Artykuł metodologiczny

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

DOI:

10.3791/60588

⸱

14 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of the Blood Brain Barrier, University of Artois, 2Department of Neurology, Universitätsmedizin Mannheim, Heidelberg University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach perycyty mózgowe stały się przedmiotem szeroko zakrojonych badań w dziedzinie biologii naczyniowej i patologii. Znaczenie perycytów w tworzeniu bariery krew-mózg i fizjologii jest obecnie wykazane, ale jej podstawy molekularne pozostają w dużej mierze nieznane. Ponieważ patofizjologiczna rola perycytów mózgowych w zaburzeniach neurologicznych jest intrygująca i ma ogromne znaczenie, modele in vitro są nie tylko wystarczająco odpowiednie, ale także mogą włączyć różne techniki do tych badań. Zaproponowano kilka metod ekstrakcji perycytów mózgowych jako modeli in vitro, chociaż pożądany jest protokół wolny od antybiotyków o wysokiej wydajności. Co najważniejsze, metoda, która ma zwiększoną wydajność na ekstrakcję, zmniejsza wykorzystanie większej liczby zwierząt.

Tutaj proponujemy prostą i efektywną metodę ekstrakcji perycytów mózgowych o wystarczająco wysokiej wydajności. Homogenat tkanki mózgowej myszy miesza się z roztworem BSA-dekstranu w celu oddzielenia resztek tkanki i osadu mikronaczyniowego. Proponujemy trzyetapową separację, po której następuje filtracja w celu uzyskania filtratu bogatego w mikronaczynia. Dzięki tej metodzie ilość fragmentów mikronaczyniowych uzyskanych od 10 myszy jest wystarczająca do wysiewu 9 dołków (9,6 cm2 każdy) płytki 6-dołkowej. Co najciekawsze, dzięki temu protokołowi użytkownik może uzyskać 27 dołków bogatych w perycyty (9,6 cm2 każdy) w przejściu 2. Czystość kultur perycytów potwierdza ekspresja klasycznych markerów perycytów: NG2, PDGFR-β i CD146. Metoda ta stanowi skuteczne i wykonalne narzędzie in vitro do badań fizjologicznych i patofizjologicznych na perycytach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perycyty mózgowe są niezbędnym składnikiem jednostki nerwowo-naczyniowej (NVU), która składa się z funkcjonalnej jednostki z komórkami śródbłonka mózgu bariery krew-mózg (BBB), komórkami glejowymi, macierzą zewnątrzkomórkową i neuronami. Perycyty są istotną częścią regulowanego funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ponieważ służą jako jeden z interfejsów do wymiany informacji molekularnych i komórkowych.

Perycyty mózgowe są osadzone w mikronaczyniach mózgowych po stronie abluminalnej i są niezbędne do ustanowienia1 i utrzymania2 fizjologii BBB. Kilka ostatnich prac podkreśliło również rolę perycytów mózgowych w angiogenezie3 i dojrzewaniu naczyń4, endothelial morphogenesis5 i survival6, oraz w kontrolowaniu metabolizmu cholesterolu w mózgu7. Co ważne, rozregulowanie któregokolwiek z tych procesów jest etiologicznym znakiem rozpoznawczym chorób neurodegeneracyjnych.

Rzeczywiście, perycyty są funkcjonalnym elementem niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania bariery krew-mózg i jej ochrony przed postępem kilku chorób neurologicznych. Zwyrodniała fizjologia i utrata perycytów są częstymi mianownikami w postępie choroby Alzheimera8, utrata neuronów podczas dysfunkcji istoty białej9, stwardnienie rozsiane10, encefalopatia septyczna11, udar niedokrwienny ostrej fazy12 oraz w innych zaburzeniach neurologicznych. Perycyty odgrywają również zasadniczą rolę w przerzutach nowotworowych13. Co ciekawe, wykazano również, że perycyty wykazują rolę ratującą po urazach i zaburzeniach neurologicznych: w remielinizacji w brain1, udarze niedokrwiennym, urazie rdzenia kręgowego14 i promowaniu angiogenezy15. Podatność perycytów na wzmacnianie patofizjologicznych przejawów urazów i zaburzeń neurologicznych sprawia, że są one potencjalnym celem terapeutycznym16.

