Artykuł metodologiczny

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

DOI:

10.3791/60589

⸱

31 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy metodę generowania kontrolowanych, dynamicznych impulsów chemicznych - gdzie miejscowy chemoatraktant staje się nagle dostępny w mikroskali - aby stworzyć mikrośrodowiska do eksperymentów z chemotaksją mikrobiologiczną. Aby wytworzyć impulsy chemiczne, opracowaliśmy system do niemal natychmiastowego wprowadzania źródeł aminokwasów poprzez fotolizę aminokwasów w klatkach w komorze mikroprzepływowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającej zawiesinę bakteryjną. Zastosowaliśmy tę metodę do bakterii chemotaktycznej, Vibrio ordalii, która może aktywnie wspinać się po tych dynamicznych gradientach chemicznych, będąc śledzoną za pomocą mikroskopii wideo. Aminokwasy, które stają się biologicznie obojętne ("uwięzione w klatce") w wyniku modyfikacji chemicznej fotousuwalną grupą ochronną, są jednolicie obecne w zawiesinie, ale nie są dostępne do spożycia aż do ich nagłego uwolnienia, które następuje w określonych przez użytkownika punktach w czasie i przestrzeni za pomocą skupionej wiązki LED o bliskim promieniowaniu UV-A. Liczbę cząsteczek uwalnianych w impulsie można określić za pomocą zależności kalibracyjnej między czasem ekspozycji a frakcją uncaging, gdzie widmo absorpcyjne po fotolizie jest charakteryzowane za pomocą spektroskopii UV-Vis. Membrana z nanoporowatego poliwęglanu (PCTE) może być zintegrowana z urządzeniem mikroprzepływowym, aby umożliwić ciągłe usuwanie przez przepływ związków nieumieszczonych w sadzkach i zużytych mediów. Silne, nieodwracalne wiązanie między membraną PCTE a strukturą mikroprzepływową PDMS uzyskuje się poprzez pokrycie membrany roztworem 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES), a następnie aktywację plazmową łączonych powierzchni. System sterowany komputerowo może generować zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych lokalizacjach i o różnej intensywności, tak aby tworzyć krajobrazy zasobów o określonej zmienności przestrzennej i czasowej. W każdym krajobrazie chemicznym można uzyskać dynamikę przemieszczania się bakterii w skali indywidualnej i ich akumulacji na poziomie populacji, co pozwala na ilościowe określenie wydajności chemotaktycznej i jej wpływu na agregacje bakterii w środowiskach istotnych z ekologicznego punktu widzenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroby polegają na chemotaksji, procesie wykrywania gradientów chemicznych i modyfikowania ruchliwości w odpowiedzi1, aby poruszać się po krajobrazach chemicznych, zbliżać się do źródeł składników odżywczych i gospodarzy oraz uciekać przed szkodliwymi substancjami. Te procesy w mikroskali określają kinetykę interakcji między mikroorganizmami a ich środowiskiem2,3. Ostatnie postępy w mikrofluidyce i technologiach mikrowytwarzania, w tym miękka litografia4, zrewolucjonizowały naszą zdolność do tworzenia kontrolowanych mikrośrodowisk, w których można badać interakcje mikroorganizmów. Na przykład wcześniejsze eksperymenty badały chemotaksję bakteryjną poprzez generowanie wysoce kontrolowanych, stabilnych gradientów o średnich i wysokich stężeniach składników odżywczych5,6. Jednak w środowisku naturalnym gradienty chemiczne w mikroskali mogą być krótkotrwałe - rozpraszane przez dyfuzję molekularną - a warunki tła są często bardzo rozcieńczone7. Aby bezpośrednio zmierzyć odpowiedź chemotaktyczną populacji drobnoustrojów po raz pierwszy wystawionych na działanie niestabilnego środowiska chemicznego, opracowaliśmy i opisujemy metody łączenia technologii mikroprzepływowej z fotolizą, naśladując w ten sposób gradienty, które dzikie bakterie napotykają w naturze.

