Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60589

⸱

31 stycznia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Streszczenie

Pokazujemy metodę generowania kontrolowanych, dynamicznych impulsów chemicznych - gdzie miejscowy chemoatraktant staje się nagle dostępny w mikroskali - aby stworzyć mikrośrodowiska do eksperymentów z chemotaksją mikrobiologiczną. Aby wytworzyć impulsy chemiczne, opracowaliśmy system do niemal natychmiastowego wprowadzania źródeł aminokwasów poprzez fotolizę aminokwasów w klatkach w komorze mikroprzepływowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającej zawiesinę bakteryjną. Zastosowaliśmy tę metodę do bakterii chemotaktycznej, Vibrio ordalii, która może aktywnie wspinać się po tych dynamicznych gradientach chemicznych, będąc śledzoną za pomocą mikroskopii wideo. Aminokwasy, które stają się biologicznie obojętne ("uwięzione w klatce") w wyniku modyfikacji chemicznej fotousuwalną grupą ochronną, są jednolicie obecne w zawiesinie, ale nie są dostępne do spożycia aż do ich nagłego uwolnienia, które następuje w określonych przez użytkownika punktach w czasie i przestrzeni za pomocą skupionej wiązki LED o bliskim promieniowaniu UV-A. Liczbę cząsteczek uwalnianych w impulsie można określić za pomocą zależności kalibracyjnej między czasem ekspozycji a frakcją uncaging, gdzie widmo absorpcyjne po fotolizie jest charakteryzowane za pomocą spektroskopii UV-Vis. Membrana z nanoporowatego poliwęglanu (PCTE) może być zintegrowana z urządzeniem mikroprzepływowym, aby umożliwić ciągłe usuwanie przez przepływ związków nieumieszczonych w sadzkach i zużytych mediów. Silne, nieodwracalne wiązanie między membraną PCTE a strukturą mikroprzepływową PDMS uzyskuje się poprzez pokrycie membrany roztworem 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES), a następnie aktywację plazmową łączonych powierzchni. System sterowany komputerowo może generować zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych lokalizacjach i o różnej intensywności, tak aby tworzyć krajobrazy zasobów o określonej zmienności przestrzennej i czasowej. W każdym krajobrazie chemicznym można uzyskać dynamikę przemieszczania się bakterii w skali indywidualnej i ich akumulacji na poziomie populacji, co pozwala na ilościowe określenie wydajności chemotaktycznej i jej wpływu na agregacje bakterii w środowiskach istotnych z ekologicznego punktu widzenia.

Wprowadzenie

Mikroby polegają na chemotaksji, procesie wykrywania gradientów chemicznych i modyfikowania ruchliwości w odpowiedzi1, aby poruszać się po krajobrazach chemicznych, zbliżać się do źródeł składników odżywczych i gospodarzy oraz uciekać przed szkodliwymi substancjami. Te procesy w mikroskali określają kinetykę interakcji między mikroorganizmami a ich środowiskiem2,3. Ostatnie postępy w mikrofluidyce i technologiach mikrowytwarzania, w tym miękka litografia4, zrewolucjonizowały naszą zdolność do tworzenia kontrolowanych mikrośrodowisk, w których można badać interakcje mikroorganizmów. Na przykład wcześniejsze eksperymenty badały chemotaksję bakteryjną poprzez generowanie wysoce kontrolowanych, stabilnych gradientów o średnich i wysokich stężeniach składników odżywczych5,6. Jednak w środowisku naturalnym gradienty chemiczne w mikroskali mogą być krótkotrwałe - rozpraszane przez dyfuzję molekularną - a warunki tła są często bardzo rozcieńczone7. Aby bezpośrednio zmierzyć odpowiedź chemotaktyczną populacji drobnoustrojów po raz pierwszy wystawionych na działanie niestabilnego środowiska chemicznego, opracowaliśmy i opisujemy metody łączenia technologii mikroprzepływowej z fotolizą, naśladując w ten sposób gradienty, które dzikie bakterie napotykają w naturze.

