Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model angiogenezy wieńcowej in vitro

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60558

⸱

10 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Biology, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Modele angiogenezy wieńcowej in vitro mogą być wykorzystane do odkrycia komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej. Hodowle eksplantatów in vitro tkanek zatok żylnych i wsierdzia wykazują silny wzrost w odpowiedzi na VEGF-A i wykazują podobny wzór ekspresji COUP-TFII jak in vivo.

Streszczenie

Tutaj opisujemy test in vitro do badania angiogenezy wieńcowej. Naczynia wieńcowe zasilają mięsień sercowy i mają znaczenie kliniczne. Ubytki w tych naczyniach stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia, takie jak miażdżyca, która może prowadzić do zawałów mięśnia sercowego i niewydolności serca u pacjentów. W związku z tym choroba wieńcowa jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Pomimo jego znaczenia klinicznego, poczyniono stosunkowo niewielkie postępy w zakresie regeneracji uszkodzonych tętnic wieńcowych. Niemniej jednak w ostatnim czasie poczyniono postępy w zrozumieniu komórkowego pochodzenia i szlaków różnicowania rozwoju naczyń wieńcowych. Pojawienie się narzędzi i technologii, które pozwalają naukowcom na fluorescencyjne znakowanie komórek progenitorowych, śledzenie ich losu i wizualizację potomstwa in vivo, odegrało zasadniczą rolę w zrozumieniu rozwoju naczyń wieńcowych. Badania in vivo są cenne, ale mają ograniczenia pod względem szybkości, dostępności i elastyczności w projektowaniu eksperymentów. Alternatywnie, dokładne modele angiogenezy wieńcowej in vitro mogą obejść te ograniczenia i umożliwić naukowcom szybkie i elastyczne badanie ważnych kwestii biologicznych. Brak odpowiednich systemów modelowych in vitro mógł utrudnić postęp w zrozumieniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu naczyń wieńcowych. Tutaj opisujemy system hodowli in vitro do hodowli naczyń wieńcowych z zatoki żylnej (SV) i wsierdzia (Endo), dwóch tkanek progenitorowych, z których powstaje wiele naczyń wieńcowych. Potwierdziliśmy również, że kultury dokładnie podsumowują niektóre ze znanych mechanizmów in vivo. Na przykład pokazujemy, że angiogenne kiełki w kulturze z SV obniżają ekspresję COUP-TFII podobnie jak to obserwuje się in vivo. Ponadto wykazaliśmy, że VEGF-A, dobrze znany czynnik angiogenny in vivo, silnie stymuluje angiogenezę zarówno z kultur SV, jak i Endo. Wspólnie opracowaliśmy dokładny model hodowli in vitro do badania angiogenezy wieńcowej.

Wprowadzenie

Naczynia krwionośne serca są powszechnie nazywane naczyniami wieńcowymi. Naczynia te składają się z tętnic, żył i naczyń włosowatych. Podczas rozwoju najpierw powstają silnie rozgałęzione naczynia włosowate, które następnie przekształcają się w tętnice i żyły wieńcowe1,2,3,4,5. Te początkowe naczynia włosowate są zbudowane z komórek progenitorowych śródbłonka znajdujących się w tkankach nadsierdzia, zatoki żylnej (SV) i wsierdzia (Endo)1,6,7,8. SV jest narządem dopływowym serca embrionalnego, a Endo jest wewnętrzną wyściółką światła serca. Śródbłonkowe komórki progenitorowe znajdujące się w SV i Endo budują większość naczyń wieńcowych, podczas gdy nasierdzie przyczynia się do stosunkowo niewielkiej jego części2. Proces, w którym sieć naczyń włosowatych naczyń wieńcowych rośnie w sercu z wcześniej istniejących komórek prekursorowych, nazywa się angiogenezą wieńcową. Choroba wieńcowa jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a mimo to brakuje skutecznego leczenia tej choroby. Zrozumienie szczegółowych mechanizmów komórkowych i molekularnych angiogenezy wieńcowej może być przydatne w projektowaniu nowatorskich i skutecznych terapii naprawy i regeneracji uszkodzonych tętnic wieńcowych.

