Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60584

⸱

22 stycznia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikrowaga kryształu kwarcu może zapewnić dokładne właściwości masy i lepkosprężystości dla folii w zakresie mikronów lub submikronów, co jest istotne dla badań w zakresie czujników biomedycznych i środowiskowych, powłok i nauki o polimerach. Grubość próbki ma wpływ na to, jakie informacje można uzyskać z materiału mającego kontakt z czujnikiem.

Streszczenie

W tym badaniu prezentujemy różne przykłady tego, jak przygotowanie cienkiej warstwy do eksperymentów z mikrowagą kryształu kwarcu wpływa na odpowiednie modelowanie danych i określa, które właściwości folii można określić ilościowo. Mikrowaga kwarcowa stanowi wyjątkowo czułą platformę do pomiaru drobnych zmian masy i/lub właściwości mechanicznych nałożonej folii poprzez obserwację zmian rezonansu mechanicznego kryształu kwarcu oscylującego z wysoką częstotliwością. Do zalet tego podejścia należy jego wszechstronność eksperymentalna, możliwość badania zmian właściwości w szerokim zakresie czasu eksperymentu oraz wykorzystanie małych rozmiarów prób. Pokazujemy, że na podstawie grubości i modułu ścinania warstwy osadzonej na czujniku możemy uzyskać różne informacje z materiału. W tym przypadku koncepcja ta jest specjalnie wykorzystywana do wyświetlania parametrów eksperymentalnych skutkujących obliczeniami masy i lepkosprężystości zaadsorbowanego kolagenu na kompleksach złota i polielektrolitu podczas pęcznienia w funkcji stężenia soli.

Wprowadzenie

Mikrowaga kwarcowa (QCM) wykorzystuje efekt piezoelektryczny kryształu kwarcowego do monitorowania jego częstotliwości rezonansowej, która zależy od masy przyczepionej do powierzchni. Technika ta polega na porównaniu częstotliwości rezonansowej i szerokości pasma czujnika z kryształu kwarcowego o cięciu AT (zazwyczaj w zakresie 5 MHz)1 w powietrzu lub cieczy z częstotliwością i szerokością pasma czujnika po osadzeniu filmu. Wykorzystanie QCM do badania właściwości cienkich warstw i powierzchni styku niesie ze sobą szereg zalet, w tym wysoką czułość na masę oraz potencjalnie na zmiany właściwości wiskoelastycznych (w zależności od jednorodności i grubości próbki), możliwość prowadzenia badań in situ2 oraz zdolność do badania znacznie krótszych skal czasowych reologicznych niż w przypadku tradycyjnej reologii ścinania lub dynamicznej analizy mechanicznej (DMA). Analiza krótkiej skali czasowej reologicznej pozwala obserwować, jak odpowiedź w tej skali zmienia się zarówno w ekstremalnie krótkim (ms)3, jak i długim (lata) czasie4. Możliwość ta jest korzystna przy badaniu różnorodnych procesów kinetycznych i stanowi również przydatne rozszerzenie tradycyjnych technik reometrycznych5,6.

Wysoka czułość QCM doprowadziła również do jego szerokiego zastosowania w aplikacjach biologicznych służących do badania fundamentalnych oddziaływań niezwykle małych biomolekuł. Niepowlekana lub funkcjonalizowana powierzchnia czujnika może być wykorzystana do badania adsorpcji białek; ponadto, dzięki zmianom masy, można badać biosensing w kontekście złożonych zdarzeń wiązania między enzymami, przeciwciałami a aptamerami7,8,9. Na przykład technika ta została użyta do zrozumienia procesu przekształcania pęcherzyków w płaską dwuwarstwę lipidową jako dwufazowego procesu adsorpcji pęcherzyków zawierających ciecz do sztywnej struktury poprzez obserwację korelujących zmian częstotliwości i lepkosprężystości10. W ostatnich latach QCM stał się ponadto solidną platformą do monitorowania dostarczania leków za pomocą pęcherzyków lub nanocząstek1. Na styku inżynierii materiałowej oraz biologii molekularnej i komórkowej możemy wykorzystać QCM do wyjaśnienia kluczowych oddziaływań między materiałami a komponentami bioaktywnymi, takimi jak białka, kwasy nukleinowe, liposomy i komórki. Przykładowo, adsorpcja białek do biomateriału pośredniczy w późniejszych odpowiedziach komórkowych, takich jak stan zapalny, i jest często stosowana jako pozytywny wskaźnik biokompatybilności, podczas gdy w innych przypadkach przyleganie białek pozakomórkowych do powłok mających kontakt z krwią może indukować niebezpieczne krzepnięcie w naczyniach12,13. QCM może zatem służyć jako narzędzie do wyboru kandydatów optymalnych dla różnych potrzeb.

