Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/60596

⸱

31 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydzielanie małych pęcherzyków błonowych do środowiska zewnętrznego jest podstawowym procesem fizjologicznym wszystkich komórek. Te pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) funkcjonują na zewnątrz komórki, regulując globalne procesy fizjologiczne poprzez przenoszenie białek, kwasów nukleinowych, metabolitów i lipidów między tkankami. EV odzwierciedlają stan fizjologiczny komórek, z których pochodzą. Zakłada się, że pojazdy elektryczne odgrywają fundamentalną rolę w praktycznie każdym aspekcie ludzkiego zdrowia. W związku z tym białko EV i ładunki genetyczne są coraz częściej analizowane pod kątem biomarkerów zdrowia i choroby. Jednak w dziedzinie pojazdów elektrycznych nadal brakuje wykonalnego systemu modeli bezkręgowców, który pozwalałby na badanie składu ładunku pojazdów elektrycznych. C. elegans dobrze nadaje się do badań nad pojazdami elektrycznymi, ponieważ aktywnie wydziela pojazdy elektryczne na zewnątrz swojego organizmu do środowiska zewnętrznego, co pozwala na łatwą izolację. Ten artykuł zawiera wszystkie niezbędne informacje do generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania tych wydzielanych przez środowisko pojazdów elektrycznych C. elegans, w tym sposób ilościowej pracy z bardzo dużymi populacjami robaków zsynchronizowanych z wiekiem, oczyszczanie EV oraz protokół cytometrii przepływowej, który bezpośrednio mierzy liczbę nienaruszonych EV w oczyszczonej próbce. W ten sposób duża biblioteka odczynników genetycznych dostępnych do badań nad C. elegans może być wykorzystana do zbadania wpływu szlaków genetycznych i procesów fizjologicznych na skład ładunku EV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) związanych z błoną ułatwia globalne procesy fizjologiczne poprzez aktywne transportowanie określonych ładunków białek, kwasów nukleinowych, metabolitów i lipidów między komórkami1. Komórki wydzielają EV o rozmiarach od 2 μm lub większych do nawet 20 nm2 . Małe EV (<200 nm) są coraz częściej badane ze względu na ich wpływ na procesy patologiczne, w tym zaburzenia metaboliczne, nowotwory, choroby układu krążenia i choroby neurodegeneracyjne3,4,5. Wykazano również, że patologie te wpływają na białko i skład genetyczny ładunków EV małych pojazdów elektrycznych. W związku z tym sygnatury biomarkerów patologii są coraz częściej odkrywane za pomocą metod wykrywania ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak LC-MS-MS i RNAseq6,7,8,9.

C. elegans był użytecznym modelem bezkręgowców do identyfikacji ewolucyjnie zachowanych szlaków sygnałowych EV. Na przykład, po raz pierwszy wykazano, że flippaza C. elegans indukuje biogenezę EV w zarodkach C. elegans, a ludzki homolog wpływa na uwalnianie EV w komórkach ludzkich10,11. C. elegans (C. elegans) Doniesiono, że pojazdy elektryczne przenoszą sygnały Hedgehog niezbędne do rozwoju naskórka. Wykazano, że dostarczanie jeża i innych morfogenów odgrywa główną rolę rozwojową EV i jest zachowane u danio pręgowanego, myszy i ludzi12,13,14,15. C. elegans dobrze nadaje się do odkrywania biomarkerów EV, ponieważ wydziela EV na zewnątrz swojego ciała, które funkcjonują w komunikacji między zwierzętami16,17 (Rysunek 1A). Jednak metodologia ustalona w poprzednim badaniu nie może być zastosowana, ponieważ źródło pożywienia E. coli nicieni również wydziela EVs18. W tej metodzie większość próbki składa się z zanieczyszczenia E. coli, co ogranicza moc podejść proteomicznych lub RNAseq do odkrywania ładunków EV C. elegans. Opisane tutaj metody zostały opracowane w celu uzyskania wysoce czystych EV C. elegans na poziomach obfitości charakterystycznych dla typowych eksperymentów z hodowlami komórkowymi, a tym samym ułatwienia podejść omicznych do odkrywania biomarkerów EV.

Duże populacje robaków są potrzebne do wygenerowania wystarczającej liczby pojazdów elektrycznych do analizy ładunku. W związku z tym uwzględniono również metody prowadzenia hodowli ilościowej dużych populacji zsynchronizowanych rozwojowo C. elegans. Zazwyczaj, gdy do eksperymentów potrzebna jest duża liczba robaków, są one hodowane w płynnych podłożach. Chociaż jest to skuteczne w generowaniu dużych populacji robaków, fizjologia zwierząt znacznie różni się od robaków hodowanych w standardowych warunkach na płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM). Zwierzęta hodowane w płynie rosną wolniej, są szczuplejsze, wykazują niejednorodność rozwojową i podlegają dużej zmienności partii. Dlatego przedstawiamy prosty, ale skuteczny sposób na ilościową hodowlę dużych populacji zsynchronizowanych rozwojowo C. elegans przy użyciu 10-centymetrowych płytek o wysokim wzroście. Skład pożywki płytek o wysokim wzroście zawiera więcej peptonu niż zwykłe płytki NGM i są wysiewane szczepem E. coli NA22, który rośnie mocniej niż OP50.

