Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60556

⸱

22 października 2021

 , 
1Ohio State Comprehensive Cancer Center, Division of Hematology, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostosowuje pomiary cyklu komórkowego do wykorzystania na platformie cytometrii masowej. Dzięki wieloparametrowym możliwościom cytometrii masowej, bezpośredni pomiar inkorporacji jodu umożliwia identyfikację komórek w fazie S, podczas gdy markery cyklu wewnątrzkomórkowego umożliwiają scharakteryzowanie każdego stanu cyklu komórkowego w szeregu warunków eksperymentalnych.

Streszczenie

Regulacja fazy cyklu komórkowego jest ważnym aspektem proliferacji komórkowej i homeostazy. Zakłócenie mechanizmów regulacyjnych rządzących cyklem komórkowym jest cechą wielu chorób, w tym raka. Badanie cyklu komórkowego wymaga umiejętności zdefiniowania liczby komórek w każdej części progresji cyklu komórkowego, a także wyraźnego rozgraniczenia między każdą fazą cyklu komórkowego. Pojawienie się cytometrii masowej (MCM) zapewnia ogromny potencjał w zakresie wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek poprzez bezpośrednie pomiary izotopów pierwiastków, a opracowanie metody pomiaru stanu cyklu komórkowego za pomocą MCM jeszcze bardziej rozszerza użyteczność MCM. Tutaj opisujemy metodę, która bezpośrednio mierzy 5-jodo-2′-deoksyurydynę (IdU), podobną do 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU), w systemie MCM. Korzystanie z tego MCM opartego na IdU ma kilka zalet. Po pierwsze, IdU jest szybko włączany do DNA podczas jego syntezy, co pozwala na wiarygodny pomiar komórek w fazie S przy inkubacji trwającej zaledwie 10-15 minut. Po drugie, IdU mierzy się bez potrzeby stosowania przeciwciał wtórnych lub konieczności degradacji DNA. Po trzecie, barwienie IdU można łatwo połączyć z pomiarem cykliny B1, fosforylowanego białka siatkówczaka (pRb) i fosforylowanego histonu H3 (pHH3), co łącznie zapewnia wyraźne nakreślenie pięciu faz cyklu komórkowego. Połączenie tych markerów cyklu komórkowego z dużą liczbą parametrów możliwą do uzyskania dzięki MCM pozwala na połączenie z wieloma innymi wskaźnikami.

Wprowadzenie

Cytometria masowa umożliwia wykrycie około 40 parametrów dzięki wykorzystaniu wysokiej rozdzielczości i ilościowej natury spektroskopii mas. Zamiast przeciwciał sprzężonych z fluoroforem stosuje się przeciwciała znakowane metalem, które pozwalają na większą liczbę kanałów i powodują minimalne rozprzestrzenianie się1,2. MCM ma zalety i wady w odniesieniu do analizy cyklu komórkowego w porównaniu z cytometrią przepływową. Jedną z głównych zalet MCM jest to, że duża liczba parametrów umożliwia jednoczesny pomiar stanu cyklu komórkowego w dużej liczbie immunofenotypowo odrębnych typów komórek T w wysoce heterogenicznych próbkach. MCM został z powodzeniem wykorzystany do pomiaru stanu cyklu komórkowego podczas prawidłowej hematopoezy w ludzkim szpiku kostnym3 i transgenicznych mysich modelach niedoboru telomerazy4. Analiza stanu cyklu komórkowego w ostrej białaczce szpikowej (AML) wykazała, że cykl komórkowy korelował ze znanymi odpowiedziami na terapie kliniczne, zapewniając wgląd in vivo w cechy funkcjonalne, które mogą informować o wyborze terapii5. Drugą zaletą analizy cyklu komórkowego metodą cytometrii masowej jest możliwość pomiaru dużej liczby innych markerów funkcjonalnych, które mogą być skorelowane ze stanem cyklu komórkowego. Ostatnie prace były w stanie skorelować syntezę białek i RNA ze stanem cyklu komórkowego dzięki zastosowaniu IdU i przeciwciał znakowanych metalami przeciwko BRU i rRNA6. Tego rodzaju wysoce parametryczna analiza mierząca stan cyklu komórkowego w wielu populacjach w kontinuum różnicowania byłaby prawie niemożliwa przy użyciu obecnej technologii cytometrii przepływowej. Główną wadą MCM jest brak porównywalnych barwników DNA lub RNA, jak te stosowane w fluorescencyjnej cytometrii przepływowej (np. DAPI, Hoechst, Pyronin Y itp.). Barwniki fluorescencyjne mogą dawać stosunkowo precyzyjne pomiary zawartości DNA i RNA, ale ta precyzja jest możliwa tylko ze względu na zmiany właściwości fluorescencyjnych tych barwników, które zachodzą po interkalacji między zasadami nukleotydowymi. Analiza MCM nie jest więc w stanie zmierzyć zawartości DNA lub RNA z podobną precyzją. Zamiast tego analiza cyklu komórkowego z cytometrią masową opiera się na pomiarach białek związanych ze stanem cyklu komórkowego, takich jak cyklina B1, fosforylowane białko siatkówczaka (pRb) i fosforylowany histon H3 (pHH3) w połączeniu z bezpośrednim pomiarem atomu jodu z inkorporacji IdU do komórek fazy S. Te dwa podejścia pomiarowe dają bardzo podobne wyniki podczas normalnej proliferacji komórek, ale mogą być potencjalnie niezgodne, gdy progresja cyklu komórkowego zostanie zakłócona.