Technologia uncaging wykorzystuje światłoczułe sondy, które funkcjonalnie zamykają biomolekuły w nieaktywnej formie. Napromieniowanie uwalnia cząsteczkę w klatce, umożliwiając ukierunkowane zakłócenie procesu biologicznego8. Ze względu na szybką i precyzyjną kontrolę chemii komórkowej, którą zapewnia odblokowanie9, fotoliza związków w klatkach jest tradycyjnie stosowana przez biologów, fizjologów i neurobiologów do badania aktywacji genów10, kanały jonowe11, oraz neurons12. Niedawno naukowcy wykorzystali znaczące zalety fotolizy do zbadania chemotaksji13, do określenia dynamiki przełączania wici w poszczególnych komórkach bakteryjnych wystawionych na stopniowy bodziec chemoatraktantowy14,15, oraz do zbadania wzorców ruchliwości pojedynczych plemników w trójwymiarowych (3D) gradientach16.

W naszym podejściu, wdrażamy fotolizę aminokwasów w klatkach w urządzeniach mikroprzepływowych, aby badać reakcję behawioralną populacji bakterii na kontrolowane impulsy chemiczne, które stają się niemal natychmiast dostępne dzięki wydaniu zdjęć. Zastosowanie obiektywu o małym powiększeniu (4x) (NA = 0,13, głębokość ostrości około 40 μm) pozwala zarówno na obserwację agregacyjnej odpowiedzi tysięcy bakterii na poziomie populacji w dużym polu widzenia (3,2 mm x 3,2 mm), jak i na pomiar ruchu na poziomie pojedynczej komórki. Przedstawiamy dwa zastosowania tej metody: 1) uwolnienie pojedynczego impulsu chemicznego w celu zbadania dynamiki akumulacji i rozpraszania bakterii w oparciu o warunki jednorodne oraz 2i) uwolnienie wielu impulsów w celu scharakteryzowania dynamiki akumulacji bakterii w zmiennych w czasie, przestrzennie niejednorodnych warunkach chemoatraktantu. Metoda ta została przetestowana na bakteriach morskich Vibrio ordalii wykonujących chemotaksję w kierunku aminokwasu glutaminianu17, ale metoda ta ma szerokie zastosowanie do różnych kombinacji gatunków i chemoatraktantów, a także do procesów biologicznych poza chemotaksją (np. pobieranie składników odżywczych, ekspozycja na antybiotyki, quorum sensing). Podejście to może pomóc w wyjaśnieniu ekologii i zachowania mikroorganizmów w realistycznych środowiskach oraz w odkryciu ukrytych kompromisów, z jakimi borykają się poszczególne bakterie podczas poruszania się po efemerycznych gradientach dynamicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wykonanie urządzenia mikroprzepływowego do eksperymentu z pojedynczym impulsem chemicznym

