Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie transgenicznych szczurów przy użyciu podejścia wektora lentiwirusowego

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60570

⸱

17 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł ma na celu przedstawienie metodologii transgenezy lentiwirusowej w zarodkach szczurów przy użyciu wielokrotnych wstrzyknięć zawiesiny wirusa do przestrzeni zygoty periviteliny. Samice szczurów, które są kojarzone płodnym szczepem samców o innym dominującym kolorze futra, są wykorzystywane do generowania pseudociężarnych matek zastępczych.

Streszczenie

Transgeniczne modele zwierzęce są fundamentalnie ważne dla nowoczesnych badań biomedycznych. Włączenie obcych genów do wczesnych zarodków myszy lub szczurów jest nieocenionym narzędziem do analizy funkcji genów w organizmach żywych. Standardowa metoda transgenezy polega na mikrowstrzykiwaniu obcych fragmentów DNA do przedjądrza zapłodnionego oocytu. Technika ta jest szeroko stosowana u myszy, ale pozostaje stosunkowo nieefektywna i wymagająca technicznie u innych gatunków zwierząt. Transgen może być również wprowadzany do zarodków w stadium jednokomórkowym poprzez infekcję lentiwirusową, stanowiąc skuteczną alternatywę dla standardowych iniekcji projądrkowych, szczególnie u gatunków lub szczepów o trudniejszej budowie zarodka. W tym podejściu zawiesina zawierająca wektory lentiwirusowe jest wstrzykiwana do przestrzeni okołowitelowej zapłodnionego zarodka szczura, który jest technicznie mniej wymagający i ma wyższy wskaźnik sukcesu. Wykazano, że wektory lentiwirusowe skutecznie włączają transgen do genomu w celu określenia generacji stabilnych linii transgenicznych. Pomimo pewnych ograniczeń (np. wymagania dotyczące poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, limity wielkości fragmentów DNA), transgeneza lentiwirusowa jest szybką i skuteczną metodą transgenezy. Dodatkowo, wykorzystanie samic szczurów, które są kojarzone płodnym szczepem samców o innym dominującym kolorze futra, jest przedstawiane jako alternatywa dla generowania pseudociężarnych matek zastępczych.

Wprowadzenie

Przez wiele lat gryzonie laboratoryjne, takie jak szczury i myszy, były używane do modelowania ludzkich stanów fizjologicznych i patologicznych. Badania na zwierzętach doprowadziły do odkryć, które były nieosiągalne w żaden inny sposób. Początkowo badania genetyczne koncentrowały się na analizie spontanicznie występujących zaburzeń i fenotypów, które uważa się za ściśle naśladujące kondycję ludzką1. Rozwój metod inżynierii genetycznej pozwolił na wprowadzenie lub usunięcie określonych genów w celu uzyskania pożądanego fenotypu. Dlatego też wytwarzanie zwierząt transgenicznych jest uznawane za podstawową technikę we współczesnych badaniach, która umożliwia badanie funkcji genów w organizmach żywych.

Transgeniczna technologia zwierzęca stała się możliwa dzięki połączeniu osiągnięć w eksperymentalnej embriologii i biologii molekularnej. W latach sześćdziesiątych XX wieku polski embriolog A. K. Tarkowski opublikował pierwszą pracę na temat manipulacji zarodkami myszy we wczesnych stadiach rozwoju2. Ponadto biolodzy molekularni opracowali techniki generowania wektorów DNA (tj. nośników) do m.in. wprowadzania obcego DNA do genomu zwierzęcia. Wektory te pozwalają na namnażanie wybranych genów i ich odpowiednią modyfikację, w zależności od rodzaju prowadzonych badań. Termin "zwierzę transgeniczne" został wprowadzony przez Gordona i Ruddle'a3.

Pierwszym powszechnie akceptowanym gatunkiem, który był używany w neurobiologii, fizjologii, farmakologii, toksykologii i wielu innych dziedzinach nauk biologicznych i medycznych, był szczur norweski, Rattus norvegicus4. Jednak ze względu na trudności w manipulowaniu embrionami szczurów, mysz domowa Mus musculus stała się dominującym gatunkiem zwierząt w badaniach genetycznych5. Innym powodem prymatu myszy w takich badaniach była dostępność technologii embrionalnych komórek macierzystych do generowania zwierząt nokautujących dla tego gatunku. Najczęściej stosowaną techniką transgenezy (2–10% transgenicznego potomstwa w stosunku do wszystkich urodzonych zwierząt) jest mikroiniekcja fragmentów DNA do przedjądrza zapłodnionego oocytu. W 1990 roku to podejście, które po raz pierwszy zostało wprowadzone u myszy, zostało zaadaptowane dla szczurów6,7. Transgeneza szczura przez wstrzyknięcie projądra charakteryzuje się niższą wydajnością8 w porównaniu z myszami, co jest ściśle związane z obecnością elastycznych błon plazmowych i przedjądrowych9. Chociaż przeżywalność zarodków po manipulacji jest o 40–50% niższa niż u myszy, technika ta jest uważana za standard w generowaniu genetycznie modyfikowanych szczurów10. Zbadano alternatywne podejścia, które mogą zagwarantować skuteczną inkorporację transgenu i wyższe wskaźniki przeżywalności wstrzykniętych zygot.

