Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model przewlekłego bólu po niedokrwieniu złożonego zespołu bólu regionalnego typu I u szczurów

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60562

⸱

21 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Key Laboratory of Acupuncture and Neurology of Zhejiang Province, 2Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dostarczony jest tutaj protokół, który szczegółowo opisuje kroki prowadzące do stworzenia zwierzęcego modelu przewlekłego bólu po niedokrwieniu (CPIP). Jest to dobrze rozpoznawalny model naśladujący ludzki złożony zespół bólu regionalnego typu I. Dalej oceniane są nadwrażliwości mechaniczne i termiczne, a także zachowania nocyfensywne wywołane kapsaicyną obserwowane w modelu szczurzym CPIP.

Streszczenie

Wprowadzenie

Complex regional pain syndrome (CRPS) odpowiada złożonym i przewlekłym objawom bólowym wynikającym ze złamań, urazów, operacji, niedokrwienia lub uszkodzenia nerwów1,2,3. CRPS jest podzielony na 2 podkategorie: CRPS typu I i typu II (CRPS-I i CRPS-II)4. Badania epidemiologiczne wykazały, że częstość występowania CRPS wynosiła około 1:20005. CRPS-I, który nie wykazuje oczywistego uszkodzenia nerwów, może powodować przewlekły ból i dramatycznie wpływa na jakość życia pacjentów. Obecnie dostępne metody leczenia wykazują niewystarczające efekty terapeutyczne. W związku z tym CRPS-I nadal pozostaje ważnym i wymagającym problemem klinicznym, którym należy się zająć.

Stworzenie przedklinicznego modelu zwierzęcego naśladującego CRPS-I jest kluczowe dla zbadania mechanizmów leżących u podstaw CRPS-I. Aby rozwiązać ten problem, Coderre i in. zaprojektowali model szczura, stosując przedłużone niedokrwienie i reperfuzję do kończyny tylnej, aby podsumować CRPS-I6. Wiadomo, że uszkodzenie niedokrwienne/reperfuzyjne jest jedną z głównych przyczyn CRPS-I7. Model CPIP u szczurów wykazuje wiele objawów podobnych do CRPS-I, które obejmują obrzęk kończyn tylnych i przekrwienie we wczesnym stadium po ustanowieniu modelu, a następnie utrzymującą się nadwrażliwość termiczną i mechaniczną6. Za pomocą tego modelu proponuje się, że centralne uwrażliwienie na ból, aktywacja obwodowego kanału TRPA1 i generowanie reaktywnych form tlenu itp. przyczyniają się do CRPS-I8,9,10. Niedawno udało nam się ustalić model szczura CPIP i przeprowadziliśmy sekwencjonowanie RNA zwojów korzenia grzbietowego (DRG), które unerwiają dotkniętą chorobą tylną łapę11. Odkryliśmy kilka potencjalnych mechanizmów, które mogą być zaangażowane w pośredniczenie w nadwrażliwości na ból CRPS-I11. Ponadto zidentyfikowaliśmy przejściowy kanał waniloidowy 1 (TRPV1) o potencjale receptora przejściowego w neuronach DRG jako ważny czynnik przyczyniający się do mechanicznej i termicznej nadwrażliwości CRPS-I12.

W tym badaniu opisaliśmy szczegółowe procedury związane z ustanowieniem szczurzego modelu CPIP. Następnie oceniliśmy model CPIP u szczurów, mierząc nadwrażliwość mechaniczną i termiczną, a także jego reakcję na ostrą prowokację kapsaicyną. Sugerujemy, że szczurzy model CPIP może być wiarygodnym modelem zwierzęcym do dalszych badań nad mechanizmami zaangażowanymi w CRPS-I.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang.

1. Zwierzęta

  1. Pozyskaj samce szczurów Sprague-Dawley (SD) (280–320 g, w wieku 8-10 tygodni) z Centrum Zwierząt Laboratoryjnych w Szanghaju. Trzymaj zwierzęta w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Chińskiego Uniwersytetu Medycznego Zhejiang. Należy pamiętać, że warunki hodowli powinny obejmować 12 godzin/2 godziny cykli światła/ciemności i utrzymywać stałą temperaturę na poziomie 24 °C. Dostarczać wodę i pokarm ad libitum. Należy zauważyć, że w sumie w tym badaniu wykorzystano 48 szczurów. Jedna uwaga, w tym modelu musimy obserwować reakcję bólową podczas całego procesu. Jeśli stosuje się leki przeciwbólowe, nie możemy z powodzeniem ustalić modelu bólu. Po eksperymentach szczury są składane w ofierze.

