Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60549

⸱

19 listopada 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Augusta University, 2Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center and University of California, San Francisco, 3Department of Pathology, Veterans Affairs Medical Center and University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Streszczenie

Ablacja sygnalizacji receptora androgenowego (AR) poprzez deprywację androgenów jest celem pierwszej linii terapii raka prostaty, która początkowo prowadzi do regresji raka. Jednak w znacznej liczbie przypadków choroba rozwija się w zaawansowanego, opornego na kastrację raka gruczołu krokowego (CRPC), który ma ograniczone możliwości terapeutyczne i często jest agresywny. Przerzuty odległe obserwuje się głównie na tym etapie agresywnej choroby. CRPC leczy się inhibitorami szlaku AR drugiej generacji, które początkowo poprawiają przeżycie, a następnie pojawiają się oporności na terapię. Neuroendokrynny rak gruczołu krokowego (NEPC) jest rzadkim wariantem raka gruczołu krokowego (PCa), który często rozwija się w wyniku oporności na terapię w procesie transdyferencjacji znanym jako różnicowanie neuroendokrynne (NED), w którym komórki PCa przechodzą zmianę linii z gruczolakoraka i wykazują zwiększoną ekspresję markerów linii neuroendokrynnej (NE). Oprócz zmian genomowych, które napędzają progresję i transdyferencjację do NEPC, czynniki epigenetyczne i sygnały mikrośrodowiskowe są uważane za kluczowych graczy w napędzaniu progresji choroby. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół identyfikacji czynników epigenetycznych (tj. małych niekodujących RNA), które są związane z zaawansowanym PCa. Wykorzystując oczyszczone mikroRNA z tkanek przerzutowych zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie i odpowiadających im pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z surowicy, protokół opisuje, w jaki sposób przygotować biblioteki z odpowiednią kontrolą jakości do sekwencjonowania mikroRNA z tych źródeł próbek. Wyizolowanie RNA zarówno z FFPE, jak i EV jest często trudne, ponieważ większość z nich jest albo zdegradowana, albo ma ograniczoną ilość. Protokół ten omówi różne metody optymalizacji wejść RNA i bibliotek cDNA w celu uzyskania najbardziej specyficznych odczytów i wysokiej jakości danych podczas sekwencjonowania.

Wprowadzenie

Rak prostaty jest napędzany przez androgeny działające poprzez sygnalizację AR. Dlatego celowanie w szlak AR jest podstawowym sposobem leczenia choroby1. Jednak często pojawia się oporność w wyniku terapii celowanych, a choroba postępuje do zaawansowanego przerzutu CRPC2. CRPC jest leczony terapią AR drugiej generacji, która obejmuje enzalutamid i abirateron2,3, co początkowo poprawia przeżycie. Jednak śmiertelne warianty, takie jak NEPC, często pojawiają się w 25−30% leczonych przypadków CRPC, które mają ograniczone możliwości leczenia, co prowadzi do zwiększonej śmiertelności3. NEPC powstaje w wyniku odwracalnego procesu transdyferencjacji znanego jako NED, w którym komórki PCa przechodzą zmianę linii z gruczolakoraka i wykazują zmniejszoną ekspresję AR i zwiększoną ekspresję markerów linii NE, w tym enolazy 2 (ENO2), chromograniny A (CHGA) i synaptofizyny (SYP)4. Biorąc pod uwagę, że te warianty oporności powstają w wyniku interwencji terapeutycznych, konieczne jest rozszyfrowanie ścieżek, które prowadzą do powstania tej śmiertelnej, trudnej do leczenia postaci PCa.

