Organoidy obrazowano w odstępach 5-minutowych, aby zobrazować wychwyt LY w czasie. Aby zmierzyć przerwanie bariery jelitowej, wystarczy zarejestrować fluorescencję przed i 60 minut po dodaniu LY oraz ponownie 10 minut po dodaniu EGTA.
12. Dodać 3 μl przygotowanego roztworu EGTA do studzienki, nie dotykając szkiełka nakrywkowego z komorą. Zalecane stężenie w komorowym szkiełku nakrywkowym EGTA wynosi 2 mM. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 300 μl.
13. Rozpocznij drugi film poklatkowy. Ponownie zarejestrować fluorescencję określonych organoidów w odstępie 5 minut, co daje łącznie 30 minut.
14. Wyrzuć wszystko zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Analiza danych

1. Analizuj tylko wyniki organoidów, które przyjęły LY po dodaniu EGTA.
2. Wyniki można określić ilościowo za pomocą Fiji ImageJ.
3. Otwórz zestaw danych w ImageJ, klikając Plik |Otwórz i wybierz dane obrazu. W następującym oknie dialogowym Opcje importu formatów biologicznych wybierz pozycję Wyświetl stos z: Hyperstack.
4. Otwórz menedżera obszaru zainteresowania (ROI), klikając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.
5. Narysuj owalny zwrot akcji, klikając przycisk Owalny wybór na pasku menu ImageJ. Narysuj zaznaczenie zawierające wewnętrzne światło organoidu. Następnie naciśnij Dodaj w Menedżerze ROI.
6. Powtórz kroki dla trzech reprezentatywnych obszarów poza organoidem.
7. Kliknij Analizuj na pasku menu i wybierz Ustaw pomiary. Włącz tylko średnią wartość szarości i wyłącz wszelkie inne pomiary. Następnie kliknij przycisk OK.
8. Upewnij się, że wszystkie ROI są zaznaczone w Menedżerze ROI. W Menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij Więcej | Wiele miar. W oknie dialogowym opcji wybierz opcję Zmierz wszystkie wycinki [...] i Po jednym wierszu na wycinek. Następnie kliknij przycisk OK.
9. Zaznacz wszystkie wartości w oknie Wyniki i skopiuj je do aplikacji arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
   nuta: Jeśli pozycja organoidu przesunęła się podczas obrazowania poklatkowego, zwrot z inwestycji musi być odpowiednio dostosowany. W tym celu należy wybrać właściwy zwrot z inwestycji w menedżerze zwrotu z inwestycji i przenieść go na nową pozycję. Następnie kliknij przycisk Aktualizuj w menedżerze zwrotu z inwestycji. Wykonaj pomiar dla każdego punktu czasowego indywidualnie, klikając opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji, a następnie przełącz się na następny punkt czasowy w oknie obrazu, korzystając z paska na dole. Zbierz wszystkie pomiary w arkuszu kalkulacyjnym. Indywidualny kształt i ruch organoidów w okresie obrazowania wymaga ręcznej analizy danych.
10. Obliczyć średnią wartość intensywności trzech ROI poza organoidem dla każdego punktu czasowego.
11. Podziel intensywność ROI wewnątrz światła organoidu przez średnią intensywność ROI na zewnątrz i średnią intensywność wewnątrz organoidu.
12. Aby obliczyć względny wzrost fluorescencji organoidów świetlnych, podziel względną fluorescencję (patrz krok 3.11) w każdym obrazowanym punkcie czasowym przez minimalną fluorescencję względną.
    nuta: Użyj minimalnej fluorescencji względnej, ponieważ czasami dyfuzja fluoroforu może być powolna na początku eksperymentu.

Results

Aby zweryfikować zastosowanie 3D organoidów myszy z jelita cienkiego jako modelu do ilościowego określenia wpływu związków regulujących integralność bariery jelitowej, zastosowaliśmy IFN-γ. Aby to zrobić, wyizolowaliśmy i wyhodowaliśmy organoidy pochodzące od myszy reagujących na IFN-γ typu dzikiego i IFN-γ-receptor-2, które nie reagują na IFN-γ⁸. Po leczeniu przez 48 godzin IFN-γ lub PBS (kontrola), wszystkie organoidy wystawiono na działanie LY i zobrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek z wirującym dyskiem w odstępach 5-minutowych przez okres 70 minut. Funkcjonalna integralność bariery jelitowej w tym modelu skutkowała wykluczeniem LY ze światła organoidu, podczas gdy wewnątrzświetlne nagromadzenie LY oznaczało zniszczenie TJ. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe fluorescencji po 70 minutach inkubacji z LY wyraźnie pokazują, że wewnątrzświetlna fluorescencja LY była widoczna tylko w organoidach od zwierząt typu dzikiego traktowanych IFN-γ. W niestymulowanych (PBS) kontrolach ani w organoidach pochodzących od zwierząt nokautujących (IFN-γR2^ΔIEC, Rysunek 1), po 70 minutach nie stwierdzono wewnątrzświetlnej fluorescencji LY.