Dwie powszechne metody przeprowadzania eksperymentów QCM pozwalają na gromadzenie analogicznych danych: pierwsza metoda rejestruje przesunięcie częstotliwości oraz połowę szerokości pasma (Γ) piku przewodzenia. Druga metoda, QCM z pomiarem dyssypacji (QCM-D), rejestruje przesunięcie częstotliwości oraz czynnik dyssypacji, który jest bezpośrednio proporcjonalny do Γ zgodnie z równaniem 1,14

Wzór matematyczny \( D_n = \frac{2\Gamma_n}{f_n} \) dla analizy dynamicznej, przedstawienie równania. (1)

gdzie D to czynnik strat, a ƒ to częstotliwość. Zarówno D, jak i Γ są powiązane z efektem tłumienia, jaki film wywiera na sensor, co daje wskazówkę co do sztywności filmu. Indeks n oznacza harmoniczną lub alikwot częstotliwości, która jest nieparzystą częstotliwością rezonansową sensora kwarcowego (n = 1, 3, 5, 7…). Dalszą dyskusję na temat modeli wykorzystujących wiele harmonicznych do wyznaczania masy i właściwości wiskoelastycznych filmu można znaleźć w przeglądzie autorstwa Johannsmanna14 oraz w poprzednich pracach grupy Shulla15,16,17,18.

Kluczową kwestią przy przygotowywaniu próbek do QCM jest sposób naniesienia cienkiej warstwy na powierzchnię sensora. Do najczęstszych metod należą spin coating, dip coating, drop coating lub adsorpcja filmu na powierzchni sensora w trakcie eksperymentu19,20. Wyróżnia się cztery obszary dla próbek QCM: granicę Sauerbreya, reżim wiskoelastyczny, reżim objętościowy (bulk) oraz reżim nadkrytycznego tłumienia (overdamped). W przypadku warstw dostatecznie cienkich obowiązuje granica Sauerbreya, w której przesunięcie częstotliwości (Δƒ) pozwala wyznaczyć gęstość powierzchniową masy filmu. W obrębie granicy Sauerbreya przesunięcie częstotliwości skaluje się liniowo z harmoniczną rezonansową, n, a zmiany współczynnika tłumienia (D lub Γ) są zazwyczaj niewielkie. W tym reżimie dostępne informacje są niewystarczające do jednoznacznego określenia właściwości reologicznych warstwy bez przyjęcia dodatkowych założeń. Dane z tego zakresu są wykorzystywane do obliczenia gęstości powierzchniowej masy (lub grubości, jeśli gęstość jest znana a priori) filmu. W reżimie objętościowym, gdy medium w kontakcie z kryształem jest dostatecznie grube, ewanescentna fala ścinania propaguje się w medium przed całkowitym wytłumieniem. W tym przypadku nie można uzyskać informacji o masie za pomocą Δƒ. Jednak w tym obszarze właściwości wiskoelastyczne są wiarygodnie wyznaczane przy użyciu kombinacji Δƒ i ΔΓ 15,18. W reżimie objętościowym, jeśli medium jest zbyt sztywne, film wytłumi rezonans sensora, co uniemożliwi zebranie jakichkolwiek wiarygodnych danych z QCM. Reżim wiskoelastyczny jest obszarem pośrednim, w którym film jest na tyle cienki, aby fala ścinania mogła w pełni przez niego propagować, a wartości współczynnika tłumienia były wiarygodne. Współczynnik tłumienia oraz Δƒ mogą być wówczas wykorzystane do określenia właściwości wiskoelastycznych filmu, a także jego masy. Tutaj właściwości wiskoelastyczne są opisane przez produkt gęstości i modułu kompleksowego ścinania |G*|p oraz kąt fazowy określony jako Φ = arctan(G" / G'). Gdy filmy są przygotowane w granicy Sauerbreya, masę na jednostkę powierzchni można obliczyć bezpośrednio na podstawie poniższego równania Sauerbreya21,