Genomika NEPC została niedawno rozszyfrowana w wyczerpującym badaniu przeprowadzonym przez Beltrana i wsp., gdzie analizowano zmiany liczby kopii, mutacje, polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) i metylację DNA z przerzutowych tkanek pochodzących od pacjenta5. Pomimo znacznego postępu w zrozumieniu genomiki tej agresywnej postaci PCa, niewiele wiadomo na temat czynników epigenetycznych, w tym małych niekodujących RNA (mikroRNA), które są zaangażowane w przejście gruczolakoraka CRPC do NEPC. MikroRNA (miRNA) to dwuniciowe RNA o długości 22 pz, które działają głównie poprzez tłumienie ekspresji genów po transkrypcji poprzez specyficzne dla sekwencji interakcje z 3'-nieuleganymi regionami (UTR) pokrewnych celów mRNA6. Zidentyfikowano już kilka oncomiR i supresorów nowotworów, a ich rola w regulacji początku choroby i przerzutów została dobrze zbadana w różnych nowotworach6,7. Te małe, niekodujące RNA często służą jako bardzo ważne cele w kontrolowaniu śmiertelności chorób6,8,9. Nowsze badania koncentrują się na zrozumieniu parakrynnego wpływu miRNA na przerzuty raka poprzez ich transport w EV, takich jak egzosomy, które przepływają w krwiobiegu i umożliwiają komórkom nowotworowym wysyłanie tych wtórnych przekaźników do miejsc przerzutów w środowisku wolnym od nukleaz10,11,12. EV przenoszą miRNA z komórek nowotworowych, aby przenieść efekty transformacji z komórek gospodarza12. Identyfikacja EV jako wtórnych przekaźników komórek nowotworowych może być zatem przydatna w nieinwazyjnym wykrywaniu ciężkości choroby.

miR-1246 jest wysoce regulowany w górę w EV od agresywnego PCa, co wskazuje na stopień zaawansowania choroby13. Te miRNA związane z EV służą nie tylko jako nieinwazyjne biomarkery choroby, ale także odgrywają funkcjonalnie ważną rolę w napędzaniu nowotworzenia. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć znaczenie repertuaru miRNA, który jest związany z opornymi formami PCa, aby umożliwić lepszą identyfikację nieinwazyjnych biomarkerów, a także ich znaczenie funkcjonalne.

Pojawienie się sekwencjonowania nowej generacji zaoferowało najbardziej wszechstronną platformę do badania szczegółów krajobrazu nowotworów obejmujących zmiany w genomie, takie jak mutacje, przemieszczenia chromosomów, chromothripsis i metylacja, z których wszystkie znacząco przyczyniają się do powstania i natury raka14,15,16. Podobnie, jest to również niezbędne narzędzie do zrozumienia rozległych zmian epigenomicznych, które zachodzą w komórce nowotworowej i które często odgrywają ważną rolę w nasileniu choroby17. W celu zrozumienia repertuaru miRNA związanego z wytwarzaniem NEPC, przeprowadzono sekwencjonowanie małego RNA na przerzutowych tkankach CRPC FFPE i odpowiadających im EV pochodzących z surowicy. RNA pochodzące z któregokolwiek z tych dwóch źródeł próbek ma (1) niską wydajność i (2) złej jakości ze względu na degradację, która często zachodzi w wyniku wiązania formaliny i izolacji EV. Co więcej, generowanie bibliotek cDNA jest krytycznym, ale kłopotliwym etapem sekwencjonowania. W związku z tym metody izolowania tych RNA i wykorzystywania ich do generowania bibliotek do sekwencjonowania małych RNA wymagają optymalizacji w celu wygenerowania dokładnych i wiarygodnych danych.

Istnieje kilka metod profilowania ekspresji miRNA w różnych próbkach, w tym RT-PCR, mikromacierze i hybrydyzacja in-situ (ISH). Niedawno opublikowano protokół wykorzystujący RNA pochodzące z tkanek FFPE do oceny ekspresji miRNA za pomocą RT-PCR i ISH18. Nowsze technologie oferują bardziej wyczerpujące i kompleksowe platformy do profilowania ekspresji miRNA w próbce. NanoString nCounter oferuje czułą platformę detekcji miRNA19, ale wykrywanie jest często ograniczone przez liczbę miRNA, które są dostępne w macierzy (~2,000). W takim scenariuszu bardziej czuła i wyczerpująca platforma, taka jak sekwencjonowanie nowej generacji, oferuje znacznie większą głębokość identyfikacji miRNA i jednoczesne profilowanie w różnych próbkach20. Metoda została wykorzystana do określenia sygnatur miRNA w moczu lub osoczu pacjentów z PCa21,22,23. W niniejszym artykule przedstawiono protokół wykorzystania platformy sekwencjonowania nowej generacji do badania profili miRNA związanych z agresywnym CRPC przy użyciu tkanek FFPE i RNA EV pochodzących z surowicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi US Common Rule i zostało zatwierdzone przez Institutional Committee on Human Research.