  1. Zaprojektuj kanał przy użyciu oprogramowania wspomaganego komputerowo (CAD), a następnie wydrukuj go na folii przezroczystej, aby stworzyć maskę naświetlającą (Rycina 1A).
  2. Wykonaj matrycę metodą litografii miękkiej (w warunkach pomieszczenia czystego).
    1. Oczyść wafle krzemowy (4 cale) kolejno acetonem, metanolem i izopropanolem, a następnie wysusz azotem. Wypal wafle w piekarniku w temperaturze 130 °C przez 5 min.
    2. Umieść wafle w centrum urządzenia do nanoszenia warstw metodą wirową (spin-coater) i wlej na niego fotorezyst SU-8. Zwiększaj prędkość wirowania do 500 rpm w ciągu 5 s i utrzymuj ją przez 10 s. Zwiększ prędkość do wartości końcowej w ciągu 10 s i utrzymuj ją przez 30 s.
      UWAGA: Dokładna wartość prędkości końcowej zależy od docelowej grubości powłoki oraz użytego fotorezystu SU-8.
    3. Po procesie nanoszenia metodą wirową wypal wafle w temperaturze 65 °C, a następnie w 95 °C. Pozostaw wafle do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 5 min.
      UWAGA: Czas wypalania zależy od docelowej grubości i rodzaju użytego fotorezystu. Jako ogólną zasadę, dla każdej warstwy 100 µm wafle należy wypalać przez 5 min w 65 °C i 45 min w 95 °C.
    4. Nałóż maskę naświetlającą na wafle, aby upewnić się, że naświetlony i spolimeryzowany zostanie tylko obszar zainteresowania. Naświetlaj światłem UV przez czas zalecany w instrukcji SU-8.
      UWAGA: W tym przypadku, przy energii naświetlania 200 mJ cm-2 i długości fali 350 nm, wafle naświetlano przez 150 s.
    5. Wypal wafle w temperaturze 65 °C i 95 °C przez czas zalecany w instrukcji SU-8.
      UWAGA: Jako ogólną zasadę, dla każdej warstwy 100 µm wafle należy wypalać przez 5 min w 65 °C i 45 min w 95 °C.
    6. Zanurz wafle w zlewce wypełnionej wywoływaczem do polimetakrylanu metylu (PMMA), aby uzyskać matrycę. Delikatnie potrząśnij zlewką, aby upewnić się, że niespolimeryzowany fotorezyst został wypłukany. Wypal matrycę w 200 °C, aby dodatkowo sieciować warstwę SU-8.
  3. Przygotuj mieszaninę polidimetylosiloksanu (PDMS), łącząc elastomer z utwardzaczem (Tabela materiałów) w stosunku 10:1 w zlewce (tutaj 40 mL). Mieszaj energicznie, aż ciecz stanie się jednorodna.
    UWAGA: Mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą, ponieważ podczas procesu mieszania powstają pęcherzyki powietrza.
    OSTROŻNIE: Aby zapobiec kontaktowi skóry z potencjalnie niebezpiecznymi chemikaliami lub materiałem biologicznym, przez cały czas trwania protokołu należy nosić fartuch laboratoryjny i jednorazowe rękawice plastikowe oraz stosować się do wszelkich specyficznych protokołów bezpieczeństwa zgodnie z kartą charakterystyki materiału (MSDS).
  4. Odgazuj mieszaninę PDMS w komorze próżniowej przez 45 min w RT. Aby przyspieszyć proces, okresowo przerywaj próżnię w celu rozbicia pęcherzyków tworzących się na granicy faz.
    UWAGA: Proces odgazowywania musi zostać przeprowadzony w ciągu 1 h, aby zapobiec rozpoczęciu utwardzania mieszaniny PDMS.
  5. Usuń kurz z powierzchni matrycy za pomocą sprężonego powietrza, następnie wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na matrycę i wypal w piekarniku w 80 °C przez 2 h.
    UWAGA: Alternatywnie, wypalanie przez noc (lub co najmniej przez 12 h) w 60 °C pozwoli uzyskać tak samo utwardzony PDMS.
  6. Wytnij PDMS skalpelem wokół mikrostruktur (w odległości około 5 mm), a następnie ostrożnie odklej PDMS od matrycy.
  7. Wypuść otwory, które będą służyć jako wlot i wylot mikrokanału (tutaj jeden wlot i jeden wylot, patrz Rycina 1A). Upewnij się, że nic nie dotyka dolnej powierzchni PDMS, na której znajdują się struktury.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. Mikrokanał należy zabezpieczyć taśmą klejącą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu i innych cząsteczek podczas przechowywania.
  8. Przytwierdź mikrokanał z PDMS do szkiełka przedmiotowego.
    1. Dokładnie oczyść szkiełko przedmiotowe mydłem, izopropanolem i wodą dejonizowaną. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia lub użyj sprężonego powietrza, aby przyspieszyć proces.
    2. Usuń cząsteczki kurzu, przykładając taśmę klejącą. Przytwierdź mikrokanał z PDMS do czystego szkiełka przedmiotowego natychmiast po potraktowaniu obu powierzchni plazmą (używając systemu koronowego lub komory plazmy tlenowej) przez 2 min.
    3. Umieść urządzenie mikrofluidyczne na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C na co najmniej 1 h, aby wzmocnić wiązanie chemiczne ze szkłem.