Wzór matematyczny na zmianę częstotliwości; stosowany w detekcji masy i analizie rezonansowej. (2)

gdzie Δƒn oznacza zmianę częstotliwości rezonansowej, n to interesująca nas harmoniczna, ƒ1 jest częstotliwością rezonansową czujnika, Δm / A to masa filmu na jednostkę powierzchni, a Zq to impedancja akustyczna kwarcu, która dla kwarcu ciętego w kierunku AT wynosi Zq = 8.84 x 106 kg / m2s. Reżim wiskoelastyczny jest najodpowiedniejszy do badania filmów polimerowych, natomiast granica objętościowa jest użyteczna przy badaniu lepkich roztworów polimerów2 lub białek16. Różne reżimy zależą od właściwości badanego materiału, przy czym optymalna grubość dla pełnej charakterystyki wiskoelastycznej i masowej zazwyczaj rośnie wraz ze sztywnością filmu. Rysunek 1 opisuje cztery obszary w odniesieniu do gęstości powierzchniowej filmu, zespolonego modułu ścinania oraz kąta fazowego, przyjmując określoną zależność między kątem fazowym a sztywnością filmu, która okazała się istotna dla materiałów tego typu. Wiele filmów o znaczeniu praktycznym jest zbyt grubych do badania właściwości wiskoelastycznych za pomocą QCM, jak np. niektóre biofilmy, których grubość rzędu od dziesięciu do setek mikrometrów23. Tak grube filmy są zazwyczaj nieodpowiednie do badania za pomocą QCM, lecz mogą być mierzone przy użyciu rezonatorów o znacznie niższej częstotliwości (takich jak rezonatory skrętne)23, co pozwala fali ścinającej propagować się głębiej w głąb filmu.

Aby określić, który reżim jest właściwy dla danej próbki QCM, ważne jest zrozumienie parametru d / λn, który stanowi stosunek grubości filmu (d) do długości fali ścinającej mechanicznych oscylacji czujnika z kryształu kwarcu (λn)15,16,18. Idealny reżim wiskoelastyczny to d / λn = 0,05 - 0,218, gdzie wartości poniżej 0,05 mieszczą się w granicy Sauerbreya, a wartości powyżej 0,2 zbliżają się do reżimu objętościowego. Bardziej szczegółowy opis parametru d / λn przedstawiono w innym miejscu15,18, jednak jest to parametr ilościowy wyznaczający granicę Sauerbreya oraz granicę wiskoelastyczną. Programy analityczne wykorzystane poniżej dostarczają ten parametr bezpośrednio.

Istnieją pewne dodatkowe ograniczenia w analizie cienkich warstw za pomocą QCM. Obliczenia Sauerbreya i obliczenia wiskoelastyczne zakładają, że warstwa jest jednorodna zarówno w całej swojej grubości, jak i lateralnie w obrębie powierzchni elektrody QCM. Chociaż to założenie utrudnia badanie warstw zawierających pustki lub wypełniacze, przeprowadzono niektóre badania QCM nad warstwami składającymi się z przeszczepionych nanocząstek6. Jeśli heterogeniczności są małe w porównaniu do całkowitej grubości warstwy, nadal można uzyskać wiarygodne właściwości wiskoelastyczne systemu kompozytowego. W przypadku systemów bardziej heterogenicznych wartości uzyskane z analizy wiskoelastycznej należy zawsze traktować z dużą ostrożnością. Idealnie byłoby, gdyby wyniki uzyskane z systemów o nieznanej heterogeniczności zostały zwalidowane w odniesieniu do systemów, o których wiadomo, że są jednorodne. Takie podejście zastosowaliśmy w przykładzie systemu opisanego w niniejszej pracy.