Postępy w technologii cytometrii przepływowej (FACS) umożliwiły bezpośrednią analizę poszczególnych EVs20,21, umożliwiając kwantyfikację EV bez nieodłącznych ograniczeń innych metod. Wcześniejsze prace wykazały, że białko nie jest użytecznym wskaźnikiem obfitości EV, ponieważ różne metodologie oczyszczania skutkują znacznie różnymi stosunkami EV do białka22. Niezwykle czyste frakcje EV zawierają stosunkowo mało białka, co utrudnia ilościowe oznaczanie próbek za pomocą żeli BCA lub Coomassie. Analiza zachodnia może zidentyfikować względne różnice poszczególnych białek, ale nie może określić, ile EV znajduje się w próbce. Solidna kwantyfikacja liczby EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek jest utrudniona przez wąski zakres sygnału do szumu, niemożność rozróżnienia między EV a agregatami stałymi oraz brak możliwości przenoszenia metod między instrumentami o różnych specyfikacjach23. Dlatego artykuł ten zawiera również uogólnioną procedurę cytometrii przepływowej do rozróżniania i ilościowego określania EV.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Dodaj 2 g żelatyny do 100 mldH 2O i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż zacznie wrzeć. Następnie wymieszaj i pozwól mu ostygnąć przez 20 minut.
  2. Przepuść roztwór przez filtr 0,22 μm i przelej do sterylnych probówek. Bezpośrednio przed użyciem należy potraktować końcówki pipet żelatyną, odpipetowując i usuwając roztwór żelatyny. Leczone końcówki można użyć natychmiast lub przechowywać.
  3. Wytnij membranę ze sterylnego filtra nasadkowego.
  4. Zwilż 20 cm kwadratowy nylonowej tkaniny siatkowej o grubości 5 μm i umieść wokół górnej części sterylnego filtra nasadkowego. Zabezpiecz go kilkoma grubymi gumowymi opaskami.
    UWAGA: Dokładnie sprawdź tkaninę, aby upewnić się, że nie ma zagnieceń. Tworzą one szczeliny powietrzne, które utrudniają ssanie.

2. Obliczanie dużych populacji robaków (Rysunek 1A)

  1. Odkręcić i odpipetować 10 μl zawiesiny robaków na pokrywie płytki do hodowli ślimaków lub na szkiełku podstawowym. Powtórz ten proces 3 razy. Zapisz liczbę zwierząt w każdej kropli.
  2. Dostosuj zawiesinę ślimaka do dwóch zwierząt na μl.
  3. Spłukać zawiesinę i odpipetować dziewięć kropli (10 μl) na szkiełku podstawowym lub pokrywce płytki. Ręcznie policz liczbę zwierząt. Zapisz liczbę zwierząt w każdej kropli.
  4. Obliczyć średnią i błąd standardowy średniej (S.E.M.) jako procent każdej populacji robaków.
  5. Obliczyć całkowitą liczbę zwierząt w każdej populacji, dzieląc średnią wartość przez 10 μl, a następnie mnożąc przez całkowitą objętość zawiesiny robaków w μl.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd procedur generowania, oznaczania ilościowego i oczyszczania pojazdów elektrycznych C. elegans. (A) Schemat liczenia dużych populacji zwierząt. (B) Schemat generowania robaków do zbierania EV. (C) Schemat oczyszczania EV z C. elegans supernatent. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Uprawa C. elegans do oczyszczania EV

  1. Wygeneruj dużą populację zsynchronizowanych rozwojowo C. elegans. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Dodaj pojedyncze zwierzę na 6 cm normalnej pożywce wzrostowej. Inkubować przez dwa pokolenia, a następnie umyć zwierzęta na dwóch płytkach o wysokim wzroście.
    2. Inkubuj, aż robaki wyczerpią pokarm.
    3. Przefiltruj robaki L1 za pomocą siatki nylonowej 5 μm przygotowanej w kroku 1.4. Umieść zakrętkę na sterylnej butelce, uruchom odkurzacz i wlej robaki na filtr. Przepuścić tę samą objętość pożywki przez agregaty ślimaków na filtrze.
    4. Określ ilościowo robaki i oblicz ich całkowitą liczbę (patrz krok 2). Niedawno wygłodzone (<24 h) robaki wyhodowane na wysokiej płytce wzrostu dają około 80 000 larw L1.
    5. Odwirować larwy L1 w ilości 2 000 x g przez 3 minuty. Zawiesić do ~100 000 zwierząt na ml.
    6. Umieść ~50 000 zwierząt na talerzu o wysokim wzroście. Hodować zwierzęta w temperaturze 20 °C, aż osiągną dorosłe osobniki (około 72 godziny).
    7. Wybielać graitujące dorosłe osobniki standardowymi środkami i pozwolić zarodkom wykluć się w 10 ml roztworu S Basal z 2,5 μg/ml cholesterolu.
    8. Określ ilościowo larwy L1 (patrz krok 2), a następnie dodaj 50 000 robaków do każdej płytki o wysokim wzroście.
    9. Uprawiać talerze w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta osiągną młode dorosłe osobniki.
  2. Przygotuj C. elegans do generacji sekretomu.
    1. Umyj robaki z płytek, dodając 15 ml sterylnego M9 z 50 μg/ml karbenicyliny do każdej płytki o wysokim wzroście. Pozostaw nasycone talerze na 5 minut. Usuń robaki, okrążając bufor wokół płytki. Unikaj chlupotania. Wlać bufor z każdej płytki do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powtórz etap mycia 2 razy więcej, aby uzyskać łącznie 45 ml buforu na płytkę.
    2. Pozwól robakom osiąść na 15 minut. Zdekantować supernatant i dodać 50 ml świeżego buforu M9 do probówki. Powtórz w sumie 4x.
    3. Umieść robaki na wierzchu 30% gradientu schodkowego sacharozy i odzyskaj zwierzęta w S Basal solution24.
      1. Krótko zawieś robaki w 15 ml lodowatego 100 mM NaCl, dodaj 15 ml lodowatej 60% sacharozy i odwróć do mieszania. Za pomocą szklanej pipety delikatnie nałóż 5 ml lodowatego 100 mM NaCl na wierzch mieszaniny sacharozy.
      2. Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut. Robaki zostaną skoncentrowane na granicy faz między NaCl a sacharozą.
      3. Delikatnie odpipetować zwierzęta z interfejsu do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj roztwór podstawowy S do 50 ml. Pozwól robakom osiąść na 5 minut.
      4. Zdekantować sklarowany osad i dodać świeże 50 ml roztworu S Basal. Powtórz to co najmniej 3 razy.
    4. Określ ilościowo liczbę robaków zgodnie z opisem w kroku 2.
    5. Zawiesić robaki do gęstości jednego zwierzęcia na μl za pomocą sterylnego roztworu podstawowego S zawierającego 2,5 μg/ml cholesterolu i 50 μM karbenicyliny.
    6. Aby przygotować próbkę do wytworzenia sekretomu, dodać do 400 ml zawiesiny do sterylnej kolby o pojemności 2 l z przegrodą dolną.
    7. Umieścić kolby na rotatorze kołowym w inkubatorze o temperaturze 100 °C przy 100 obr./min na 24 godziny.