Modele badań in vitro perycytów w BBB są ważnymi narzędziami do prowadzenia szeroko zakrojonych badań. Modele te stanowią platformę dla bardziej szczegółowych badań, reprezentując modele robocze BBB i nie tylko. Na przykład modele te można wykorzystać do zrozumienia fizjologii komórkowej w perycytach i wśród innych typów komórek NVU. Ponadto modele in vitro są narzędziami badawczymi z pierwszej ręki do testowania farmakologicznego wpływu nowych leków i cząsteczek na perycyty. Modele te można również wykorzystać do zrozumienia patofizjologicznej roli perycytów w odniesieniu do zaburzeń neurologicznych. Niemniej jednak rozwój modeli in vitro wymaga zwiększenia wydajności, aby umożliwić swobodę eksperymentowania. Modele te powinny być łatwe i szybkie oraz zmniejszać liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych. Ponadto pożądana jest możliwość rozwinięcia takich modeli w modele hodowli dwu- i potrójnej.

Istnieje wiele protokołów, które zostały opracowane. Protokoły proponowane przez Tiggesa i in.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20 oraz Crouch i Doetsch21 są godnymi pochwały podejściami, które spełniają większość potrzeb. Wszystkie te metody dają skuteczne wyniki, ale wspólnym mianownikiem tych protokołów pozostaje zależność od dużej liczby zwierząt doświadczalnych. Dlatego konieczne staje się opracowanie metody o wysokiej wydajności, która może izolować i oczyszczać perycyty z maksymalną możliwą wydajnością. W tym protokole czystość komórek uzyskanych po drugim pasażu jest weryfikowana za pomocą kilku markerów perycytów. Sprawdziliśmy obecność β receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFR-β), który jest używany jako klasyczny marker perycytów17, oraz NG2 (neuron-glial antigen 2), który jest markerem morfogenezy naczyń krwionośnych za pośrednictwem perycytów22 i waskularyzacji23. Sprawdziliśmy również klaster różnicowania 146 (CD 146), który został zgłoszony jako jedna z cząsteczek ulegających ekspresji w perycytach17,18.

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji pierwotnych perycytów od myszy (typu dzikiego lub transgenicznego), który spełni wszystkie wyżej wymienione wymagania z wysoką wydajnością. Stosujemy metodę proliferacji pierwotnej perycytów mózgowych opartą na antybiotykach i immunopanacji, która sprawdzi się jako skuteczny model do prowadzenia badań in vitro.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu dotyczącymi użytkowania i obchodzenia się ze zwierzętami. Zgodnie z ustawodawstwem francuskim, obiekt dla zwierząt na Uniwersytecie w Artois został zatwierdzony przez władze lokalne (nr referencyjny: B62-498-5). Zgodnie z prawodawstwem Unii Europejskiej (dyrektywa 2010/63/UE) wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-De-Calais, nr referencyjny: C2EA 75) oraz francuskie Ministerstwo Badań Naukowych (nr referencyjny: 2015090115412152).

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 500 ml buforu myjącego A (WBA): 10 mM roztworu HEPES w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 500 ml buforu myjącego B (WBB): 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 10 mM roztworu HEPES w HBSS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować 300 ml 30% roztworu dekstranu w WBA, mieszając roztwór przez noc w temperaturze pokojowej. Przed użyciem roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 110 °C przez 30 minut. Po autoklawowaniu pozostaw roztwór w temperaturze pokojowej na 2-3 godziny. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 100 ml 0,1% roztworu BSA w zimnym roztworze dekstranu. Wstrząsać energicznie przez 3-4 minuty i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), rozpuszczając 20% surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy, 50 μg/ml gentamycyny, 1% witamin, 2% aminokwasów Basal Medium Eagle (BME) w pożywce Basal DMEM i przechowuj w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać 1 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
  6. Przygotować kompletną pożywkę dla perycytów, dodając suplementy wzrostu perycytów (dostarczane z pożywką dla perycytów) i 20% surowicy cielęcej płodu (FCS) w pożywce podstawowej do hodowli perycytów i przechowuj w temperaturze 4 °C.