Ważnym punktem, który ilustrujemy w niniejszej pracy, jest dokładna odpowiedniość między pomiarami QCM wykonanymi w dziedzinie częstotliwości (gdzie raportowane jest Γ) a eksperymentami w dziedzinie czasu (gdzie raportowane jest D). Opisano wyniki z dwóch różnych eksperymentów QCM, jednego w dziedzinie czasu i jednego w dziedzinie częstotliwości, z których każdy obejmuje inny, lecz koncepcyjnie powiązany system modelowy. Pierwszy system to prosty przykład przyłączania kolagenu do sensora, służący do zilustrowania reprezentatywnej kinetyki wiązania i równowagi adsorpcji w czasie podczas pomiaru w dziedzinie czasu (QCM-D). Kolagen jest najliczniejszym białkiem w organizmie, znanym z wszechstronności zachowań wiązania i morfologii. Roztwór kolagenu użyty w tym przypadku nie wymaga dodatkowej funkcjonalizacji złotej powierzchni sensora w celu wywołania adsorpcji9. Drugim systemem eksperymentalnym jest kompleks polielektrolitowy (PEC) składający się z anionowego polistyrenosulfonianu (PSS) i kationowego poli(diallyldimethylammonium) (PDADMA), przygotowany w taki sam sposób jak przez Sadmana i współpracowników2. Materiały te pęcznieją i stają się miękkie w roztworach soli (w tym przypadku KBr), stanowiąc prostą platformę do badania mechaniki polimerów przy użyciu podejścia w dziedzinie częstotliwości (QCM-Z). Dla każdego protokołu proces przygotowania, wykonania i analizy pomiaru przedstawiono na Rysunku 2. Schemat pokazuje, że główna różnica między podejściami QCM-Z i QCM-D polega na etapie zbierania danych oraz instrumentacji użytej w eksperymencie. Wszystkie wspomniane techniki przygotowania próbek są kompatybilne z obiema metodami, a każde z podejść pozwala na analizę próbek w trzech obszarach przedstawionych na Rysunku 1.

Nasze dane wykazują, że przygotowanie próbek, niezależnie od tego, czy powlekanie czujnika odbywa się przed pomiarem, czy w jego trakcie, determinuje możliwość wyznaczenia właściwości wiskoelastycznych układu. Dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu początkowych etapów eksperymentu możemy określić, jakie informacje jesteśmy w stanie precyzyjnie zebrać podczas etapu analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Adsorpcja kolagenu metodą QCM-D

1. Przygotowanie próbki i wstępne czyszczenie czujnika

  1. Przygotować 20 mL 0,1 M buforu octanowego, dostosowując pH za pomocą HCl i NaOH w razie potrzeby, aby uzyskać pH = 5,6.
  2. W warunkach sterylnych dodać do 20 mL buforu octanowego roztwór kolagenu z ogona szczura do końcowego stężenia 10 µg/mL.
  3. Oczyścić pozłacany czujnik kwarcowy w celu usunięcia materiałów organicznych i biologicznych25,26.
    1. Umieścić czujnik stroną aktywną do góry w komorze UV/Ozon i poddać powierzchnię działaniu przez około 10 min.
    2. Podgrzać mieszaninę wody dejonizowanej (dH2O), amoniaku (25%) i nadtlenku wodoru (30%) w proporcji 5:1:1 do 75 °C. Umieścić czujnik w roztworze na 5 min.
    3. Przepłukać czujnik dH2O i osuszyć strumieniem azotu.
    4. Umieścić czujnik stroną aktywną do góry w komorze UV/Ozon i poddać powierzchnię działaniu przez 10 min.
      UWAGA: Procedura czyszczenia powinna zostać przeprowadzona bezpośrednio przed pomiarem, aby zminimalizować zanieczyszczenia środowiskowe na powierzchni czujnika.