4. Oczyszczanie EV

  1. Zbiór i frakcjonowanie
    1. Wyjąć 2-litrową kolbę z robakami z inkubatora i rozpakować zwierzęta do stożkowych fiolek o pojemności 50 ml (500 x g przez 2 minuty).
    2. Przelej supernatant przez filtr próżniowy 0,22 μm, aby usunąć wszelkie cząstki stałe.
      UWAGA: W tym momencie przefiltrowany supernatant zawierający sekretom i pęcherzyki może być przechowywany w temperaturze -80 °C.
    3. Policz liczbę zwierząt zgodnie z opisem w kroku 2.
    4. Określ żywotność robaków, umieszczając kroplę zawieszonych robaków na trawniku bakteryjnym. Odczekaj 15 minut, a następnie oceń zwierzęta jako poruszające się, sparaliżowane lub martwe.
    5. Zagęścić przefiltrowany supernatant o wielkości 0,22 μm do 700 μl przy użyciu regenerowanych jednostek filtrujących nitrocelulozę 10 kDa. Dodać 150 μl roztworu podstawowego S, a następnie pipetować przez filtr i wirować. Powtórz 2 razy.
    6. Odwirować stężony supernatant o stężeniu 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej probówki. Ten krok usuwa wszelkie potencjalne zanieczyszczenia lub większe cząstki, które mogły nagromadzić się podczas przenoszenia.
    7. Dodaj koktajl inhibitorów proteazy + EDTA zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: W tym momencie skoncentrowany supernatant zawierający sekretom i pęcherzyki może być przechowywany w temperaturze -80 °C.
  2. Chromatografia wykluczania wielkości
    1. Wlać 80–200 μm żywicy agarozowej (zakres frakcjonowania wielkości porów od 70 000 do 40 000 000 kDa dla białek globularnych) do pustego wkładu kolumny przepływowej grawitacyjnej. Przepływ S Roztwór podstawowy do momentu, gdy złoże żywicy zostanie wypełnione w końcowej objętości 10 ml.
      UWAGA: Jeśli do wkładu kolumny zostanie wlana zbyt duża ilość żywicy, należy rozproszyć górną część kolumny i usunąć nadmiar pipetą.
    2. Przepuścić 40 ml sterylnego, przefiltrowanego roztworu S Basal przez kolumnę i pozwolić mu płynąć pod wpływem grawitacji.
      UWAGA: Sprawdź, czy żywica nie jest naruszona.
    3. Pozwól buforowi płynąć, aż górna część żywicy nie zostanie zanurzona, a następnie zakryj spód wkładu kolumny. Umieść rurkę zbiorczą pod kolumną.
    4. Zdejmij nasadkę umieszczoną na wkładzie. Dodaj skoncentrowany sekretom otrzymany w kroku 2.1 kroplami do górnej części łoża kolumny. Odpipetować kroplami 1 ml roztworu S Basal. Umieść świeżą probówkę zbiorczą pod kolumną.
    5. Powoli napełnij zbiornik górnej kolumny 5 ml roztworu S Basal, aby nie naruszyć żywicy. Zbierz pierwsze 2 ml eluatu, a następnie szybko zmień probówki i zbierz następne 4 ml. Jest to frakcja, która jest wzbogacana dla pojazdów elektrycznych.
    6. Zagęścić eluat do 300 μl za pomocą regenerowanego filtra odcięcia nitrocelulozy 10 kDa o masie cząsteczkowej (MWCO) i przenieść retentat do probówki mikrowirówkowej o niskiej wiązalności.
    7. Przemyć membranę filtracyjną 2x 100 μl roztworu S Basal, wirując przez 20 s i pipetując bufor przez filtr. Dodać do próbki początkowej w celu uzyskania końcowej objętości 500 μl.
    8. Dodaj koktajl inhibitorów proteazy zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. Dalsze eksperymenty należy przeprowadzić natychmiast (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS itp.) lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Kwantyfikacja obfitości EV w cytometrii przepływowej