Technologia uncaging wykorzystuje światłoczułe sondy, które funkcjonalnie zamykają biomolekuły w nieaktywnej formie. Napromieniowanie uwalnia cząsteczkę w klatce, umożliwiając ukierunkowane zakłócenie procesu biologicznego8. Ze względu na szybką i precyzyjną kontrolę chemii komórkowej, którą zapewnia odblokowanie9, fotoliza związków w klatkach jest tradycyjnie stosowana przez biologów, fizjologów i neurobiologów do badania aktywacji genów10, kanały jonowe11, oraz neurons12. Niedawno naukowcy wykorzystali znaczące zalety fotolizy do zbadania chemotaksji13, do określenia dynamiki przełączania wici w poszczególnych komórkach bakteryjnych wystawionych na stopniowy bodziec chemoatraktantowy14,15, oraz do zbadania wzorców ruchliwości pojedynczych plemników w trójwymiarowych (3D) gradientach16.

W naszym podejściu, wdrażamy fotolizę aminokwasów w klatkach w urządzeniach mikroprzepływowych, aby badać reakcję behawioralną populacji bakterii na kontrolowane impulsy chemiczne, które stają się niemal natychmiast dostępne dzięki wydaniu zdjęć. Zastosowanie obiektywu o małym powiększeniu (4x) (NA = 0,13, głębokość ostrości około 40 μm) pozwala zarówno na obserwację agregacyjnej odpowiedzi tysięcy bakterii na poziomie populacji w dużym polu widzenia (3,2 mm x 3,2 mm), jak i na pomiar ruchu na poziomie pojedynczej komórki. Przedstawiamy dwa zastosowania tej metody: 1) uwolnienie pojedynczego impulsu chemicznego w celu zbadania dynamiki akumulacji i rozpraszania bakterii w oparciu o warunki jednorodne oraz 2i) uwolnienie wielu impulsów w celu scharakteryzowania dynamiki akumulacji bakterii w zmiennych w czasie, przestrzennie niejednorodnych warunkach chemoatraktantu. Metoda ta została przetestowana na bakteriach morskich Vibrio ordalii wykonujących chemotaksję w kierunku aminokwasu glutaminianu17, ale metoda ta ma szerokie zastosowanie do różnych kombinacji gatunków i chemoatraktantów, a także do procesów biologicznych poza chemotaksją (np. pobieranie składników odżywczych, ekspozycja na antybiotyki, quorum sensing). Podejście to może pomóc w wyjaśnieniu ekologii i zachowania mikroorganizmów w realistycznych środowiskach oraz w odkryciu ukrytych kompromisów, z jakimi borykają się poszczególne bakterie podczas poruszania się po efemerycznych gradientach dynamicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzenia mikroprzepływowego do eksperymentu z pojedynczym impulsem chemicznym