2. Ustanowienie modelu CPIP

  1. Znieczulenie wszystkich szczurów (w tym grupy pozorowane i grupy modelowe CPIP) fenobarbitalem sodu (50 mg/kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe [i.p.]). W razie potrzeby utrzymać znieczulenie do 20 mg/kg/h fenobarbitalu [i.p.]. Sprawdź odruchy każdego zwierzęcia, ściskając jego tylną łapę lub końcówkę ogona za pomocą kleszczy. Upewnij się, że szczury nie reagują przed ustanowieniem modelu. Umieść maść weterynaryjną na oczach, aby uniknąć wysuszenia podczas zabiegu. Umieścić znieczulone szczury na podgrzewanej podkładce utrzymywanej w temperaturze 37 °C w celu wykonania następującej procedury.
  2. Niedokrwienie i reperfuzja tylnej łapy
    1. Nasmaruj prawą tylną łapę i kostkę glicerolem po znieczuleniu szczura.
    2. Wsuń O-ring z twardości nitrylu 70 o średnicy wewnętrznej 7/32" (5.5 mm) w większą stronę probówki Eppendorfa o pojemności 1.5 ml (z odciętą zatrzaskową nasadką przed użyciem). Ostrożnie włóż tylną łapę do pustej rurki Eppendorfa, aż dotrze do dna.
    3. Stopniowo przesuwaj O-ring z rurki na prawą tylną kończynę w pobliżu stawu skokowego i umieść na 3 godziny. Zastosuj ten sam zabieg do pozorowanej grupy szczurów, z wyjątkiem tego, że wokół kostki należy umieścić złamany O-ring, który jest odcięty i nie powinien wywoływać niedokrwienia.
    4. Odetnij O-ring 3 godziny po etapie niedokrwienia. Uważnie obserwuj szczura, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżący mostek. Należy pamiętać, że szczur, który otrzymał znieczulenie, nie powinien być umieszczany z powrotem w towarzystwie innych szczurów, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.

3. Nocyfencyjne testy behawioralne

  1. Umieść szczura w przezroczystej komorze z pleksiglasu, która znajduje się na siatkowej podłodze. Przyzwyczaj szczura przez 0,5 godziny przed jakimikolwiek testami behawioralnymi.
  2. Mechaniczna allodynia
    1. Do testu należy użyć filamentów von Freya (0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 i 26,0 g). Rozpocznij badanie od środkowego włókna (4,0 g). Przyłóż pionowo włókna do środkowej powierzchni podeszwowej tylnej łapy. Lekko przyłóż odpowiednią siłę, aby zgiąć filament przez maksymalnie 5 s. Nagłe cofnięcie tylnej łapy w odpowiedzi na bodźce jest uważane za zachowanie nocyfensywne. Przeprowadzaj mechaniczny test allodynii w dniach -3, -2, -1 i co drugi dzień do 13 dnia.
    2. Zastosuj metodę testowania góra-dół, aby przetestować próg. Zastosuj metodę Dixona do obliczania 50% progu wycofania łapy (PWT)13,14,15.
  3. Hiperalgezja termiczna
    1. Użyj metody Hargreavesa do zbadania hiperalgezji termicznej. Skieruj wiązkę światła emitowaną z żarówki (50 W) bezpośrednio na tylną łapę, aby zmierzyć opóźnienie wycofania łapy (PWL). Ustaw 20 s jako próg odcięcia, aby uniknąć nadmiernych obrażeń spowodowanych ogrzewaniem.
    2. Powtórz każdy test 3 razy w odstępach 5-minutowych dla każdej tylnej łapy. Weź średnią z tych trzech testów jako PWL każdego rat16. Test hiperalgezji termicznej przeprowadzaj w dniach -3, -2, -1 i co drugi dzień do 13 dnia.
  4. Ostre zachowanie nocyfencyjne wywołane kapsaicyną
    1. Przygotować roztwór podstawowy kapsaicyny (200 mM) przy użyciu dimetylosulfotlenku (DMSO) i dalej rozcieńczyć do 1:1000 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do wstrzyknięcia tylnej łapy. Końcowe stężenie DMSO w PBS wynosi 0,1% (nośnik zawiera 0,1% DMSO tylko w PBS). Wstrzyknąć kapsaicynę lub nośnik do tylnej łapy (wstrzyknięcie dopodeszwowe) w objętości 50 μl za pomocą igły 30 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
    2. Rejestruj zachowanie nocyfensywne (tj. lizanie, gryzienie lub wzdryganie się łapy, w którą wstrzyknięto) za pomocą kamery wideo przez 10 minut zaraz po wstrzyknięciu, a następnie określ ilościowo, jak opisano wcześniej17,18,19.
  5. Ocena obrzęku tylnej łapy: Oceń obrzęk tylnej łapy, mierząc wzrost średnicy łapy. Zmierz suwmiarką cyfrową i oblicz różnicę między wartością podstawową a wartością testową obserwowaną w różnych punktach czasowych. Oceń zmiany grubości łapy po 15 minutach, 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach od założenia modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po założeniu pierścienia uszczelniającego (O-ring) na kostkę, skóra ipsilateralnej tylnej łapy wykazywała sinicę, co wskazywało na hipoksję tkankową (Rycyna 1A). Po przecięciu pierścienia, ipsilateralna tylna łapa zaczęła napełniać się krwią i wykazywała silny obrzęk, co stanowiło wyraźny objaw hiperemii (Rycyna 1A). Obrzęk łapy stopniowo ustępował i wrócił do normy 48 h po procedurze niedokrwienia/reperfuzji (dwuczynnikowa anal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje szczegółowe metody ustalania modelu CPIP szczura poprzez zastosowanie niedokrwienia/reperfuzji do tylnych kończyn szczurów. Polega na ocenie wyglądu kończyn tylnych, obrzęku, nadwrażliwości mechanicznej/termicznej i ostrych zachowań nocyfencyjnych w odpowiedzi na wstrzyknięcie kapsaicyny.