Pomiar liczby komórek w każdej fazie cyklu komórkowego jest ważny dla zrozumienia normalnego rozwoju cyklu komórkowego, jak również zakłóceń cyklu komórkowego, które są powszechnie obserwowane w nowotworach i chorobach immunologicznych. MCM zapewnia wiarygodny pomiar czynników zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych przy użyciu przeciwciał znakowanych metalem; jednak pomiar fazy S był ograniczony, ponieważ interkalator DNA oparty na irydzie nie był w stanie odróżnić DNA 2N i 4N. Aby zdefiniować fazy cyklu komórkowego, Behbehani opracował metodę, która wykorzystuje IdU o masie 127, która mieści się w zakresie cytometru masowego i umożliwia bezpośredni pomiar komórek w S-phase3. Ten bezpośredni pomiar pozwala uniknąć konieczności stosowania przeciwciał drugorzędowych lub stosowania środków denaturujących DNA, takich jak kwas lub DNaza. W połączeniu z markerami cykli wewnątrzkomórkowych umożliwia wysoką rozdzielczość rozkładu cyklu komórkowego w modelach eksperymentalnych.

Ten protokół dostosowuje pomiary cyklu komórkowego do popularnych protokołów cytometrii przepływowej dla MCM. Nasze metody zapewniają wygodny i prosty sposób uwzględniania parametrów cyklu komórkowego. Inkorporacja IdU próbek in vitro wymaga tylko 10 do 15 minut inkubacji w temperaturze 37 °C, czyli krócej niż większość protokołów barwienia BrdU, które zalecają czas inkubacji wynoszący kilka godzin3,7. Próbki zawierające IdU i BrdU można utrwalić za pomocą stabilizatora proteomicznego, a następnie przechowywać przez pewien czas w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Pozwala to na archiwizację dużej liczby próbek barwionych IdU do analizy wsadowej bez obniżania jakości próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie zapasów IdU

  1. Rozpuścić 5-jodo-2'-deoksyurydynę (IdU) w DMSO do stężenia 50 mM. Sterylny filtr, podwielokrotność porcji do probówek 10-50 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C
  2. Wyjmij IdU z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć IdU w RPMI-1640, aby uzyskać roztwór roboczy o końcowym stężeniu 1 mM. Pipetować w górę iw dół lub wirować, aby wymieszać.
    1. Zazwyczaj stężoną dawkę IdU należy rozcieńczyć w pożywce, w której hodowane są komórki (np. DMEM, IMDM itp.) lub rozcieńczyć ją do PBS w celu dodania bezpośrednio do próbek aspiratu krwi obwodowej lub szpiku kostnego. Ten etap wstępnego rozcieńczania ułatwia mieszanie DMSO z pożywką wodną komórek będących przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Końcowe stężenie IdU podczas inkubacji powinno wynosić 10 μM; roztwór o stężeniu 1 mM można dodać w proporcji 10 μl na każdy 1 ml pożywki.