1. Mikrodysekcja

UWAGA: Przerzutowe tkanki CRPC FFPE z cechami gruczolakoraka (CRPC-Adeno) lub różnicowaniem NE (CRPC-NE) uzyskano z Sieci Biorepozytorium Raka Prostaty (PCBN). Dziesięciomikronowe skrawki PCa na szkiełkach przygotowano do ręcznej mikrodysekcji, jak omówiono wcześniej18. Podsumowując pokrótce:

  1. Odparafinować skrawki tkanki, mocząc szkiełka w ksylenie (2x, 10 min każda). Następnie ponownie uwodnić sekcje, inkubując szkiełka przez 5 minut każda w sortowanym etanolu (100%, 95%, 90%, 80% i 70%), a następnie przemyć wodą destylowaną i zabarwić hematoksyliną (30 s moczenia).
  2. Po barwieniu hematoksyliną umyj skrawki tkanki wodą. Następnie odwodnić skrawki tkanki, umieszczając je w sortowanym etanolu (70%, 80%, 90%, 95%, 100%) (5 min każdy), a następnie ksylenie (5 min).
  3. Przeanalizuj odpowiednie szkiełka hematoksyliny i eozyny (H&E), aby zidentyfikować obszary guza (tj. gruczolakorak lub NED) i oznaczyć te obszary guza i normalne przyległe obszary z pomocą certyfikowanego patologa. Korzystając z tych slajdów H&E jako map drogowych, zaznacz tkanki barwione hematoksyną uzyskane w powyższym kroku, aby odróżnić guz od obszarów normalnych.
  4. Ostrożnie wypreparuj oznaczoną tkankę pod mikroskopem za pomocą ostrza skalpela.
  5. Zbierz wypreparowaną tkankę z obszarów normalnych i nowotworowych w oddzielnych probówkach za pomocą elektrostatycznie naładowanych końcówek do pipet z żelem. Naładowana końcówka przyciąga wypreparowaną tkankę i pozwala na maksymalną regenerację tkanki po rozwarstwieniu. Gdy tkanka przyklei się do naładowanej końcówki, pokrój końcówkę do pustej probówki o pojemności 2 ml.

2. Izolowanie EV pochodzących z serum

UWAGA: Zamrożone próbki surowicy pacjenta pobrane od pacjentów z przerzutowym CRPC z cechami gruczolakoraka (CRPC-adeno) lub różnicowaniem NE (CRPC-NE) zostały pobrane z PCBN przy użyciu zatwierdzonego protokołu IRB i przechowywane w temperaturze -80 °C przed ich użyciem. Próbki surowicy pobrano od tej samej grupy pacjentów, co próbki używane do mikropreparowanych tkanek, aby umożliwić porównanie odpowiednich tkanek z EV pochodzącymi z surowicy. Do zebrania EV użyto dostępnego na rynku odczynnika do izolacji EV w surowicy.

  1. Zamrożone próbki surowicy pacjenta rozmrozić w temperaturze 4 °C.
  2. Użyj 110 μl rozmrożonej próbki surowicy i wiruj w temperaturze 2 000 x g przez 30 minut.
  3. Zebrać supernatant do późniejszej izolacji EV/egzosomu i wyrzucić osad gruzu. Dodać 30 μl odczynnika do izolacji egzosomów surowicy do supernatantu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  4. Wirować w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut. Ostrożnie zebrać surowicę zubożoną w EV, nie naruszając granulki, w oddzielnej probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  5. Zawiesić osad EV w 70 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przygotowanej w wodzie wolnej od nukleaz. Zachowaj podwielokrotność dla systemu analiz śledzenia cząstek, aby ocenić jakość i liczbę cząstek. Pozostałą część próbki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