2. Pozyskiwanie danych pomiarowych QCM-D

  1. Włącz cały niezbędny sprzęt do przeprowadzenia pomiaru, w tym pompę, jednostkę elektroniczną oraz oprogramowanie komputerowe.
  2. Zdejmij moduł przepływowy z platformy komory i odkręć duże śruby motylkowe, aby otworzyć moduł.
  3. Jeśli czujnik pozostał poza urządzeniem po wstępnym czyszczeniu (kroki 1.3.1-1.3.4), przepłucz go wodą dejonizowaną (dH2O) i osusz strumieniem azotu, aby upewnić się, że na powierzchni nie ma zanieczyszczeń.
  4. Zamontuj czujnik w module przepływowym na odsłoniętym pierścieniu O-ring, uprzednio osuszając ten obszar strumieniem azotu i sprawdzając, czy pierścień O-ring przylega płasko. Czujnik należy umieścić stroną aktywnej powierzchni do dołu, a elektrodę w kształcie kotwicy skierować w stronę znacznika w module przepływowym.
  5. Dokręć śruby motylkowe, aby uszczelnić moduł przepływowy, a następnie umieść go z powrotem na platformie komory. Podłącz niezbędne przewody PTFE pompy do modułu przepływowego i zewnętrznej pompy.
  6. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania komputerowego ustaw temperaturę modułu przepływowego na 37 °C. Monitoruj zmianę temperatury przez 10-15 min, aby upewnić się, że ustabilizowała się ona na żądanej wartości.
  7. Wyznacz początkowe częstotliwości rezonansowe czujnika. Jeśli oprogramowanie nie wykryje niektórych częstotliwości rezonansowych, sprawdź, czy moduł przepływowy jest prawidłowo umieszczony na platformie komory lub zamontuj ponownie czujnik w module przepływowym, aby upewnić się, że jest on wycentrowany i zapewnia prawidłowy kontakt elektryczny.
  8. Umieść wlotowy przewód pompy w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Uruchom przepływ z zewnętrznej pompy z prędkością 25 µL/min i wizualnie sprawdź przewody, aby upewnić się, że ciecz przepływa przez rurkę.
    UWAGA: Przepływ cieczy może być łatwiejszy do zaobserwowania po chwilowym zwiększeniu szybkości przepływu do 10 µL/min lub więcej. Jeśli ciecz nie przemieszcza się przez rurkę, najprawdopodobniej dwie części modułu przepływowego nie tworzą szczelnego połączenia. Spróbuj dokręcić śruby motylkowe, uszczelnić złącza przewodów do wlotu i wylotu lub zamontować ponownie czujnik, aby upewnić się, że pierścień O-ring jest płaski i wycentrowany.
  9. Pozostaw ciecz 1x PBS w przepływie przez moduł przez co najmniej 15 min w celu prawidłowej ekwilibracji.
  10. Uruchom pomiar w oprogramowaniu komputerowym, aby rozpocząć akwizycję danych. Monitoruj wartości częstotliwości i dyssypacji przez co najmniej 5 min, aby zapewnić stabilną linię bazową.
  11. Zatrzymaj pompę, przenieś wlotowy przewód do roztworu buforu kolagenowo-acetatowego i wznowij przepływ cieczy. Zanotuj czas tego zdarzenia do późniejszej analizy.
  12. Pozostaw nowe wartości częstotliwości i dyssypacji do czasu ustabilizowania się. W tym przypadku oczekuje się, że stabilizacja ta nastąpi po 8-12 h.
  13. Zatrzymaj pompę, przenieś wlotowy przewód z powrotem do roztworu 1x PBS i wznowij przepływ cieczy. Zanotuj czas tego zdarzenia do późniejszej analizy.
  14. Pozostaw nowe wartości częstotliwości i dyssypacji do czasu ustabilizowania się. W tym przypadku stabilizacja następuje po 30 min.
    UWAGA: Kroki 2.13 i 2.14 można powtarzać dla każdego nowego okresu przepływu cieczy w bardziej rygorystycznych eksperymentach z większą liczbą etapów.
  15. Zakończ akwizycję danych pomiarowych i zapisz dane.
  16. Oczyść i zdemontuj sprzęt QCM.
    1. Zwiększ szybkość przepływu cieczy z zewnętrznej pompy do 50 µL/min lub więcej i umieść wlotowy przewód w 2% roztworze czyszczącym Hellmanex na co najmniej 20 min.
      UWAGA: W przypadku innych eksperymentów, jeśli planowana jest dalsza analiza czujnika, należy go wyjąć przed krokiem 2.16.1 i umieścić w module inny czujnik do czyszczenia.
    2. Zatrzymaj pompę, przenieś wlotowy przewód do dH2O i wznowij przepływ cieczy, aby dalej płukać system przez co najmniej 20 min.
    3. Zatrzymaj przepływ cieczy i wyjmij czujnik z modułu przepływowego. Osusz czujnik oraz wnętrze modułu przepływowego strumieniem azotu. Wyłącz oprogramowanie komputerowe, jednostkę elektroniczną oraz pompę perystaltyczną.
      UWAGA: Czujniki powlekane złotem można odpowiednio oczyścić, zgodnie ze szczegółami w krokach 1.3.1-1.3.4, i ponownie wykorzystać do kilku pomiarów. Wskazówkami sugerującymi, że czujnik nie nadaje się już do wiarygodnych pomiarów, mogą być m.in. duża zmienność początkowych częstotliwości rezonansowych oraz znaczne dryfowanie pomiarów linii bazowej podczas przepływu buforu. Dane można otwierać i analizować w preferowanym oprogramowaniu, w tym w programach dostarczanych przez firmy specjalizujące się w sprzęcie QCM-D.