  1. Zaprojektuj kanał za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) i wydrukuj go na przezroczystej folii, aby utworzyć maskę fotograficzną (Rysunek 1A).
  2. Wytwórz mistrza za pomocą miękkiej litografii (w warunkach pomieszczenia czystego).
    1. Wyczyść płytkę krzemową (4 cale) w krótkich odstępach czasu acetonem, metanolem i izopropanolem, a następnie wysusz azotem. Wafelek pieczemy w piekarniku w temperaturze 130°C przez 5 minut.
    2. Umieść wafel na środku wirówki i wlej na niego fotorezystor SU-8. Zwiększ prędkość wirówki do 500 obr./min w ciągu 5 s i utrzymuj ją na poziomie 500 obr./min przez 10 s. Zwiększ prędkość do końcowej prędkości przez 10 s i utrzymuj tę prędkość przez 30 s.
      UWAGA: Dokładna wartość prędkości końcowej zależy od docelowej grubości powłoki i zastosowanego SU-8.
    3. Po procesie wirowania wafel piecze się w temperaturze 65 °C, a następnie w temperaturze 95 °C. Pozostaw wafel do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 5 minut.
      UWAGA: Czas pieczenia zależy od docelowej grubości i rodzaju użytego fotorezystu. Zgodnie z ogólną zasadą, na każde 100 μm warstwy wafel powinien być pieczony przez 5 minut w temperaturze 65 °C i 45 minut w temperaturze 95 °C.
    4. Umieść maskę fotograficzną na płytce, aby upewnić się, że tylko obszar zainteresowania jest odsłonięty i spolimeryzowany. Wystawić na działanie promieniowania UV przez czas zalecany w instrukcji SU-8.
      UWAGA: Tutaj, przy energii ekspozycji 200 mJ cm-2 przy długości fali 350 nm, płytka była naświetlana przez 150 s.
    5. Wafel pieczemy w temperaturze 65°C i 95°C przez czas zalecany w instrukcji SU-8.
      UWAGA: Z reguły na każde 100 μm warstwy wafel należy piec przez 5 minut w temperaturze 65 °C i 45 minut w temperaturze 95 °C.
    6. Zanurz wafel w zlewce wypełnionej wywoływaczem z polimetakrylanu metylu (PMMA) w celu uzyskania wzorca. Delikatnie potrząśnij zlewką, aby upewnić się, że niespolimeryzowany fotorezystor został wypłukany. Piecz wzorzec w temperaturze 200 °C, aby jeszcze bardziej usieciować warstwę SU-8.
  3. Przygotować mieszaninę polidimetylosiloksanu (PDMS), łącząc elastomer z jego utwardzaczem (tabela materiałów) w stosunku 10:1 w zlewce (tutaj 40 ml). Mieszać energicznie, aż płyn będzie jednorodny.
    UWAGA: Mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą, ponieważ podczas procesu mieszania powstają bąbelki.
    UWAGA: Aby zapobiec kontaktowi skóry z potencjalnie niebezpiecznymi chemikaliami lub materiałem biologicznym, należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny i jednorazowe plastikowe rękawiczki przez cały czas trwania protokołu i przestrzegać wszelkich określonych protokołów bezpieczeństwa zgodnie z Kartą Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS).
  4. Mieszaninę PDMS odgazowuje się w komorze próżniowej przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Aby przyspieszyć proces, okresowo uwalniaj próżnię, aby rozerwać pęcherzyki, które tworzą się na interfejsie.
    UWAGA: Proces odgazowywania należy przeprowadzić w ciągu 1 godziny, aby zapobiec rozpoczęciu utwardzania mieszaniny PDMS.
  5. Usunąć kurz z powierzchni urządzenia wzorcowego za pomocą środka czyszczącego pod ciśnieniem, a następnie wlać odgazowaną mieszaninę PDMS na urządzenie główne i piec w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 2 godziny
    UWAGA: Alternatywnie, pieczenie przez noc (lub przez co najmniej 12 godzin) w temperaturze 60 °C pozwoli uzyskać ten sam utwardzony PDMS.
  6. Przeciąć PDMS ostrzem wokół mikrostruktur (w odległości około 5 mm), a następnie ostrożnie oderwać PDMS od wzorca.
  7. Przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot mikrokanału (tutaj jeden wlot i jeden wylot, patrz Rysunek 1A). Upewnij się, że nic nie dotyka dolnej powierzchni PDMS, na której znajdują się obiekty.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Mikrokanalik należy uszczelnić taśmą klejącą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu i innych cząstek podczas przechowywania.
  8. Podłącz mikrokanał PDMS do szkiełka podstawowego.
    1. Dokładnie wyczyść szklane szkiełko mydłem, izopropanolem i wodą dejonizowaną. Pozwól szkłu wyschnąć lub użyj sprężonego powietrza, aby przyspieszyć proces.
    2. Usuń cząsteczki kurzu, przecierając taśmą klejącą. Przymocuj mikrokanał PDMS do czystego szkiełka podstawowego, natychmiast po potraktowaniu obu powierzchni plazmą (przy użyciu systemu koronowego lub plazmowej komory tlenowej) przez 2 minuty.
    3. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe w celu ogrzewania na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby wzmocnić wiązanie chemiczne ze szkłem.

