Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60596

⸱

31 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Wydzielanie małych pęcherzyków błonowych do środowiska zewnętrznego jest podstawowym procesem fizjologicznym wszystkich komórek. Te pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) funkcjonują na zewnątrz komórki, regulując globalne procesy fizjologiczne poprzez przenoszenie białek, kwasów nukleinowych, metabolitów i lipidów między tkankami. EV odzwierciedlają stan fizjologiczny komórek, z których pochodzą. Zakłada się, że pojazdy elektryczne odgrywają fundamentalną rolę w praktycznie każdym aspekcie ludzkiego zdrowia. W związku z tym białko EV i ładunki genetyczne są coraz częściej analizowane pod kątem biomarkerów zdrowia i choroby. Jednak w dziedzinie pojazdów elektrycznych nadal brakuje wykonalnego systemu modeli bezkręgowców, który pozwalałby na badanie składu ładunku pojazdów elektrycznych. C. elegans dobrze nadaje się do badań nad pojazdami elektrycznymi, ponieważ aktywnie wydziela pojazdy elektryczne na zewnątrz swojego organizmu do środowiska zewnętrznego, co pozwala na łatwą izolację. Ten artykuł zawiera wszystkie niezbędne informacje do generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania tych wydzielanych przez środowisko pojazdów elektrycznych C. elegans, w tym sposób ilościowej pracy z bardzo dużymi populacjami robaków zsynchronizowanych z wiekiem, oczyszczanie EV oraz protokół cytometrii przepływowej, który bezpośrednio mierzy liczbę nienaruszonych EV w oczyszczonej próbce. W ten sposób duża biblioteka odczynników genetycznych dostępnych do badań nad C. elegans może być wykorzystana do zbadania wpływu szlaków genetycznych i procesów fizjologicznych na skład ładunku EV.

Wprowadzenie

Wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) związanych z błoną ułatwia globalne procesy fizjologiczne poprzez aktywne transportowanie określonych ładunków białek, kwasów nukleinowych, metabolitów i lipidów między komórkami1. Komórki wydzielają EV o rozmiarach od 2 μm lub większych do nawet 20 nm2 . Małe EV (<200 nm) są coraz częściej badane ze względu na ich wpływ na procesy patologiczne, w tym zaburzenia metaboliczne, nowotwory, choroby układu krążenia i choroby neurodegeneracyjne3,4,5. Wykazano również, że patologie te wpływają na białko i skład genetyczny ładunków EV małych pojazdów elektrycznych. W związku z tym sygnatury biomarkerów patologii są coraz częściej odkrywane za pomocą metod wykrywania ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak LC-MS-MS i RNAseq6,7,8,9.

C. elegans był użytecznym modelem bezkręgowców do identyfikacji ewolucyjnie zachowanych szlaków sygnałowych EV. Na przykład, po raz pierwszy wykazano, że flippaza C. elegans indukuje biogenezę EV w zarodkach C. elegans, a ludzki homolog wpływa na uwalnianie EV w komórkach ludzkich10,11. C. elegans (C. elegans) Doniesiono, że pojazdy elektryczne przenoszą sygnały Hedgehog niezbędne do rozwoju naskórka. Wykazano, że dostarczanie jeża i innych morfogenów odgrywa główną rolę rozwojową EV i jest zachowane u danio pręgowanego, myszy i ludzi12,13,14,15. C. elegans dobrze nadaje się do odkrywania biomarkerów EV, ponieważ wydziela EV na zewnątrz swojego ciała, które funkcjonują w komunikacji między zwierzętami16,17 (Rysunek 1A). Jednak metodologia ustalona w poprzednim badaniu nie może być zastosowana, ponieważ źródło pożywienia E. coli nicieni również wydziela EVs18. W tej metodzie większość próbki składa się z zanieczyszczenia E. coli, co ogranicza moc podejść proteomicznych lub RNAseq do odkrywania ładunków EV C. elegans. Opisane tutaj metody zostały opracowane w celu uzyskania wysoce czystych EV C. elegans na poziomach obfitości charakterystycznych dla typowych eksperymentów z hodowlami komórkowymi, a tym samym ułatwienia podejść omicznych do odkrywania biomarkerów EV.