Ostatnio, dzięki rozwojowi nowych narzędzi i technologii, nasz wzrost wiedzy na temat rozwoju naczyń wieńcowych został częściowo osiągnięty. W szczególności znakowanie linii in vivo i zaawansowane technologie obrazowania okazały się bardzo przydatne w odkrywaniu pochodzenia komórkowego i szlaków różnicowania naczyń wieńcowych9,10,11,12. Pomimo zalet tych narzędzi in vivo, istnieją ograniczenia pod względem szybkości, elastyczności i dostępności. W związku z tym solidne systemy modelowe in vitro mogą uzupełniać systemy in vivo w celu wyjaśnienia komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej w sposób wysokoprzepustowy.

Tutaj opisujemy model in vitro angiogenezy wieńcowej. Opracowaliśmy system hodowli eksplantatów in vitro do hodowli naczyń wieńcowych z dwóch tkanek progenitorowych, SV i Endo. Za pomocą tego modelu pokazujemy, że w kulturach eksplantatów tkanek in vitro wyrastają kiełki naczyń wieńcowych, gdy są stymulowane przez pożywkę wzrostową. Dodatkowo, kultury eksplantatów rosną szybko w porównaniu z kontrolą, gdy są stymulowane przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A), bardzo silne białko angiogenne. Ponadto stwierdziliśmy, że angiogenne kiełki z hodowli SV ulegają odróżnicowaniu żylnemu (utracie ekspresji COUP-TFII), mechanizmowi podobnemu do angiogenezy SV in vivo1. Dane te sugerują, że system hodowli eksplantatów in vitro wiernie przywraca zdarzenia angiogenne, które występują in vivo. Podsumowując, opisane tutaj modele angiogenezy in vitro są idealne do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej w sposób wysokoprzepustowy i dostępny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie wszystkich zwierząt w tym protokole było zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Ball State University.

1. Ustalanie hodowli myszy i wykrywanie zatyczek dopochwowych w przypadku ciąży w określonym czasie

  1. Ustaw klatkę hodowlaną myszy z samcami i samicami myszy typu dzikiego. Upewnij się, że wiek myszy hodowlanych wynosi od 6 do 8 tygodni. Ustaw parę (1 samiec i 1 samicę) lub jako trio (1 samiec i 2 samice) do hodowli.
  2. Następnego ranka sprawdź, czy nie ma korka dopochwowego. Użyj kątowej metalowej sondy, aby wykryć głęboką zatyczkę, wkładając ją do otworu pochwy. Oznacz poranek dodatniego czopu pochwowego jako dzień embrionalny 0,5 (e0,5).
    UWAGA: Czop dopochwowy może być albo powierzchowny (który jest łatwo widoczny, patrz Rysunek 1) lub głęboki (który nie jest łatwo widoczny). Obecność głębokiej zatyczki zablokuje pełne włożenie sondy, podczas gdy brak wtyczki pozwoli na pełne włożenie bez oporu.
  3. Utrzymuj ciążę w czasie, aż zarodki osiągną e11.5, w którym zostaną zebrane. Aby potwierdzić ciążę przed pobraniem zarodków, zapisz masę samic myszy między e7,5 a e11,5,
    UWAGA: Codzienny wzrost masy ciała matki będzie wskazywał na udaną ciążę, podczas gdy brak zmiany masy ciała będzie wskazywał na nieudaną ciążę.

2. Pobieranie zarodków od ciężarnych myszy

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujący sprzęt i odczynniki: komora eutanazyjna CO2, 70% etanolu, ręczniki papierowe, zwykłe kleszcze, cienkie kleszcze, nożyczki, 1x sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10 cm sterylne szalki Petriego, pojemnik z lodem, perforowana łyżka, stereoskop preparacyjny.

  1. Umieść ciężarną mysz e11.5 w czystej komorze eutanazyjnej CO2 , aby ją poświęcić. Zamknij pokrywę komory, aby zapobiec ucieczce myszy.
  2. Po zabezpieczeniu myszy w komorze eutanazyjnej włącz CO2. Upewnij się, że regulujesz natężenie przepływu CO2 zgodnie z zaleceniami IACUC (tj. 10-30% wyporności na minutę). Po całkowitej eutanazji myszy wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
  3. Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę nad brzuch za pomocą kleszczy, wykonaj małe nacięcie za pomocą nożyczek i przedłuż nacięcie na boki. Powiększ nacięcie do przodu aż do przepony i odsłoń róg macicy zawierający zarodki (Ryc. 2).
  4. Wyciągnij sznurek zarodków (róg macicy + zarodki), chwytając macicę i odcinając ją. Umieść sznurek zarodków w lodowato zimnym sterylnym 1x PBS.
  5. Wypreparuj poszczególne zarodki z rogu macicy, odrywając mięsień macicy, woreczek żółtkowy i owodnię jeden po drugim (Rysunek 3A-F) pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś oczyszczone zarodki za pomocą perforowanej łyżki na szalkę Petriego zawierającą sterylny 1x PBS na lodzie. Upewnij się, że zarodki są zimne.