Kluczowym wyznacznikiem stabilnej ekspresji transgenu i jego transmisji do potomstwa jest jego integracja z genomem komórki gospodarza. Lentiowirusy (LV) mają tę charakterystyczną cechę, że są w stanie infekować zarówno komórki dzielące się, jak i niedzielące się. Ich zastosowanie jako narzędzia do inkorporacji heterologicznych genów do zarodków okazało się bardzo skuteczne11, a osobniki transgeniczne charakteryzują się stabilną ekspresją włączonego fragmentu DNA. Potwierdzono skuteczność wektorów lentiwirusowych w genetycznej modyfikacji myszy12,13, rats12,14 i innych gatunków11. W tej metodzie zawiesinę LV wstrzykuje się pod osłonę przejrzystą zarodka na etapie dwóch przedjądrzy. Technika ta zasadniczo gwarantuje 100% przeżycie zarodków, ponieważ oolemma pozostaje nienaruszona. Produkcja wysokiej jakości i stosunkowo wysoko skoncentrowanych zawiesin nn jest kluczowym czynnikiem. Jednak niższe stężenia zawiesin LV można przezwyciężyć poprzez wielokrotne wstrzyknięcia11, co zwiększa ilość cząstek wirusa na powierzchni jaja, nie wpływając jednocześnie na integrację błony. Zarodki, które są poddawane wielokrotnym wstrzyknięciom w przestrzeń perywiteliny, rozwijają się dalej, a transgeniczne potomstwo może przekazywać transgen przez linię zarodkową. Skuteczność transgenicznego generowania szczurów przez transgenezę lentiwirusową może sięgać nawet 80%12.

Tutaj opisujemy produkcję rekombinowanego lentiwirusa pochodzącego od HIV-1, który został pseudotypowany białkiem G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Zastosowanie pseudotypu VSV systemu pakowania drugiej generacji decyduje o szerokiej zakaźności cząstek wirusa i pozwala na produkcję wysoce stabilnych wektorów, które mogą być zagęszczane przez ultrawirowanie i kriokonserwowane. Po weryfikacji miana, wektory są gotowe do użycia jako nośnik do dostarczania transgenu do zygot szczurów albinosów Wistar. Po serii wstrzyknięć zarodki mogą być hodowane przez noc i przenoszone w stadium dwukomórkowym do matek zastępczych. W tym momencie można rozważyć jedno z dwóch alternatywnych podejść. Standardowa procedura wykorzystuje kobiety w ciąży rzekomej jako biorczynie zarodków. Jednakże, gdy wskaźnik ciąż jest niski po kryciu z samcami po wazektomii, zarodki można wszczepić ciężarnym samcom Wistar/Sprague-Dawley (SD), które są kojarzone z płodnymi samcami szczurów o ciemnym kolorze futra (np. szczury rasy Brown Norway [BN]). Kolor futra pozwala na odróżnienie potomstwa z naturalnej ciąży od potomstwa, które wywodzi się z przenoszonych zmanipulowanych zarodków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Produkcja i zastosowanie wektorów wirusowych było zgodne z wytycznymi Poziomu Bezpieczeństwa Biologicznego 2 i zostało zatwierdzone przez polskie Ministerstwo Środowiska. Wszystkie procedury na zwierzętach doświadczalnych, które są opisane poniżej, zostały zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną. Zwierzęta trzymano w indywidualnie wentylowanych klatkach w stabilnej temperaturze (21–23 °C) i wilgotności (50–60%) z dostępem ad libitum do wody i pożywienia w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności.