  1. Przygotowanie barwnika
    1. Przygotuj 10 mM zapasu DI-8-ANEPPS przy użyciu świeżego DMSO. Rozprowadzić w 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować 1 mM roztwór roboczy, dodając 90 μl sterylnego, przefiltrowanego PBS do probówki z 10 μl barwnika.
  2. Przygotowanie próbki doświadczalnej
    1. Dodać 840 μl roztworu S Basal do probówki do mikrowirówki. Następnie dodać 60 μl oczyszczonych EV wytworzonych w sekcji 4.2 i wirować.
    2. Porcję 300 μl próbki do dwóch nowych probówek do mikrowirówek. Obecnie dostępny jest eksperymentalny zestaw trzech probówek zawierających 300 μl rozcieńczonych EV każda. Oznacz probówki #1–3. Do próbek #2 i #3 dodać 7 μl wsadu DI-8-ANEPPS przygotowanego w ppkt. 5.1.2. Następnie dodaj 7 μl 1% Triton-X 100 do probówki #3. Wymieszaj każdą tubkę przez wirowanie.
    3. Sonizuj próbkę #3, umieszczając końcówkę sonikatora w środku próbki i pulsując 10 razy przy 20% mocy 30% cyklu pracy.
      UWAGA: Upewnij się, że końcówka sondy sonikatora znajduje się w środku sample tak, aby wytwarzanie piany było ograniczone do minimum. Piana może uszkodzić próbkę, powodując agregację pojazdów elektrycznych.
    4. Dodać 300 μl roztworu S Basal do dwóch probówek do mikrowirówek. Dodać 7 μl odczynnika roboczego DI-8-ANNEPS przygotowanego w kroku 5.1 do drugiej probówki i oznaczyć etykietą "Tylko barwnik". Oznacz drugą rurkę jako "Tylko bufor".
      UWAGA: Przygotuj próbki kontrolne tylko barwnik i tylko bufor oraz próbki eksperymentalne z tym samym źródłem S Basal.
    5. Próbki należy inkubować z dala od bezpośredniego światła, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Przeprowadzanie eksperymentów FACS.
    1. Ustaw filtr wzbudzenia FACS na 488 nm (niebieski), a filtr emisji na 605 nm (pomarańczowy). Ustaw natężenie przepływu na 1,5 μl na minutę.
    2. Uruchom mieszankę kalibracyjną FACS nanobeadów (opcjonalna, ale zalecana).
    3. Uruchom każdą próbkę na maszynie FACS przez 3 minuty (180 s). Zanotuj dokładny czas pracy w sekundach.
  4. Przeanalizuj dane FACS.
    1. Otwórz pliki za pomocą oprogramowania do analizy FACS.
    2. Przełącz oś Y na 488-Org (obszar), klikając oś, wybierając z menu rozwijanego.
    3. Ustaw prostokątną bramę zaczynającą się na szczycie działki, rozciągającą się od poziomu SALS 102 do 104 (cząstki o wielkości <300 nm). Rozciągnij bramę w dół, aż będzie zawierała 2,5% wszystkich zdarzeń. Nazwij zdarzenia bramki "DI-8-ANEPPS+".
  5. Kwantyfikacja liczebności próbki EV
    1. Skopiuj tę bramkę i wklej ją do pozostałych dwóch próbek w zestawie eksperymentalnym, a także do kontrolek Tylko bufor i Tylko barwnik. Eksportuj analizę do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Jeśli próbki FACS nie były uruchamiane przez zalecane 3 minuty (180 s), znormalizuj wszystkie liczby zdarzeń w próbce do zdarzeń na 180 s. Na przykład, jeśli próbka była prowadzona przez 250 s, numer zdarzenia DI-8-ANEPPS+ jest skalowany o 250 s/180 s.
    3. Usuń zdarzenia tła barwnika, odejmując liczbę zdarzeń DI-8-ANEPPS+ w kontrolce Tylko barwnik od tych w próbce #2.
    4. Usuń zdarzenia tła izotypu, odejmując liczbę zdarzeń DI-8-ANEPPS+ w próbce #1.
    5. Usuń zdarzenia niewrażliwe na detergenty, odejmując liczbę zdarzeń DI-8-ANEPPS+ w próbce #3. Ta wartość to liczba pojazdów elektrycznych działających w dobrej wierze.
    6. Obliczyć liczbę EV w 1 μl próbki, dzieląc wartość obliczoną w kroku 5.5.5 przez objętość analizowaną w μl (4,5 μl analizowane zgodnie z opisem w kroku 5.3) i mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia (10x zgodnie z opisem w kroku 2.5). Pomnóż tę wartość przez liczbę μl pozostałą w preparacie EV. Jest to liczba pojazdów elektrycznych dostępnych do dalszej analizy.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat przygotowania próbki za pomocą cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia obfitości EV. (A) Preparat EV dzieli się na trzy identyczne próbki. Próbka # 1 to kontrola ujemna bez barwnika. DI-8-ANEPPS jest następnie dodawany do próbek #2 i #3. Triton-X 100 jest następnie dodawany do próbki #3. Zielona strzałka wskazuje, że tylko próbka #3 jest następnie sonikowana. Dane z przepływu pomagają określić bezwzględną liczbę wrażliwych na detergent EV w próbkach FACS, a następnie obliczyć obfitość EV w całym przygotowaniu. Bramka do określania zdarzeń barwniko-dodatnich jest ustawiana z próbką #1, która nie zawiera barwnika. Czerwony napis na danych w arkuszu kalkulacyjnym ma zilustrować, że zdarzenia barwnikowo-dodatnie w próbce poddanej działaniu detergentu są odejmowane od próbki za pomocą barwnika. (B) Równania do ilościowego określania EV w próbce analizowanej przez FACS i obliczania całkowitej liczby EV w próbce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat procesów niezbędnych do generowania i oczyszczania EV jest pokazany w Rysunek 1. Typowy czas wymagany do wykonania każdego kroku jest pokazany poniżej. Rysunek 2 pokazuje schemat przygotowania próbek do analizy FACS za pomocą DI-8-ANEPPS (Rysunek 2A), a także obliczenia niezbędne do oszacowania całkowitej liczby EV w próbce (Rysunek 2B).

Reprezentatywne wyniki z 10 biologicznych powtórzeń są pokazane w Rysunek 3A. Zmienność między powtórzeniami nie jest znacząca, a typowy S.E.M. wielkości populacji wynosi nieco ponad 10% (Rysunek 3B). Filtrowanie robaków i uprawa na świeżych, wysokich płytkach wygeneruje dużą populację grawitacyjnych osobników nadających się do synchronizacji wybielacza. Pojedyncza wygłodzona płytka przetworzona w ten sposób może wyprodukować eksperymentalną populację 1 x 10,6 lub więcej zsynchronizowanego potomstwa, ponieważ każdy ciężarny dorosły będzie zawierał około 10 jaj. Możliwe jest utrzymanie dużych populacji zsynchronizowanych rozwojowo poprzez filtrowanie jaj i larw przez filtr 40 μm w celu uzyskania EV od starszych zwierząt. Zatrzymane dorosłe osobniki są przenoszone na świeże płytki o wysokim wzroście w zagęszczeniu 20 000 zwierząt na talerzu. Proces ten powtarzano co 2 dni. Rysunek 3C pokazuje trzy biologiczne repliki populacji robaków przenoszone przez trzy transfery płyt. Przenoszenie zwierząt między płytkami powoduje około 10% utraty zwierząt (Rysunek 3C), podczas gdy około 20% zwierząt jest traconych na etapie flotacji sacharozy (Rysunek 3D).