3. Izolowanie serc od embrionów e11.5

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: zwykłe kleszcze, drobne kleszcze, 1x sterylny PBS, 10 cm sterylna szalka Petriego, 6 cm sterylna szalka Petriego, pojemnik z lodem, perforowana łyżka, stereoskop preparacyjny.

  1. Ustaw nową szalkę Petriego z lodowato zimnym sterylnym 1x PBS pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś zarodek z kroku 2.5 na szalkę Petriego, aby wypreparować serce.
  2. Usuń głowę zarodka za pomocą kleszczy. Najpierw jedną ręką ściśnij głowę między kleszczami, a następnie zdejmij głowę, zeskrobując ją drugą ręką za pomocą zamkniętych kleszczy (Rysunek 4A-C).
  3. Po zdjęciu głowy ustaw zarodek brzuszną stroną do góry, trzymając zarodek kleszczami na brzuchu jedną ręką (Rysunek 4D).
  4. Drugą ręką otwórz ścianę klatki piersiowej zarodka, wykonując najpierw małe nacięcie w klatce piersiowej nieco powyżej przepony za pomocą cienkich kleszczy. Następnie bardzo ostrożnie powiększ nacięcie, wkładając zamknięte kleszcze i rozrywając ścianę klatki piersiowej, otwierając kleszcze. Upewnij się, że nie pchasz zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić serce. Za pomocą kleszczy utrzymuj ścianę klatki piersiowej szeroko otwartą, aby odsłonić serce i płuca w klatce piersiowej (Rysunek 4E).
  5. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie przesuń serce do przodu (90°) i odsłoń aortę/żyłę grzbietową. Wyciągnij serce/płuca do przodu, chwytając aortę grzbietową/żyłę u podstawy serca (Rysunek 4F-H).
    UWAGA: Bądź delikatny podczas wyciągania serca/płuc, aby uniknąć rozerwania SV, który znajduje się po grzbietowej stronie serca.
  6. Przepłucz serce/płuca zimnym 1x PBS, aby usunąć krwinki.
  7. Powtórz kroki 3.1-3.6, aby usunąć serce/płuca z pozostałych zarodków. Upewnij się, że izolowane serce/płuca znajdują się na lodzie.

4. Izolowanie SV i komór od e11.5 Embrionalne serca myszy

  1. Umieścić szalkę Petriego z sercem/płucami z kroku 3.7 pod mikroskopem stereoskopowym, aby wyizolować SV i całe komory. Oderwij przyczepione płaty płuc jeden po drugim od ich korzenia za pomocą cienkich kleszczy.
  2. Ustaw serce na jego grzbietowej stronie i usuń przedsionki i przylegającą tkankę otaczającą SV z przodu, nie rozrywając SV. Usuń lewe i prawe przedsionki z serca, przytrzymując je u podstawy i zeskrobując za pomocą cienkich kleszczy (Ryc. 5B). Usuń sąsiednią tkankę otaczającą SV przy użyciu podobnej techniki (Rysunek 5C).
    UWAGA: Należy pamiętać, że prawe przedsionek jest przymocowany do SV, więc należy uważać, aby zdjąć tylko przedsionek.
  3. Aby odizolować SV, najpierw ustaw serce grzbietową stroną skierowaną do góry (ponieważ SV znajduje się po stronie grzbietowej) i utrzymuj serce w tej pozycji, delikatnie przytrzymując serce w komorach za pomocą kleszczy.
    UWAGA: SV jest narządem dopływowym serca embrionalnego, który leży pomiędzy przedsionkami po grzbietowej stronie serca.
  4. Usuń SV, ostrożnie odklejając go od serca, do którego jest przymocowany, lub przytrzymując SV u podstawy jego mocowania za pomocą cienkich kleszczyków i zeskrobując go zamkniętymi kleszkami (Rysunek 5D,E).
  5. Przenieść wyizolowaną SV na nową 6-centymetrową szalkę Petriego z lodowato zimnym sterylnym 1x PBS na lodzie za pomocą sterylnej pipety transferowej i oznaczyć szalkę Petriego jako SV.
  6. Aby wyizolować całe komory, usuń drogę odpływu (aortę i pień płucny) z serca po usunięciu SV (Rysunek 5F,G).
  7. Przenieść całe komory na nową 6 cm szalkę Petriego zawierającą sterylny 1x PBS na lodzie za pomocą sterylnej pipety transferowej i oznaczyć szalkę Petriego jako komory. Trzymaj izolowany SV i komory na lodzie.
  8. Powtórz kroki 4.1-4.7, aby wyizolować SV i komory z pozostałych serc.