3. Izolacja RNA z mikrowypreparowanych tkanek prostaty i EV

UWAGA: Całkowite RNA zostało wyizolowane z mikrowypreparowanych tkanek i oczyszczonych EV przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu (Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta z kilkoma modyfikacjami. W poniższych sekcjach pokrótce opisano te procedury, ze szczególnym naciskiem na ważne kroki:

  1. Wyizoluj RNA z mikrowypreparowanych tkanek.
    1. Zawiesić mikrowypreparowaną tkankę FFPE w 150 μl buforu proteinazy K. Wymieszać przez wirowanie i odpipetować pozostałą tkankę z końcówki. Wirować z prędkością 11 000 x g przez 1 min.
    2. Do granulki dodać 10 μl proteinazy K. Poczekaj 2 minuty, aż granulka zmieni kolor na biały. Pipetuj kilka razy w górę i w dół.
    3. Inkubować w temperaturze 56 °C przez 16 minut. Wirować co 3 minuty.
    4. Wyjąć próbki i pozwolić, aby blok grzewczy osiągnął temperaturę 80 °C. Inkubować próbki na bloku przez 16 minut. Wirować co 3 minuty.
    5. Inkubować na lodzie przez 3 minuty.
    6. Wirować z prędkością 20 000 x g przez 15 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml.
    7. Dodać 16 μl buforu wspomagającego DNazę, a następnie 10 μl DNazy I. Wymieszać, delikatnie odwracając probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
    8. Dodać 320 μl buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC). Wymieszać odwracając probówkę, a następnie dodać 1,120 μl 100% etanolu. Natychmiast przenieść na kolumny wirujące przechowywane w temperaturze 4 °C. Wirować z prędkością 8 000 x g przez 30 s.
    9. Przemyć kolumny 2x buforem do przemywania i obracać kolumny przy 20 000 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki buforu do płukania.
    10. Pozostaw kolumnę wirową do wyschnięcia na powietrzu przez 2-3 minuty, a następnie wymyj 19 μl wody wolnej od RNaz. Oznaczyć ilościowo oczyszczony RNA na spektrofotometrze i znormalizować próbkę do 40 ng/μl.
  2. Izolacja RNA z EV pochodzących z surowicy.
    1. Wyizoluj egzosomalne RNA za pomocą zestawu. Dodać 75 μl buforu do lizy A i 9,3 μl buforu do lizy B do 50 μl oczyszczonej zawiesiny EV.
      nuta: Kontynuuj mieszanie próbki, odwracając rurkę przez około 10 minut, aby umożliwić całkowitą lizę EV.
    2. Dodać 130 μl 100% etanolu i natychmiast wymieszać, odwracając próbkę. Przenieś na kolumnę wirującą, a następnie wiruj z prędkością 3 300 x g przez 1 min.
    3. Przemyć kolumnę 2x buforem do płukania. Obracać kolumnę przy 1,300 x g przez 3 minuty, aby całkowicie usunąć bufor do płukania.
    4. Pozostawić kolumnę do wyschnięcia na powietrzu przez 2 minuty. Dodać 18 μl buforu elucyjnego do kolumny i pozostawić na 2 minuty. Wirować z prędkością 400 x g przez 1 minutę, a następnie ponownie wirować z prędkością 5 800 x g przez 3 minuty.
    5. Powtórzyć krok 3.2.4 z eluowanym buforem dołączonym do zestawu, aby zwiększyć wydajność RNA z próbki.
    6. Określić ilościowo próbkę na spektrofotometrze i znormalizować ją do 40 ng/μl.

4. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania małych RNA

UWAGA: Mały zestaw do przygotowania biblioteki RNA (Tabela Materiałów) został użyty do wygenerowania bibliotek cDNA z wyizolowanych próbek RNA. Kroki generowania bibliotek, oczyszczania i sprawdzania ich jakości przed uruchomieniem w sekwencerze mają kluczowe znaczenie dla każdego protokołu sekwencjonowania, ponieważ ostatecznie określają jakość danych wyjściowych z przebiegu. Dlatego postępuj ostrożnie z każdym krokiem. Wytyczne producenta sugerują użycie minimum 50 ng RNA. Biorąc pod uwagę słabą jakość i niskie ilości całkowitego RNA zwykle uzyskiwanego z tych dwóch źródeł próbek, protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem stężeń RNA tak niskich, jak 100 ng. Poniższy protokół dotyczy jednej próbki biblioteki.

  1. Wygeneruj cDNA podwiązane adapterem.
    1. Użyj 5 μl znormalizowanej (40 ng/μl) próbki RNA. Dodaj 1 μl adaptera 3'. Przed rozpoczęciem inkubacji próbek należy podgrzać termocykler do temperatury 70 °C. Inkubować przez 2 minuty. Próbki należy natychmiast przenieść na lód przed przejściem do następnego etapu.
    2. W osobnej probówce wymieszaj 2 μl buforu ligacyjnego, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl ligazy T4 RNA 2, mutanta delecji. Wymieszać pipetując w górę i w dół i dodać 4 μl tej mieszanki do probówki z adapterem RNA/3'.
    3. Przenieść do termocyklera podgrzanego do temperatury 28 °C i inkubować przez 1 godzinę.
    4. Dodać 1 μl roztworu zatrzymującego, trzymając próbki na bloku termicznym. Inkubować w temperaturze 28 °C przez kolejne 15 minut.
    5. Wyjmij rurki i trzymaj na lodzie natychmiast po tym kroku.
    6. W osobnej probówce dodaj 1 μl adaptera 5'.
    7. Przenieść do termocyklera podgrzanego do temperatury 70 °C i inkubować przez 2 minuty.
    8. Natychmiast umieść rurkę na lodzie, aby zapobiec ponownemu wyżarzaniu adapterów.
    9. Dodać 1 μl 10 mM ATP do probówki denaturowanego adaptera 5'. Wymieszać pipetując i dodać do mieszaniny 1 μl ligazy T4 RNA. Wymieszać pipetując i dodać 3 μl tej mieszaniny do probówki zawierającej RNA ligowane adapterem 3'. Przenieść na termocykler podgrzany do temperatury 28 °C i inkubować przez 1 godzinę.
    10. Natychmiast przenieść do lodu i albo kontynuować pracę z próbkami, albo przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    11. Aby wykonać RT-PCR, użyj 6 μl każdego RNA ligowanego adaptorowo i dodaj do niego 1 μl startera RNA RT. Przenieść do termocyklera podgrzanego do temperatury 70 °C. Inkubować przez 2 minuty.
    12. W osobnej probówce wymieszaj 2 μl 5x buforu nici, 0,5 μl 12,5 mM dNTP, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy. Dodać 5,5 μl tej mieszaniny do RNA ligowanego adaptorowo i przenieść do termocyklera podgrzanego do 50°C. Inkubować przez 1 godzinę.
    13. Natychmiast przenieś cDNA ligowane adaptorowo do lodu.
    14. W osobnej probówce wymieszaj 25 μl mieszanki PCR, 2 μl startera RNA PCR, 2 μl wskaźnika startera RNA PCR i 8,5 μl wody wolnej od RNaz. Dodaj 37,5 μl tej mieszanki do 12,5 μl cDNA podwiązanego adaptorowo. Przenieść do termocyklera, który został wstępnie podgrzany do 98 °C. Zaprogramować termocykler zgodnie z sugestiami w protokole producenta ze zmodyfikowanym numerem cyklu na 15 zamiast 11.
      nuta: Sekwencje wszystkich użytych starterów są wymienione w Tabeli materiałów.
    15. Po zakończeniu przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Kontynuuj z nimi lub przechowuj w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
  2. Oczyść i przeprowadź kontrolę jakości ligowanego cDNA.
    nuta: Amplifikowany cDNA został oczyszczony żelem zgodnie z protokołem producenta, z wyjątkiem kilku modyfikacji mających na celu poprawę jakości i wydajności oczyszczonych próbek cDNA, jak wyjaśniono poniżej.
    1. Użyj 6% żeli poliakryloamidowych TBE do oczyszczenia amplifikowanego cDNA. Rozcieńczyć drabinkę o wysokiej rozdzielczości (HRL) i niestandardową drabinkę RNA (CRL) równymi objętościami barwnika ładującego DNA.