figure-results-1
Rysunek 3: Kwantyfikacja dużych populacji C. elegans do analizy EV. (A) Porównanie liczby robaków L1 w stadium larwalnym wyizolowanych z pojedynczej, niedawno zagłodzonej (<24 h) płytki wysokiego wzrostu. Wykreślane są wartości każdej z 10 kontrprób biologicznych. Suma wszystkich punktów danych w 10 powtórzeniach jest również przedstawiona jako wykres skrzypiec i takt z S.E.M. To pokazuje, że pojedyncza płytka niedawno zagłodzonych robaków da ~ 80 000 larwalnych robaków L1. (B) S.E.M. z 15 różnych pomiarów populacji płytek w panelu A naniesionych jako indywidualne punkty. Ogólnie rzecz biorąc, S.E.M. jest nieco większy niż 10%. (C) Trzy powtórzenia biologiczne populacji robaków oszacowano po każdym z dwóch transferów między płytkami co 4 godziny. To przenoszenie zwierząt między płytkami nie spowodowało znacznego zmniejszenia liczebności populacji. Wskazuje to, że przedstawiona tutaj metodologia przemieszczania robaków nie powoduje znacznych strat zwierząt. (D) Pomiary populacji dokonane w trakcie trzech powtórzeń eksperymentalnych EV: liczba zwierząt, które oszacowano dla pierwotnych larw L1, które rozpoczęły doświadczenie, liczba młodych dorosłych zwierząt odzyskanych z pływaka sacharozy i gotowych do 24-godzinnego okresu inkubacji, liczba zwierząt policzonych od przygotowania EV po odzyskaniu sekretomu. Obserwuje się niewielki, ale nieistotny spadek liczebności populacji między początkowym oszacowaniem populacji w stadium larwalnym L1 a późniejszymi, gdy zwierzęta są młodymi osobnikami dorosłymi. Średni pomiar populacji L1 został oznaczony jako 100%, a wszystkie inne pomiary zostały przeskalowane ze względu na ich stosunek do tej wartości. Słupki błędów S.E.M. * = wartość p < 0,05, N.S. = nieistotna w parametrycznym sparowanym teście t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stosunek białka do zwierzęcia jest użytecznym wskaźnikiem do scharakteryzowania preparatu EV. Ta metryka może zapewnić szybki sposób na określenie spójności między przygotowaniami EV. Średnio 1000 młodych dorosłych zwierząt typu dzikiego wydziela 1 μg białek większych niż 10 kDa do swojego środowiska (Rysunek 4A). Gdy frakcja ta jest dalej rozdzielana przez chromatografię wykluczania wielkości, całkowity profil elucji białka wykazuje mały pik białka między 2–6 ml i duży pik po 8 ml. EV są zawarte w pierwszych 5 ml eluatu kolumny ( Rysunek 4B). Analiza śledzenia nanocząstek: pierwsze 5 ml eluatu kolumny zawiera monodyspersyjną populację małych EV o długości ~ 150 nm (Rysunek 4C). Transmisyjna mikroskopia elektronowa frakcji wykluczających wielkość ujawnia obfite EV we frakcji 2–6 ml eluatu, ale nie w późniejszych objętościach eluatu. EV są znane ze swojego kształtu przypominającego miseczkę i dlatego są łatwe do odróżnienia od cząstek stałych, które wyglądają jak punktowe jasne kropki, gdy są przygotowane w ujemnych warunkach barwienia (Rysunek 4D).

figure-results-2
Rysunek 4: Oczyszczanie pojazdów elektrycznych C. elegans z całkowitej wydzielanej biomasy. (A) Wykreślono stosunek całkowitej ilości białek większych niż 10 kDa do liczby robaków inkubowanych w preparacie dla 10 kontrprób biologicznych. Większość preparatów zawierała 1 μg białka na 1000 zwierząt. (B) Profil elucji białek z kolumny z żywicą o pojemności 10 ml wypełnionej 1 ml skoncentrowanego sekretomu. Frakcje, które są konsolidowane w dalszych analizach, są zacieniowane w grupy. (C) Analiza śledzenia nanocząstek skonsolidowanych frakcji eluowanych żywicą 2–6 ml. Przedział ufności 95% jest zacieniowany na szaro. (D) Analiza TEM skonsolidowanych frakcji eluowanych żywicą. Materiał wyjściowy zawierał zarówno cząstki pęcherzykowate, jak i niepęcherzykowe. Skonsolidowana frakcja elucyjna o objętości 2–6 ml została wzbogacona o pęcherzyki z niewielką ilością cząstek niepęcherzykowych. Skonsolidowane frakcje o objętości 7–11 ml zawierały niewiele cząstek pęcherzykowatych, ale wiele cząstek niepęcherzykowych. Frakcje elucyjne o objętości 12–15 ml zawierały tylko cząstki niepęcherzykowe. Wszystkie mikrofotografie są pokazane w tym samym powiększeniu. Podziałka = 200 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby bezpośrednio porównać charakterystykę cytometrii przepływowej między C. elegans a ludzkimi EV, oczyściliśmy EV z kondycjonowanych pożywek kultur komórkowych ludzkich neuronów za pomocą tej metody. Cytometria przepływowa rozdziela cząstki na podstawie rozpraszania światła. Rozpraszanie światła pod małym kątem (SALS) z grubsza koreluje z rozmiarem, a rozpraszanie światła pod długim kątem (LALS) koreluje z wewnętrzną strukturą błony. Większość wszystkich zdarzeń związanych z próbkami zarówno z hodowli komórkowych, jak i preparatów EV C. elegans jest ściśle skoncentrowana w klastrze skoncentrowanym wokół 103 SALS i 104 LALS (Rysunek 5A). Histogram przykładowych zdarzeń C. elegans EV posortowany według SALS pokazuje, że wszystkie przygotowania osiągają szczyt na poziomie ~103 (Rysunek 5B).

figure-results-3
Rysunek 5: pojazdy elektryczne C. elegans są wyraźnie zdefiniowane przez swoje właściwości rozpraszania światła. (A) Histogram zdarzeń SALS w trzech replikach biologicznych C. elegans EVs. ~80% wszystkich zdarzeń w próbie mieści się w ścisłej, jasno zdefiniowanej populacji. Podobnie jak w przypadku analizy śledzenia nanocząstek, pokazuje ona, że rozkład wielkości pojazdów elektrycznych C. elegans jest monodyspersyjny. Dla porównania przedstawiono histogram buforu S Basal używanego do rozcieńczania próbek. (B) Porównanie właściwości refrakcji C. elegans i ludzkich kultur komórkowych EV oczyszczonych metodami opisanymi w niniejszym tekście. Oba typy EV konsekwentnie charakteryzują się porównywalnymi krótko- i długokątowymi rozkładami rozpraszania światła (SALS i LALS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

