Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60550

⸱

7 grudnia 2019

 , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest połączenie dwóch różnych typów komórek w celu stworzenia komórek hybrydowych. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej połączonych komórek służy do śledzenia komórki pochodzenia organelli komórkowych. Test ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób struktura i funkcja komórkowa reagują na zakłócenia spowodowane fuzją komórek.

Streszczenie

Życie jest przestrzennie podzielone w błonach lipidowych, aby umożliwić izolowane tworzenie odrębnych stanów molekularnych wewnątrz komórek i organelli. Fuzja komórek to połączenie dwóch lub więcej komórek w jedną komórkę. Tutaj przedstawiamy protokół fuzji komórek dwóch różnych typów komórek. Skondensowane komórki hybrydowe są wzbogacane przez sortowanie oparte na cytometrii przepływowej, a następnie mikroskopię fluorescencyjną struktury i funkcji komórek hybrydowych. Znakowane fluorescencyjnie białka generowane przez edycję genomu są obrazowane wewnątrz połączonych komórek, co pozwala na identyfikację struktur komórkowych na podstawie emisji fluorescencji i odniesienie z powrotem do typu komórki, z której pochodzą. Ta solidna i ogólna metoda może być stosowana do różnych typów komórek lub organelli będących przedmiotem zainteresowania, aby zrozumieć strukturę i funkcję komórkową w zakresie szeregu podstawowych pytań biologicznych.

Wprowadzenie

Homeostatyczne utrzymanie struktury komórkowej jest kluczowe dla życia. Komórki mają charakterystyczne morfologie, liczbę organelli subkomórkowych i wewnętrzny skład biochemiczny. Zrozumienie, w jaki sposób generowane są te podstawowe właściwości i jak przebiegają nieprawidłowo podczas choroby, wymaga narzędzi laboratoryjnych, aby je zaburzyć.

Fuzja komórek to połączenie dwóch lub więcej oddzielnych komórek. Fuzja komórek mogła mieć kluczowe znaczenie dla pojawienia się życia eukariotycznego1. W ludzkim ciele fuzja komórek jest stosunkowo rzadka, zachodzi w ograniczonych warunkach rozwojowych i typach tkanek, takich jak zapłodnienie lub tworzenie mięśni, kości i łożyska2. Protokół ten opisuje indukcję fuzji komórka-komórka w liniach komórkowych hodowli tkankowej z różnie fluorescencyjnie znakowanymi organellami, jako narzędzie do zrozumienia mechanizmów kontrolujących strukturę i funkcję komórki.

Indukowana in vitro fuzja komórkowo-komórkowa jest kluczowa dla produkcji przeciwciał monoklonalnych3, ważne narzędzie do badań biologicznych i leczenia chorób. Fuzja komórkowa została również wykorzystana do zadawania wielu różnych podstawowych pytań biologicznych dotyczących dominacji cyklu komórkowego4, aneuploidy5,6, przeprogramowanie komórkowe7,8, naprawa uszkodzonych neuronów9, proliferacja wirusów10, apoptosis11, nowotworygeneza12, dynamika cytoszkieletu13 oraz membrane fusion14,15. Laboratoryjne metody indukowania fuzji komórka-komórka16,17,18,19 indukują koalescencję błony lipidowej poprzez fizyczne połączenie dwóch dwóch warstw w jedną. Fuzja komórek może być indukowana przez elektryczność18, metody oparte na wirusach17, ogrzewanie termoplazmoniczne20, transgene expression19, oraz chemikalia, w tym glikol polietylenowy (PEG)16,21,22.