2. Inkubacja IdU i konserwacja próbki

  1. Próbki należy przechowywać w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wyjąć próbkę z inkubatora i przenieść ją do okapu bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Dodać 10 μl 1 mM IdU do każdego 1 ml próbki.
    1. W przypadku płytki 6-dołkowej dodać 30 μl 1 mM IdU do 3 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku. IdU może być również stosowany bezpośrednio w aspiratach szpiku kostnego, a także w badaniach na myszach4.
  3. Umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10-15 minut. Utrzymuj komórki w optymalnych warunkach wzrostu podczas ekspozycji na IdU, aby uzyskać najdokładniejszy pomiar fazy S.
  4. Po inkubacji IdU wyjąć próbkę i przenieść do stożkowej probówki.
  5. Wirować próbkę o gramaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl PBS.
    1. W razie potrzeby na tym etapie wykonaj barwienie żywe/martwe (przy użyciu cisplatyny), aby oznaczyć martwe komórki przed utrwaleniem i zamrożeniem.
      UWAGA: Barwienie żywego/martwego rodu nie działa dobrze po przepuszczalności metanolu, dlatego nie jest zalecane do stosowania w analizach cyklu komórkowego.
  7. Dodaj 18,75 μl 16% paraformaldehydu (PFA) do PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 1,5% PFA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wirować próbkę w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać roztwór PBS/PFA i ponownie zawiesić próbkę w 500 μl pożywki do barwienia komórek (CSM; 1x PBS z 0,5% BSA i 0,02% azydkiem sodu) + 10% DMSO przed zamrożeniem.
    1. W przypadku stosowania komercyjnego stabilizatora proteomicznego należy dodać 280 μl stabilizatora proteomicznego do próbki ponownie zawieszonej w 200 μl PBS (1:1,4). Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie umieścić bezpośrednio w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Wykazano, że IdU skutecznie integruje się w ciągu 10-15 minut inkubacji w temperaturze 37 °C. Inkubacje IdU dłuższe niż 10-15 minut stopniowo zmniejszają rozdzielczość populacji fazy S i G2, ponieważ komórki znakowane IdU opuszczają fazę S i przechodzą do fazy G2 lub M. Zaobserwowaliśmy również, że długotrwała inkubacja z IdU może powodować śmierć komórki i artefakty cyklu komórkowego. Późniejsze przetwarzanie komórek i barwienie przeciwciał po inkorporacji IdU jest wystarczające do wypłukania resztkowych IdU, które nie zostały włączone do komórek fazy S. Nie zaobserwowaliśmy znaczącego tła jodu podczas stosowania opisanego tutaj protokołu in vitro; Jednak bardzo rzadko zaobserwowaliśmy zanieczyszczenie jodem w próbkach klinicznych. Może się to zdarzyć w wyniku procedur medycznych, takich jak kontrast jodowy w tomografii komputerowej lub w wyniku leków zawierających jod. W przypadku zaobserwowania dużych ilości tła IdU, próbki nie należy badać, aby uniknąć uszkodzenia detektora cytometru masowego.