1. Produkcja wektorów lentiwirusowych

  1. Transfekcja komórek HEK 293T
    UWAGA: Protokół przedstawiony w niniejszym dokumencie jest przeznaczony do transfekcji dwudziestu szalek hodowlanych Ø10 cm, które wytwarzają około 200 ml surowego supernatantu wektorowego.
    1. Hodowla komórek HEK 293T w pożywce DMEM, którą uzupełnia się płodową surowicą bydlęcą (10%, v/v) w wilgotnym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Do transfekcji przygotuj dwadzieścia płytek o średnicy 10 cm i wysiew 1,5–2 x 106 komórek HEK 293T na talerz.
    2. Gdy konfluencja osiągnie ~70%, transfekuj komórki za pomocą odczynnika polietylenonegoiny (PEI) o pH 7,0, w stosunku 3 μg PEI na 1 μg DNA.
      1. Przygotuj mieszankę do transfekcji na pięć talerzy (przygotuj liczbę powtórzeń zgodnie z całkowitą liczbą potraw). Do 1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM; bez surowicy) firmy Dulbecco dodaj mieszaninę trzech plazmidów, tak aby osiągnęły końcową ilość 25 μg plazmidu VSVg, 50 μg delta R8.2 i 50 μg plazmidu kodującego.
      2. Pipetować w górę i w dół i dodać 125 μl PEI o stężeniu 3 μg/μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, trzykrotnie odwracając probówkę podczas inkubacji. Dodać 200 μl mieszaniny transfekcyjnej na płytkę. Następnie inkubować płytki w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Stężenie wektorów lentiwirusowych
    1. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji zbierz podłoże zawierające cząstki LV. Użyj probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
      UWAGA: W przypadku korzystania z plazmidu ze znacznikiem fluorescencyjnym, komórki mogą być w tym momencie wizualizowane w celu sprawdzenia skuteczności transfekcji. Można dodać nową porcję pożywki DMEM, a komórki można inkubować przez dodatkowe 24 godziny. Wydajność LV jest porównywalna, gdy jest zbierana w 48 i 72 godzinach po transfekcji.
    2. Odwirować pożywkę o sile 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia oderwanych komórek.
    3. Przefiltrować supernatant (0,45 μm) i wlać go do nowych probówek.
      UWAGA: Ten krok można pominąć.
    4. Dodać DNazę I (wolną od RNaz, 1 μg/ml) i MgCl2 (1 mM) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    5. Przenieść pożywkę do jednorazowych probówek polietylenowych i ultrawirować w wirniku wahliwym przy 115 000 x g i temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny.
    6. Po odwirowaniu delikatnie odsączyć ścianki probówek z pozostałości pożywki.
    7. Namoczyć granulat sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; 70–80 μl na probówkę).
    8. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4–8 °C.
    9. Zawiesić wektory wirusowe w PBS przez delikatne pipetowanie.
      UWAGA: Unikać pienienia.
    10. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 7 000 x g i 4 °C przez 30 s. Przenieść supernatant do nowej probówki. Powtarzaj ten krok, aż nie będzie widać żadnych resztek komórkowych.
    11. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Unikać ponownego zamrażania podwielokrotności lewej wysokości.
  3. Oznaczanie miana wirusa za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy
    UWAGA: Miareczkowanie wektorów wirusowych przeprowadza się za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Metoda ta opiera się na amplifikacji dwuniciowego fragmentu DNA o długości 84 pz w długim regionie powtórzeń końcowych genomu wirusa15.
    1. Przygotować krzywą wzorcową, wykonując seryjne rozcieńczenia plazmidu kodującego LV: 1:500, 1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:100,000 i 1:1,000,000. Określ liczbę kopii plazmidu, który jest używany dla krzywej standardowej. Użyj następującego wzoru: liczba kopii/μL = (stężenie [g/μL] x 6,02 x 1023 [liczba/mol]) / (660 [g/mol] x rozmiar plazmidu [bp]), gdzie 6,02 x 1023 liczba/mol to liczba Avogadro, a 660 g/mol to masa bp.
      UWAGA: Można korzystać z kalkulatorów numerycznych online.
    2. Przygotować rozcieńczenia zawiesiny lentiwirusowej: 1:100, 1:500 i 1:1,000.
    3. Przygotować mieszaninę reakcyjną (objętości na studzienkę): 10 μl qPCR Mastermix, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera odwrotnego i 7 μL H2O. Odpipetować mieszaninę do dołków na płytkach 96-dołkowych.
      UWAGA: Podkład do przodu: 5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA. Podkład odwrotny: 5'-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA.
    4. Dodać 1 μl każdego wzorcowego rozcieńczenia i zawiesiny lentiwirusowej w trzech egzemplarzach.
    5. Uruchomić qPCR zgodnie z następującymi parametrami: 50 °C przez 2 min, 96 °C przez 5 min i 35 cykli po 96 °C przez 20 s, 60 °C przez 40 s i 70 °C przez 1 min, a następnie etap krzywej topnienia: 95 °C przez 1 min i 60 °C przez 30 s.
    6. Przeanalizuj wyniki, porównując liczbę cząsteczek otrzymanych dla każdego rozcieńczenia z krzywą wzorcową. Określić stężenie cząsteczek wektora jako średnią z trzech kontrprób dla każdego rozcieńczenia.
      UWAGA: Przedstawiona kwantyfikacja podaje fizyczne stężenie cząsteczek wirusa. Nie należy go traktować jako miana funkcjonalnego.