2. Regeneracja tkanki mózgowej i usuwanie opon mózgowych

  1. Aby zachować spójność, używaj myszy w podobnym wieku i tej samej płci w każdej partii ekstrakcji. Korzystaj ze schroniska dla zwierząt wolnego od patogenów i zapewnij ad libitum dostęp do wody. Aby zapewnić wydajność i minimalne wykorzystanie zwierząt, należy unikać utraty materiału tkankowego.
  2. Eutanazja C57BL/6J, 4-6 tygodniowe, samce myszy (Janvier labs, Le Genest-Saint-Isle, Francja).
  3. Szybko wyciąć tkankę mózgową w sterylnych warunkach, unikając uszkodzenia tkanki. Ostrożnie umieść tkankę w 40 ml soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (PBS).
  4. Przenieś tkankę mózgową w zimnym PBS na szalkę Petriego (100 mm x 15 mm).
  5. Umieść tkankę mózgową na sterylnej, suchej, niestrzępiącej się chusteczce i za pomocą kleszczyków z zakrzywioną końcówką usuń móżdżek, prążkowie i nerwy potyliczne.
    1. Usuń wszystkie widoczne opony mózgowe za pomocą bawełnianego wacika. Umieść tkankę mózgową do góry nogami i otwórz płaty bawełnianym wacikiem, wykonując lekkie pociągnięcia na zewnątrz. Usuń wszystkie widoczne naczynia krwionośne.
    2. Umieść wolną od opon mózgowych tkankę mózgową na szalce Petriego (100 mm x 15 mm) z 15 ml zimnego WBB.

3. Homogenizacja

  1. Przenieś tkankę do probówki z moździerzem do mielenia tkanek Dounce i dodaj 3-4 ml WBB za pomocą kleszczy.
  2. Zmiel tkankę "luźnym" tłuczkiem 55 razy. Opłucz "luźny" tłuczek WBB. Teraz zmiel gnojowicę "ciasnym" tłuczkiem 25 razy.
  3. Podziel zawiesinę równo na dwie probówki o pojemności 50 ml i dodaj 1,5 razy więcej zimnego 30% dekstranu BSA, energicznie potrząsając probówkami, aby wymieszać gnojowicę.