3. Barwienie próbek do cytometrii masowej

  1. Usunąć próbki z temperatury -80 °C i pozostawić do rozmrożenia przed barwieniem powierzchni.
    1. W przypadku stosowania metody utrwalania SmartTube próbki należy rozmrażać w temperaturze 0–4 °C, aby uniknąć dodatkowego utrwalania w miarę nagrzewania się próbek.
  2. Po rozmrożeniu próbek przenieś około 1-2 miliony komórek do probówki FACS o pojemności 5 ml.
  3. Odwirować probówkę FACS o masie 600 x g przez 5 minut i napełnić probówkę FACS pożywką do barwienia komórek (CSM) w celu umycia komórek. Powtórz jeszcze jeden raz.
    1. Jeśli wiadomo, że komórki sklejają się ze sobą, dodaj 400 U/ml heparyny do płynów do płukania CSM, aby zapobiec kontaktowi komórka-komórka, ale nie jest to absolutnie konieczne.
  4. Inkubować komórki ze środkiem blokującym FC, 5 μl środka na 100 μl komórek, przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj mieszaninę przeciwciał, które zabarwią powierzchnię lub część zewnątrzkomórkową komórek. Całkowita mieszanina barwiąca wyniesie 100 μl na 1-2 miliony komórek w każdym teście. Mieszanina barwiąca zostanie odpowiednio zrównoważona CSM i heparyną w koktajlu i probówce FACS.
    UWAGA: Dodanie CSM na tym etapie również zmniejszy niespecyficzne artefakty barwienia8. Ta mieszanina barwiąca jest całkowicie zależna od celów zainteresowania i fenotypu powierzchniowego (np. badanie z udziałem limfocytów T użyje mieszaniny powierzchniowej CD45, CD3, CD4, CD8 itp.). Szczegółowy protokół przetwarzania i barwienia próbek można znaleźć w Behbehani and McCarthy et al.9,10.
  6. Dodaj mieszaninę barwiącą powierzchnię do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej z ciągłym wstrząsaniem przez 30-60 minut.
  7. Po zabarwieniu napełnij probówkę FACS CSM i wiruj w dół przy 600 x g przez 5 minut.
  8. Przemyć jeszcze dwa razy CSM, obracając próbkę o masie 600 x g przez 5 minut i odsysając każde przemycie CSM.
  9. Napraw przeciwciała zewnątrzkomórkowe, dodając 1 ml PBS z 10% CSM i 1,5% PFA.
  10. Napełnić probówkę FACS zawierającą mieszaninę PBS/CSM/PFA CSM. Wirować przy 600 x g przez 5 minut i zassać supernatant.
  11. Dodać metanol w temperaturze -20 °C.
  12. Wirować próbkę przez 1-2 minuty, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i sprawdzić, czy wszystkie grudki komórek zostały ponownie zawieszone.
  13. Podczas gdy próbka powoli wiruje, szybko dodaj 1 ml lodowatego metanolu za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z końcówką filtrującą.
  14. Trzymaj rurkę FAC pod światło i upewnij się, że nie ma widocznych grudek; należy spodziewać się zachmurzenia. Wszelkie grudki spowodują, że próbka nie będzie nadawała się do późniejszej analizy MCM.
  15. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C przez 10-20 minut.
  16. W tym czasie przygotuj wewnątrzkomórkową mieszaninę barwiącą. Wewnątrzkomórkowa mieszanina barwiąca będzie zależała od celów będących przedmiotem zainteresowania. Do analizy cyklu komórkowego należy dołączyć CyclinB1, pRb, Ki67 i pHH3 do tej mieszaniny barwiącej, ale w razie potrzeby można dodać inne markery wewnątrzkomórkowe.
  17. Po 10-20 minutach w temperaturze -20 °C usunąć próbkę, dodać 1,5 ml PBS i wypełnić pozostałą część CSM.
  18. Odwirować próbkę o masie 600 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  19. Przemyć jeszcze dwa razy CSM, obracając próbkę w tempie 600 x g przez 5 minut i za każdym razem odsysając supernatant.
  20. Po ostatnim płukaniu CSM odwirować próbkę i pozostawić pozostałą objętość około 50 μl.
  21. Dodać przygotowaną mieszaninę przeciwciał (zwykle dodać 50 μl koktajlu barwiącego przeciwciała, aby uzyskać końcową objętość barwienia 100 μl) do próbki i inkubować na platformie wstrząsającej przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.
  22. Po zabarwieniu dodać CSM i odwirować przy 600 x g przez 5 min.
  23. Odessać CSM, ponownie przemyć CSM, wirując z prędkością 600 x g przez 5 minut, zasysając CSM, a następnie dodać PBS.
  24. Po zakończeniu barwienia wewnątrzkomórkowego umieść komórki w roztworze interkalatora, który wiąże przeciwciała z komórkami i barwi DNA każdej komórki, aby umożliwić identyfikację. Roztwór interkalatora zawiera nieizotopowo czysty interkalator irydowy (pentametylocyklopentadienylo-Ir(III)-dipirydofenazyna) dodany z roztworu podstawowego producenta w stężeniu 500 μM. Rozcieńczyć roztwór irydu w stosunku 1:4000 w roztworze PBS i 1,5% PFA. Dodać roztwór interkalatora irydowego w stężeniu 100-200 μl na milion komórek, aby równomiernie zabarwić i zapobiec nadmiernemu przebarwieniu.
    UWAGA: Iryd w tym roztworze interkalatora jest przeznaczony do identyfikacji komórek do bramkowania singletowego, nie powinien być używany do żywych / martwych plam. Jeśli pożądane są żywe/martwe plamy, należy je wykonać przed utrwaleniem, jak wspomniano powyżej oraz w McCarthy et al.9.
  25. Przechowywać próbki w roztworze interkalatora w lodówce o temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni przed pobraniem próbki na CyTOF.