2. Generacja transgenicznych szczurów

  1. Superowulacja i pobieranie zapłodnionych zarodków
    1. Podawać gonadotropiny.
      UWAGA: Aby zwiększyć liczbę pobranych zarodków (około 30 na samicę), do stymulacji hormonalnej należy użyć niedojrzałych 5-tygodniowych samic Wistar.
      1. W dniu 1 (12-13) dootrzewnowo wstrzyknąć ciężarnej klaczy gonadotropinę surowicy (PMSG; 25 IU na samicę). Przygotować 1 ml podwielokrotności roztworu roboczego o stężeniu 125 j.m./ml, rozpuszczając proszek hormonalny w 0,9% NaCl. Przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca lub -80 °C do 6 miesięcy.
      2. W dniu 3 (12-13) dootrzewnowo wstrzyknąć ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG; 30 IU na samicę). Przygotować 1 ml porcji roztworu roboczego (150 j.m./ml), rozpuszczając proszek hormonalny w 0,9% NaCl. Przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca lub -80 °C do 6 miesięcy.
    2. Po podaniu hCG samice kojarzą się w stosunku 1:1 z płodnymi płciowo samcami (w wieku 3-10 miesięcy).
    3. Następnego ranka (4 dzień o 8–10 rano) sprawdź samice pod kątem obecności czopa dopochwowego. Sprawdź otwór pochwy pod kątem obecności białawego korka godowego, który dla najlepszej wizualizacji należy sprawdzić wcześnie rano po nocy godowej. Do pobierania zarodków należy używać tylko samic z widoczną zatyczką.
    4. Zbierz zarodki o 10 rano. Złóż zwierzęta w ofierze, aby wyciąć jajowody i zbierz jajowody w naczyniu ze wstępnie podgrzanym podłożem M2.
      1. Przenieść jajowody do naczynia o średnicy 35 mm, które zawiera wstępnie podgrzane podłoże M2 z hialuronidazą z jąder bydlęcych w stężeniu 0,5 mg/ml.
      2. Otwórz ściany jajowodu za pomocą cienkich kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i dociśnij bańkę (tj. spuchniętą część jajowodu, która zawiera zapłodnione zarodki otoczone komórkami wzgórka), aż zarodki zostaną uwolnione.
        UWAGA: Hialuronidaza enzymatycznie trawi komórki wzgórka, uwalniając zarodki.
        UWAGA: Długotrwałe narażenie na hialuronidazę jest szkodliwe dla zarodków; Dlatego ten krok nie powinien trwać dłużej niż 5 minut.
      3. Aby ułatwić uwalnianie zarodków z komórek wzgórka, delikatnie pipetuj je w górę i w dół za pomocą szklanej pipety transferowej, która jest podłączona do rurki aspiratora obsługiwanej przez usta.
        1. Aby wyprodukować pipetę transferową, przeciągnij szklaną pipetę Pasteura nad płomieniem, aby uzyskać prostą końcówkę o długości ~5-10 cm. Rozbij pipetę, pozostawiając końcówkę o długości ~4 cm.
      4. Umyj zarodki kilka razy w podłożu M2, aby usunąć hialuronidazę i resztki komórkowe. Przenieść zarodki do szalki o średnicy 60 mm, która zawiera (~50 μl) kropli wstępnie zbalansowanej pożywki M16, pokrytej ciekłą parafiną lub olejem mineralnym, w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5%CO2
        5. .
  2. Mikroiniekcja wektorów lentiwirusowych do zarodka w stadium jednokomórkowym pod osłonką przejrzystą
    UWAGA: Do mikroiniekcji należy użyć zarodków w stadium jednokomórkowym z dwoma widocznymi przedjądrzami (Ryc. 1).
    1. Rozmrozić podwielokrotność lewej dawki w temperaturze pokojowej i odwirować przy 10 000 x g i RT przez 2 minuty, aby osadzać wszelkie pozostałe resztki komórkowe.
    2. Konfiguracja mikroiniekcji
      1. Przygotować szklane pipety do przechowywania (kapilara ze szkła borokrzemianowego) za pomocą mikrokuźni. Przeciągnij szklaną kapilę nad płomieniem, aby uzyskać końcówkę o długości 5–10 cm. Rozbij pipetę, pozostawiając końcówkę o długości ~4 cm. Średnica zewnętrzna powinna wynosić ~80–120 μm.
        UWAGA: Upewnij się, że końcówka pipety jest idealnie prosta i gładka.
      2. Zmontuj wyciągniętą pipetę w mikrokuźni tak, aby końcówka znajdowała się przed żarnikiem grzewczym. Podgrzej filament bardzo blisko końcówki pipety i pozwól mu skurczyć się do średnicy ~15 μm (około 20% wielkości zarodka). Ustaw pipetę prostopadle do żarnika grzewczego, 2–3 mm od końcówki pipety i zacznij podgrzewać. Szkło zmięknie. Podgrzewaj, aż osiągnie kąt 15°.
      3. Przygotować kapilary ze szkła borokrzemianowego do mikroiniekcji z żarnikiem za pomocą ściągacza do pipet. Włóż kapilę do komory ciągnącej. Przeprowadź test rampy (po raz pierwszy dla nowego szkła i za każdym razem po wymianie filamentu). Ustaw Ciepło na wartość rampy -10, Ciągnięcie na 100, Prędkość na 150 i Czas na 100.
        UWAGA: Zmodyfikuj parametry, aby uzyskać optymalną kapilarnę iniekcyjną.
      4. Pod pokrywą z przepływem laminarnym bezpieczeństwa biologicznego załadować około 2 μl roztworu wirusa do pipety do mikroiniekcji z końcówką do mikroładowania.
      5. Przygotować naczynie do mikroiniekcji (pokrywka z szalki Petriego o średnicy 60 mm) z kroplą 100 μl pożywki M2 (w środku), pokrytą ciekłą parafiną lub olejem mineralnym.