5. Ustawianie płytek do hodowli tkankowych z wkładkami i powłoką macierzy zewnątrzkomórkowej

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: komercyjny roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM; np. Matrigel), wkładki do hodowli politereftalanu etylenu (PET) 8,0 μM, płytki 24-dołkowe, 37 °C, inkubator 5% CO2.

  1. Pozwól roztworowi ECM rozmrozić się na lodzie. Roztwór ECM należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć zestalenia.
  2. Umieścić wkładki do hodowli membranowej PET (wielkość porów = 8,0 μm, obszar filtracji = 0,3 cm2, średnica filtra = 6,5 mm) w studzienkach 24-dołkowych płytek poddanych działaniu kultur nietkankowych. Oznacz płytki jako SV lub komory odpowiednio do testów SV lub angiogenezy wsierdzia.
    UWAGA: Umieść wkładki w osobnych płytkach dla SV i komór podczas wykonywania obu kultur jednocześnie. Upewnij się, że ustawiłeś wystarczającą liczbę studzienek dla wszystkich próbek eksperymentalnych i kontroli.
  3. Po rozmrożeniu roztworu ECM należy natychmiast rozcieńczyć ECM w stosunku 1:2 we wstępnie schłodzonym podłożu podstawowym (tj. pożywce podstawowej EBM-2, patrz Tabela Materiałów) do odpowiedniej objętości (100 μl/wkładkę x liczba wkładek).
    UWAGA: Na przykład, jeśli jest sześć wkładek, całkowita objętość wyniesie 100 μL x 6 = 600 μL. Dodaj 200 μL ECM do 400 μL podłoża podstawowego.
  4. Pokryj wkładki 100 μl świeżo rozcieńczonego ECM, dodając go bezpośrednio na membranę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić ECM zestalenie się.
    UWAGA: Należy to wykonać pod kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.

6. Kultury SV i całych komór

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujący sprzęt i odczynniki: 70% etanol, pipeta transferowa, stereomikroskop, kleszcze, kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, zestaw uzupełniający komórki śródbłonka mikronaczyniowego (tabela materiałów), podłoże podstawowe, 1x sterylny PBS). Rysunek 6 pokazuje przebieg SV i hodowli komorowej.