Centrosomy to centra organizujące mikrotubule kontrolujące kształt, ruchliwość, polaryzację i podział komórek23. Korzenie centrosomalne to włókniste struktury wyrastające z centrosomów zawierających białko rootletin24 (kodowane przez gen CROCC). Niedawno użyliśmy fuzji komórka-komórka, aby zrozumieć, jak zmienia się pozycja i liczba centrosomów wewnątrz heterokarionów w stosunku do komórek rodzicielskich24. Uzasadnieniem zastosowania tej metody jest śledzenie komórki pochodzenia korzeni w heterokarionie po fuzji różnie fluorescencyjnie znakowanych komórek rodzicielskich, a tym samym zobrazowanie fuzji i rozszczepienia organelli. Znakowane fluorescencyjnie białka rootletin-meGFP lub rootletin-mScarlet-I są tworzone przez edycję genomu w oddzielnych liniach komórkowych, które są następnie łączone przez fuzję komórek za pośrednictwem PEG. Opisujemy zastosowanie barwników komórkowych (tabela materiałów) do identyfikacji połączonych komórek za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie identyfikacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej komórki centrosomu pochodzenia i morfologii (ryc. 1). Podejście to jest solidną i unikalną metodą badania, w jaki sposób główne zmiany w stanie komórkowym, w tym liczba organelli, wpływają na homeostazę komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Różnicowe znakowanie komórek fluorescencyjnych

  1. Znakowanie genów za pomocą CRISPR Cas9
    1. Użyj edycji genomu CRISPR Cas9, aby oznaczyć rootletynę (lub inne interesujące geny) za pomocą białek fluorescencyjnych meGFP lub mScarlet-I w ludzkich liniach komórkowych raka.
      nuta: Szczegółowe protokoły edycji genomu są omówione gdzie indziej24,25,26.
  2. Etykietowanie barwnikami fluorescencyjnymi
    1. Hoduj ludzkie komórki rakowe Cal51 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), L-glutaminą i 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
      nuta: Ważne jest, aby zapewnić, że komórki są regularnie sprawdzane pod kątem braku zanieczyszczenia mykoplazmą oraz tożsamości linii komórkowej. Nie należy używać komórek, które zostały w znacznym stopniu pasażowane w hodowli (>15 pasaży). Komórki muszą być zdrowe i rosnąć wykładniczo. Unikaj niedostatecznej lub nadmiernej konfluencji.
    2. Wysiewaj każdy typ komórek (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I i rodzicielskie nieoznakowane komórki Cal51) tak, aby ~6 x 106 komórek było obecnych następnego dnia dla każdej próbki, przy zbiegu 70−90%.
      nuta: Jest to w przybliżeniu jedna kolba do hodowli tkankowych T75 lub jedna 10-centymetrowa półka na każdy typ komórki. Nieoznaczone komórki rodzicielskie są wymagane jako kontrola negatywna w dalszej części protokołu. Protokół ten pozwala na produkcję ~ 20 000 połączonych komórek, ale liczba ta może zostać zwiększona poprzez skalowanie protokołu ze zwiększoną liczbą partii.
    3. Następnego dnia podgrzej DMEM, trypsynę i 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    4. Umyj komórki rootletin-meGFP i rootletin-mScarlet-I 2x w PBS, wylewając lub odsysając pożywkę i zastępując 10 ml PBS.
    5. Oznacz komórki Cal51 rootletin-meGFP, dodając 500 nM barwnika z komórek fioletowych (tabela materiałów) w PBS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Oznacz komórki korzenia Cal51 mScarlet-I, dodając 200 nM barwnika dalekich krwinek czerwonych (tabela materiałów) w PBS przez 1 minutę w RT.
      nuta: Tam, gdzie to możliwe, po barwieniu fluorescencyjnym próbki należy chronić przed światłem, aby uniknąć fotowybielania fluorescencji.
    7. Zatrzymaj reakcje znakowania barwnika, dodając 10 ml DMEM na 5 minut.
    8. Usuń nieoznakowane rodzicielskie komórki Cal51 z inkubatora (od kroku 1.2.2).
      nuta: Komórki te zostaną później wykorzystane jako nieznakowane kontrole ujemne (etap 3.3.2).
    9. Umyj wszystkie komórki raz, odlewając pożywkę wzrostową i zastępując 10 ml PBS.
    10. Odlej PBS i inkubuj przez 5 minut w warunkach hodowli z 1 ml wstępnie podgrzanej 1x trypsyny.
    11. Przenieść komórki do plastikowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 1000 x g przez 5 minut.
    12. Ostrożnie usuń i wyrzuć trypsynę z osadu komórkowego za pomocą pipety.
    13. Delikatnie zawiesić ponownie fioletowe i dalekie od czerwieni oznaczone granulki komórek w 1 ml PBS.
    14. Delikatnie zawiesić macierzysty (niefluorescencyjny) osad komórkowy w 1 ml DMEM i wrócić do inkubatora.
      nuta: Próbka ta nie zostanie poddana fuzji komórka-komórka, ale zostanie wykorzystana później podczas cytometrii przepływowej.