      6. Zamontuj pipetę podtrzymującą i kapilę do mikroiniekcji, która jest wypełniona roztworem wirusa, do mikromanipulatora i naczynia do mikroiniekcji pod mikroskopem odwróconym.
    3. Wykonać mikroiniekcję.
      1. Przenieś 15–20 zarodków w stadium jednokomórkowym do kropli M2 na czaszy do mikroiniekcji. Przytrzymaj zarodek za pomocą pipety podtrzymującej.
      2. Korzystając z 400-krotnego powiększenia, wstrzyknąć roztwór LV pod osłonę przezroczystą do przestrzeni perywitelinalnej za pomocą szklanej kapilary, która jest podłączona do automatycznego wstrzykiwacza. Przytrzymaj przez chwilę naczynia włosowate pod osłonką przejrzystą.
        UWAGA: Przy delikatnym nadciśnieniu roztwór wirusa będzie w sposób ciągły wypływał z kapilary iniekcyjnej, ale nie można kontrolować objętości dostarczanej zawiesiny.
      3. Za pomocą cienkiej pipety umieścić zarodki z powrotem na naczyniu hodowlanym w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Liczba wstrzyknięć jednej zygoty może być różna i może być dostosowana w zależności od stężenia wektora wirusowego.
        UWAGA: Wstrzyknięte zarodki mogą być przenoszone do matek zastępczych w stadium jednokomórkowym lub inkubowane O/N w pożywce M16 przed przeniesieniem na etapie dwukomórkowym. Należy unikać długotrwałego posiewu in vitro zarodków szczurów.
  3. Przekazywanie zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, matkom zastępczym
    1. Przygotowanie matek zastępczych poprzez kojarzenie dojrzałych płciowo samic SD z płodnymi samcami BN lub z samcami SD po wazektomii (procedura wazektomii jest opisana w sekcji 3 poniżej) w dniu 3 (w przypadku transferu zarodków w stadium jednokomórkowym) lub w dniu 4 (w przypadku transferu zarodków w stadium dwukomórkowym).
      UWAGA: Do transferu jajowodu należy użyć samic 0,5 dnia po stosunku (dpc).
    2. Następnego ranka sprawdź, czy samice SD nie mają zatyczki dopochwowej i używaj tylko tych z widoczną zatyczką.
    3. Wykonaj transfer zarodków.
      UWAGA: Zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić za pomocą sterylnych narzędzi pod mikroskopem stereoskopowym. Przed dniem zabiegu nożyczki do autoklawu, cienkie kleszcze, uchwyt na igłę i uchwyt na skalpel.
      1. Znieczulić kobietę roztworem ketaminy (50 mg/kg) i medetomidyny (0,5 mg/kg) dożylnie. Test na odruchy w celu potwierdzenia znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
      2. Wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie kwas tolefenamowy (2 mg/kg), winian butorfanolu (1 mg/kg) i enrofloksacynę (5-10 mg/kg), aby zapobiec odpowiednio stanowi zapaleniu, bólowi i infekcji.
      3. Nałóż smar maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Ogol sierść od grzbietu i wysterylizuj skórę peelingiem chirurgicznym, a następnie 70% alkoholem za pomocą sterylnych, nieprzywierających płatków. Pozostaw skórę do wyschnięcia.
      4. Wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie 100 μl 0,25% bupiwakainy (znieczulenie miejscowe) w miejscu nacięcia. Przenieś zwierzę w pozycji leżącej na czystą powierzchnię na poduszce grzewczej pod mikroskopem operacyjnym. Przykryj szczura sterylną serwetą z małym otworem wyciętym w dolnej części pleców.
      5. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 2 cm, równolegle do kręgosłupa lędźwiowego.
      6. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj nacięcie w ścianie brzucha. Chwyć poduszeczkę tłuszczową jajnika za pomocą kleszczy, wyciągnij jajnik i jajowód i umieść je na gazie zwilżonej 0,9% NaCl.
      7. Odessać podłoże M2, trzy pęcherzyki powietrza i zarodki do kapilary transferowej. Zalecana łączna liczba zarodków do transferu (jednostronnie lub obustronnie): ciężarna samica (≤ 15–16 zarodków), kobieta w ciąży rzekomej (≤ 30 zarodków).
      8. Wykonaj małe nacięcie w jajowodzie (między lejkiem a bańką) za pomocą mikronożyczek i włóż pipetę transferową do jajowodu.
      9. Delikatnie usunąć zarodki i pęcherzyki powietrza z pipety do jajowodu. kleszczami umieść układ rozrodczy z powrotem w jamie brzusznej.
      10. Zszyj ścianę brzucha szwami wchłanialnymi kwasu poliglikolowego i zamknij nacięcie skóry klipsami do ran. W zależności od liczby dostępnych zarodków powtórz tę procedurę dla drugiego jajowodu.
      11. Wstrzyknąć zwierzęciu dootrzewnowo atipamezol (0,5 mg/kg) w celu odwrócenia efektu znieczulenia.
      12. Przenieś zwierzę do czystej klatki i trzymaj je na płycie grzewczej, aby w pełni wyzdrowiało ze znieczulenia. Dostawa u szczurów następuje po ~21 dniach.
        UWAGA: Kiedy samce szczurów BN są używane do krycia, tylko białe szczenięta są potencjalnie transgeniczne; Brązowe szczenięta pochodzą z naturalnej ciąży.
      13. Pobrać fragmenty tkanek (najlepiej z ucha) do genotypu 3-tygodniowych szczeniąt.