    2. Dodaj 10 μl barwnika ładującego DNA do każdej próbki cDNA. Umieścić 30 μl każdej próbki na dwóch oddzielnych torach przylegających do siebie za pomocą CRL i HRL w przestrzeni pośredniej między dwiema różnymi próbkami.
    3. Uruchom żel w 1x buforze TBE pod napięciem 145 V przez około 30−40 min.
      nuta: Śledź dolny niebieski przód barwnika załadowczego. Przerwij elektroforezę, gdy zbliży się do dna żelu.
    4. Przenieść żel w 1x bufor TBE z bromkiem etydyny (EtBr) w stężeniu 0,5 μg EtBr/1 ml 1x TBE.
      ostrożność: EtBr jest znanym czynnikiem rakotwórczym i każdy krok od tego momentu aż do wycięcia z żelu powinien być wykonywany z najwyższą ostrożnością.
    5. Wizualizuj żel w transiluminatorze i dokładnie przetnij żel między markerem 145 pz a 160 pz.
      nuta: Dimery adaptera biegną bardzo blisko znacznika 145 pz. Dlatego należy przeciąć żel nieco powyżej znacznika 145 pz, aby uniknąć zanieczyszczenia dimerem adaptera.
    6. Przenieś żel do probówek do rozbijania DNA przechowywanych w probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml. Wirować z prędkością 20 000 x g przez 2 minuty. Dodaj 300 μl wody wolnej od RNaz i pozwól jej delikatnie obracać się na bujaku przez noc w temperaturze pokojowej.
    7. Aby przeprowadzić wytrącanie DNA, następnego dnia przenieś zawartość probówki do probówek filtracyjnych o średnicy 5 μm. Wirować z prędkością 600 x g przez 10 s.
      nuta: Nie pozwól, aby rurki wirowały dłużej niż 10 sekund, gdy żel przechodzi przez filtr.
    8. Do eluowanego DNA dodać 2 μl glikogenu, 30 μl 3 M NaOAc, 2 μl 0,1x farby w postaci granulek i 975 μl 100% etanolu. Wirować z prędkością 17 000 x g w temperaturze 4°C przez 20 min.
    9. Wyrzuć supernatant i dodaj 75% etanolu, aby umyć osad. Wirować w temperaturze 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odrzucić supernatant i inkubować probówki w temperaturze 37 °C w celu całkowitego odparowania etanolu.
    10. Zawiesić osad za pomocą 12 μl 10 mM Tris-HCl pH 8,5.
    11. Przeprowadź kontrolę jakości biblioteki, rozcieńczając oczyszczony cDNA 10-krotnie (1:10) i używając 1 μl rozcieńczonego cDNA do uruchomienia na bioanalizatorze.
    12. Upewnij się, że rozmiar produktu cDNA odpowiada zakresowi małego RNA (136−160 pz) na elektroferogramie. Obliczyć całkowitą molowość dla każdej próbki. Normalizować każdą próbkę do 2 nM przy użyciu Tris-HCl pH 8,5.
  3. Denaturacja i sekwencjonowanie oczyszczonego cDNA.
    1. Połącz biblioteki, mieszając równe objętości każdej próbki o długości 2 nM w jednej probówce PCR o pojemności 200 μl. Dodać 10 μl świeżo przygotowanego 0,2 N NaOH do 10 μl połączonej biblioteki.
    2. Wymieszać natychmiast przez wirowanie i wirować w temperaturze 280 x g przez 1 minutę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Dodać 10 μl 200 mM Tris-HCl pH 7 do 20 μl zdenaturowanej biblioteki. Mieszaj przez wirowanie i wiruj w temperaturze 280 x g przez 1 min.
    4. Dodać 970 μl wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego do biblioteki i dobrze wymieszać przez wirowanie. Biblioteka jest w stężeniu 20 pm. Przechowywać na lodzie, aż zostanie ostatecznie rozcieńczony.
      nuta: Końcowe rozcieńczenie wykonuje się tuż przed uruchomieniem na sekwencerze.
    5. Dodać 117 μl zdenaturowanej biblioteki do 1,183 μl wstępnie schłodzonego buforu hybrydyzacyjnego. Wymieszać, odwracając probówkę i wirówkę pulsacyjną. Końcowe stężenie w bibliotece wynosi obecnie 1,8 pm.
    6. Dodaj 1,3 μl PhiX do 1,3 ml końcowej biblioteki. Aby zainicjować uruchomienie w sekwencerze, postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w interfejsie oprogramowania, przejrzyj parametry uruchomienia, w tym typ odczytu (pojedynczy odczyt), długość odczytu (liczba cykli dla każdego odczytu), identyfikator biblioteki i wybierz Uruchom.