Duże populacje robaków są potrzebne do wygenerowania wystarczającej liczby pojazdów elektrycznych do analizy ładunku. W związku z tym uwzględniono również metody prowadzenia hodowli ilościowej dużych populacji zsynchronizowanych rozwojowo C. elegans. Zazwyczaj, gdy do eksperymentów potrzebna jest duża liczba robaków, są one hodowane w płynnych podłożach. Chociaż jest to skuteczne w generowaniu dużych populacji robaków, fizjologia zwierząt znacznie różni się od robaków hodowanych w standardowych warunkach na płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM). Zwierzęta hodowane w płynie rosną wolniej, są szczuplejsze, wykazują niejednorodność rozwojową i podlegają dużej zmienności partii. Dlatego przedstawiamy prosty, ale skuteczny sposób na ilościową hodowlę dużych populacji zsynchronizowanych rozwojowo C. elegans przy użyciu 10-centymetrowych płytek o wysokim wzroście. Skład pożywki płytek o wysokim wzroście zawiera więcej peptonu niż zwykłe płytki NGM i są wysiewane szczepem E. coli NA22, który rośnie mocniej niż OP50.

Postępy w technologii cytometrii przepływowej (FACS) umożliwiły bezpośrednią analizę poszczególnych EVs20,21, umożliwiając kwantyfikację EV bez nieodłącznych ograniczeń innych metod. Wcześniejsze prace wykazały, że białko nie jest użytecznym wskaźnikiem obfitości EV, ponieważ różne metodologie oczyszczania skutkują znacznie różnymi stosunkami EV do białka22. Niezwykle czyste frakcje EV zawierają stosunkowo mało białka, co utrudnia ilościowe oznaczanie próbek za pomocą żeli BCA lub Coomassie. Analiza zachodnia może zidentyfikować względne różnice poszczególnych białek, ale nie może określić, ile EV znajduje się w próbce. Solidna kwantyfikacja liczby EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek jest utrudniona przez wąski zakres sygnału do szumu, niemożność rozróżnienia między EV a agregatami stałymi oraz brak możliwości przenoszenia metod między instrumentami o różnych specyfikacjach23. Dlatego artykuł ten zawiera również uogólnioną procedurę cytometrii przepływowej do rozróżniania i ilościowego określania EV.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Dodać 2 g żelatyny do 100 mL dH2O i podgrzewać w mikrofalówce, aż roztwór zacznie wrzeć. Następnie wymieszać i pozostawić do ostygnięcia na 20 min.
  2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i rozdzielić do sterylnych probówek. Napełnić końcówki pipet żelatyną bezpośrednio przed użyciem, pobierając i wypuszczając roztwór żelatyny. Potraktowane końcówki można wykorzystać natychmiast lub przechowywać.
  3. Wyciąć membranę ze sterylnego filtra nakrętkowego.
  4. Zwilżyć kwadrat o boku 20 cm z nylonowej siatki o oczkach 5 μm i umieścić go wokół górnej części sterylnego filtra nakrętkowego. Przymocować za pomocą kilku grubych gumek recepturek.
    UWAGA: Należy dokładnie sprawdzić tkaninę, aby upewnić się, że nie ma na niej zagięć. Powodują one powstanie szczelin powietrznych, które utrudniają ssanie.

2. Obliczanie liczebności dużych populacji nicieni (Rysunek 1A)

  1. Wymieszać zawiesinę nicieni na wirówce typu vortex, a następnie nanieść 10 μL zawiesiny na pokrywkę płytki do hodowli nicieni lub na szkiełko przedmiotowe. Powtórzyć ten proces 3x. Odnotować liczbę zwierząt w każdej kropli.
  2. Dostosować stężenie zawiesiny nicieni do poziomu dwóch zwierząt na μL.
  3. Wymieszać zawiesinę na wirówce typu vortex i nanieść dziewięć kropli (10 μL) na szkiełko lub pokrywkę płytki. Ręcznie policzyć liczbę zwierząt. Odnotować liczbę zwierząt w każdej kropli.
  4. Obliczyć średnią oraz błąd standardowy średniej (S.E.M.) jako procent każdej populacji nicieni.
  5. Obliczyć całkowitą liczbę zwierząt w każdej populacji, dzieląc wartość średnią przez 10 μL, a następnie mnożąc wynik przez całkowitą objętość zawiesiny nicieni wyrażoną w μL.