4. Działanie cytometru masowego

UWAGA: Operacja cytometrii masowej może być specyficzna dla maszyny. Zawsze zaleca się zapoznanie się z instrukcją obsługi CyTOF przed rozpoczęciem pracy. Dodatkowo, obecnie dostępne są dwa artykuły JoVE poświęcone uruchamianiu i konserwacji maszyn9,11.

  1. Sprawdź nebulizator pod kątem zatorów, pęknięć i innych nieprawidłowości przed uruchomieniem cytometru masowego.
  2. Podłącz nebulizator do cytometru i rozpocznij procedurę rozgrzewania. Nie uruchamiaj cytometru masowego bez założonego nebulizatora.
  3. Przepuść wodę przez linie próbek, gdy cytometr masowy zakończy nagrzewanie. Komora natryskowa musi osiągnąć około 200 °C przed wykonaniem strojenia lub analizy próbki.
  4. Uruchom wodę przez 5-10 minut. Po 5-10 minutach załaduj rozwiązanie do dostrajania i wybierz menedżera strojenia. Roztwór strojeniowy jest roztworem zawierającym stałe stężenia metali i stosowanym do optymalizacji cytometru masowego przed pobraniem próbki
  5. W menedżerze dostrajania wybierz pozycję Podgląd, gdy rozwiązanie dostrajania osiągnie rekord trafień w stanie stałym, aby rozpocząć proces dostrajania automatycznego.
  6. Po zakończeniu strojenia załaduj próbnik wodą i pozwól wodzie przepływać przez linie próbki podczas przetwarzania próbki. Szczegółowy protokół codziennej obsługi i strojenia cytometru można znaleźć na stronie Leipold11.
  7. Czasami automatyczne dostrajanie nie dostroi się do optymalnej wydajności maszyny. Powtórz procedurę strojenia, aby to poprawić.
  8. Umyj próbkę jednorazowo CSM i dwukrotnie czystą wodą dejonizowaną przed pobraniem próbki. Mycie wodą jest ważne w celu usunięcia resztek soli z PBS/CSM.
  9. Sprawdź czułość i przepływ próbki za pomocą dostarczonych przez producenta kulek równoważących, kulek polistyrenowych obciążonych znanymi stężeniami metali.
  10. Zmień tryb pozyskiwania z trybu dostrajania na tryb przechwytywania zdarzeń. Ustaw limit czasu zatrzymania akwizycji na 120 s. Poczekaj 45 s przed wybraniem opcji Nagraj.
  11. Cytometr masowy automatycznie zatrzyma pobieranie próbki po 120 sekundach. Użyj przeglądarki wykresów deszczu, aby sprawdzić intensywność Eu151 i Eu153.
  12. Rozcieńczyć kulki równowagi w czystej wodzie dejonizowanej w stosunku 1:20.
  13. Przed pobraniem próbki sprawdź menedżera eksperymentów. Użyj menedżera eksperymentów, aby przypisać nazwy kanałom i dodać kanały do nagrania.
    1. Upewnij się, że kanał 127-I został dodany w przypadku korzystania z IdU.
    2. Należy pamiętać, że konieczne jest ustawienie cytometru masowego w celu zmierzenia potrzebnych parametrów (np. IdU) przed pobraniem próbki. Jeśli kanały nie zostaną wybrane wcześniej, dane nie zostaną zebrane z żadnego niewybranego kanału i nie będzie można ich odzyskać.
  14. Rozcieńczyć komórki do stężenia około 1-2 x 106/ml za pomocą czystej wody dejonizowanej w stosunku 1:20 i mieszaniny kulek równowagi. Przepuść komórki przez rurkę FACS z filtrem, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki.
  15. Załaduj próbkę i zmień czas pobierania.
  16. Naciśnij Podgląd i poczekaj, aż liczba zdarzeń na sekundę się ustabilizuje.
    1. Nie uruchamiaj wydarzeń przekraczających 400 zdarzeń na sekundę, doprowadzi to do znacznych ilości dubletów i gruzu. Zazwyczaj zbieramy co najmniej 20 000 do 50 000 zdarzeń komórkowych, ale optymalna liczba będzie zależeć od projektu eksperymentalnego. Barwienie do 2 milionów komórek zwykle daje od 300 000 do 400 000 zdarzeń komórkowych. Należy pamiętać, że nie wszystkie zdarzenia będą komórkami (w liczbie zdarzeń będą uwzględniane zdarzenia związane z gruzem i koralikami).
  17. Po pobraniu próbki załaduj roztwór myjący, rozpocznij indukcję próbki i uruchom przez 5-10 minut. Po 5-10 minutach przerwij indukcję próbki i puść wodę przez 10-20 minut. Roztwór płuczący jest słabym roztworem kwasu fluorowodorowego przeznaczonym do usuwania pozostałości metalu z linii pobierania próbek.
  18. Wyłącz cytometr masowy i wyjmij nebulizator. Nebulizator będzie gorący, zachowaj ostrożność podczas obsługi.