DI-8-ANEPPS solidnie oznacza EVs C. elegans, konsekwentnie podkreślając większość wszystkich zdarzeń zarówno w próbkach C. elegans, jak i pochodzących z hodowli komórkowych. Koraliki kalibracyjne i kontrolki są przedstawione w Rysunek 6A. Poszczególne wykresy punktowe FACS są pokazane na podstawie próbki C. elegans przygotowanej z 200 000 zwierząt i dwóch przygotowanych z 500 000 zwierząt (Rysunek 6B). Przeanalizowano również EV ze 100 ml lub 200 ml (#2,3) hodowli komórkowej (Rysunek 6C). Zarówno C. elegans, jak i próbki pochodzące z kultur komórkowych wykazywały liczne zdarzenia fluorescencyjne, które zniknęły po potraktowaniu 0,05% Triton-X 100 i lekkiej sonikacji. Pokazuje to, że znakowane zdarzenia są labilnymi strukturami fosfolipidowymi (pęcherzykami), a nie niewrażliwymi na detergent stałymi agregatami lipoprotein. Obfitość EV oblicza się jako różnicę między liczbą zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+ między frakcjami bez detergentu (-) i z detergentem (+) pomniejszoną o zdarzenia w kontroli Tylko barwnik. Dla jasności, dane przedstawione indywidualnie w Rysunek 6B i Rysunek 6C jest podsumowany jako wykresy słupkowe w Rysunek 6D i Rysunek 6E. Obfitość oczyszczonych EV nie różniła się znacząco między C. elegans a preparatami pochodzącymi z kultur komórkowych (Ryc. 6F).

figure-results-4
Rysunek 6: Przykłady danych z cytometrii przepływowej wykorzystanych do obliczenia obfitości EV. (A) W celu zapewnienia, że liczba zdarzeń może być bezpośrednio porównana między próbkami, kontrole tylko bufor i tylko bufor i barwnik muszą być przeprowadzane przy tym samym natężeniu przepływu i czasie zbierania, co frakcje próbki EV. W bramie DI-8-ANEPPS odbywa się bardzo mało wydarzeń. (B) Reprezentatywne wyniki protokołu DI-8-ANEPPS i detergentu z C. elegans. Pokazano trzy powtórzenia biologiczne. Replikat biologiczny #1 został przygotowany z 200 000 zwierząt, podczas gdy #2 i #3 zostały przygotowane z 500 000 zwierząt. Zniknięcie pojazdów elektrycznych wraz z obróbką detergentem jest oczywiste we wszystkich przypadkach. (C) Reprezentatywne wyniki protokołu DI-8-ANEPPS i detergentów z użyciem pożywek kondycjonowanych do hodowli komórek ludzkich. Replikaty biologiczne #1 i #2 przygotowano z 200 ml kondycjonowanych pożywek, podczas gdy replikaty biologiczne #3 przygotowano ze 100 ml. (D) Wykres słupkowy danych zebranych z trzech kontrprób biologicznych EV C. elegans. Słupki błędów = S.E.M. Sparowane dwustronne testy t między zabiegami. = wartość p < 0,001. (E) Wykres słupkowy danych zebranych z trzech kontrprób biologicznych EV pochodzących z hodowli komórkowych. Sparowane dwustronne testy t między zabiegami. = wartość p < 0,001 (F) Liczbę zdarzeń wrażliwych na detergent znakowanych barwnikiem na μl obliczono dla wszystkich kontrprób biologicznych C. elegans i hodowli komórkowej. Wartości między dwoma źródłami próbek EV nie różnią się znacząco. Sparowane dwustronne testy t między zabiegami wartość p = 0,685. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1 zawiera surowe wartości eksperymentalne dla pełnych 4,5 μL każdego rodzaju analizowanej próbki. Całkowita liczba zdarzeń zebranych z frakcji EV oczyszczonych z 500 000 zwierząt była 10-20 razy większa niż liczba cząstek tła zebranych przez sam bufor, podczas gdy frakcja oczyszczona z 200 000 zwierząt zawierała około 2 razy więcej zdarzeń niż sam bufor. Liczba zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+ jest również pokazana dla każdej próbki. Dane te można zaimportować do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia liczby pojazdów elektrycznych z dodatnim barwnikiem i wrażliwymi na detergenty, jak opisano powyżej. Na przykład liczbę EV w 1 ml pierwszego pokazanego replikatu biologicznego C. elegans obliczono by w następujący sposób:

(18,974 - 3,853 - 1,487) x (10/4.5) x 1,000 = 30,297,778.