Dodanie EGTA powoduje niespecyficzne załamanie integralności bariery jelitowej poprzez sekwestrację kofaktorów TJ. Ta kontrola była zawsze wykorzystywana pod koniec eksperymentu, aby zademonstrować zdolność odpowiedniego organoidu do przyjmowania LY (Rysunek 1). Jeśli po leczeniu EGTA nie wykryto wewnątrzświetlnej fluorescencji LY, organoid został wykluczony z eksperymentu.

Dla ilościowej oceny wyników mikroskopowych, zmierzono fluorescencję LY w świetle organoidu i poza nim. Obliczono względne wartości intensywności (fluorescencja wewnątrz/ fluorescencja na zewnątrz + wewnątrz) i są one wyświetlane dla każdego zobrazowanego punktu czasowego. Zaleca się unikanie obrazowania organoidów o różnych rozmiarach. Zdecydowaliśmy się skupić na organoidach o średnicy 80 ± 30 μm (Rysunek 2). Schemat protokołu z reprezentatywnymi obrazami jest pokazany w Rysunek 3. Niektóre główne problemy i techniki rozwiązywania problemów są pokazane i omówione w Rysunek 4.

Rycina 1: Integralność bariery jelitowej można analizować w organoidach myszy. Organoidy jelitowe z IFN-γR2^WT i IFN-γR2^ΔIEC hodowano w obecności IFN-γ przez 48 godzin lub pozostawiono bez leczenia. Aby zbadać integralność bariery jelitowej, dodano LY (457 Da) i wykonano konfokalne obrazy fluorescencyjne w odstępach 5-minutowych, w sumie przez 70 minut. Pokazane są reprezentatywne obrazy w punkcie czasowym 0 min, 70 min i po dodaniu EGTA (zielony = Lucyfer żółty; Podziałka = 20 μm). Ten rysunek został zmodyfikowany z Bardenbacher et al.⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Model integralności bariery organoidowej jelita cienkiego dostarcza wyników ilościowych. (A) Fluorescencję LY określono wewnątrz i na zewnątrz organoidu. Obliczono względne wartości intensywności (wewnątrz/fluorescencja na zewnątrz + wewnątrz) w stosunku do początkowej intensywności względnej + SEM i są one wyświetlane dla każdego punktu czasowego. (B) Rozkład wielkości analizowanych organoidów. Aby zmniejszyć odchylenie standardowe i błędy wynikające ze zmian stosunku powierzchni do objętości, analizowaliśmy tylko organoidy o średnicy 80 ± 30 μm. Średnie wartości odpowiednich średnic organoidów są pokazane + SD (IFN-γR2^WT, n = 20; IFN-γR2^ΔIEC, n = 18). Średnie wartości średnicy nie różniły się istotnie między różnymi grupami (jednoczynnikowa ANOVA). (C) Przepuszczalność organoidów określono 70 minut po dodaniu LY. Określono go, dzieląc natężenia fluorescencji wewnątrzświetlnej po 70 minutach przez minimalne względne natężenia fluorescencji zmierzone w okresie obserwacji. Każdy słupek reprezentuje wartości średnie + SD, mierzone w 10 organoidach pochodzących z dwóch niezależnych eksperymentów (IFN-γR2^WT, n = 20; IFN-γR2^ΔIEC, n = 18). IFN-γ istotnie zwiększał wychwyt LY tylko w organoidach^WT IFN-γR2. Wartość p <0,001 w teście t-Studenta. Ten rysunek został zmodyfikowany z Bardenbacher et al.⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematyczny protokół z reprezentatywnymi obrazami. (A) Schematyczny opis głównych kroków protokołu. (B) Reprezentatywne zdjęcia głównych etapów protokołu. (B1) Obraz mikroskopowy DIC centralnego wycinka przez odpowiedni organoid, który został wybrany do analizy przepuszczalności. Linia przerywana reprezentuje szerokość 89 μm. (B2) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej tego samego organoidu w (B1) przed dodaniem LY. Obraz przedstawia autofluorescencję organoidu. (B3) Organoid 70 minut po dodaniu LY. Przedstawiony organoid nie wykazuje wychwytu LY, a zatem nienaruszoną funkcję barierową. Linie przerywane pokazują zwrot z inwestycji do dalszej analizy. Zaznaczone jest wewnętrzne światło organoidu i trzy reprezentatywne obszary wokół organoidu. (B4) Organoid po dodaniu EGTA. Organoid nadaje się do dalszej analizy, ponieważ wykazuje wychwyt LY po leczeniu EGTA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rozwiązywanie typowych problemów. (A) Tabela z typowymi problemami i rozwiązaniami. (B) Przykładowe zdjęcia. (B1) Obraz DIC dużego wielogałęziowego organoidu, który nie nadaje się do tego testu. (B2). Konfokalny obraz organoidu wykazującego wysoką autofluorescencję przed dodaniem LY do pożywki. Organoid został wyłączony z oceny ilościowej. (B3) Konfokalny obraz organoidu wykazującego niską autofluorescencję przed dodaniem LY do pożywki. W tym przypadku fluorescencję określono ilościowo. (B4) Organoid niewykazujący wychwytu LY z pożywki 30 minut po dodaniu EGTA i w związku z tym wyłączony z oznaczania ilościowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Test ten oferuje technikę badania integralności bariery jelitowej w żywych organoidach. Cały test opiera się na organoidach myszy w jelicie cienkim i konfokalnej mikroskopii żywych komórek. Dlatego konieczne jest wcześniejsze przećwiczenie właściwego obchodzenia się z organoidami. Po wyizolowaniu organoidy mogą być rutynowo dzielone i przechowywane przez kriozamrażanie ^3,9. W tym teście zalecamy rozszczepienie organoidów na 48 godzin przed rozpoczęciem leczenia. Okres ten daje organoidom szansę na całkowite zamknięcie i utworzenie kulistych struktur. Wysiewanie organoidów do eksperymentu jest krytycznym krokiem w ramach testu. Aby zmniejszyć indywidualne różnice w obchodzeniu się z odpadami, zalecamy rutynową procedurę w procesie wysiewu. Ten krok ma kluczowe znaczenie, a rutynowy protokół postępowania wyraźnie zmniejsza różnice eksperymentalne.