Pęcznienie kompleksu polielektrolitowego w technice QCM

3. Przygotowanie próbek

UWAGA: Ten eksperyment został przeprowadzony przy użyciu programu MATLAB opracowanego w grupie badawczej Shull do zbierania i analizy danych.

  1. Najpierw umieść goły czujnik z kryształu kwarcu w uchwycie na próbkę podłączonym do wektorowego analizatora sieci i komputera. Włącz analizator, aby przyłożyć do czujnika napięcie oscylujące, a następnie zarejestruj referencyjne widmo przewodności czujnika w powietrzu.
  2. Zanurz uchwyt na próbkę w bezkrawędziowym zlewce o pojemności 10 mL wypełnionej wodą destylowaną i zarejestruj referencyjne widmo przewodności gołego czujnika w wodzie.
  3. Przygotuj 0,5 M roztwór bromku potasu (KBr).
    1. Rozpuść 1,79 g KBr w 30 mL wody destylowanej. Wstrząsaj do czasu całkowitego rozpuszczenia.
    2. Włóż mały wafel krzemowy do roztworu KBr pod kątem, aby stworzyć podpórkę dla czujnika kwarcowego podczas etapu wygrzewania, co zapobiegnie odrywaniu się filmu od czujnika.
  4. Przygotuj czujnik do nanoszenia metodą spin-coatingu.
    1. Ustaw parametry spin-coatingu na 10 0 rpm, przyspieszenie 8 00 i czas 5 s.
    2. Umieść czujnik w urządzeniu do spin-coatingu i włącz próżnię.
    3. Pokryj powierzchnię czujnika etanolem i uruchom urządzenie, aby oczyścić powierzchnię czujnika.
    4. Nanieś PEC (PSS:PDADMA przygotowany w ten sam sposób, jak szczegółowo opisano w Sadman et al.2) na powierzchnię czujnika.
      1. Jeśli kompleks jest dwufazowy (faza bogata w polimer i faza uboga w polimer), powoli wprowadź pipetę do roztworu. Odpowietrz pipetę, wypuszczając pęcherzyki powietrza, przesuwając ją jednocześnie do gęstszej fazy bogatej w polimer.
      2. Po wypuszczeniu kilku pęcherzyków w fazie bogatej w polimer, pobierz do pipety 0,5-0,75 mL roztworu bogatego w polimer. Utrzymując nacisk na gruszkę pipety, aby zapobiec przedostaniu się fazy ubogiej w polimer do wnętrza, wyjmij pipetę z roztworu.
      3. Wytrzyj zewnętrzną część pipety ręcznikiem Kimwipe. Dodawaj roztwór kroplami na powierzchnię czujnika kwarcowego, aż zostanie ona całkowicie pokryta. Upewnij się, że w roztworze na powierzchni czujnika nie ma widocznych pęcherzyków powietrza.
  5. Wykonaj spin-coating próbki PEC i natychmiast zanurz czujnik w 0,5 M roztworze KBr, aby zapobiec krystalizacji soli na filmie.
    UWAGA: Ten krok jest czasami trudny do skoordynowania. Dla uzyskania najlepszych rezultatów zwolnij czujnik tuż nad roztworem KBr.
  6. Pozostaw film do wygrzewania przez co najmniej 12 h.
    UWAGA: Dla ułatwienia przeprowadzenia eksperymentu, wykonaj krok 4 wieczorem i pozostaw film do wygrzewania przez całą noc.