5. Analiza danych

  1. W celu usunięcia koralików, a także skorygowania dryfu sygnału podczas akwizycji próbki, znormalizuj pliki FCS za pomocą oprogramowania Fluidigm lub aplikacji opracowanej przez Finck12.
  2. Prześlij FCS do Cytobank lub innego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Pliki FCS mogą być używane w dowolnym kompatybilnym oprogramowaniu, na potrzeby tego protokołu wszystkie bramkowanie i dalsza analiza zostały wykonane w Cytobank13.
  3. Zanim będzie można narysować bramki cyklu komórkowego, wyklucz wszelkie dublety lub szczątki komórek z dalszej analizy, można to zrobić za pomocą dwuosiowego wykresu długości zdarzenia w funkcji 191-Ir (Rysunek 1a). Komórki utworzą wyraźną, jasną populację Irhigh, którą można wykorzystać do wykluczenia dubletów i szczątków. To jest bramka singletowa. Ta metoda bramkowania zazwyczaj usuwa około 50-60% zdarzeń komórek dubletowych, więc mogą być wymagane dodatkowe strategie w celu usunięcia pozostałych zdarzeń komórek dubletowych.
    1. Zmień skalę długości zdarzenia (minimalną i maksymalną), aby komórki wydawały się bardziej widoczne, aby pomóc w bramkowaniu singletowym.
    2. Dalej usuwaj dublety i zanieczyszczenia za pomocą parametrów Gaussa, Reszty i Przesunięcia. Wyższa Residual z niższym Offset to również gruz i dublety, a bramkowanie wokół tej populacji może dodatkowo usuwać dublety i gruz (Rysunek 1b,c).
  4. Bramkowanie w fazie S – Faza S jest najłatwiejszą do narysowania bramą, ale także najważniejszą. Narysuj tę bramkę, używając dwuosiowego wykresu IdU vs pRb, Ki67 lub cyklinB1. Komórki IdU+ w fazie S utworzą odrębną populację, patrząc na te dwuosiowe wykresy (Rysunek 2b).
  5. Bramkowanie G0 / G1, G2 / M - Ustal bramki fazowe G0 / G1 i G2 / M na działce IdU vs CyclinB1 i zastosowanie inkorporacji IdU ma kluczowe znaczenie dla ustalenia granicy między bramkami fazowymi G0 / G1 i G2 / M. Faza G0 / G1 będzienisko CyclinB1 / IdU-, a faza G2 / M będziewysoka CyclinB1 / IdU-. Dobre barwienie cyklinB1 pokaże naturalną populację między populacjami G0-G1 i G2-M; Jednak w warunkach eksperymentalnych będzie się to różnić w zależności od typu próbki i komórki. W warunkach eksperymentalnych, w których może to mieć wpływ na rozkład cyklu komórkowego i jest mniejsza separacja między fazą CyclinB1 G0 / G1 a fazą G2 / M, wykorzystanie fazy S pozwoli na spójne bramkowanie dla określonych typów komórek w każdym konkretnym eksperymencie. Ta metoda jest szczegółowo opisana poniżej.
    1. Wykreśl tylko komórki fazy S na CyclinB1 vs IdU, aby pomóc w ustaleniu separacji między fazą G0/G1 a fazą G2/M. Narysuj bramkę napopulacji o wysokiej populacji CyclinB1 i dostosuj do momentu, aż około 5% górnej populacji fazy S znajdzie się wewnątrz bramki (Rysunek 2c). W ten sposób ustala się punkt przerwania między bramkami fazowymi G0/G1 i G2/M (Rysunek 2e,f). Populacja aktywna zostanie zmieniona na populację będącą przedmiotem zainteresowania, a część znajdująca się wewnątrz poprzedniej bramy będzie populacją fazy G2/M, podczas gdy pozostała część będzie populacją fazy G0/G1.
  6. Bramkowanie fazy G0 - Ustal fazę G0 na działce pRb vs IdU. Faza G0 będzie reprezentowana przez populacjęo niskim poziomie pRb/IdU-. Aktywna populacja rowerowa będzie miała wysoką ekspresję inkorporacji pRb i IdU, bramka fazy G0 może być narysowana na tej granicy, ponieważ zwykle wyraża się w dwóch odrębnych populacjach (Rysunek 2g,i).