4. Izolacja frakcji naczyniowej

  1. Po energicznym wstrząśnięciu probówkami odwirować je przez 25 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C.
  2. Przenieść supernatant (wraz z górną warstwą mieliny) do 2 nowych probówek i odwirować probówki przez 25 minut w temperaturze 3 000 x g i 4 °C. Zachować granulki z pierwszego wirowania, dodając 3 ml zimnego WBB (utrzymać osad w temperaturze 4 °C).
  3. Powtórz krok 4.2 i ostrożnie zabezpiecz granulki z 2. wirowania.
  4. Wyrzucić dekstran i mielinę wraz z resztkami tkanek z probówek z kroku 4.3. Zachowaj granulki w zimnym WBB.
  5. Zebrać zawartość probówki 1 i probówki 2 z kroku 4.1 i uzupełnić do końcowej objętości 10 ml zimnym WBB.
  6. Powtórz ten krok dla rur z kroku 4.2 i kroku 4.3.
    UWAGA: Na koniec są 3 probówki z 3 wirówek.
  7. Odciąć osad za pomocą 6 ruchów w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aż nie pozostaną żadne widoczne grudki granulek.
  8. Za pomocą zespołu filtra próżniowego i nylonowego filtra siatkowego przefiltruj zawiesiny komórek każdej rurki.
    UWAGA: Ten etap filtracji jest ważny w celu usunięcia dłuższych/większych naczyń za pomocą filtra siatkowego.
  9. Odzyskaj i ponownie zamieść kapilary, zeskrobując filtr za pomocą kleszczyków z płaską końcówką lub skrobaka w WBB w temperaturze pokojowej. Przefiltruj zawiesinę świeżym filtrem, aby odzyskać więcej naczyń włosowatych
  10. Podzielić filtrat równomiernie na dwie probówki i odwirowywać przez 7 minut przy 1 000 x g i RT.
    UWAGA: Na tym etapie wirowania przygotuj roztwór enzymatyczny. Określić wymaganą ilość WBB w zależności od liczby wykorzystanych zwierząt (patrz tabela materiałów). Dodać 1x DNazy 1 i 1x chlorowodorku tozylo-L-lizylochlorometanu (TLCK) (patrz tabela materiałów) w WBB i ogrzać do temperatury 37 °C.
  11. Zebrać granulki z kroku 4.10 w jednej probówce z wstępnie podgrzanym WBB z enzymami. Dodaj podgrzaną 1x kolagenazę/dispase. Umieścić probówkę w łaźni wodnej ze stołem do wytrząsania w temperaturze 37 °C dokładnie na 33 minuty.
  12. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 30 ml zimnego WBB. Odwirowywać zawiesinę przez 7 minut przy 1 000 x g i RT.
  13. Ostrożnie odrzucić supernatant i oddzielić osad w WBB wykonując 6 ruchów w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Ten krok powinien być mniej rygorystyczny i stosunkowo szybszy.
  14. Odwirowywać zawiesinę przez 7 minut przy 1 000 x g i RT.
    UWAGA: Na tym etapie wyrzuć powłokę z naczyń hodowlanych i spłucz je raz DMEM w temperaturze pokojowej. Szalki z kulturami komórkowymi należy pokrywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  15. Odrzucić supernatant z probówki otrzymanej w kroku 4.14 i zdysocjować osad w nowym, kompletnym pożywce DMEM, pokryć komórki (Dzień 0, P0) w 9 dołkach z płytkami 6-dołkowymi (1 dołek po 9,6cm2 każda).

5. Proliferacja perycytów mózgowych

  1. Hodowle komórkowe należy utrzymywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnym inkubatorze. Wymień pożywkę hodowlaną po 24 godzinach (dzień 1) od posiewu komórek, ostrożnie usuwając resztki. Po 1 dniu zmieniaj pożywkę co 48 godzin.
  2. Obserwuj kulturę komórkową przez co najmniej 7-8 dni. Do tego czasu powinny być widoczne narośla komórkowe na szczycie jednowarstwy śródbłonka.
  3. Przejście komórek w 8-10 dniu (w zależności od zbiegu) w pożywce do hodowli perycytów do pasażu 1 (P1) na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni. Obserwuj komórki przez 6-7 dni. Komórki są kolejno ponownie dzielone do pasażu 2 (P2) w dniu 17 [i pasażu 3 (P3) w dniu 24 tylko w razie potrzeby], hodowane w pożywce perycytowej na płytkach pokrytych żelatyną.
    UWAGA: Komórki powinny być gotowe do eksperymentów/obserwacji przy prawie 80-90% zbieżności.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół (Rysunek 1) efektywnie daje 9 dołków (z 6-dołkowych płytek) w momencie siewu na P0 (Rysunek 2A (P0: Dzień 1)).

Od P0 do P2 można zaobserwować specyficzne cechy morfologiczne, dzięki którym można zaobserwować komórki śródbłonka (oznaczone białymi strzałkami) i stopniowy wzrost perycytów (oznaczony czarnymi strzałkami). W P0 wydłużone komórki śródbłonka rozwijające się z mikronaczyń są obfite (Ryc. 2A, P0: Dzień 3), podczas gdy obfitość takich wydłużonych komórek jest zmniejszona w P1 i nieobecna w P2. Wręcz przeciwnie, perycyty wyglądają jak czworoboczne komórki, które są obfite w P2 (Ryc. 2A, P2: Dzień 18).