  1. Rozmrozić zawartość zestawu suplementów na lodzie. Przygotować kompletną pożywkę, dodając całą zawartość zestawu suplementów do 500 ml podłoża podstawowego pod certyfikowanym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym. Dobrze wymieszać podłoże i rozprowadzić na 50 ml porcji.
  2. Wysterylizuj podstawę mikroskopu stereoskopowego i otaczający go obszar roboczy 70% etanolem.
  3. Uzyskać płytki do hodowli tkankowych z kroku 5.4. Za pomocą pipety transferowej ostrożnie przenieś eksplantaty z kroku 4.7 na membranę wkładu. Pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą czystych kleszczyków umieść eksplantaty na środku wkładek, aby upewnić się, że nie utknęły w rogu wkładek ani nie są przymocowane do ścianek bocznych.
  4. Po umieszczeniu eksplantatów i wyśrodkowaniu ich na wkładkach, ostrożnie usuń nadmiar PBS z wkładek i zamknij pokrywki płytek.
  5. Pod kapturem do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym dodać 100 μl wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki na wierzch wkładek i 200 μl do studzienek, aby wyhodować eksplantaty na granicy faz powietrze-ciecz tak, aby podstawowa powierzchnia wkładki stykała się z pożywką, ale górna powierzchnia była wystawiona na działanie powietrza.
    UWAGA: Upewnij się, że dostosowałeś głośność, aby uzyskać interfejs powietrze-ciecz, jeśli używasz wkładek/płytek dołkowych o różnych rozmiarach.
  6. Dodać 300 μl PBS do niewykorzystanych studzienek na płytkach 24-dołkowych i przykryć pokrywką. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i hodować kultury przez 5 dni.
  7. W kolejnych dniach rutynowo obserwuj kultury pod mikroskopem światła odwróconego, aby ocenić stan kultur eksplantatów. Upewnij się, że eksplantaty wykazują bicie skurczowe i że wszystkie eksplantaty są przymocowane do dna membrany osadzonej za pomocą ECM. Zwróć uwagę na wszelkie pływające eksplantaty.
    UWAGA: Okresowe kurczenie się eksplantatów wskazuje, że są żywe. W analizie należy pominąć eksplantaty pływające.
  8. Po ocenie stanu kultury umieść płytkę hodowlaną z powrotem w inkubatorze i kontynuuj hodowlę przez okres do 5 dni.

7. Traktowanie kultur za pomocą VEGF-A (kontrola pozytywna)

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, 1x PBS, podłoże podstawowe + 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), podłoże podstawowe + VEGF-A, pipety i końcówki do pipet.

  1. Przygotować podłoże podstawowe + 1% FBS i podłoże podstawowe + VEGF-A.
    1. Aby przygotować podłoże podstawowe + 1% FBS, najpierw określ liczbę potrzebnych studzienek kontrolnych. Na przykład, jeśli istnieją trzy studzienki kontrolne, to 300 μL/studzienkę x 3 = 900 μL to całkowita potrzebna objętość. Dodaj 9 μl FBS do 891 μl podłoża podstawowego, aby uzyskać podłoże podstawowe + 1% FBS.
    2. Aby przygotować podłoże podstawowe + VEGF-A, najpierw określ całkowitą liczbę studzienek wymagających pożywki VEGF-A. Jeśli są trzy dołki, to 300 μL/studzienkę x 3 = 900 μL to całkowita objętość, a 50 ng/studzienka x 3 = 150 ng VEGF-A. Dodać 150 ng VEGF-A do 900 μl podłoża podstawowego, aby uzyskać podłoże podstawowe + VEGF-A.
      UWAGA: Złóż ten roztwór w większej objętości niż obliczono, aby zapewnić wystarczającą liczbę mniejszych porcji dla każdego eksperymentu.
  2. W dniu 2 usuń pożywkę z obu komór (wkładek i studzienek). Przemyć kultury 300 μL 1x PBS, dodając 100 μL do wkładek i 200 μL do studzienek. Mocno zakręć płytkami kilka razy i wyjmij PBS.
  3. Dodać 300 μl podłoża podstawowego + 1% FBS (100 μl do wkładki i 200 μl do studzienek), aby zagłodzić kultury przez 24 godziny.
  4. W dniu 3, po zagłodzeniu, dodać odpowiednio 300 μl podłoża podstawowego + 1% FBS (100 μl do wkładki i 200 μl do studzienek) do studzienek kontrolnych i podłoża podstawowego + VEGF-A (50 ng/studzienkę) do studzienek zabiegowych.
  5. Po leczeniu kontynuuj hodowlę kultur w inkubatorze.

8. Utrwalenie i barwienie immunologiczne

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujący sprzęt i odczynniki: 4% paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, przeciwciała pierwszorzędowe i wtórne, shaker, 0,5% niejonowy środek powierzchniowo czynny w PBS (PBT).