Schemat chromatografii nicieni; układ obejmujący etapy mieszania w wortexie, filtracji, wirowania i wykluczania sterycznego.
Rysunek 1: Przegląd procedur generowania, kwantyfikacji i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) C. elegans. (A) Schemat liczenia dużych populacji zwierząt. (B) Schemat generowania nicieni do pozyskiwania EVs. (C) Schemat oczyszczania EVs z nadsączu C. elegans. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Hodowla C. elegans w celu oczyszczania EV

  1. Wygeneruj dużą populację rozwojowo zsynchronizowanych C. elegans. W tym celu wykonaj poniższe kroki.
    1. Przenieś pojedyncze zwierzę na 6 cm płytkę z normalną pożywką do wzrostu. Inkubuj przez dwa pokolenia, a następnie przemyj zwierzęta na dwie płytki z pożywką o wysokiej gęstości wzrostu.
    2. Inkubuj do czasu, aż nicienie wyczerpią zapasy pokarmu.
    3. Przefiltruj nicienie w stadium L1 za pomocą siatki nylonowej o oczkach 5 μm przygotowanej w kroku 1.4. Zakręć sterylną butelkę, uruchom próżnię i wlej nicienie na filtr. Przepłucz agregaty nicieni na filtrze taką samą objętością pożywki.
    4. Ilościowo określ liczbę nicieni i oblicz ich całkowitą liczbę (patrz krok 2). Niedawno głodzone (<24 h) nicienie hodowane na płytce o wysokiej gęstości wzrostu dają około 80 000 larw L1.
    5. Wiruj larwy L1 z prędkością 2,000 x g przez 3 min. Resuspenduj do stężenia ~100 000 zwierząt na mL.
    6. Umieść ~50 000 zwierząt na każdej płytce o wysokiej gęstości wzrostu. Hoduj zwierzęta w temperaturze 20 °C, aż staną się dorosłymi osobnikami z jajami (gravid adults) (około 72 h).
    7. Poddaj dorosłe osobniki z jajami standardowej procedurze wybielania i pozwól embrionom wykluć się w 10 mL roztworu S Basal z dodatkiem 2,5 μg/mL cholesterolu.
    8. Ilościowo określ liczbę larw L1 (patrz krok 2), a następnie przenieś po 50 000 nicieni na każdą płytkę o wysokiej gęstości wzrostu.
    9. Inkubuj płytki w temperaturze 20 °C, aż zwierzęta staną się młodymi osobnikami dorosłymi.
  2. Przygotuj C. elegans do generowania sekretomu.
    1. Zmyj nicienie z płytek, dodając 15 mL sterylnego buforu M9 z 50 μg/mL karbenicyliny do każdej płytki o wysokiej gęstości wzrostu. Pozostaw nasycone płytki na 5 min. Odseparuj nicienie, delikatnie rozprowadzając bufor po obwodzie płytki. Unikaj gwałtownego wstrząsania. Przelej bufor z każdej płytki do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Powtórz etap płukania jeszcze 2 razy, aby uzyskać łącznie 45 mL buforu na płytkę.
    2. Pozostaw nicienie do osadzenia na 15 min. Odlej nadosad i dodaj do probówki 50 mL świeżego buforu M9. Powtórz łącznie 4 razy.
    3. Wykorzystaj gradient skokowy 30% sacharozy, aby nicienie wypłynęły na powierzchnię, a następnie odzyskaj zwierzęta w roztworze S Basal24.
      1. Krótko resuspenduj nicienie w 15 mL lodowatego 100 mM NaCl, dodaj 15 mL lodowatej 60% sacharozy i wymieszaj przez odwracanie probówki. Za pomocą pipety szklanej ostrożnie nanieś warstwę 5 mL lodowatego 100 mM NaCl na powierzchnię mieszaniny sacharozy.
      2. Wiruj z prędkością 1,500 x g przez 5 min. Nicienie skoncentrują się na granicy faz między NaCl a sacharozą.
      3. Ostrożnie pobierz pipetą zwierzęta z granicy faz do nowej probówki stożkowej 50 mL. Dopełnij roztworem S Basal do objętości 50 mL. Pozostaw nicienie do osadzenia przez 5 min.
      4. Odlej nadosad i dodaj świeże 50 mL roztworu S Basal. Powtórz tę czynność co najmniej 3 razy.
    4. Ilościowo określ liczbę nicieni zgodnie z opisem w kroku 2.
    5. Resuspenduj nicienie do gęstości jednego zwierzęcia na μL w sterylnym roztworze S Basal zawierającym 2,5 μg/mL cholesterolu i 50 μM karbenicyliny.
    6. Aby przygotować próbkę do generowania sekretomu, dodaj do 400 mL zawiesiny do sterylnej kolby o pojemności 2 L z dnem z przegrodami (bottom-baffled flask).
    7. Umieść kolby na rotatorze w inkubatorze w temperaturze 20 °C przy 100 rpm przez 24 h.