2. Produkcja wydrukowanego w 3D urządzenia milifluidowego do eksperymentu z wieloma impulsami

  1. Zaprojektuj kształt 3D za pomocą oprogramowania do projektowania 3D i wydrukuj wzorzec formy PDMS za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1B).
    UWAGA: Zobacz tabelę materiałów dla drukarki 3D i materiału formy użytego do stworzenia wzorca.
  2. Powtórz kroki 1.3−1.4, a następnie wyczyść powierzchnię wzorca, przecierając taśmą klejącą. Umieść wzorzec na wadze, a następnie, unikając środkowego obszaru wzorca, który będzie zajęty przez membranę, wlej dokładną ilość nieutwardzonej mieszaniny PDMS (tutaj 23,4 g), aby uzyskać pożądaną wysokość PDMS, dopasowując wysokość wzorca (tutaj 0,5 mm). Usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki za pomocą sprężonego powietrza.
  3. Umieść PDMS odlany na mistrzu w piekarniku w temperaturze 45 °C i piecz przez co najmniej 12 godzin.
  4. Połącz formę 3D PDMS z szalką Petriego.
    1. Delikatnie oderwij utwardzoną warstwę PDMS i przebij otwory wlotowe i wylotowe do wstrzykiwania zawiesiny bakteryjnej ( Rysunek 1C).
    2. Aktywuj zarówno powierzchnię szalki Petriego (90 mm x 15 mm), jak i formę PDMS za pomocą plazmy tlenowej na 2 minuty. Przyklej formę PDMS do szalki Petriego. Delikatnie dociśnij formę do szalki Petriego, ale nie naciskaj w miejscu, w którym znajdują się elementy, ponieważ może to spowodować zawalenie się komory przesłuchań.
    3. Umieścić szalkę Petriego połączoną z formą PDMS 3D w piecu w temperaturze 45 °C na co najmniej 12 godzin, aby wzmocnić wiązanie chemiczne.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  5. Funkcjonalizacja powierzchni membrany18
    1. Aktywuj membranę z nanoporowatego poliwęglanu (PCTE) w komorze plazmy tlenowej na 1 minutę w temperaturze RT.
      UWAGA: Unikaj używania systemu koronowego do aktywacji plazmy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie membrany.
    2. Pod kapturem chemicznym rozcieńczyć komercyjny roztwór 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) w wodzie dejonizowanej do 1% objętości (tutaj 40 ml), używając rurki polipropylenowej.
      UWAGA: Roztwór APTES jest silnie toksyczny (ocena zagrożenia dla zdrowia MSDS 3) i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością wyłącznie pod kapturem chemicznym w rękawiczkach. Zmienić rękawice natychmiast po użyciu roztworu APTES. Opary APTES działają destrukcyjnie na błony śluzowe i górne drogi oddechowe. Narządami docelowymi APTES są nerwy, wątroba i nerki. Jeśli wyciąg nie jest dostępny, należy zastosować osłonę twarzy i maskę oddechową.
    3. Rozcieńczony roztwór APTES przenieść na szalkę Petriego i zanurzyć aktywowaną membranę w roztworze APTES na 20 minut.
    4. Usuń membranę z roztworu APTES za pomocą pęsety i umieść ją na chusteczce do pomieszczenia czystego do wyschnięcia.
  6. W celu wytworzenia kanałów mikroprzepływowych PDMS, które będą leżeć na membranie i umożliwią mycie areny bakteryjnej, powtórz kroki 1,1−1,7.
  7. Połączyć kanały myjące PDMS z funkcjonalizowaną membraną.
    1. Aktywuj zarówno kanał myjący PDMS, jak i membranę PCTE za pomocą komory plazmy tlenowej przez 2 min.
      UWAGA: Membrana, która zostanie umieszczona między dwiema warstwami PDMS, powinna być mniejsza niż kanał myjący PDMS.
    2. Bezpośrednio po zabiegu plazmowym należy doprowadzić do kontaktu funkcjonalizowanej membrany i kanału myjącego PDMS, delikatnie dociskając kanał myjący PDMS do membrany.
      UWAGA: Na tym etapie nie należy wywierać nadmiernego nacisku, ponieważ może to spowodować (nieodwracalne) przyklejenie membrany do dachu kanału, blokując kanał.
  8. Umieść membranę pomiędzy dwiema warstwami PDMS ( Rysunek 1E).
    1. Aktywuj zarówno kanał myjący PDMS z klejonego laminatu, membranę PCTE, jak i formę 3D PDMS wcześniej połączoną z szalką Petriego za pomocą komory plazmy tlenowej na 2 minuty. Doprowadź je do kontaktu i dociśnij do siebie.
    2. Umieścić szalkę Petriego przyklejoną do struktury warstwy warstwowej w piecu w temperaturze 45 °C na co najmniej 12 godzin, aby wzmocnić wiązanie chemiczne.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Hodowla komórkowa