  1. Szóstego dnia hodowli usunąć pożywkę i przemyć kultury 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).
    1. Utrwalić kultury, dodając 200 μl 4% roztworu PFA do studzienek i 100 μl do wkładek. Utrwal kultury w temperaturze 4 °C na 20 minut podczas kołysania.
    2. Po 20 minutowym utrwaleniu usunąć PFA z kultur w dygestoriach i przemyć kultury 1x PBS, dodając 200 μl do studzienek i 100 μl do wkładek.
    3. Powtórz pranie 3 razy po 10 minut, jednocześnie bujając. Następnie przystąp do wykonywania barwienia immunologicznego.
      UWAGA: Wszystkie etapy mycia są wykonywane na blacie w RT.
  2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (anty-VE-kadheryna, anty-ERG 1/2/3) w roztworze blokującym (5% surowica osła, 0,5% PBT). Dodać 300 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (200 μl do studzienek dennych i 100 μl do wkładek). Inkubować kultury w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C podczas kołysania.
    UWAGA: Anty-VE-kadheryna służy do znakowania błony komórkowej śródbłonka, a anty-ERG 1/2/3 służy do znakowania jądra komórkowego śródbłonka w celu uwidocznienia angiogennych kiełków komórek śródbłonka.
  3. Następnego dnia umyj i rozbujaj płytki hodowlane 10x w 0,5% PBT, zmieniając PBT co 10 minut.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (anty-szczur Alexa Fluor 488 i osła anty-królik Alexa Fluor 555) w roztworze blokującym. Dodać 300 μl przeciwciała drugorzędowego, jak w kroku 8.2 i inkubować kultury przez noc w temperaturze 4 °C, kołysząc się. Następnego dnia przemyj przeciwciała drugorzędowe 10 razy w PBT, zmieniając PBT co 10 min.
    UWAGA: Prać minimum 10 razy, ale więcej prań jest lepszych. Po zakończeniu mycia kultury można przechowywać z 1x PBS do momentu zamontowania na szkiełkach.

9. Montaż kultur na szkiełkach, obrazowanie i analiza

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: drobne kleszcze, szkiełka, podłoże montażowe z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), szkiełka nakrywkowe i mikroskop konfokalny. Po wtórnym barwieniu przeciwciałami zamontuj kultury na szkiełkach w celu obrazowania, wykonując następujące czynności.

  1. Ostrożnie oderwij membranę od wkładki za pomocą drobnych kleszczyków i przenieś ją na szkiełka, kładąc membranę stroną do dołu i umieszczając kultury eksplantatów do góry. Umieść powtórzone próbki na tych samych szkiełkach i oznacz je jako kontrolne lub VEGF-A. Dodać kilka kropel medium montażowego z DAPI bezpośrednio na membranę i przykryć szkiełka szkiełkami nakrywkowymi.
    UWAGA: Upewnij się, że podczas zakładania szkiełek nakrywkowych nie ma pęcherzyków powietrza.
  2. Uszczelnij krawędzie szkiełek przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia.
    UWAGA: Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  3. Szkiełka obrazowe za pomocą mikroskopu konfokalnego.
  4. Wykonaj analizę, aby zmierzyć długość wyrostu angiogennego. Określ ilościowo długość wzrostu angiogennego, mierząc odległość komórek śródbłonka (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) rozciągniętych od wewnętrznej granicy komórek ERG 1/2/3+ w hodowlach komorowych i od środka eksplantatów SV w kulturach SV.
    1. Aby przeprowadzić kwantyfikację za pomocą FIJI/ImageJ, najpierw pobierz oprogramowanie FIJI.
    2. Otwórz pliki obrazów na FIDŻI: przejdź do Plik | Otwórz | Teczka | Nazwa pliku | Otwarty.
    3. Przejdź do punktu Analiza | Ustawianie pomiarów | Wybierz opcję Obwód.
    4. Wybierz narzędzie Linia prosta w oknie głównym.
    5. Narysuj linię w poprzek długości kiełka, zgodnie z sugestią w kroku 9.4.
    6. Przejdź do punktu Analiza | Środek.
      UWAGA: Pomiary długości są wyświetlane w nowym oknie.
    7. Wykonaj kwantyfikację na obrazach, które reprezentują co najmniej trzy losowo wybrane pola widzenia. Uśrednij pomiary długości kiełków i podaj je jako średnią ± odchylenie standardowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jedną z najbardziej uderzających cech angiogenezy SV in vivo jest to, że przebiega ona określoną ścieżką i obejmuje zdarzenia dedyferencjacji oraz redyferencjacji komórek, które występują w stereotypowych czasach i miejscach1. W miarę jak początkowe komórki SV narastają na komorę serca, przestają produkować markery żylne, takie jak COUP-TFII (Rycina 7). Następnie pąki wieńcowe przyjmują dwie drogi migracji: albo po powierzchni serca, a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niektóre z najważniejszych kroków do pomyślnego wyhodowania naczyń wieńcowych z tkanek progenitorowych SV i Endo to: 1) Prawidłowa identyfikacja i wyizolowanie tkanki SV do hodowli SV; 2) wykorzystanie komór z zarodków w wieku od e11−11,5 do dokładnej hodowli Endo; 3) utrzymanie sterylnych warunków przez cały okres preparacji i utrzymywanie tkanek w chłodzie przez cały czas; oraz 4) utrzymywanie eksplantatów przymocowanych do membrany pokrytej ECM, aby uniknąć unoszenia się tkanki w podłożu.