2. Fuzja komórka-komórka

  1. Wymieszaj 3 x 106 komórek znakowanych na fioletowo z 3 x 106 komórek znakowanych na czerwono w probówce o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując razem po 0,5 ml każdego typu komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  2. Odwirować pozostałe niezmieszane komórki z kroku 2.1 przy 1 000 x g przez 5 minut, następnie odlać PBS, ponownie zawiesić osad w 1 ml DMEM i powrócić do inkubatora.
    nuta: Te pozostałe niezmieszane, znakowane pojedynczo próbki zostaną później wykorzystane jako kontrole ujemne i kompensacyjne określone w sekcji 3 protokołu.
  3. Odwirować zmieszane komórki z kroku 2.1 przy 1 000 x g przez 5 minut i ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
  4. Dodawać kroplami 0,7 ml 50% roztworu 1450 PEG do osadu komórkowego (krok 2.3) za pomocą pipety o pojemności 1 ml przez okres 30 sekund.
  5. Pozostaw na 3,5 min w RT.
    nuta: Czas inkubacji z PEG może być zoptymalizowany w zależności od typu komórki, chociaż należy pamiętać, że dłuższy czas inkubacji zwiększa toksyczność komórek.
  6. Dodaj kroplami 10 ml DMEM bez surowicy przez 30 s i pozostaw w inkubatorze na 10 minut.
  7. Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml kompletnego podłoża (DMEM zawierającego FBS).
    nuta: Przejdź bezpośrednio do sekcji 3. Istnieje toksyczność związana z ekspozycją na PEG, po której następuje cytometria przepływowa i obrazowanie, więc utrzymuj komórki w warunkach hodowli w jak największym stopniu, postępując szybko między etapami.

3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu wzbogacenia połączonych komórek

  1. Przygotować wszystkie komórki do cytometrii przepływowej, delikatnie pipetując każdą próbkę oddzielnie przez filtr 70 μm do probówki FACS.
    nuta: Wymagane są cztery próbki: komórki zrośnięte, pojedynczo znakowane krwinki dalekiej czerwieni, pojedynczo znakowane komórki fioletowe, nieznakowane komórki rodzicielskie. Po wyjęciu z okapu do hodowli tkanek sterylnych komórki mają zdolność do zakażenia, dlatego od tego momentu należy zminimalizować czas ekspozycji próbek na niesterylne środowisko. Komórki są sortowane w kompletnym pożywce DMEM.
  2. Użyj cytometru zdolnego do sortowania pojedynczych komórek.
    1. Skonfiguruj sortownik komórek do sortowania aseptycznego. Przeprowadź kontrolę jakości przyrządu zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Narysuj wykres rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego oraz wykres dyskryminacji dubletowej.
  3. Utwórz bramki, aby zidentyfikować połączone komórki.
    1. Wzbudzić barwniki fluorescencyjne o długości fal 405 nm i 635 nm. Wykrywanie przy 450 nm i 660 nm (odpowiednio długości fal fioletowej i dalekiej czerwieni). Wykreśl dalekie długości fal czerwonych i fioletowych.
    2. Przepuść nieoznakowane komórki rodzicielskie przez cytometr i zapisz intensywność fluorescencji.
      nuta: Wartości powyżej tej linii bazowej określają dodatniość dla barwienia barwnikiem.
    3. Przepuść pojedyncze znakowane fioletowe komórki przez cytometr. Upewnij się, że nie ma rozlewania się fioletu do dalekiego kanału czerwonego.
    4. Przepuścić pojedyncze znakowane dalekie krwinki czerwone przez cytometr i upewnić się, że nie ma rozlania się dalekiej czerwieni do kanału fioletowego.
      nuta: W przypadku reprezentatywnych danych pokazano, komórki sortowano pod ciśnieniem 20 psi na sortowniku wyposażonym w dyszę 100 μm.
    5. Uruchom na krótko próbkę fuzji, aby potwierdzić, że połączone komórki są widoczne z bramkami utworzonymi w kroku 3.3.
  4. Wyrównaj strumień sortowania centralnie w 8-dołkowej misce do obrazowania.
  5. FACS sortuje połączone komórki, obecne jako podwójnie dodatnie komórki znakowane fioletem i daleką czerwienią, bezpośrednio do 8-dołkowej naczynia obrazowania zawierającej 100 μl pożywki wzrostowej.
    nuta: Maksymalna zalecana liczba komórek to ~50 000 na 8-dołkowe naczynie. Zadbaj o zdrowie komórek podczas sortowania. Konfluencja komórek może wpływać na zdrowie komórek, więc utrzymuj komórki między 20-90% konfluencji po sortowaniu, sortując odpowiednią liczbę komórek do naczynia do obrazowania. Każda posortowana kropla zawiera około 3 nl płynu w osłonce. Upewnij się, że płyn osłonowy nie rozcieńcza znacząco podłoża wzrostowego podczas sortowania.
  6. Bezpośrednio po sortowaniu należy zabrać komórki z powrotem do inkubatora i pozostawić na >2 godziny lub na noc.
    >nuta: W tym okresie przylegające komórki będą stopniowo ponownie przylegać do szkiełka nakrywkowego, począwszy od sortowania, a zatem ich morfologia zmieni się z czasem, jeśli zostaną pobrane bezpośrednio pod mikroskop.

4. Barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie fuzji komórka-komórka

UWAGA: Połączone komórki mogą być obrazowane na żywo lub po utrwaleniu i dalszym barwieniu fluorescencyjnym (lub obu), w zależności od wymaganych eksperymentów i pomiarów.

  1. Obrazowanie żywych komórek
    1. Zastąp pożywkę wzrostową pożywką obrazową bez czerwieni fenolowej (tabela materiałów) i przejdź bezpośrednio do obrazowania.
  2. Utrwalanie i barwienie
    1. Przygotuj świeży 4% paraformaldehyd (PFA) w PBS.
    2. Utrwalić komórki, inkubując je w 100 μl 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PFA po 15 min.
      ostrożność: PFA jest toksyczny w przypadku wdychania, dlatego ten etap należy wykonać w dygestoriach z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej.
      nuta: Po fiksacji eksperyment można wstrzymać i w razie potrzeby wznowić później. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C, w razie potrzeby chronić przed światłem.
    3. Umyj komórki 3x w 200 μl PBS w temperaturze pokojowej.
    4. Przepuszczalność komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej w 200 μl 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów) i 0,1% niejonowego detergentu (tabela materiałów) rozcieńczonego w PBS.
    5. Blokować 200 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Inkubować z przeciwciałami w 150 μl PBS zawierającego 3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego oraz 0,05% niejonowego detergentu przez 1 godzinę w temperaturze RT.
      nuta: Pierwszorzędowymi przeciwciałami stosowanymi do generowania reprezentatywnych wyników są fluorescencyjnie sprzężone nanobody anty-GFP (stosowane w rozcieńczeniu 1:400) i fluorescencyjnie sprzężone anty-mScarlet-I nanobody (stosowane w rozcieńczeniu 1:500). Wzmacniają one sygnał już fluorescencyjnych białek.
    7. Myć 2x przez 5 min w 300 μL PBS, a następnie pozostawić w 200 μL PBS.
      nuta: Próbki są obrazowane w PBS. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  3. Akwizycja obrazu
    1. Uzyskuj obrazy za pomocą odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do obrazowania czterokolorowego (np. oświetlenie konfokalne, szerokokątne, strukturalne).
    2. Wzbudz kanały meGFP i mScarlet-I za pomocą laserów o długości fali 488 nm i 561 nm. Ustaw detektory tak, aby wykrywały przy ~505−550 nm i ~590−650 nm. Wzbudzaj kanały barwnika fioletowego i dalekiej czerwieni za pomocą laserów o długości fali 405 nm i 633 nm. Ustaw detektory tak, aby wykrywały przy ~430−500 nm i ~660−750 nm.
    3. Empirycznie określ intensywność lasera tak, aby nie wystąpiło znaczące fotowybielanie i aby komórki pozostały zdrowe (w przypadku obrazowania żywych komórek).
    4. Empirycznie określ wzmocnienie w taki sposób, aby sygnał był uzyskiwany bez nasycania lub sztucznego przycinania wartości pikseli.
    5. Zbieraj dane ze stosu Z, tak aby obrazy były trójwymiarowe, obejmujące zakres 20−60 μm z rozmiarem kroku ~500 μm.
      nuta: Obrazy pokazane w reprezentatywnych danych zostały uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej (Rysunek 2B), Airyscan (Rysunek 2C) lub mikroskopii oświetlenia strukturalnego (Rysunek 2D). Każda komórka jest heterokarionem w dobrej wierze, jeśli zawiera zarówno fioletowe, jak i dalekie czerwone barwniki nakładające się na siebie w cytoplazmie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odpowiednio oznakowane komórki są widoczne podczas cytometrii przepływowej jako sygnał fluorescencyjny wyższy niż w przypadku nieoznakowanych komórek kontrolnych (Rysunek 2A). Bramki ustawia się w celu sortowania komórek podwójnie pozytywnych, wzbogacając tę populację bezpośrednio w naczyniach do obrazowania w celu dalszych analiz mikroskopowych. Połączone komórki są wykrywalne jako wyraźne komórki podwójnie fluorescencyjnie pozytywne i stano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Demonstrujemy łatwy i ekonomiczny protokół fuzji komórek i wizualizacji późniejszej architektury hybryd komórkowych za pomocą mikroskopii, co zajmuje około dwóch dni od początku do końca. Krytycznymi częściami tego protokołu są wzbogacanie połączonych komórek poprzez sortowanie komórek (sekcja protokołu 3) oraz staranna walidacja połączonych komórek za pomocą mikroskopii (sekcja protokołu sekcja 4). Sekcje te zapewniają, że połączone komórki są łatwo uzyskane i są heterokarionami w dobrej wierze. Należy przestrzegać stęż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship dla R.M. (numer https://wellcome.ac.uk/grant 100090/12/Z). Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Ashokowi Venkitaramanowi i Paulowi Frenchowi za krytyczne rady i wskazówki dotyczące projektu. Dziękujemy Chiarze Cossetti i Gabrieli Grondys-Kotarbie z Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry za doskonałe wsparcie. Dziękujemy Liamowi Cassidayowi, Thomasowi Millerowi i Gianmarco Contino za korektę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 15 mlSarstedt62554502
37% roztworem formaldehyduSigma-AldrichF8875
880 Skaning laserowy Konfokalny mikroskop AiryscanZeiss
8-dołkowe naczynia do obrazowaniaIbidi80826
Wzmacniacz GFP z alpaki anty-GFP nanobodyChromotekgba-488
BD Napływ Sortownik komórekBD Biosciences Albumina
surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
Filtry komórkowe (70 μ m)BiofilCSS010070
CellTrace Far RedThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX, pirogronianThermoFisher Scientific31966021
Płodowa surowica bydlęcaSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 anty-mScarlet-I alpaka nanobodyNanoTag BiotechnologiesN1302-AT565
L15 Niezależna pożywka do obrazowania CO2Sigma-Aldrich21083027
Penicylina/streptomycynaSigma-Aldrich15140122
DMEM bez czerwieni fenolowej, wysoka zawartość glukozyThermoFisher Scientific21063029
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS)8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O do 1 l
glikolu polietylenowego Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Rurki polipropylenoweBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioOdczynnikiBP151niejonowy środek powierzchniowo czynny
TrypsynaSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337niejonowy detergent
Carl

Bibliografia

  1. Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
  5. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
  6. Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
  7. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
  8. Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
  9. Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
  10. Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
  11. Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
  12. Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
  13. Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
  14. Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
  15. Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
  16. Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
  17. Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
  18. Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
  19. Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
  20. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).
  21. Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
  22. Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
  23. Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
  24. Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).
  25. Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
  28. Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
  29. Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).
  30. Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
  31. Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
  32. Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
  33. Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnaedycja genomuhomeostaza organellitworzenie heterokaryon wfuzja indukowana PEGznakowanie bia kami fluorescencyjnymisortowanie kom rekduplikacja centrosom w
Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.