    1. Zdefiniuj fazę G0, czyniąc populację fazy S narysowaną wcześniej (Rysunek 2b) populacją aktywną i rysując bramę obejmującą górne 90-100%populacji o wysokim poziomie pRb. Jest to populacja rowerowa pRb+ (Rysunek 2i),niska populacja pRb poza tą bramką to populacja G0 (Rysunek 2j).
    2. Jeśli pRb jest niedostępny lub nie można go zarejestrować, użyj Ki67 vs IdU, aby ustalić populację fazy G0. Narysowanie bramki reprezentującej większość populacji fazy S i użycie tej bramki jako granicy dla Ki67 vs IdU, pozostała część populacji będzie fazą G0 (Rysunek 3a).
  7. Bramkowanie w fazie M — ustal, faza M na wykresie dwuosiowym IdU i pH3. Faza M reprezentuje bardzo małą frakcję komórek i jest bramkowana w populacjio wysokim pH 3 (Rysunek 2d).
  8. Inkorporacja IdU nie powiodła się lub nie była możliwa - Jeśli IdU jest niedostępna, zdefiniuj cykle komórkowe i nie cykliczne frakcje za pomocą Ki67 i pRb. Ki67 i pRb, w normalnych warunkach, tworzą dwie odrębne populacje: Ki67wysoki/pRbwysoki i Ki67niski/pRbniski. Populacja podwójnie dodatnia reprezentuje populację aktywnych cykli, korelującą z fazami G1, fazami S, G2 i M. Podwójnie niska populacja reprezentuje populację niecykliczną, korelującą z fazą G0 (Rysunek 3b).
    UWAGA: Nie jest możliwe wyznaczenie każdej pojedynczej fazy za pomocą Ki67 vs pRb, ale można określić eksperymentalne efekty dla względnych populacji cyklicznych/niecyklicznych.
  9. Analiza cyklu komórkowego – Po ustanowieniu bramek wyeksportuj wartości liczbowe z bramek do dalszej analizy. Wartości procentowe w każdym cyklu można osiągnąć, odejmując pojedyncze populacje od populacji połączonych. Fazę G0, narysowaną naniskimpoziomieIdU pRb, procent bramki, można odjąć od fazy G0 / G1, narysowanej nanegencie CyclinB1o niskimpoziomie IdU, aby znaleźć procent fazy G1. Podobnie procent fazy G2 pochodzi z odjęcia bramki fazy M od bramki fazy G2/M. Spowoduje to wygenerowanie wartości liczbowych dla każdej pojedynczej fazy cyklu komórkowego; G0, G1, S, G2 oraz M. Wartości liczbowe wygenerowane dla każdej pojedynczej fazy cyklu komórkowego można wykorzystać do dalszej analizy, takiej jak tworzenie wykresów i analiza statystyczna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując komórki HL-60 oraz aspirat szpiku kostnego człowieka, można wykazać, w jaki sposób warunki eksperymentalne mogą wpływać na rozkład i analizę cyklu komórkowego. W pierwszej kolejności należy opracować strategię bramkowania (gating), aby zademonstrować, w jaki sposób wyznacza się fazy cyklu komórkowego. Na Rysunku 1 przedstawiamy ustalanie bramki dla singletów, co jest istotne dla oddzielenia debris komórkowego oraz dubletów i wyodrębnienia populacji pojedynczych komórek. W przyp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tutaj przykłady pokazują, jak wykorzystać platformę MCM do analizy rozkładu cyklu komórkowego. Wykazano również, że analiza cyklu komórkowego jest wrażliwa na warunki eksperymentalne, takie jak czas i temperatura, co jest ważnym czynnikiem, który naukowcy muszą wziąć pod uwagę, rozważając MCM w analizie cyklu komórkowego14. Próbki pozostawione w magazynie przez krótki okres czasu, nie dłuższy niż godzinę, będą miały włączenie IdU porównywalne z ich normalnym stanem. Próbki w systemie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Behbehani otrzymuje wsparcie w podróży od Fluidigm. Firma Fluidigm zakupiła również odczynniki i materiały do użytku laboratoryjnego.