5. Analiza danych

  1. Na końcu uruchomienia sekwencera uzyskaj wynikowe dane sekwencjonowania jako pliki fastQ. Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby przeanalizować wynikowe dane sekwencjonowania.
  2. Otwórz aplikację fastQ toolkit i naciśnij przycisk Uruchom.
  3. Wybierz pliki z listy próbek w oprogramowaniu i wybierz miejsce, w którym dane zostaną zapisane.
  4. Dodaj nazwę ciągu, która ma zastosowanie do każdej przyciętej sekwencji. Utrzymuj rygorystyczność na poziomie 0,9. Wprowadź sekwencję adaptera do przycinania jako "TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG" od końca 3' każdej sekwencjonowanej próbki. Rozwiń kartę Filtrowanie odczytu i wybierz minimalną długość odczytu "5". Zaznacz pole Potwierdzenie i naciśnij przycisk Kontynuuj, aby rozpocząć przycinanie. Przycięte pliki zostaną zapisane w folderze projektu po zakończeniu analizy.
  5. Otwórz małą aplikację RNA v.1.0 w oprogramowaniu i naciśnij przycisk Uruchom.
  6. Wybierz projekt, w którym pliki zostaną zapisane i wysłane po analizie.
  7. Wybierz w aplikacji funkcję Novel miR i Differential miRs. Podziel grupy jako "Kontrola" i "Test" do analizy różnicowej i dodaj przycięte pliki do analizy w odpowiednich grupach.
  8. Wybierz przycisk Uruchom, aby zainicjować analizę. Po przeprowadzeniu analiz pobierz pliki wynikowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Bibliotekę przygotowano po izolacji RNA oraz przeprowadzeniu kontroli jakości. Oczyszczanie żelowe dla amplifikowanej biblioteki cDNA przygotowanej z RNA izolowanego z tkanek poddanych mikrodysekcji oraz pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pochodzenia surowiczego przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2. Wielkość produktu dla miRNA z przyłączonymi adaptorami wynosiła około 136−160 bp dla każdej próbki. Rysunek 1A-B ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule opisujemy protokół izolacji RNA z tkanek FFPE i EV pochodzących z surowicy przy użyciu zestawów, które zostały zoptymalizowane w celu zwiększenia wydajności i jakości izolowanych RNA. Co więcej, oczyszczone RNA wykorzystano do wygenerowania bibliotek cDNA do sekwencjonowania małych RNA. Oba wymienione kroki są niezbędne do określenia jakości i głębokości odczytów sekwencjonowania, które są końcowym wynikiem przebiegu24. Dlatego optymalizacja tych kluczowych kroków ma kluczowe znacze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez US Army Medical Research Acquisition Activity (USAMRAA) poprzez Nagrodę Rozwoju Pomysłów pod Nagrodą nr W81XWH-18-1-303 i W81XWH-18-2-0013 oraz dodatkowo przez Nagrodę nr W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 i W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). Docenia się również wsparcie finansowe dla laboratorium autorów przez National Cancer Institute przy National Institutes of Health (grant numer RO1CA177984). Rajvir Dahiya jest starszym naukowcem w Departamencie ds. Weteranów, BX004473 i finansowanym przez NIH-UO1CA199694 (RD). Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są popierane przez Departament Obrony lub Armię Stanów Zjednoczonych. Jesteśmy wdzięczni Judy Shigenaga, dyrektorce głównego obiektu w San Francisco VAMC, za jej pomoc przy sekwencerze NextSeq 500.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3 M NaOAc pH 5,5USB Corp.75897 100 ml
5 &mikro; m rurki filtracyjneIST Engineering Inc.5388-50
6% żele poliakryloamidowe TBENovexEC6265BOX
Oprogramowanie doBaseSpace IlluminaBioanalizator
ładujący DNAAgilent
Termostat Eppendorf plusEppendorf 1,5 mL
Alkohol etylowy 200-odpornyPharmco111000200
Zestaw do izolacji egzosomalnego RNANorgen58000
Rurki do łamania żeluIST Engineering Inc.3388-100
Glikogen klasy biologii molekularnejThermo ScientifcR0561
Hematoxylin SelectStat labSL401
MikrowirówkaFisher Scientific13-100-676accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE zestawQiagen217504