3. Wazektomia

UWAGA: Przed dniem operacji nożyczki do autoklawu, kleszcze i uchwyt na igłę.

  1. Znieczulić 5-tygodniowego samca szczura SD podając dożylnie roztwór ketaminy (50 mg/kg) i medetomidyny (0,5 mg/kg). Przetestuj odruchy, aby potwierdzić znieczulenie przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
  2. Kwas tolfenamowy (2 mg/kg), winian butorfanolu (1 mg/kg) i enrofloksacyna (5-10 mg/kg) należy podawać podskórnie, aby zapobiec odpowiednio stanowi zapalnemu, bólowi i infekcji.
  3. Nałóż smar maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Umieść szczura na wznak na czystej powierzchni na poduszce grzewczej i wysterylizuj skórę jąder za pomocą peelingu chirurgicznego, a następnie 70% alkoholu za pomocą sterylnych, nieprzywierających podpasek. Pozostaw skórę do wyschnięcia. Przykryj szczura sterylną serwetą z małym otworem wyciętym nad jądrami. Delikatnie naciśnij brzuch, aby odsłonić jądra w worku mosznowym.
  4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie ~0,5 cm na środku worka mosznowego. Zlokalizuj ścianę linii środkowej (białawą linię) między jądrami.
  5. Wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w błonie jądra blisko lewej strony ściany linii środkowej.
  6. Ostrożnie popchnij jądro w lewo i zlokalizuj nasieniowód (między jądrem a linią środkową) jako biały przewód z pojedynczym naczyniem krwionośnym.
  7. Delikatnie wyciągnij nasieniowody z worka mosznowego za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich. Przytrzymaj nasieniowody jedną parą kleszczy i przetnij je cienkimi nożyczkami (lub przyżegaj rozgrzanymi do czerwoności końcówkami drugiej pary kleszczy). Usuń ~1 cm fragment kanału.
    UWAGA: Jeśli przeprowadzana jest kauteryzacja, przytrzymaj końcówkę drugiej pary kleszczy w płomieniu.
  8. Powtórz powyższą procedurę dla drugiego jądra. Zszyć skórę szwami wchłanialnymi przez kwas poliglikolowy i wstrzyknąć zwierzęciu dootrzewnowo atipamezol (0,5 mg/kg).
  9. Umieść szczura w czystej klatce na płycie grzewczej, aż zwierzę wyzdrowieje ze znieczulenia.
    UWAGA: Samce mogą być używane w kryciach testowych po ~2-tygodniowym okresie rekonwalescencji. Po potwierdzeniu bezpłodności można je zastosować do indukcji ciąży rzekomej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z opisanym w niniejszym dokumencie protokołem otrzymano wektory lentiwirusowe przenoszące konstrukt Syn-TDP-43-eGFP (fizyczny miano LV = 3,4 x 108/µL) a następnie można było je wykorzystać do iniekcji podstrefowych zarodków w stadium jednego komórki. Procedurze poddano wyłącznie zarodki z dwoma widocznymi jąderkami. Liczbę iniekcji zawiesin wirusowych określono doświadczalnie. Za wskaźniki niewystarczającej liczby cząstek wirusowych dla skutecznej transdukcji uznano wysoką wydajność implantacji przy je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Postępy w technologiach transgenicznych sprawiły, że modele gryzoni stały się nieocenionym narzędziem w badaniach biomedycznych. Dają one możliwość badania zależności genotyp-fenotyp in vivo. W tym miejscu przedstawiamy szeroko dostępną alternatywę dla konwencjonalnej transgenezy za pomocą iniekcji przedjądrowych. Zastosowanie lentiwirusowej transdukcji genów omija potrzebę wymagających mikroiniekcji, ponieważ wektory wirusowe mogą być wstrzykiwane pod osłonę przejrzystą. Takie podejście nie wpływa na integralność zarodk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor (W.K.) posiada prawa patentowe "Sposób wytwarzania zwierzęcia transgenicznego" wydane przez Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (nr P 355353; 21.03.2008).