Aby potwierdzić czystość hodowli perycytów w P2, sprawdziliśmy ekspresję NG2, CD146 i PDGFR-beta jako markerów perycytów za pomocą ilościowego PCR (Rysunek 2B), immunocytochemii (Rysunek 2C) i western blot (Rysunek 3). Perycyty w P2 wyrażają wyższe poziomy CD146, NG2 i PDGFR-β w porównaniu z ekspresją w całkowitym ekstrakcie mózgu myszy (Ms Br). Jako kontrolę, w P2 zaobserwowano również brak ekspresji markerów śródbłonka okludyny i CD31, markera astrocytów Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) i markera mikrogleju CD11b.

figure-results-1
Rysunek 1: Podsumowanie protokołu. Ten zarys przedstawia krytyczne etapy ekstrakcji perycytów, które rozpoczynają się od rozpadu tkanki za pomocą szklanego młynka, a następnie 3-etapowej separacji dekstranu i filtracji. Protokół ten wykorzystuje 33-minutowy etap trawienia enzymatycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ryc. 2: Morfologia komórek i ekspresja markerów. (A) Obrazy z kontrastem fazowym perycytów w stadiach proliferacji P0, P1 i P2. Obfite komórki śródbłonka w P0 są oznaczone białymi strzałkami. Ich liczba zmniejszyła się w P1 i zniknęły w P2. Perycyty są oznaczone czarnymi strzałkami. (B) Analiza ekspresji CD146, NG2 i PDGFR-β metodą PCR w perycytach w P2 z perycytami w próbkach P1 i mózgu myszy (Ms Br). (C) Reprezentatywne obrazy perycytów w P2 wykazujących dodatnie barwienie immunologiczne CD146, PDGFR-β i NG2. Podziałka: 50 μm (powiększenie 20x) i 20 μm (powiększenie 40x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywna czystość kultur komórkowych. Analiza ekspresji CD146, PDGFR-β, NG2, Okludyny, GFAP, CD31, CD11b i tubuliny metodą western blot w perycytach w próbkach P2 i mózgu myszy (Ms Br). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne porównanie różnych metod rozpadu tkanek, oczyszczania, wzbogacania i trawienia enzymatycznego. Każdy opublikowany protokół jest podsumowany ze wskazaniami dotyczącymi liczby zwierząt wykorzystanych w każdym protokole. Wyjścia są również wskazane w odniesieniu do liczby dołków uzyskanych po wysiewie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perycyty mózgowe są integralną częścią NVU i odgrywają aktywną rolę w indukcji i utrzymaniu BBB24. Podobnie, rola tych komórek w różnych zaburzeniach neurodegeneracyjnych i patologiach naczyniowych jest intrygująca. W związku z tym wydajny model pierwotnych komórek perycytów o wysokiej wydajności zapewni wydajną platformę do badań in vitro.