P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują członkom laboratorium Sharma za zapewnienie wspierającego środowiska badawczego. Szczególne podziękowania kierujemy do Diane (Dee) R. Hoffman, która utrzymuje i opiekuje się naszą kolonią myszy. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Philipowi J. Smaldino i Carolyn Vann za staranną korektę manuskryptu i dostarczenie pomocnych komentarzy. Praca ta była wspierana przez fundusze z Biura Rektora Uniwersytetu Stanowego Ball i Wydziału Biologii dla B.S., fundusze Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant dla B.S. oraz fundusze NIH (RO1-HL128503) i The New York Stem Cell Foundation dla K.R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 MMFisher Scientific 877222Określany w protokole jako szalka Petriego
24-dołkowe płytkiFisher Scientific08-772-51
Wkładki do hodowli membrany PET 8,0 uMMillipore SigmaMCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anty-królik 555Fisher ScientificA31572Przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor Donkey anty-szczur 488Fisher ScientificA21206Przeciwciało wtórne
Kątowa metalowa sondaPrecyzyjne narzędzia naukowe10088-15Kąt 45 stopni, używany do wykrywania głębokich zatyczek Przeciwciało
anty-ERG 1/2/3AbcamAb92513Przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty-VE-KadherynaFisher ScientificBDB550548Przeciwciało pierwszorzędowe, producent BD BioSciences
Zbiornik gazu CO2Różni dostawcyNie dotyczy
CO2 InkubatorFisher Scientific13998223Dla 37 & stopni; C, 5% inkubacja CO2
Sekcja stereomicrosopeLeicaS9iLeica S9i Stereomikroskop Leica S9i
EBM-2 podłoże podstawoweLonzaCC-3156Wzrost komórek śródbłonka podłoże podstawowe
Roztwór ECMCorning354230Komercyjnie znany jako Matrigel
EGM-2 MV Zestaw SinglequotsLonzaCC-4147Zestaw suplementów komórek śródbłonka mikronaczyniowego; Jest on mieszany z EBM-2, aby EGM-2 był kompletnym podłożem
Surowica bydlęca płodu (FBS)Fisher ScientificSH3007003IR
FiJiNIHNAOprogramowanie do przetwarzania obrazów (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Cienkie kleszczePrecyzyjne narzędzia naukowe11412-11Używany do zarodka preparacja
Nożyczki operacyjne Fisherbrand z prostym ostrzemFisher Scientific13-808-4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (1X)Fisher ScientificSH-302-5601LR
Kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnymróżne modeleFisher Scientific
MediumVector LaboratoriesH-1200Vectashield z DAPI
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopiaelektronowa/Fisher50-980-494Jest to dostępne w 32%; musi być rozcieńczone do 4%
Łyżka perforowanaNarzędzia naukowe10370-18Przydatny w usuwaniu zarodków/tkanek z roztworu
Rekombinowana mysia VEGF-A 165PeproTech450-32
Standardowe kleszcze, Dumont #5Narzędzia do nauki precyzyjnej11251-30
Komora Sure-Seal na myszy/szczuraEasysystemincEZ-1785Komora do eutanazji
Dostępne

Bibliografia

  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  2. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
  3. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
  4. Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
  5. Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
  6. Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
  7. Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  8. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
  9. Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
  10. Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
  11. Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
  12. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
  13. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
  14. Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
  15. Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
  16. Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
  17. Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
  18. Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
  19. Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
  20. Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zatoka ylnaendokardiumopracowanie VEGF Amikroskopia konfokalnahodowla tkankowaembrionalne sercekom rki progenitorowemacierz zewn trzkom rkowahodowla kom rkowa
Model angiogenezy wieńcowej in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.