Podczas procedury wysiewu (krok 1.7) organoidy ulegają rozdrobnieniu w wyniku powtarzającego się przechodzenia przez standardową końcówkę pipety o pojemności 10 μl. Wielkość porów tego produktu różni się w zależności od firmy. Procedurę tę należy przećwiczyć z wyprzedzeniem, a wynik należy zawsze sprawdzić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Gdy uzyskane organoidy osiągną pożądany rozmiar, nie należy zmieniać procedury.

Wysiew organoidów musi być zoptymalizowany i dostosowany do dostępnej konfiguracji mikroskopowej. Aby móc hodować i obrazować organoidy przez co najmniej 48 godzin, absolutnie wymagana jest inkubowana komora mikroskopowa. Wybierz szkiełko nakrywkowe komorowe, które odpowiada Twoim wymaganiom. Podczas wysiewu organoidów należy upewnić się, że organoidy koncentrują się na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Jest to możliwe dzięki przechowywaniu szkiełka nakrywkowego w komorze na opakowaniu z lodu przez 5 minut po umieszczeniu zawiesiny organoidowej macierzy komórkowej. Ten krok jest ważny dla poprawy jakości obrazowania konfokalnych żywych komórek. Rozdzielczość osiowa i odległość robocza soczewek mikroskopu konfokalnego są szczególnie ograniczone. Im bardziej zbliżysz próbkę do soczewki, tym lepiej możesz ją zobrazować i tym mniej energii lasera jest potrzebne do wzbudzenia fluorescencji LY.