Istnieją różne protokoły, które zostały zaproponowane do izolacji pierwotnych perycytów (ryc. 4). Tigges i wsp.17 zasugerowali metodę obejmującą tkankę korową z oponami mózgowymi. Podejście to polega na zmiękczeniu tkanki od 6 myszy (trawienie w temperaturze 37 °C, 70 minut z enzymami papainy/DNazy), a następnie etapie dezintegracji za pomocą igieł 21 G i 18 G. Protokół ten sugeruje jednoetapową separację (wirowanie w 22% roztworze BSA/PBS), która daje co najmniej 2 dołki pokryte kolagenem I na 6-dołkowej płytce. Komórki są utrzymywane w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka (ECGM) do pasażu 3, a następnie w pożywce wzrostu perycytów (PGM) dla komórek pasażujących w celu promowania proliferacji perycytów. W innym podobnym podejściu, Chen i wsp.18 zaproponowali dysocjację tkanek poprzez pokrojenie tkanki w kostkę za pomocą wysterylizowanej żyletki i trawienie tkanek kolagenazą/DNazą przez 90 minut w temperaturze 37 °C. Po jednoetapowym oddzieleniu (odwirowanie w 22% BSA) komórek, warstwa mieliny jest usuwana, a osad jest dwukrotnie przemywany w ECGM. Mikronaczynia są platerowane w 3 dołkach 6-dołkowych płytek pokrytych kolagenem I. Po osiągnięciu konfluencji komórki są dwukrotnie pasażowane, a następnie utrzymywane w PGM. W końcu, jeśli komórki zostaną przekazane w stosunku 3, możemy uzyskać 27 dołków z płytkami 6-dołkowymi tylko przy użyciu 10 myszy na początku protokołu.

W Thomsen i wsp. autorzy sugerują izolację perycytów mózgowych poprzez dwuetapowe trawienie enzymatyczne19. Opony mózgowe i istota biała są usuwane, a próbki mózgu są cięte na małe kawałki. Fragmenty tkanek poddawane są pierwszej reakcji enzymatycznej w kolagenazie/DNazie I przez 75 minut w temperaturze 37 °C, po jednym etapie rozdzielania w 20% BSA. Osad zbiera się i dalej trawi w kolagenazie/dypazie/DNazie I przez 50 minut w temperaturze 37 °C. Po tym etapie następuje separacja mikronaczyń w gradiencie Percoll 33% i ponowne płukanie raz. Mikronaczynia wysiewa się na szalkach o średnicy 35 mm pokrytych kolagenem IV/fibronektyną. Proliferacji perycytów sprzyja 10% FCS i siarczan gentamycyny w DMEM przez 10 dni. W innym dwuetapowym podejściu do trawienia enzymatycznego, Yamazaki i wsp. sugerują mielenie wyciętej tkanki w zimnym DMEM20. W pierwszej reakcji enzymatycznej próbki poddaje się działaniu kolagenazy/DNazy I przez 75 minut w temperaturze 37 °C. Po jednoetapowym odwirowaniu osad jest ponownie myty raz i rozpoczyna się druga reakcja enzymatyczna w kolagenazie/dispazie przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Po jednoetapowej separacji granulat jest ponownie zawieszany i odwirowywany w 22% roztworze BSA. Na koniec osad mikronaczyniowy jest ponownie zawieszany i platerowany na płytce 6-dołkowej. W przypadku 5 mózgów myszy można platerować 1 dołek z 6-dołkowej płytki. Aby uzyskać perycyty, kultury śródbłonka są trzykrotnie pasażowane, podczas gdy są utrzymywane w pożywce II komórek śródbłonka mózgu myszy (mBEC). Crouch i Doetsch20 sugerują metodę oczyszczania perycytów za pomocą FACS. Próbki tkanek z kory i strefy komorowo-podkomorowej mózgu myszy są mikropreparowane i dokładnie mielone skalpelem. Po inkubacji kolagenazy/enzymu dyspazy przez 30 minut w temperaturze 37 °C, strawioną tkankę oddziela się od mieliny, a jej szczątki odwirowuje się w roztworze Percollu o stężeniu 22% v/v. Zawiesina komórkowa jest następnie inkubowana w fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciałach w celu analizy i sortowania FACS. Posortowane komórki są siane w pokrytych kolagenem studzienkach z 24-dołkową płytką. Sugeruje się, że jedna kora daje wystarczającą ilość komórek do jednego posiewu w 1 dołku 24-dołkowej płytki.

Nawet jeśli metody te są wydajne, mają kilka ograniczeń, od wykorzystania dużej liczby zwierząt do izolacji pojedynczej partii po bardzo ograniczoną ilość produkcji.