4. Pomiar filmu w powietrzu i wodzie

  1. Przenieś czujnik do zlewki wypełnionej wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar KBr z warstwy oraz z tylnej strony czujnika. Pozostaw czujnik w roztworze na 30-60 min.
  2. Wykonaj pomiar warstwy w powietrzu. Odnieś wynik do gołego czujnika w powietrzu. Pozwól danym z pomiaru warstwy ustabilizować się.
  3. Włóż wysuszony siarczan wapnia do zlewki bez dzierswia o pojemności 10 mL i zmierz grubość całkowicie suchej warstwy. Usuń siarczan wapnia ze zlewki i wypłucz ją wodą destylowaną.
  4. Napełnij zlewkę bez dzierswia o pojemności 10 mL 30 mL wody destylowanej. Włóż mieszadło magnetyczne, aby zapewnić cyrkulację wody wokół warstwy. Mierz warstwę w wodzie przez około 30-45 min lub do momentu ustabilizowania się danych. Odnieś wynik do gołego czujnika w wodzie.
  5. Przygotuj 15 mL roztworu 3 M KBr w wodzie destylowanej. Odmierz 5,35 g KBr do cylindra miarowego i dopełnij wodą destylowaną do 15 mL. Mieszaj okrężnymi ruchami do całkowitego rozpuszczenia.
  6. Dodawaj roztwór KBr do zlewki z wodą destylowaną w przyrostach 0,1 M. Tabela 1 przedstawia przyrosty 0,1 M w mL roztworu 3 M KBr. Skieruj warstwę w stronę przeciwną do miejsca, w którym roztwór KBr jest dodawany do wody, aby zapobiec rozpuszczaniu się warstwy. Upewnij się, że układ osiągnął stan równowagi przed kolejnym dodaniem roztworu KBr.
  7. Po zebraniu wszystkich danych wyjmij warstwę z uchwytu i umieść ją w zlewce z wodą destylowaną. Pozostaw do wypłukania soli z warstwy (30-60 min), a następnie wysusz warstwę na powietrzu.
  8. Aby usunąć warstwę PEC z czujnika, dodaj KBr do zlewki i delikatnie zamieszaj roztwór. Pozostaw na 5-10 min. Powtórz ten proces 2-3 razy, a następnie wypłucz czujnik wodą destylowaną.
    UWAGA: Czujnik można wyczyścić i użyć ponownie, jeśli jego odpowiedź jest nadal prawidłowa. Można to sprawdzić, mierząc małą absolutną szerokość pasma dla interesujących harmonicznych (<10 Hz).