Tabela 1: Dane z cytometrii przepływowej w tabelach. Dane pokazane w Rysunek 6 są przedstawione jako arkusz kalkulacyjny. Dla każdej próbki pokazana jest suma zdarzeń i zdarzenia bramkowane DI-8-ANEPPS+. Każda kontrpróba biologiczna jest ułożona w kolejności próbek #1–3 w protokole. Wskaźniki te ujawniają, że całkowita liczba zdarzeń zebranych z próbek C. elegans przygotowanych z 500 000 zwierząt lub 200 ml pożywki kondycjonowanej do hodowli komórkowej była 10-20 razy większa niż liczba cząstek tła zebranych przez sam bufor, podczas gdy replikacja biologiczna oczyszczona z 200 000 zwierząt zawierała około 2 razy więcej zdarzeń ogółem niż sam bufor. Liczba zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+ jest również pokazana dla każdej próbki. Wskaźniki te można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć łączną liczbę pojazdów elektrycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowym wyzwaniem w dziedzinie pojazdów elektrycznych jest oddzielenie szerokiej gamy podtypów pojazdów elektrycznych2. Opisane tutaj metody wykorzystują filtrację, wirowanie różnicowe i chromatografię wykluczania wielkości do wygenerowania czystej populacji małych EV, ponieważ wcześniej wykazano, że EV ~100 nm są wydzielane do środowiska zewnętrznego i funkcjonują w fizjologicznie istotnych szlakach komunikacyjnych16. EV oczyszczone za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość mogą nadal być mieszaniną egzosomów i małych mikropęcherzyków, ponieważ te podklasy EV mają podobną wielkość. Podklasy EV kręgowców są zwykle rozdzielane przez immunoprecypitację, ponieważ ta metoda izoluje EV poprzez wiązanie się z selektywnymi markerami białek błonowych. Opisane metody ułatwiają identyfikację białek markerowych błony EV C. elegans . W związku z tym w przyszłości możliwe będzie dalsze rozdzielanie małych podklas EV za pomocą analogicznych metod immunoprecypitacji. Teoretycznie immunoprecypitacja może izolować EV od dobrze odżywionych robaków, ponieważ EV E. coli nie powinny wchodzić w interakcje z przeciwciałem. Naukowcy zainteresowani identyfikacją białek i ładunków genetycznych większych podklas EV (>200 nm) mogą to zrobić, pomijając etap filtracji 0,22 μm, a następnie analizując osad, a nie supernatant. Odkrycie obfitości białek i ładunków genetycznych w dużych EV pozwoli na bardziej wszechstronne zrozumienie procesów fizjologicznych zachodzących w sekretomie C. elegans . Oprócz wydzielania do środowiska, EV C. elegans są przenoszone wewnętrznie między tkankami. W związku z tym metody te izolują tylko podzbiór całkowitych EV C. elegans . Jednak wykrycie ładunku wewnętrznych pojazdów elektrycznych nie jest możliwe, ponieważ nie ma metody oddzielania pojazdów elektrycznych od zlizowanych robaków. Analiza ładunku tego podzbioru EV wydzielanego zewnętrznie dostarcza środków do identyfikacji potencjalnych ogólnych markerów białkowych EV zdolnych do znakowania również wewnętrznych EV.

Skala przygotowania EV będzie zależała od wymagań eksperymentu. W sumie 500 000 młodych dorosłych zapewnia wystarczającą ilość EV do równoległego przeprowadzania cytometrii przepływowej, LC-MS-MS i analizy RNAseq. Liczba ta może być skalowana w górę lub w dół w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Największym praktycznym czynnikiem przemawiającym za zwiększeniem skali jest wymagana liczba płytek o wysokości 10 cm. Płytki o wysokim wzroście przygotowane z 500 μl 20-krotnie skoncentrowanej przez noc kultury NA22 będą wspierać populację ~ 50 000 dorosłych osobników od stadium larwalnego L1 do pierwszego dnia dorosłości. Dlatego, aby przeprowadzić eksperyment z 500 000 dorosłych osobników, potrzebnych jest 13 płytek o wysokim wzroście: jedna płytka do wygenerowania populacji L1, dwie płytki do wygenerowania dorosłych osobników do bielenia i 10 płytek do wzrostu zwierząt doświadczalnych. Wskaźniki te zależą od warunków siewu i wzrostu bakterii na płytkach o wysokim wzroście. Dlatego zaleca się wykonanie wszystkich płytek w ustandaryzowany sposób, a następnie kalibrację ze znanymi ilościami zwierząt.

Robaki są liczone na dwóch etapach procesu uprawy: 1) przed wysiewem robaków na talerze i 2) przed wygenerowaniem kondycjonowanego podłoża. Wykazano, że gęstość hodowli zwierząt wpływa na zachowanie, rozwój i reakcje na stres 15,16,17,18, a zatem może również wpływać na ładunki EV. Dlatego, aby zapewnić stałą gęstość uprawy, konieczne jest dokładne oszacowanie populacji robaków. Ilościowe określenie liczby robaków w dziewięciu kroplach daje statystyczną pewność szacunków populacji. Istotne jest, aby traktować każdą kroplę indywidualnie, wirując między każdą kroplą i wkładając pipetę w tej samej odległości do zawiesiny ślimaka. Podjęcie tych środków ostrożności zapewni wartości S.E.M. na poziomie ~5-10% całej populacji. Jeśli S.E.M. dla populacji robaków jest wyższy niż 20%, to coś poszło nie tak.

Po 24-godzinnym okresie inkubacji wolnej od bakterii, młode, dzikie C. elegans pełzają natychmiast po dodaniu do trawnika bakteryjnego. Oznacza to, że inkubacja nie wpływa poważnie na ich zdrowie. Jednak ten etap ma wpływ na fizjologię zwierząt, a zatem może mieć wpływ na skład ładunków EV. Dlatego podczas pracy z bardzo chorymi genotypami lub starszymi zwierzętami konieczne jest sprawdzenie żywotności po etapie inkubacji. Jeśli nie wszystkie zwierzęta przeżyją inkubację, należy zwiększyć wielkość populacji doświadczalnej i skrócić czas inkubacji. Podczas pracy z dużymi ilościami kondycjonowanych mediów bardziej praktyczne jest użycie koncentratora z mieszanymi ogniwami z filtrem wykonanym z regenerowanej nitrocelulozy. EV nie wiążą się z tą chemią filtra tak mocno, jak inne typy filtrów14.

Stosunek całkowitego białka odzyskanego z kondycjonowanej pożywki do liczby zwierząt inkubowanych w celu wytworzenia preparatu jest użytecznym wskaźnikiem. Jeśli wskaźnik ten jest znacznie wyższy niż oczekiwano, możliwe jest, że szacunki populacji były błędne lub że zwierzęta padły i pogorszyły się w kondycjonowanych pożywkach. Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy niż oczekiwano, część białka mogła zostać utracona na filtrach podczas procesu zagęszczania. Podczas gdy metody FACS bezpośrednio określają ilościowo EV w przygotowaniu, ta metryka jest przydatna, ponieważ może uwidocznić anomalie próbki na wczesnym etapie procesu. Inną przydatną metodą weryfikacji jakości przygotowania EV jest transmisyjna mikroskopia elektronowa, jak pokazano na rysunku 4D. Chociaż protokół transmisyjnej mikroskopii elektronowej nie jest formalnie uwzględniony w tym artykule dotyczącym metod ze względu na długość, można go przeprowadzić standardowymi metodami. Zaleca się przeprowadzenie tego typu analizy, przynajmniej na początku, jako metody uzupełniającej do FACS do oceny jakości preparatów EV. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżo opróżnionych siatek formvarowo-węglowych i zabarwić próbki 2% kwasem fosfatungstycznym zamiast octanem uranylu.