2. Wykonanie wydrukowanego w technologii 3D urządzenia milifluidycznego do eksperymentu z wielokrotnymi impulsami

  1. Zaprojektuj kształt 3D przy użyciu oprogramowania do projektowania 3D i wydrukuj matrycę do formy z PDMS za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1B).
    UWAGA: Informacje na temat użytej drukarki 3D oraz materiału formy do stworzenia matrycy znajdują się w Tabeli materiałów.
  2. Powtórz kroki 1.3−1.4, a następnie oczyść powierzchnię matrycy, przykładając do niej taśmę klejącą. Umieść matrycę na wadze, a następnie, omijając centralny obszar matrycy, który będzie zajęty przez membranę, wlej dokładną ilość nieutwardzonej mieszaniny PDMS (w tym przypadku 23,4 g), aby uzyskać pożądaną wysokość PDMS zgodną z wysokością matrycy (w tym przypadku 0,5 mm). Usuń pozostałe pęcherzyki powietrza za pomocą sprężonego powietrza.
  3. Umieść odlew PDMS na matrycy w piekarniku w temperaturze 45 °C i wygrzewaj przez co najmniej 12 h.
  4. Przytwierdź trójwymiarową formę z PDMS do szalki Petriego.
    1. Ostrożnie odklej utwardzoną warstwę PDMS i wykonaj otwory wlotowe oraz wylotowe do iniekcji zawiesiny bakteryjnej (Rysunek 1C).
    2. Aktywuj zarówno powierzchnię szalki Petriego (90 mm x 15 mm), jak i formę z PDMS w plazmie tlenowej przez 2 min. Przytwierdź formę z PDMS do szalki Petriego. Delikatnie dociśnij formę do szalki, jednak nie naciskaj w miejscach, gdzie znajdują się elementy strukturalne, ponieważ może to doprowadzić do zapadnięcia się komory badawczej.
    3. Umieść szalkę Petriego z przytwierdzoną trójwymiarową formą z PDMS w piekarniku w temperaturze 45 °C na co najmniej 12 h, aby wzmocnić wiązanie chemiczne.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
  5. Funkcjonalizacja powierzchni membrany18
    1. Aktywuj nanoporowatą membranę z poliwęglanu (PCTE) w komorze plazmy tlenowej przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT).
      OSTROŻNIE: Unikaj stosowania systemu koronowego do aktywacji plazmą, ponieważ uszkodzi on membranę.
    2. W dygestorium rozcieńcz komercyjny roztwór 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) w wodzie dejonizowanej do stężenia 1% objętościowo (w tym przypadku 40 mL), używając probówki z polipropylenu.
      OSTROŻNIE: Roztwór APTES jest silnie toksyczny (wskaźnik zagrożenia zdrowia w MSDS: 3) i należy z nim obchodzić się z najwyższą ostrożnością, wyłącznie w dygestorium i w rękawiczkach. Zmień rękawiczki natychmiast po kontakcie z roztworem APTES. Opary APTES działają niszcząco na błony śluzowe i górne drogi oddechowe. Organami docelowymi APTES są nerwy, wątroba i nerki. W przypadku braku dygestorium należy stosować przyłbicę oraz respirator pełnotwarzowy.
    3. Przenieś rozcieńczony roztwór APTES do szalki Petriego i zanurz aktywowaną membranę w roztworze APTES na 20 min.
    4. Wyjmij membranę z roztworu APTES pęsetą i połóż na chusteczce do czystych pomieszczeń (cleanroom wipe) do wyschnięcia.
  6. W celu wykonania mikroprzepływowych kanałów z PDMS, które będą spoczywać na membranie i umożliwiać płukanie areny bakteryjnej, powtórz kroki 1.1−1.7.
  7. Przytwierdź kanały płuczące z PDMS do funkcjonalizowanej membrany.
    1. Aktywuj zarówno kanał płuczący z PDMS, jak i membranę PCTE w komorze plazmy tlenowej przez 2 min.
      UWAGA: Membrana, która zostanie zamknięta między dwiema warstwami PDMS, powinna być mniejsza niż kanał płuczący z PDMS.
    2. Natychmiast po obróbce plazmą doprowadź funkcjonalizowaną membranę i kanał płuczący z PDMS do kontaktu, delikatnie dociskając kanał płuczący do membrany.
      UWAGA: Na tym etapie nie należy stosować nadmiernego nacisku, ponieważ może to spowodować (nieodwracalne) przyklejenie się membrany do górnej ścianki kanału, co doprowadzi do jego zablokowania.
  8. Zamknij membranę pomiędzy dwiema warstwami PDMS (Rysunek 1E).
    1. Aktywuj zarówno złączony laminat z kanału płuczącego z PDMS i membrany PCTE, jak i trójwymiarową formę z PDMS wcześniej przytwierdzoną do szalki Petriego w komorze plazmy tlenowej przez 2 min. Doprowadź je do kontaktu i dociśnij do siebie.
    2. Umieść szalkę Petriego z przytwierdzoną strukturą kanapkową w piekarniku w temperaturze 45 °C na co najmniej 12 h, aby wzmocnić wiązanie chemiczne.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.