Podczas opracowywania tego proponowanego protokołu udało nam się uzyskać wysoką wydajność: 9 dołków z 6-dołkowej płytki z zaledwie 10 myszy. W tym celu usunięcie opon mózgowych zapewnia jednoetapowe usunięcie dużych naczyń z tkanki. Młynek do tkanek Dounce jest bardziej odpowiedni dla tkanek miękkich, takich jak mózg. Zapewnia również redukcję próbki za pomocą luźnego tłuczka, homogenizację za pomocą ciasnego tłuczka i zapobiega niepotrzebnym uszkodzeniom komórek. Jednym z głównych celów protokołów pierwotnej hodowli komórkowej jest minimalne marnotrawstwo tkanek i wydłużone pobieranie naczyń mózgowych. W przedstawionym protokole osiąga się to poprzez powtarzalne wirowanie homogenatu tkankowego w infuzji dekstranu-BSA. Trzyetapowe wirowanie pomaga odzyskać duże ilości układu naczyniowego z homogenatu tkankowego. Zapewnia to 3-krotnie lepszą regenerację mikronaczyń. Po separacji filtracja jest kolejnym istotnym krokiem, który sprzyja wykluczeniu dużych naczyń związanych z komórkami mięśni gładkich. Jak wspomniano wcześniej, zaproponowano kombinację różnych enzymów do trawienia enzymatycznego. Podczas gdy DNaza i kolagenaza/dyspaza są stosowane odpowiednio do zmniejszania skupisk komórek i izolowania pojedynczych komórek, bardzo ważne jest, aby zapobiec śmierci komórek w tak inwazyjnym środowisku, a zapobiega temu TLCK, co w ten sposób zwiększa ostateczną wydajność. Początkowo w pierwszym pasażu pozwala się wytworzyć monowarstwę śródbłonka, która później wspomaga wzrost przyczepionych perycytów na jednowarstwie. Ponieważ przeżywalność pierwotnych komórek śródbłonka jest zmniejszona po pasażowaniu, zwiększa to prawdopodobieństwo odzyskania pericytów. Co więcej, protokół ten wykorzystuje inne pasażowanie, które zapewnia uniknięcie zanieczyszczenia komórek śródbłonka. Należy zauważyć, że przy większej liczbie komórek z P2 zmniejsza się zależność od dalszego pasażowania komórek. Ponadto zmniejsza możliwość wyprzedzenia wzrostu perycytów przez komórki mięśni gładkich, które namnażają się w znacznie szybszym tempie.

Aby osiągnąć wyższą wydajność, istnieje kilka kroków, które są krytyczne i powinny być dokładnie wykonane w odniesieniu do temperatury i czasu. Mieszanie homogenatu tkankowego z dekstranem BSA powinno być szybkie. Dysocjacja osadów po etapach wirowania powinna być szybka, aby zapobiec śmierci komórki. Co więcej, 33 minuty trawienia enzymatycznego powinny być wykonane z precyzją i starannością. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest 7-8-dniowy czas, w którym jednowarstwa śródbłonka może rosnąć i dalej ułatwiać wzrost perycytów. Ewidentnie izolacja mikronaczyń jest większa, wzrost jednowarstwy jest szybszy, a co za tym idzie, zwiększa się liczba perycytów. Zaleca się, aby nie używać mniej niż 10 myszy w każdej ekstrakcji, aby zapewnić odpowiednią liczbę frakcji mikronaczyniowych, aby dalej wspierać wzrost perycytów. Jeśli powyższe punkty są uważnie przestrzegane, można łatwo osiągnąć pożądaną gęstość komórek do hodowli perycytów mózgowych.