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować wysiłkom Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang i Justin Lyeberger za ich eksperymentalne wsparcie. Praca ta była wspierana przez Program Stypendialny Pelotonia. Wszelkie opinie, ustalenia i wnioski wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają opinie Programu Stypendialnego Pelotonia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA3059Składnik
wirówkiThermo Scientific75-217-420Wirowanie próbki
Cleaved-PARP (D214)BD BiosciencesF21-852Identyfikacja komórek apoptotycznych
Cyklina B1BD BiosciencesGNS-1G2 Rozdzielczość
dimetylosulfotlenku (DMSO)SigmaD2650Kriokonserwant
EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjneFluidigm201078Wewnętrzny metalowy standard do wydajności CyTOF
Rurka FACS z sitkiem siatkowymCorning08-771-23Sitko do komórek do usuwania grudek/zanieczyszczeń przed uruchomieniem CyTOF
Płodowa surowica bydlęca (FBS)VWR97068-085Suplement na wzrost hodowli komórkowych
HeliosFluidigmCyTOF System/Platforma
HeparynaSigmaH3393Dodatek barwiący zapobiegający niespecyficznemu barwieniu
IdU (5-Iodo-2′-deoksyurydyna)SigmaI7125Zawiera w fazie S
Ki-67eBiosciencesSolA15Potwierdzenie G0/G1
MaxPar Multi Label KitFluidigm201300Zestaw do etykietowania metali, mocuje metale do przeciwciał
Wytrząsarka do mikropłytekThermo Scientific 88880023Mieszanie próbek podczas barwienia
Paraformaldehyd (PFA)Usługi mikroskopii elektronowej15710Utrwalacz
pentametylocyklopentadienylo-Ir(III)-dipirydofenazynyFluidigm201192Identyfikacja komórek podczas akwizycji CyTOF
p-H2AX (S139)MilliporeJBW301Wykrywanie uszkodzeń DNA
p-HH3 (S28)BiolegendHTA28rozdzielczości M-fazowej
(PBS)Gibco14190-144Roztwór płuczący do hodowli komórkowych i składnik roztworu utrwalającego
p-Rb (S807/811)BD BiosciencesJ112906rozdzielczości G0/G1
SmartTube IncPROT1Utrwalacz próbki
RPMI 1640Gibco21870-076Pożywka do hodowli komórkowych
Azydek soduAcros OrganicsAC447810250Składnik buforu CSM/przeciwciała, biocyd
CSM Sól fizjologiczna buforowana fosforanem o Stabilizator proteomiczny o

Bibliografia

  1. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  2. Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
  3. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  4. Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).
  5. Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
  6. Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).
  7. Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
  8. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
  9. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).
  10. Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).
  12. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  13. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).
  14. Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
  15. Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
  16. Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).
  17. Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza cyklu kom rkowegoznakowanie IdUcyklina B1fosforylowane bia ko Rbfosforylowana histona H3cytometria przep ywowaanaliza pojedynczych kom rekproliferacja kom rek
Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.