3. Hodowla komórkowa

  1. Hodować populację V. ordalii (szczep 12B09 lub 12B09pGFP) przez noc (20 h) w pożywce 221619 na inkubatorze wytrząsowym (600 rpm) w temperaturze 30 °C i zebrać komórki w późnej fazie wzrostu wykładniczego. W przypadku izolatów zawierających pGFP, dodać spektynomycynę (50 µg mL-1), aby utrzymać plazmid.
  2. Odwirować 1 mL alikwot komórek przy 2500 x g przez 3 min, usunąć nadosad i ponownie zawiesić komórki w 1 mL filtrowanej sztucznej wody morskiej. Powtórzyć ten krok.
  3. Głodzić populację V. ordalii na inkubatorze wytrząsowym (600 rpm) w temperaturze 30 °C przez 3 h.
  4. Przygotować roztwór zapasowy 4-metoksy-7-nitroindolinylo-klatkowo-L-glutaminianu (MNI-caged-L-glutamate) w sztucznej wodzie morskiej o stężeniu 10 mM (w tym przypadku 1 mL) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Chronić roztwór MNI-caged-L-glutamate przed światłem otoczenia, aby zapobiec fotolizie.
  5. Rozcieńczyć komórki 50-krotnie, zawieszając zagłodzone komórki w roztworze sztucznej wody morskiej zawierającym 1 mM MNI-caged-L-glutamate.
    UWAGA: Zapewni to końcowe stężenie bakterii poniżej 5 x 107 mL-1 (dokładna wartość zależy od początkowego stężenia komórek w późnej fazie wykładniczej, które zazwyczaj wynosi ~109 mL-1). Stężenie bakterii oszacowano za pomocą spektrofotometru przy gęstości optycznej (OD) 600 nm.

4. Kalibracja protokołu uwalniania z klatki

  1. Na szkiełko przedmiotowe nanieść kroplę (20 μL) roztworu sztucznej wody morskiej zawierającego MNI-caged-L-glutamate20 o stężeniu C0 = 10 mM. Zamknąć kroplę, przykrywając ją okrągłą komorą z PDMS (średnica d = 5 mm, wysokość h = 250 μm).
  2. Umieścić szkiełko przedmiotowe na stoliku mikroskopu i naświetlać całą komorę przez 20 ms wiązką LED o długości fali 395 nm (moc 295 mW), korzystając z obiektywu 4x (apertura numeryczna [NA] = 0,13).
  3. Otworzyć komorę z PDMS i pobrać kroplę (1 μL) do analizy spektrofotometrem UV-Vis.
  4. Powtórzyć kroki 4.1–4.3 dla różnych czasów naświetlania LED: 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (lub do momentu nasycenia reakcji chemicznej) oraz 0 s (w celu uzyskania tła). Powtórzyć kroki procedury 4.1–4.4 co najmniej 3 razy (w tym przypadku 4 razy).
  5. Ze spektru absorpcyjnego odczytać wartość przy 405 nm, która odpowiada piki w widmie absorpcyjnym cząsteczki klatki21. Aby wyznaczyć szybkość k reakcji chemicznego uwalniania indukowanego naświetlaniem LED14, użyć następującego równania kinetyki pierwszego rzędu do dopasowania numerycznego danych eksperymentalnych17
    Równanie wzrostu wykładniczego, C(t)=C₀(1-e^(-kt)), analiza wzoru matematycznego.
    gdzie C(t) to wartość widma absorpcyjnego roztworu przy 405 nm (po odjęciu tła) dla czasu uwalniania t sekund. Dla krótkich czasów uwalniania t, gdy kt 1, Równanie 1 można uprościć do postaci liniowej
    Równanie zaniku wykładniczego, \( C(t)=C_0 e^{kt} \), przedstawione w formacie wzoru naukowego.