Niedokrwienie/reperfuzja kończyn jest częstym czynnikiem przyczyniającym się do CRPS-I u pacjentów12. W tym protokole opisano, jak ustanowić szczurzy model CPIP, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z niniejszą pracą.

Podziękowania

Ten projekt był sponsorowany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81873365 i 81603676), Zhejiang Provincial Natural Science Funds for Distinguished Young Scholars (LR17H270001) oraz fundusze badawcze z Chińskiego Uniwersytetu Medycznego Zhejiang (Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka EppendorfEppendorf22431021
DMSOSigma-AldrichD1435
KapsaicynaAPEXBIOA3278
Suwmiarka cyfrowaMeinaiteO-ring NA
O-ringi ZachodniNitryl 70 Twardość7/32 in.
średnica wewnętrzna
Aparatura do testowania podeszwyUGO Basile, Włochy37370
von Frey filamentsUGO Basile, WłochyNC12775

Bibliografia

  1. Goh, E. L., Chidambaram, S., Ma, D. Complex regional pain syndrome: a recent update. Burns, Trauma. 5 (1), 2(2017).
  2. Birklein, F., Ajit, S. K., Goebel, A., Rsgm, P., Sommer, C. Complex regional pain syndrome - phenotypic characteristics and potential biomarkers. Nature Reviews Neurology. 14 (5), (2018).
  3. Shim, H., Rose, J., Halle, S., Shekane, P. Complex regional pain syndrome: a narrative review for the practising clinician. British Journal of Anaesthesia. , (2019).
  4. Urits, I., Shen, A. H., Jones, M. R., Viswanath, O., Kaye, A. D. Complex Regional Pain Syndrome, Current Concepts and Treatment Options. Current Pain, Headache Reports. 22 (2), 10(2018).
  5. Helyes, Z., et al. Transfer of complex regional pain syndrome to mice via human autoantibodies is mediated by interleukin-1-induced mechanisms. Proceedings of National Academy Sciences of the United States of America. 116 (26), 13067-13076 (2019).
  6. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-Type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1), 94-105 (2004).
  7. Coderre, T. J., Bennett, G. J. A hypothesis for the cause of complex regional pain syndrome-type I (reflex sympathetic dystrophy): pain due to deep-tissue microvascular pathology. Pain Medicine. 11 (8), 1224-1238 (2010).
  8. Klafke, J. Z., et al. Acute and chronic nociceptive phases observed in a rat hind paw ischemia/reperfusion model depend on different mechanisms. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 468 (2), 229-241 (2015).
  9. Tang, Y., et al. Interaction between astrocytic colony stimulating factor and its receptor on microglia mediates central sensitization and behavioral hypersensitivity in chronic post ischemic pain model. Brain Behavioral Immunology. 68, 248-260 (2018).
  10. Kim, J. H., Kim, Y. C., Nahm, F. S., Lee, P. B. The Therapeutic Effect of Vitamin C in an Animal Model of Complex Regional Pain Syndrome Produced by Prolonged Hindpaw Ischemia-Reperfusion in Rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (1), 97-101 (2017).
  11. Yin, C., et al. Transcriptome profiling of dorsal root ganglia in a rat model of complex regional pain syndrome type-I reveals potential mechanisms involved in pain. Journal of Pain Research. 12, 1201-1216 (2019).
  12. Hu, Q., et al. TRPV1 Channel Contributes to the Behavioral Hypersensitivity in a Rat Model of Complex Regional Pain Syndrome Type 1. Frontiers in Pharmacology. 10, 453(2019).