5. Analiza danych

  1. Otwórz interfejs graficzny (GUI) programu MATLAB do analizy danych QCM-D stworzony przez Sadmana (https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI)27Otwórz plik danych powietrznych filmu, wybierając opcję „Load QCM”.
    UWAGA: Grupa Shull opracowała podobny interfejs graficzny (GUI) w języku Python do zbierania i analizy danych dla QCM (https://github.com/shullgroup/rheoQCM). Część kodu analitycznego służącego zarówno do analizy danych, jak i do generowania rycin w niniejszej pracy została udostępniona w informacjach uzupełniających.
  2. Wybierz żądane obliczenie (albo 3,5,3 lub 3,5,5), gamma, i film w powietrzu ikony. Kliknij Wykres QCM.
  3. Wyznacz grubość suchej warstwy, korzystając z najbardziej zrównoważonego punktu pomiarowego (zazwyczaj ostatniego punktu danych) z eksperymentu. Zapisz tę wartość.
  4. Otwórz plik danych „film in water”. Wybierz te same parametry co w kroku 5.2, z wyjątkiem wybrania opcji „film in water” zamiast „film in air”.
  5. Po każdym etapie równoważenia w eksperymencie pęcznienia należy wyznaczyć grubość filmu, zespolony moduł ścinania oraz wiskoelastyczny kąt przesunięcia fazowego. Wartości te należy zapisać wraz z siłą jonową (w zakresie od 0 do 1 M, w przyrostach 0,1 M).
  6. Wyznacz procent pęcznienia jako
    wzór na stopień pęcznienia, schemat, przedstawia obliczenia pęcznienia polimeru z wykorzystaniem porównania gęstości (3)
    gdzie dp czy grubość filmu z roztworu i dpsuchy jest grubością suchej warstwy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zmiany częstotliwości w czasie podczas adsorpcji białek wykazują charakterystyczną krzywą i plateau przedstawione na Rysunku 3A-B. Wstępne płukanie buforem 1x PBS na odsłoniętej powierzchni sensora wywołuje jedynie pomijalne zmiany częstotliwości, zapewniając stabilną linię bazową służącą jako punkt odniesienia dla przyszłych pomiarów. Wprowadzenie roztworu kolagenu inicjuje adsorpcję białek, co objawia się stałym spadkiem częstotliwości w czasie, aż gęstość przywartego kola...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyniki adsorpcji kolagenu obejmują zakresy reżimu Sauerbreya oraz reżimu wiskoelastycznego. Po wykreśleniu przesunięć częstotliwości znormalizowanych względem odpowiedniego numeru harmonicznej obserwujemy, że granica Sauerbreya jest zachowana przez około pierwsze 2 h pomiaru. Jednak wraz ze wzrostem masy przylegającej do sensora, znormalizowane przesunięcia częstotliwości dla trzeciej i piątej harmonicznej zaczynają od siebie odbiegać (t > 2 h), co wskazuje na możliwość określenia właściwości wiskoelastycznyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. i E.S. potwierdzają wsparcie ze strony NSF (DMR-1751308).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma-AldrichA6283Do adsorpcji kolagenu
Roztwór wodorotlenku amonuSigma-Aldrich221228Do adsorpcji kolagenu
Wodna sonda QCMAWSensorsCLS 00050 ADo pęcznienia polielektrolitu
Kolagen I Białko szczurze, ogonThermo Fisher ScientificA1048301Do adsorpcji kolagenu
Woda destylowanaSigma-AldrichEM3234Do pęcznienia polielektrolitu; ogólnie łatwe do zdobycia w laboratoriach badawczych, ale istnieje numer katalogowy na wypadek, gdyby nie był dostępny
EtanolSigma-Aldrich793175-1GA-PBDo pęcznienia polielektrolitu
Gibco Fosforan buforowany solą fizjologicznąThermo Fisher Scientific20012-027Do adsorpcji kolagenu
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Do adsorpcji kolagenu
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich216763Do adsorpcji kolagenu
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań, 1-warstwoweFisher Scientific06-666ADo pęcznienia polielektrolitu
NP2K VNAInstrumentyDo pęcznienia polielektrolitu
Chlorek poli(diallilodimetyloamoniowy), MW 200 000Sigma-Aldrich409022Dla pęcznienia polielektrolitu; dla pełnej procedury syntezy patrz Sadman i wsp.
Sól sodowa poli(styrenosulfonianu) 30% masy w wodzieSigma-Aldrich561967-500GDo pęcznienia polielektrolitu; pełna procedura syntezy patrz Sadman i wsp.
Bromek potasuSigma-Aldrich793604-1KGDo pęcznienia polielektrolitu
QSense QCM Explorer SystemBiolin ScientificDo adsorpcji kolagenu
Octan sodu, bezwodnySigma-AldrichS2889Do adsorpcji kolagenu
Powlekarka wirowa, model WS-650MZ-23NPPTechnologieDo pęcznienia polielektrolitu
Makarowa laurowe

Bibliografia

  1. Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution - Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
  2. Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
  3. Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
  4. Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
  5. Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
  6. Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
  7. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  8. Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
  9. Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
  10. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  11. Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
  12. Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
  13. Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
  14. Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
  15. Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
  16. Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
  17. Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists' paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
  18. Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
  19. Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
  20. Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
  21. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  22. Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
  23. Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
  24. Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2017).
  25. Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , Stockholm, Sweden. (2015).
  26. Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887(1990).
  27. Sadman, K. sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie filmuanaliza wiskoelastycznaadsorpcja kolagenukompleks polielektrolitowydyssypacja cz stotliwo ciowagrubo pr bkiw a ciwo ci mechaniczne
Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.