5. Eksperyment z pojedynczym impulsem chemicznym

  1. Utrzymywać kanał mikrofluidyczny w próżni przez 20 min w celu zmniejszenia stężenia gazu w PDMS, aby zminimalizować prawdopodobieństwo powstawania pęcherzyków podczas procesu napełniania.
  2. Wyjąć kanał z pompy próżniowej i natychmiast wprowadzić do mikrokanału rozcieńczoną zawiesinę bakterii w 1 mM MNI-caged-L-glutaminianie w sztucznej wodzie morskiej, robiąc to delikatnie za pomocą mikropipety, aby uniknąć uszkodzenia wici przez siły ścinania mechanicznego (w tym przypadku cały proces napełniania trwał 5-10 s). Po napełnieniu kanału zawiesiną bakteryjną, odssać nadmiar roztworu za pomocą ręcznika papierowego i uszczelnić wlot oraz wylot korkami z PDMS, delikatnie dociskając je do otworów.
    UWAGA: W ten sposób zapobiega się przepływowi cieczy w komorze.
  3. Umieścić mikrokanał na stoliku mikroskopu i przesunąć stolik tak, aby pole widzenia znajdowało się w połowie kanału. Skonfigurować mikroskop do obrazowania w kontraście fazowym (obiektyw 4x) przy częstotliwości klatek 12 fps.
    UWAGA: Wartość ta może być zmienna, ale nie powinna być mniejsza niż 10 fps, aby umożliwić rekonstrukcję trajektorii bakterii poprzez analizę obrazu (patrz sekcja protokołu 7).
  4. Ustawić otwór pinhole wiązki LED na minimalną aperturę. Ustawiając czas ekspozycji kamery na 5 s, zarejestrować kilka klatek, aby uzyskać precyzyjne pomiary położenia przestrzennego i rozmiaru wiązki LED.
    UWAGA: Źródło światła LED jest połączone z iluminatorem epifluorescencyjnym mikroskopu za pomocą płynnego światłowodu. Wiązka LED nie wpływa na przechwytywanie wideo, ponieważ akwizycja wideo i stymulacja LED są sterowane niezależnie za pomocą oprogramowania.
  5. Przeprowadzić ciągłe obrazowanie przez łączny czas 10 min (20 min dla największego impulsu chemicznego) i jednocześnie aktywować skupioną wiązkę LED o długości fali 395 nm przez pożądany czas (w tym eksperymencie t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) w zdefiniowanym przez użytkownika punkcie czasowym (tutaj 10 s po rozpoczęciu akwizycji wideo) za pomocą oprogramowania mikroskopu. Aby uzyskać wiele powtórzeń tego samego procesu, przesunąć stolik, aby zarejestrować odpowiedź bakterii w różnych pozycjach kanału mikrofluidycznego. Powtórzyć tę procedurę dla każdego rozmiaru impulsu, używając nowego mikrokanału.
    UWAGA: Proces uwalniania (uncaging) generuje osiowo-symetryczny impuls cylindryczny, który dyfunduje radialnie na zewnątrz w płaszczyźnie obrazowania.
  6. Przeprowadzić oddzielne eksperymenty bez chemicznego uwalniania przy większym powiększeniu (obiektyw 20x, NA = 0.45) i wyższej częstotliwości klatek (50 fps), aby zarejestrować niezakłócony ruch pływający bakterii.

6. Eksperyment z wielokrotnym impulsem chemicznym

  1. Utrzymuj komorę milifluidyczną w próżni przez 20 min.
  2. Umieść szalkę Petriego zawierającą komorę milifluidyczną na stole mikroskopu. Wypełnij komorę pod membraną rozcieńczoną zawiesiną bakterii (w tym przypadku cały proces napełniania trwał 10–15 s) wykazujących fluorescencję GFP *V. ordalii* w 1 mM MNI-caged-Lroztwór glutaminianu w sztucznej wodzie morskiej. Po napełnieniu kanału zawiesiną bakteryjną, nadmiar roztworu należy odssać za pomocą ręcznika papierowego, a wlot i wylot zamknąć korkami z PDMS, delikatnie dociskając je do otworów.
    UWAGA: W ten sposób zapobiega się przepływowi cieczy w komorze. Aby umożliwić lepszą wizualizację bakterii w tej konfiguracji, w której obrazowanie odbywa się przez membranę nanoporowatą, zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepów fluorescencyjnych zamiast typu dzikiego (użytego w eksperymencie z pojedynczym impulsem chemicznym).
  3. Napełnić strzykawkę sztucznym roztworem wody morskiej zawierającym 1 mM MNI-caged-L-glutaminianu i podłączyć rurki do wlotu oraz wylotu kanału płuczącego znajdującego się nad membraną.
  4. Podłączyć rurkę do zbiornika na odpady i upewnić się, że jest ona całkowicie zanurzona w cieczy w zbiorniku na odpady, aby uniknąć oscylacji ciśnienia.
  5. Ustaw odpowiednią prędkość przepływu na pompie strzykawkowej (tutaj, 50 μL min-1) w celu uzyskania pożądanego średniego natężenia przepływu w kanale płuczącym, które zależy od geometrii kanału.
  6. Uruchom pompę strzykawkową, aby ustanowić przepływ w kanale płuczącym nad membraną.
  7. Uruchom oprogramowanie sterujące wiązką LED oraz stolikiem mikroskopu, aby wygenerować zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych lokalizacjach i o różnej intensywności.
    UWAGA: Ciągły przepływ roztworu sztucznej wody morskiej zawierającego 1 mM MNI-caged-L-glutaminian w kanale płuczącym powyżej błony uzupełnia roztwór związku w klatce i wypłukuje zużyte medium z areny bakteryjnej.
  8. Nagrywaj wideo przy użyciu obiektywu 4x w regularnych odstępach czasu przez kilka godzin oraz w wielu sąsiednich obszarach, aby objąć dużą powierzchnię (w tym przypadku 1 cm x 1 cm, Rycina 1F).