  13. Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).
  14. Chai, W., et al. Electroacupuncture Alleviates Pain Responses and Inflammation in a Rat Model of Acute Gout Arthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2018, 2598975(2018).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Fang, J. Q., et al. Parameter-specific analgesic effects of electroacupuncture mediated by degree of regulation TRPV1 and P2X3 in inflammatory pain in rats. Life Sciences. 200, 69-80 (2018).
  17. Tai, Y., et al. Involvement of Transient Receptor Potential Cation Channel Member A1 activation in the irritation and pain response elicited by skin-lightening reagent hydroquinone. Scientific Reports. 7 (1), 7532(2017).
  18. Liu, B., et al. TRPM8 is the principal mediator of menthol-induced analgesia of acute and inflammatory pain. Pain. 154 (10), 2169-2177 (2013).
  19. Liu, B., et al. Oxidized Phospholipid OxPAPC Activates TRPA1 and Contributes to Chronic Inflammatory Pain in Mice. PLoS One. 11 (11), 0165200(2016).
  20. Terkelsen, A. J., Gierthmuhlen, J., Finnerup, N. B., Hojlund, A. P., Jensen, T. S. Bilateral hypersensitivity to capsaicin, thermal, and mechanical stimuli in unilateral complex regional pain syndrome. Anesthesiology. 120 (5), 1225-1236 (2014).
  21. Drummond, P. D., Morellini, N., Finch, P. M., Birklein, F., Knudsen, L. F. Complex regional pain syndrome: intradermal injection of phenylephrine evokes pain and hyperalgesia in a subgroup of patients with upregulated alpha1-adrenoceptors on dermal nerves. Pain. 159 (11), 2296-2305 (2018).
  22. Minert, A., Gabay, E., Dominguez, C., Wiesenfeld-Hallin, Z., Devor, M. Spontaneous pain following spinal nerve injury in mice. Experimental Neurology. 206 (2), 220-230 (2007).
  23. Kingery, W. S., et al. Capsaicin sensitive afferents mediate the development of heat hyperalgesia and hindpaw edema after sciatic section in rats. Neuroscience Letters. 318 (1), 39-43 (2002).
  24. Xu, J., et al. Activation of cannabinoid receptor 2 attenuates mechanical allodynia and neuroinflammatory responses in a chronic post-ischemic pain model of complex regional pain syndrome type I in rats. European Journal of Neuroscience. 44 (12), 3046-3055 (2016).
  25. Coderre, T. J., Xanthos, D. N., Francis, L., Bennett, G. J. Chronic post-ischemia pain (CPIP): a novel animal model of complex regional pain syndrome-type I (CRPS-I; reflex sympathetic dystrophy) produced by prolonged hindpaw ischemia and reperfusion in the rat. Pain. 112 (1-2), 94-105 (2004).
  26. Weissmann, R., Uziel, Y. Pediatric complex regional pain syndrome: a review. Pediatric Rheumatology Online Journal. 14 (1), 29(2016).
  27. Kim, H., Lee, C. H., Kim, S. H., Kim, Y. D. Epidemiology of complex regional pain syndrome in Korea: An electronic population health data study. PLoS One. 13 (6), 0198147(2018).
  28. Tang, C., et al. Sex differences in complex regional pain syndrome type I (CRPS-I) in mice. Journal of Pain Research. 10, 1811-1819 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Niedokrwienie i reperfuzjakończyna dolnamechaniczna allodyniatermiczna hiperalgezjawstrzyknięcie kapsaicynywłókna Von Freymetoda Hargreavesazachowanie nocyceptywne
Model przewlekłego bólu po niedokrwieniu złożonego zespołu bólu regionalnego typu I u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.