  1. Hoduj populację V. ordalii (szczep 12B09 lub 12B09pGFP) przez noc przez 20 godzin w 2216 medium19 na wytrząsarce orbitalnej (600 obr./min) w temperaturze 30 °C i zbieraj komórki w późnej fazie wykładniczej. W przypadku izolatów zawierających pGFP należy dodać spektynomycynę (50 μg mL-1) w celu utrzymania plazmidu.
  2. Odwirować 1 ml porcji komórek przy 2500 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml przefiltrowanej sztucznej wody morskiej. Powtórz ten krok.
  3. Zagłodzić populację V. ordalii na wytrząsarce orbitalnej (600 obr./min) w temperaturze 30 °C przez 3 godziny.
  4. Przygotować podstawowy roztwór sztucznej wody morskiej o stężeniu 10 mM (tutaj 1 ml) L-glutaminianu 4-metoksy-7-nitroindolinylu w klatce (L-glutaminianu MNI) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Chroń roztwór L-glutaminianu MNI-caged-glutaminianu przed światłem otoczenia, aby zapobiec fotolizie.
  5. Rozcieńczyć komórki 50 razy, ponownie zawieszając wygłodzone komórki w sztucznym roztworze wody morskiej 1 mM L-glutaminianu MNI.
    UWAGA: Zapewni to końcowe stężenie bakterii niższe niż 5 x 107 mL-1 (dokładna wartość zależy od początkowego stężenia komórek w późnym wykładniku, które zwykle wynosi ~109 mL-1). Stężenie bakterii oszacowano za pomocą spektrofotometru o gęstości optycznej (OD) 600 nm.

4. Kalibracja protokołu uncaging

    Umieść kroplę (20 μl) sztucznego roztworu L-glutaminianu MNI-caged-glutaminianu20 o stężeniu C 0 = 10 mM na szkiełku podstawowym.
  1. Kapsułkować kroplę, przykrywając ją okrągłą komorą PDMS (średnica d = 5 mm, wysokość h = 250 μm).
  2. Umieść szkiełko podstawowe na stoliku mikroskopowym i naświetl całą komorę na 20 ms wiązką LED o długości fali 395 nm (moc 295 mW) za pomocą obiektywu 4x (apertura numeryczna [NA] = 0,13).
  3. Otworzyć komorę PDMS i pobrać kroplę (1 μl) do analizy za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
  4. Powtórz kroki 4.1−4.3 dla różnych czasów świecenia diody LED: 0.1 s, 0.5 s, 2.5 s, 25 s, 250 s (lub do nasycenia reakcji chemicznej) i 0 s (aby uzyskać tło). Powtórz kroki procedury 4.1−4.4 co najmniej 3x (tutaj 4x).
  5. Z widma absorpcyjnego wyodrębnij wartość przy 405 nm, która reprezentuje pik w widmie absorpcyjnym cząsteczki klatki21. Aby określić szybkość k chemicznej reakcji odblokowywania za pomocą diody LED exposure14, użyj następującego równania kinetyki pierwszego rzędu dla numerycznego dopasowania danych eksperymentalnych17
    figure-protocol-1
    gdzie C(t) jest wartością widma absorpcyjnego roztworu przy długości fali 405 nm (po usunięciu tła) z czasem rozmieszczania w klatce wynoszącym t sekund. Dla krótkiego czasu rozmieszczania w klatce t, tak że kt 1, równanie 1 można uprościć do formuły liniowej
    figure-protocol-2