7. Analiza obrazów i analiza danych

  1. Rekonstrukcja trajektorii bakterii
    1. Na podstawie filmów zarejestrowanych przy użyciu obiektywu 4x, zrekonstruować trajektorie bakterii, korzystając z oprogramowania do śledzenia (tracking software)17.
      UWAGA: Trajektorie te stanowią rzuty 2D trójwymiarowego ruchu bakterii w mikrokanale.
    2. Na podstawie zrekonstruowanych trajektorii bakterii wyznaczyć radialną prędkość dryfu każdego pływającego osobnika poprzez rzutowanie jego prędkości pływania na kierunek prowadzący do centrum impulsu chemicznego (Rysunek 2D). Do wizualizacji dynamiki czasowo-przestrzennej radialnej prędkości dryfu należy użyć siatki binowania o rozmiarze przestrzennym 75 μm x 75 μm i oknie czasowym w odstępach 5−10 s (Rysunek 2D,E).
      UWAGA: Ze względu na cylindryczną symetrię procesu dane można analizować w układzie współrzędnych biegunowych i uśredniać w wymiarze kątowym (Rysunek 3).
    3. Na podstawie zrekonstruowanych trajektorii bakterii wyznaczyć dynamikę czasowo-przestrzenną rozkładu bakterii w odpowiedzi na impulsy chemiczne (Rysunek 2E).
    4. Z filmów o wyższej rozdzielczości, zarejestrowanych przy użyciu obiektywu 20x podczas eksperymentów z pojedynczym impulsem, wyodrębnić rozkład prędkości pływania i czasu trwania runu dla populacji bakterii reagujących na impuls chemiczny (Rysunek 4).
  2. Oszacować współczynnik dyfuzji bakterii, biorąc pod uwagę dynamikę dyssypacji populacji bakterii po zakończeniu chemotaksji17 (tutaj dla t > 300 s; Rysunek 3).
  3. Oszacować współczynnik dyfuzji glutaminianu, stosując równanie Stokesa-Einsteina
    Wzór na współczynnik dyfuzji \(D_c = k_BT/(6\pi\eta r)\), schemat równania dla badań fizycznych.
    gdzie przyjmuje się, że cząsteczki aminokwasów są cząstkami sferycznymi o promieniu hydrodynamicznym22 rG, kB to stała Boltzmanna (1.38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T to temperatura (296 K), a η to lepkość dynamiczna sztucznej wody morskiej (zasolenie 36 g kg-1) w 23 °C (10-3 Pa s)23