DI-8-ANEPPS został wybrany, ponieważ wykazano, że ilościowo znakuje błony EV, przewyższając inne ogólne barwniki EV z próbkami biopsji człowieka i liposomami25. Pomiary są szybkie, a czas pobierania każdej próbki wynosi tylko 3 minuty. Kwantyfikacja wrażliwych na detergenty EV ma bezpośrednie znaczenie funkcjonalne, ponieważ wykorzystuje fundamentalne fizyczne rozróżnienie między EV a stałymi agregatami lipoprotein. Co ważne, na metodę tę nie ma wpływu ilość białka całkowitego ani liczba agregatów innych niż EV, a zatem może w sposób bezstronny określić ilościowo EV uzyskane za pomocą różnych metod oczyszczania. Wskaźnik EV zweryfikowany przez FACS, który tutaj opisujemy, byłby szczególnie pomocny w badaniach, które pokazują fizjologiczne skutki oczyszczonych pojazdów elektrycznych. Ustanowienie metodologii FACS jako uniwersalnego wskaźnika, tak aby bezwzględna obfitość pojazdów elektrycznych mogła być bezpośrednio porównywana w różnych badaniach, może być również korzystna dla całej branży pojazdów elektrycznych. Barwniki Vital mogą również oznaczać EV C. elegans , ale nie są one tak jasne jak EV oznaczone Di-8-ANEPPS.

To podejście do oczyszczania wykorzystuje aktywne wydzielanie pojazdów elektrycznych poza ciałami nienaruszonych, żywych robaków. Pozwala to na wyizolowanie EV C. elegans o porównywalnej czystości i liczebności jak z hodowli komórkowej, co jest wystarczające do identyfikacji setek ładunków białek i RNA za pomocą analizy LC-MS-MS i RNAseq26. W ten sposób duża biblioteka odczynników dostępnych do badań nad C. elegans może być wykorzystana do zbadania wpływu zaburzeń genetycznych i fizjologicznych na skład ładunku EV.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z wdzięcznością dziękujemy Nickowi Terzopoulosowi za płytki robaków i odczynniki; Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) przy Biurze Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440) za linię nicieni N2; dr Lucia Vojtech za pomoc w analizie śledzenia nanocząstek; Dr Jessica Young i dr Marie Claire za pożywki komórkowe kondycjonowane neuronalnie pochodzące z hiPSC; Wai Pang za pomoc w obrazowaniu TEM. Praca ta była wspierana przez grant NIH P30AG013280 dla MK oraz grant NIH AG054098 dla JCR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m jednostki filtracyjneGenesee25-233Do klarowania kondycjonowanych mediów z zanieczyszczeń
1% roztwór Triton X-100ThermoFisherHFH10Dodaj to do 0,05% do lizy EV
10 cm wysokie płytkiwzrostu N/AN/DDo hodowli dużych populacji robaków
Kolby z przegrodą denną o pojemności 2 lThermoFisher4110-2000PKDo przeprowadzania separacji EV z wykluczeniem wielkości
40 μ m siatkaAmazonCMY-0040-C / 5PK-05Użyj tego, aby oddzielić dorosłe robaki od stadiów larwalnych
5 i mu; m siatkaAmazonCMN-0005-CUżyj tego, aby oddzielić L1 od innych stadiów robaków
6 cm normalny wzrost pożywka do uprawy robakówN/AN/ADo hodowli małych populacji robaków
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 10 kD mwcoMilliporeSigmaC7715Do koncentracji elucji wykluczającej rozmiar
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 10 kD mwcoMilliporeSigmaC78144Do zagęszczania kondycjonowanych mediów
Cytometr przepływowy Apogee A50ApogeeTen cytometr przepływowy specjalizuje się w rozdzielaniu cząstek o rozmiarach nanometrowych
ApogeeMixApogee1493Oceń rozpraszanie światła i fluorescencję FACS
DI-8-ANEPPSThermoFisherD3167Dodaj to przy 20 uM, aby oznaczyć EVs
Jednorazowa kolumnachromatograficznaBioRad7321010Do przeprowadzania separacji EV z wykluczeniem wielkości
ŻeletynaMilliporeSigmaG9391-100GDo leczenia końcówek pipet, aby robaki nie przywierały
Inhibitor proteazy HALTThermoFisher87785Dodaj do próbki EV, aby zapobiec degradacji białek
Probówki do zbierania wiązań niskobiałkowychThermoFisher90410Użyj ich do próbek EV
NaClSigmaS7653-1KGDo flotacji sacharozy robaków
S Bufor podstawowy N/AN/APrzepis w żywicy WormBook
Sepharose CL-2BMilliporeSigmaCL2B300-100MLDo przeprowadzania separacji EV z wykluczeniem wielkości
Mała wytrząsarka orbitalnaABC Scientific83211301Użyj tego do inkubacji robaka S Podstawowa
sacharozaSigmaS8501-5KGDo unoszenia sacharozy na rynku robaków

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  3. Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
  4. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
  5. Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228(2012).
  6. Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589(2013).
  7. Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
  8. Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  9. Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
  10. Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
  11. Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069(2019).
  12. Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
  13. Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
  14. Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
  15. Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
  16. Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
  17. Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
  18. Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
  20. Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502(2016).
  21. Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940(2016).
  22. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  23. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  24. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
  25. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
  26. Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C elegans EVsEV PurificationSize ExclusionFlow CytometryWorm SynchronizationSecretome GenerationProtease InhibitorTriton X 100Potentiometric ProbeRNA SEQ Analysis

Powiązane artykuły