NanodropThermo ScientifcNano Drop 1000
Nanosight NTAMalvernLM14
NextSeq 500 SequencerIllumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cykli)IlluminaFC-404-2001
Farba granulkowaMillipore70748-3
Indeks górny II Odwrotna transkryptazaInvitogen18064014
T4 RNA Ligaza 2 Delecja MutantLucigenLR2D11310K
TBE Bufor do biegania (5x)NovexLC6675
TermocyklerMJ ResearchPTC100
Odczynnik do całkowitej izolacji egzosomów (z surowicy)Invitrogen4478360
TrueSeq mała biblioteka RNA Zestaw przygotowawczy-Zestaw A (indeksy 1-12)IlluminaRS-200-0012
XyleneFisher NaukowyX3P- 1GAL
RNA 3' PodkładGUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' PodkładTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop OligoGAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT PrimerGCCTTGGCACCCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR PrimerAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index PrimerCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 zasad]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-
--6 zasad w adapterze
RNA PCR Index Primer 1CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2ACATCG
RNA PCR Index Primer 3GCCTAA
Starter indeksu RNA PCR 4Starter
RNA PCR 5CACTGT
RNA PCR 6ATTGGC
RNA PCR 7
RNA PCR GATCTGindeksu RNA PCR TCAAGT
9indeksu CTGATC
RNA PCR 10indeksujący AAGCTA
RNA PCR 11GTAGCC
Starter indeksujący RNA PCR 12TACAAG
analizy Barwnik Novex LC6678 EtBr Pierce 17898 indeksu Starter indeksu Starter indeksu Starter indeksu 8 Starter Starter Starter

Bibliografia

  1. Heinlein, C. A., Chang, C. Androgen receptor in prostate cancer. Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).
  2. Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor. European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).
  3. Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer. Current Oncology Reports. 19 (5), 32(2017).
  4. Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).
  5. Beltran, H., et al. Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer. Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).
  6. Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
  7. Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).
  8. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  9. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  10. Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).
  11. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  12. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  13. Bhagirath, D., et al. microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).
  14. Witte, J. S. Prostate cancer genomics: towards a new understanding. Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).
  15. Kim, J. H., et al. Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).
  16. Robinson, D., et al. Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer. Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).
  17. Kim, J., Yu, J. Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer. Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).
  18. Bucay, N., et al. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. Journal of Visualized Experiments. (103), e53123(2015).
  19. Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).
  20. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).
  21. Rodriguez, M., et al. Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes. Molecular Cancer. 16 (1), 156(2017).
  22. Guelfi, G., et al. Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research. Scientific Reports. 8 (1), 7111(2018).
  23. Daniel, R., et al. A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281(2017).
  24. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges. Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja RNAprzygotowanie biblioteksekwencjonowanie następnej generacjielektroforeza żelowasynteza cDNAizolacja egzosomów
Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.