Podziękowania

To badanie było wspierane przez projekt ANIMOD w ramach programu Team Tech Core Facility Plus Fundacji na rzecz Nauki Polskiej, współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego dla WK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
7500 Real Time PCR SystemApplied Biosystems
Aerrane (izofluran)BaxterFDG9623
Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigmaA5177-5EA
Atipam 5 mg/mlEurovet Animal Health BVN/A0,5 mg/kg
Baytril 25 mg/ml (enrofloksacyna)BayerN/A5-10 mg/kg
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z włóknem GC100TF-15Harvard Apparatus Limited30-0039kapilar iniekcyjne
Bupiwakaina 25 mg/mlAdvanz PharmaN/A0,25% in  0,9% NaCl
Butomidor 10 mg/ml (butorfanol  winian)Orion PharmaN/A1 mg/kg
CELLSTAR Naczynie do hodowli komórek tkankowych 35 mmGreiner Bio-One627160
CELLSTAR Naczynie do hodowli komórek tkankowych 60 mmGreiner Bio-One628160
CellTram OilEppendorf5176 000.025
Cepetor (Medetomidyna) 1 mg/mlcp-pharmaN/A0,5 mg/kg
Chorulon, ludzka gonadotropina kosmówkowa IntervetN/A150 IU / ml ml 0,9% NaCl
DMEM niska glukozaSigma AldrichD6048
DNaza, wolne od RNazA& A Biotechnology1009-100
EmbryoMax Filtrowany lekki olej mineralnySigmaES-005-C
Plazmid kodujący białko kopertowe dla wektorów lentiwirusowych (plazmid VSVg) ADDGENE14888
FemtoJetEppendorf4i /5252 000.013
Płodowa surowica bydlęcaSigma AldrichF9665-500ML
Folligon, klacz w ciąży s Gonadotropina w surowicy IntervetN/A125 j.m./ml w 9% komórkach NaCl
HEK 293T ATCCATCC CRL-3216
Hialuronidaza z jąder bydlęcych SigmaH4272-30MG0,5 mg/ml w średnim
mikroskopie odwróconym M2 ZeissAxiovert 200
Ketamina 100mg/mlBiowet PuławyN/A50 mg/kg
Parafina płynnaMerck Millipore8042-47-5
M16 medium EmbryoMaxSigmaMR-016-D
M2 mediumSigmaM7167
Chlorek magnezu 1MSigma Aldrich63069-100ML
MicroforgeNarishigeMF-900
Olej mineralnySigmaM8410-500ML
NaCl 0,9%POLPHARMA OTCN/Asterylne, ampułki 5ml
Mikroskop operacyjny Inami Ophthalmic InstrumentsDeca-21
System pakowania kodujący plazmid dla wektorów lentiwirusowych  (plazmid delta R8.2)ADDGENE12263
Odczynnik PEI (polietylenimina, Mw ~ 25 000,),Polysciences, Inc23966-1
Penicilin-streptomycynaSigma AldrichP0781-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowychSigma Aldrich806552-500ML
Puller Instrument Sutter Co.P-97
Reflex Clip Applier/Reflex ClipsWorld Precision Instruments500345/500346
Safil, kwas poliglikolowy, pleciony, powlekany, nici wchłanialneB.Braun Chirurgicznymikroskop
OlympusSZX16
Nici chirurgiczne do szyciaB.Braun 
SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystem4334973
Tolfedine 4% (kwas tolfenamowy)VetoquinolN/A2 mg/kg
TransferMan NK2EppendorfN/A
Trypsyna EDTA roztwórSigma AldrichT3924-500ML
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-100 XP 
VacuTipEppendorf5175108.000uchwyty kapilarne
Vita-POSUrsapharmN/Amaść do oczu
Płyta grzewczaSemicN/A
Kleszcze zegarmistrzowskieVWR470018-868
stereoskopowy 1048029 C1048040