5. Eksperyment z pojedynczym impulsem chemicznym

  1. Utrzymuj kanał mikroprzepływowy w próżni przez 20 minut, aby zmniejszyć stężenie gazu w PDMS, aby mniej prawdopodobne było tworzenie się pęcherzyków podczas procesu napełniania.
  2. Odekstrahuj kanał z pompy próżniowej i natychmiast delikatnie wprowadź rozcieńczoną zawiesinę bakteryjną w 1 mM L-glutaminianu MNI-caged-glutaminianu w sztucznej wodzie morskiej do mikrokanału za pomocą mikropipety, aby uniknąć uszkodzenia wici przez mechaniczne siły ścinające (tutaj cały proces napełniania trwał 5-10 s). Po napełnieniu kanału zawiesiną bakteryjną należy odessać nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym, a wlot i wylot uszczelnić zatyczkami PDMS, delikatnie wciskając je w otwory.
    UWAGA: W ten sposób zapobiega się przepływowi płynu w komorze.
  3. Umieść mikrokanał na stoliku mikroskopu i przesuń stolik, aby ustawić pole view w środkowym kanale. Ustaw mikroskop tak, aby wykonywał obrazowanie z kontrastem fazowym (obiektyw 4x) z szybkością 12 kl./s.
    UWAGA: Wartość ta może być zmieniana, ale nie powinna być mniejsza niż 10 kl./s, aby umożliwić rekonstrukcję trajektorii bakterii poprzez analizę obrazu (patrz rozdział 7 protokołu).
  4. Ustaw otworek wiązki LED na minimalny otwór. Ustawiając czas naświetlania kamery na 5 s, nagraj kilka klatek, aby uzyskać precyzyjne pomiary położenia przestrzennego i wielkości wiązki LED.
    UWAGA: Źródło światła LED łączy się z oświetlaczem epifluorescencyjnym mikroskopu za pomocą złącza światłowodu cieczy. Wiązka LED nie ma wpływu na przechwytywanie wideo, ponieważ akwizycja wideo i stymulacja LED są sterowane niezależnie za pomocą oprogramowania.
  5. Wykonuj ciągłe obrazowanie przez łączny czas 10 minut (20 minut dla największego impulsu chemicznego) i jednocześnie aktywuj skupioną wiązkę LED o długości 395 nm przez żądany czas (w tym eksperymencie t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) w zdefiniowanym przez użytkownika punkcie czasowym (w tym przypadku 10 s po rozpoczęciu akwizycji wideo) za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Aby uzyskać wiele powtórzeń tego samego procesu, należy przesunąć stolik, aby zarejestrować odpowiedź bakterii w różnych pozycjach kanału mikroprzepływowego. Powtórz tę procedurę dla każdego rozmiaru impulsu, używając nowego mikrokanału.
    UWAGA: Proces odblokowywania generuje osiowosymetryczny impuls cylindryczny, który rozprasza się promieniście na zewnątrz w płaszczyźnie obrazowania.
  6. Przeprowadź oddzielne eksperymenty bez chemicznego odkrępowania przy większym powiększeniu (obiektyw 20x, NA = 0,45) przy większej liczbie klatek na sekundę (50 kl./s), aby zarejestrować bezstronny ruch pływania bakterii.

6. Eksperyment z wieloma impulsami chemicznymi

  1. Utrzymuj komorę milifluidyczną w próżni przez 20 minut.
  2. Umieścić szalkę Petriego zawierającą komorę milifluidyczną na stoliku mikroskopu. Napełnij komorę pod membraną rozcieńczoną zawiesiną bakteryjną (tutaj cały proces napełniania trwał 10−15 s) fluorescencyjnego V. ordalii GFP w 1 mM roztworze L-glutaminianu MNI-w klatce w sztucznej wodzie morskiej. Po napełnieniu kanału zawiesiną bakteryjną należy odessać nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym, a wlot i wylot uszczelnić zatyczkami PDMS, delikatnie wciskając je w otwory.
    UWAGA: W ten sposób zapobiega się przepływowi płynu w komorze. Aby umożliwić lepszą wizualizację bakterii w tym układzie, w którym obrazowanie odbywa się przez membranę nanoporowatą, zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepów fluorescencyjnych zamiast typu dzikiego (jak w eksperymencie z pojedynczym impulsem chemicznym).
  3. Napełnij strzykawkę sztucznym roztworem wody morskiej zawierającym 1 mM L-glutaminianu MNI-caged-glutaminianu i podłącz rurkę do wlotu i wylotu kanału myjącego nad membraną.
  4. Podłącz rurkę do zbiornika na odpady i upewnij się, że rurka jest całkowicie zanurzona w zbiorniku na odpady płynu, aby uniknąć wahań ciśnienia.
  5. Ustaw odpowiednie natężenie przepływu na pompie strzykawkowej (tutaj 50 μL min-1), aby uzyskać pożądane średnie natężenie przepływu w kanale myjącym, które zależy od geometrii kanału.
  6. Uruchomić pompę strzykawkową, aby ustalić przepływ w kanale myjącym nad membraną.
  7. Uruchom oprogramowanie sterujące wiązką LED i stolikiem mikroskopu, aby wygenerować zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych miejscach i o różnej intensywności.
    UWAGA: Ciągły przepływ sztucznego roztworu L-glutaminianu MNI-klatkowo w wodzie morskiej w kanale myjącym nad membraną uzupełnia roztwór złożony w klatce i wypłukuje zużyte podłoże z areny bakteryjnej.
  8. Nagrywaj wideo za pomocą obiektywu 4x w regularnych odstępach czasu przez kilka godzin i w wielu sąsiadujących ze sobą miejscach, aby pokryć dużą powierzchnię (tutaj, 1 cm x 1 cm, Rysunek 1F).