Modele in vitro stanowią realną platformę do opracowania modeli pochodnych w celu uzyskania większej ilości informacji na temat znaczenia patofizjologicznego i komunikacji między innymi komórkami NVU podczas zaburzeń neurologicznych. Izolowane perycyty można włączyć do modeli hodowli dwukomórkowej (z komórkami śródbłonka lub glejowymi) i hodowli trójkomórkowej (komórki śródbłonka i gleju). Rozwój tych modeli nie został tutaj omówiony. Podsumowując, protokół ten zapewnia jedno podejście do izolacji komórek pierwotnych o wyższej wydajności i lepszą platformę do badań in vitro związanych z biologią perycytów mózgu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LT i FG zostały przyznane przez Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) w ramach Wspólnego Programu UE – Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi (JPND) dla projektu SNOWBALL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aminokwasy BMESigmaB-6766Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Podstawowe podłoże DMEMInvitrogen316000083Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówSigmaF-0291Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
BSASigmaA-8412Przechowywać w 4 & st. C.
Kolagenaza dispazaSigma10269638001Przygotuj 10x roztwór podstawowy w sterylnym PBS-CMF. Przefiltrować roztwór za pomocą 0,22 μ m strzykawki przefiltrować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Uwaga: Dla etapu trawienia enzymatycznego protokołu, dla każdego zestawu 10 myszy do ekstrakcji, 300 &mikro; Wymagany jest L 10x kolagenazy dispazy.
DextranSigma31398
DNase ISigma 11284932001Przygotować roztwór podstawowy 1000X, rozpuszczając 100 mg w 10 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze -20°C.
ŻelatynaSigmaG-2500Przygotować powłokę roboczą, sporządzając 0,2% roztwór żelatyny w sterylnym PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 0,2 g/L KH2PO4, 2,86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez minimum 20 minut w temperaturze 120 °; C i przechowywać w temperaturze pokojowej. Szalki hodowlane należy obtaczać przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C.
GentamycinBiochrom AGA-2712 Przechowywaćw temperaturze 4 stopni Celsjusza.
GlutaminaMerckI.00289Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
HBSSSigmaH-8264Przechowywać w 4 & stopni C.
HEPESSigmaH-0887Przechowywać w temperaturze 4 & C.
MatrigelBD Biocoat354230Przygotować roboczy roztwór powlekający Matrigel, rozcieńczając materiał w zimnym DMEM w stosunku 1:48 o końcowym stężeniu 85 &mikro; g/cm2. Naczynia z kultur komórkowych należy pokrywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Pericyte Medium-mouseSciencell laboratories1231Przechowywać w temperaturze 4 & C.
Tosyl Lysin Chloromethyl KetoneSigmaT-7254Przygotuj 1000X roztwór podstawowy w WBA, rozpuszczając 16 mg w 10,88 ml WBA, aby uzyskać roztwór 4 mM i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
WitaminySigmaB-6891Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Wymagania sprzętowe
Narzędzia filtracyjneSefar, Siatka nylonowa, porowatość
Sprzęt laboratoryjnyWirówka z wirnikiem kubełkowym obrotowym Łaźnia
wodna z mieszadłem
Okap z przepływem laminarnym: BSL2
Szkło (wszystkie elementy mają być podgrzewane sterylizowany)Młynek do tkanek Dounce ze szklanym tłuczkiem
Tłuczek I: 0,0035 - 0,0065 cala
Tłuczek II: 0,0010 - 0,0030 cala
Zespół filtra próżniowego z podstawą
Chirurgiczne narzędzia preparacyjne (wszystkie elementy do sterylizacji termicznej)Kleszcze, nożyczki, palnik Bunsena, bawełna Waciki, miernik
60 mikronównośną filtra ze szkła spiekanego o grubej porowatości

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
  2. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  3. Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
  4. Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106(2017).
  5. Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
  6. Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
  7. Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
  8. Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932(2013).
  9. Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
  10. Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
  11. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  12. Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
  13. Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385(2016).
  14. Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
  15. Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
  16. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  17. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  18. Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
  19. Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
  20. Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
  21. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  22. Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
  23. Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
  24. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

M zg myszyhomogenizacja tkanekroztw r BSA dekstranufrakcja mikro naczyniowatrawienie enzymatycznemarkery pericyt wNG2 PDGFR Betaekspresja CD146pasa owanie kultur kom rkowych

Powiązane artykuły