Bibliografia

  1. Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
  2. Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, 51-71 (1963).
  3. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  4. Gill, T. J., Smith, G. J., Wissler, R. W., Kunz, H. W. The Rat as an Experimental Animal. Science. 245 (4915), 269-276 (1989).
  5. Aitman, T. J., et al. Progress and prospects in rat genetics: a community view. Nature Genetics. 40 (5), 516-522 (2008).
  6. Hammer, R. E., Maika, S. D., Richardson, J. A., Tang, J. P., Taurog, J. D. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell. 63 (5), 1099-1112 (1990).
  7. Mullins, J. J., Peters, J., Ganten, D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene. Nature. 344 (6266), 541-544 (1990).
  8. Menoret, S., Remy, S., Usal, C., Tesson, L., Anegon, I. Generation of Transgenic Rats by Microinjection of Short DNA Fragments. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 81-92 (2010).
  9. Tesson, L., et al. Transgenic modifications of the rat genome. Transgenic Research. 14 (5), 531-546 (2005).
  10. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: Technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  11. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  12. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  13. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2140-2145 (2002).
  14. Koza, P., et al. Neuronal TDP-43 depletion affects activity-dependent plasticity. Neurobiology of Disease. 130, 104499(2019).
  15. Scherr, M., Battmer, K., Blomer, U., Ganser, A., Grez, M. Quantitative determination of lentiviral vector particle numbers by real-time PCR. Biotechniques. 31 (3), 520(2001).
  16. Canseco, R. S., et al. Gene transfer efficiency during gestation and the influence of co-transfer of non-manipulated embryos on production of transgenic mice. Transgenic Research. 3 (1), 20-25 (1994).
  17. Charreau, B., Tesson, L., Soulillou, J. P., Pourcel, C., Anegon, I. Transgenesis in rats: technical aspects and models. Transgenic Research. 5 (4), 223-234 (1996).
  18. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  19. Armstrong, D. T., Opavsky, M. A. Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biology of Reproduction. 39 (3), 511-518 (1988).
  20. Popova, E., Krivokharchenko, A., Ganten, D., Bader, M. Comparison between PMSG- and FSH-induced superovulation for the generation of transgenic rats. Molecular Reproduction and Development. 63 (2), 177-182 (2002).
  21. Johnson, L. W., Moffatt, R. J., Bartol, F. F., Pinkert, C. A. Optimization of embryo transfer protocols for mice. Theriogenology. 46 (7), 1267-1276 (1996).
  22. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  23. Remy, S., et al. The Use of Lentiviral Vectors to Obtain Transgenic Rats. Rat Genomics: Methods and Protocols. 597, 109-125 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroiniekcja zarodk wb ona przejrzystaprzestrze periwitellinowamatki zast pczepoziom biosafety 2ilo ciowa PCRTDP 43 eGFPtransfer zarodk w
Wytwarzanie transgenicznych szczurów przy użyciu podejścia wektora lentiwirusowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.