7. Analiza obrazu i analiza danych

  1. Rekonstrukcja trajektorii bakteryjnych
    1. Na podstawie filmów nagranych za pomocą obiektywu 4x zrekonstruuj trajektorie bakterii za pomocą oprogramowania śledzącego17.
      UWAGA: Trajektorie te reprezentują rzuty 2D ruchu bakterii 3D w mikrokanale.
    2. Na podstawie zrekonstruowanych trajektorii bakteryjnych określ prędkość dryfu radialnego każdego pływającego osobnika, rzutując jego prędkość pływania w kierunku środka impulsu chemicznego (Rysunek 2D). Do wizualizacji czasoprzestrzennej dynamiki dryfu radialnego należy użyć siatki kategoryzacji o rozmiarze przestrzennym 75 μm x 75 μm i oknie czasowym w przedziale 5−10 s (Rysunek 2D,E).
      UWAGA: Ze względu na cylindryczną symetrię procesu, dane mogą być analizowane we współrzędnych biegunowych i uśredniane w wymiarze kątowym (Rysunek 3).
    3. Na podstawie zrekonstruowanych trajektorii bakteryjnych określ czasoprzestrzenną dynamikę rozmieszczenia bakterii w miarę reagowania na impulsy chemiczne (Rysunek 2E).
    4. Z filmów o wyższej rozdzielczości zarejestrowanych obiektywem 20x podczas eksperymentów z pojedynczym impulsem wyodrębnij rozkład prędkości pływania i czasu pracy dla populacji bakterii, gdy reagują one na impuls chemiczny (Rysunek 4).
  2. Oszacuj współczynnik dyfuzji bakterii, biorąc pod uwagę dynamikę rozpraszania populacji bakterii po zakończeniu chemotaksji17 (tutaj, dla t > 300 s; Rysunek 3).
  3. Oszacuj współczynnik dyfuzji glutaminianu, stosując równanie Stokesa-Einsteina
    figure-protocol-3
    gdzie zakłada się, że cząsteczki aminokwasów są sferycznymi cząstkami o promieniu hydrodynamicznym22 rG, kB jest stałą Boltzmanna (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T jest temperaturą (296 K), a η jest lepkością dynamiczną sztucznej wody morskiej (zasolenie 36 g kg-1) w temperaturze 23 °C (10-3 Pa s)="xref">23