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do badania profili akumulacji bakterii w dynamicznych warunkach odżywczych wykorzystaliśmy urządzenia mikrofluidyczne i millifluidyczne (Rysunek 1). Trajektorie bakterii wyekstrahowano z nagrań wideo uzyskanych za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej, rejestrujących dynamikę akumulacji i dyssypacji populacji bakterii po impulsie chemicznym wywołanym fotolizą (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Poprzez uśrednienie milionów trajektorii uzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda ta pozwala naukowcom badać chemotaksję bakteryjną pod kontrolowanymi, dynamicznymi gradientami w urządzeniach mikro- i miliprzepływowych, umożliwiając powtarzalne pozyskiwanie danych. Niemal natychmiastowe wytwarzanie impulsów chemicznych w mikroskali w procesie fotolizy ma na celu odtworzenie rodzajów impulsów odżywczych, które bakterie napotykają w naturze z różnych źródeł, na przykład dyfuzyjnego rozprzestrzeniania się pióropuszy za tonącymi cząstkami morskimi25 lub rozprzestrzeniania si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują PIERWSZEMU zakładowi mikrofabrykacji na ETH Zurich. Praca ta została wsparta przez Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (dla D.R.B.), nagrodę Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (dla R.S.) oraz grant Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (dla R.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)Sigma-AldrichA3648>98% czystości, wysoce toksyczna
probówka CELLSTAR WirówkaGreiner Bio-One21026150 ml
Eppendorf5424Rdo usuwania zużytych pożywek z kultur bakteryjnych
Inkubatory cyfrowe Incu-LineVWR-CH390-0384do pieczenia 3D master
DusterVWR-CH16650-22do czyszczenia płytki i mikrokanalików
Płyta grzejnaVWR-CH444-0601do łączenia mikrokanalików
IzopropanolSigma-AldrichW292907
Mikroprobówki wirówkoweLightSafe Sigma-AldrichZ6883121,5 ml
MATLABMathworksdo analizy obrazu i śledzenia
bakteriiProbówka do mikrowirówekEppendorf301200861,5 ml
Szkiełko mikroskopoweVWR-CH631-1552
Mikroskop Nikon Eclipse TiENikon InstrumentyMEA53100ze zmotoryzowanym stolikiem
MNI-glutaminianTocris Bioscience1490>98 % czystości, światłoczuły
Sprzęt do drukowania formStratasysObjet30 3D drukarka
Usługa drukowania form3D Printing StudiosCustomhttps://www.3dprintingstudios.com/Nanodrop
One Spektrofotometr UV-VisThermo Fisher ScientificND-ONE-Wdo kalibracji odłączania
elementów NISInstrumenty Nikon Obrazowaniemikroskopowe
Oprogramowanie Piekarnik Venti-LineVWR-CH466-3516do pieczenia PDMS (z konwekcją wymuszoną)
Photoresist SU-8-3050MicroChem Corp.SU8-3050
Komora plazmowa ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1do funkcjonalizacji powierzchni przed klejeniem
Membrana poliwęglanowaSterlitechPCT04471000,4 i mikro; m wielkość porów, 19 % otwarta przestrzeń, 24 i mikro; m grubość
Mikrorurki polietylenoweScientific CommoditiesBB31695-PE/2ID x OD: 0,015 "x 0,043" / 0,38 mm x 1,09 mm
Polistyrenowa płytka PetriegoVWR-CH25373-100dolna powierzchnia (90 mm x 15 mm) do łączenia urządzenia milifluidowego
SkalaVWR-CH611-2605do wagi mieszaniny PDMS
Kamera sCMOS Andor ZylaOxford Instrumentsdo mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji (max 100 kl./s)Sól
morskaInstant OceanNr produktu SS1-160p
SolidWorks 2015Dassault Systèmes, SolidWorksSłuży do zaprojektowania formy
Silnik świetlny Spectra XLumencolordo LED 395 nm
Sylgard 184Dow Corning110-41-155PDMS Si Elastomer Zestaw; utwardzacz
Strzykawka (Luer-Lok)B Braun Omnifix4616308F
Igła do strzykawkiAganiA228od 10 do 30 ml
Pompa strzykawkowa 11 Aparat Pico Plus EliteHarvard70-4506Terumo Agani 23 miernik 5/8 cala (16 mm)
Podwójna pompa strzykawkowaVeroGreyStratasys
Vortex-GenieScientific IndustriesSI-0236Materiał formy

Bibliografia

  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895(2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985(2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548(2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. Nikon depth of field calculator. , Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019).
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231(2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Impulsy chemicznechemotaksja mikrobówfotoliza klatkowanych aminokwasówmikrofluidyczna komora PDMSVibrio ordaliispektroskopia UV-Visnanoporowata membrana PCTEwiązanie plazmowe APTESsterowane komputerowo impulsy LEDanaliza trajektorii bakterii
Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.