Fototaksja jest ważną kwestią, jeśli chodzi o mikroskopię żywych komórek. W ramach tego testu wykluczamy tę opcję. Funkcjonalny AJC jest widoczny przez wykluczenie LY ze światła organoidu (ryc. 1, PBS). Dodanie EGTA na końcu eksperymentu powoduje sekwestrację jonów dwuwartościowych, które są kofaktorami białek AJC. LY jest wykluczony ze światła organoidu tylko w ważnych organoidach z funkcjonalnym kompleksem AJC. Ogólnie rzecz biorąc, cząsteczki fluorescencyjne mogą być używane do pomiaru integralności bariery jelitowej. Wybraliśmy LY zamiast innych powszechnie stosowanych fluoroforów, takich jak dekstran znakowany fluoresceiną, ponieważ są one transportowane transkomórkowo w komórkach jelitowych z przedziału podstawnego do wierzchołkowego⁹. Wybraliśmy LY również ze względu na jego niewielkie rozmiary. LY ma masę cząsteczkową 457 Da, dzięki czemu ułatwia badanie przepuszczalności bariery dla małych cząsteczek. Cząsteczka fluorescencyjna musi być wybrana w zależności od badanego zagadnienia naukowego. Ze względu na obecność fototoksycznych defektów AJC, energia wzbudzenia lasera musi zostać zmniejszona lub wydłużony odstęp między obrazowaniami. Optymalną techniką obrazowania konfokalnego dla tego testu jest mikroskopia wirującego dysku. Odpowiednie instrumenty umożliwiają obrazowanie konfokalne z krótkim czasem naświetlania przy niskiej mocy lasera.

Opracowano już różne modele do badania integralności bariery jelitowej in vitro. Podczas gdy stosowanie testów opartych na monowarstwach linii komórkowych lub eksperymentach in vivo maleje, metody oparte na organoidach stają się coraz częstsze. W przeciwieństwie do metod opisanych^wcześniej 4,5,6,7, nasza metoda pozwala na ilościowe określenie funkcji bariery w czasie. Pozwala to na wystawienie organoidów na dodatkowe bodźce w trakcie eksperymentu. W tym przypadku stosujemy EGTA jako drugi bodziec na końcu eksperymentu jako kontrolę pozytywną.

W przeciwieństwie do sytuacji in vivo, w naszym teście LY jest dodawany do pożywki i przenika do organoidu od zewnętrznej strony nabłonka podstawno-bocznego w kierunku wewnętrznego światła wierzchołkowego. LY jest mały i służy tylko do wizualizacji szczelności bariery jelitowej. Cząsteczki i bodźce, które modulują warstwę nabłonkową na powierzchni wierzchołkowej, muszą zostać wstrzyknięte do światła organoidu⁷. Aby zmniejszyć wysiłek eksperymentalny i móc zmierzyć integralność bariery wielu organoidów w tym samym czasie, zdecydowaliśmy się na zastosowanie barwnika fluorescencyjnego od zewnątrz.

Wykorzystaliśmy test do zbadania funkcji IFN-γ na ścisłym połączeniu organoidów myszy w jelicie cienkim. Fakt, że byliśmy w stanie przeanalizować integralność bariery w żywych organoidach, daje przyszłe możliwości zastosowania tej techniki do opisania inhibitorów wywołanego stanem zapalnym uszkodzenia bariery jelitowej. Substancje, które przeciwdziałają upośledzonej funkcji bariery spowodowanej przez IFN-γ mogą być kandydatami do leczenia chorób zapalnych jelit, w których upośledzona funkcja bariery jest jednym z czynników chorobotwórczych¹⁰.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka 8-dołkowe 48-dołkowe	Thermo Fisher Scientific	#150687
	Ibidi	#80826
96-dołkowa płytka hodowlana	Greiner Bio-One	#655101
Axio Observer.Z1 - wirujący dysk	Zeiss		488 nm / filtr emisyjny 525/25
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A3059-100G
Sitko do komórek	Falcon	352350
Probówka wirówkowa 15 ml	Thermo Fisher Scientific	11507411
Probówka wirówkowa 50 ml	Thermo Fisher Scientific	10788561
EDTA	Sigma-Aldrich	431788-25g
EGTA	Sigma-Aldrich	431788
Lucyfer Żółta sól dilitowa CH	Sigma-Aldrich	L0259
Matrigel, zredukowany czynnik wzrostu, wolny od czerwieni fenolowej	Corning	356231	Roztwór macierzy komórkowej
Myszy	Laboratorium Jacksona	M. musculus C57/Bl6
Szkiełko		mikroskopu 24 mm x 60 mm
Organoid Growth Medium mysie	technologie	komórek macierzystych#06005
Solanka buforowana fosforanem	Biochrom	L182-05
Rekombinowana mysia IFN-γ	Kot Biolegend	#575304