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy urządzeń mikroprzepływowych i milifluidowych (Rysunek 1) do zbadania profili akumulacji bakterii w dynamicznych warunkach odżywczych. Trajektorie bakterii wyodrębniono z nagranych filmów uzyskanych za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego dynamiki akumulacji-rozpraszania populacji bakterii po impulsie chemicznym uwolnionym w wyniku fotolizy (Rysunek 2 i Rysunek 3). Uśredniając miliony trajektorii, uzyskano czasoprzestrzenną dynamikę prędkości dryfu radi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta pozwala naukowcom badać chemotaksję bakteryjną pod kontrolowanymi, dynamicznymi gradientami w urządzeniach mikro- i miliprzepływowych, umożliwiając powtarzalne pozyskiwanie danych. Niemal natychmiastowe wytwarzanie impulsów chemicznych w mikroskali w procesie fotolizy ma na celu odtworzenie rodzajów impulsów odżywczych, które bakterie napotykają w naturze z różnych źródeł, na przykład dyfuzyjnego rozprzestrzeniania się pióropuszy za tonącymi cząstkami morskimi25 lub rozprzestrzeniania si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują PIERWSZEMU zakładowi mikrofabrykacji na ETH Zurich. Praca ta została wsparta przez Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (dla D.R.B.), nagrodę Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (dla R.S.) oraz grant Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (dla R.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)Sigma-AldrichA3648>98% czystości, wysoce toksyczna
probówka CELLSTAR WirówkaGreiner Bio-One21026150 ml
Eppendorf5424Rdo usuwania zużytych pożywek z kultur bakteryjnych
Inkubatory cyfrowe Incu-LineVWR-CH390-0384do pieczenia 3D master
DusterVWR-CH16650-22do czyszczenia płytki i mikrokanalików
Płyta grzejnaVWR-CH444-0601do łączenia mikrokanalików
IzopropanolSigma-AldrichW292907
Mikroprobówki wirówkoweLightSafe Sigma-AldrichZ6883121,5 ml
MATLABMathworksdo analizy obrazu i śledzenia
bakteriiProbówka do mikrowirówekEppendorf301200861,5 ml
Szkiełko mikroskopoweVWR-CH631-1552
Mikroskop Nikon Eclipse TiENikon InstrumentyMEA53100ze zmotoryzowanym stolikiem
MNI-glutaminianTocris Bioscience1490>98 % czystości, światłoczuły
Sprzęt do drukowania formStratasysObjet30 3D drukarka
Usługa drukowania form3D Printing StudiosCustomhttps://www.3dprintingstudios.com/Nanodrop
One Spektrofotometr UV-VisThermo Fisher ScientificND-ONE-Wdo kalibracji odłączania
elementów NISInstrumenty Nikon Obrazowaniemikroskopowe
Oprogramowanie Piekarnik Venti-LineVWR-CH466-3516do pieczenia PDMS (z konwekcją wymuszoną)
Photoresist SU-8-3050MicroChem Corp.SU8-3050
Komora plazmowa ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1do funkcjonalizacji powierzchni przed klejeniem
Membrana poliwęglanowaSterlitechPCT04471000,4 i mikro; m wielkość porów, 19 % otwarta przestrzeń, 24 i mikro; m grubość
Mikrorurki polietylenoweScientific CommoditiesBB31695-PE/2ID x OD: 0,015 "x 0,043" / 0,38 mm x 1,09 mm
Polistyrenowa płytka PetriegoVWR-CH25373-100dolna powierzchnia (90 mm x 15 mm) do łączenia urządzenia milifluidowego
SkalaVWR-CH611-2605do wagi mieszaniny PDMS
Kamera sCMOS Andor ZylaOxford Instrumentsdo mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji (max 100 kl./s)Sól
morskaInstant OceanNr produktu SS1-160p
SolidWorks 2015Dassault Systèmes, SolidWorksSłuży do zaprojektowania formy
Silnik świetlny Spectra XLumencolordo LED 395 nm
Sylgard 184Dow Corning110-41-155PDMS Si Elastomer Zestaw; utwardzacz
Strzykawka (Luer-Lok)B Braun Omnifix4616308F
Igła do strzykawkiAganiA228od 10 do 30 ml
Pompa strzykawkowa 11 Aparat Pico Plus EliteHarvard70-4506Terumo Agani 23 miernik 5/8 cala (16 mm)
Podwójna pompa strzykawkowaVeroGreyStratasys
Vortex-GenieScientific IndustriesSI-0236Materiał formy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895(2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985(2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548(2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231(2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Impulsy chemicznechemotaksja mikrob wfotoliza klatkowanych aminokwas wmikrofluidyczna komora PDMSVibrio ordaliispektroskopia UV Visnanoporowata membrana PCTEwi zanie plazmowe APTESsterowane komputerowo impulsy LEDanaliza trajektorii bakterii

Powiązane artykuły