4. Oczyszczanie EV

  1. Zbiór i frakcjonowanie
    1. Wyjąć kolbę 2L z nicieniami z inkubatora i odwirować zwierzęta w stożkowych probówkach 50 mL (500 x g przez 2 min).
    2. Przełożyć nadsącz przez filtr próżniowy 0,22 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń cząsteczkowych.
      UWAGA: Na tym etapie przefiltrowany nadsącz zawierający sekretom i pęcherzyki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Policzyć liczbę zwierząt zgodnie z opisem w kroku 2.
    4. Określić żywotność nicieni, umieszczając kroplę zawiesiny zwierząt na trawniku bakteryjnym. Odczekać 15 min, a następnie zaklasyfikować zwierzęta jako poruszające się, sparaliżowane lub martwe.
    5. Skoncentrować nadsącz przefiltrowany przez membranę 0,22 μm do objętości 700 μL przy użyciu regenerowanych jednostek filtracyjnych z nitrocelulozy o progu odcięcia 10 kDa. Dodać 150 μL roztworu S Basal, a następnie nanieść pipetą na filtr i wymieszać w wirówce typu vortex. Powtórzyć 2x.
    6. Odwirować skoncentrowany nadsącz przy 18 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C i przenieść nadsącz do nowej probówki. Krok ten usuwa ewentualne zanieczyszczenia lub większe cząsteczki, które mogły nagromadzić się podczas obróbki.
    7. Dodać koktajl inhibitorów proteaz + EDTA zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Na tym etapie skoncentrowany nadsącz zawierający sekretom i pęcherzyki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Chromatografia wykluczania cząsteczkowego
    1. Wsypać żywicę agarozową 80–200 μm (zakres frakcjonowania wielkości porów od 70 000 do 40 000 000 kDa dla białek globularnych) do pustego wkładu kolumny przepływowej grawitacyjnej. Przepuszczać roztwór S Basal, aż złoże żywicy zostanie upakowane do końcowej objętości 10 mL.
      UWAGA: Jeśli do wkładu kolumny wsypano zbyt dużo żywicy, należy rozprowadzić górną część kolumny i usunąć nadmiar pipetą.
    2. Przepuścić 40 mL sterylnego, przefiltrowanego roztworu S Basal przez kolumnę, pozwalając mu spływać grawitacyjnie.
      OSTRZEŻENIE: Należy upewnić się, że złoże żywicy nie zostało naruszone.
    3. Pozostawić bufor, aż górna część żywicy nie będzie zanurzona, a następnie zamknąć dół wkładu kolumny. Umieścić probówkę zbiorczą pod kolumną.
    4. Zdjąć zatyczkę z wkładu. Dodać kroplami na górę złoża kolumny skoncentrowany sekretom otrzymany w kroku 2.1. Nanieść kroplami 1 mL roztworu S Basal. Umieścić nową probówkę zbiorczą pod kolumną.
    5. Powoli napełnić górny zbiornik kolumny 5 mL roztworu S Basal, aby nie naruszyć żywicy. Zebrać pierwsze 2 mL eluatu, następnie szybko zmienić probówkę i zebrać kolejne 4 mL. Jest to frakcja wzbogacona w EV.
    6. Skoncentrować eluat do 300 μL za pomocą regenerowanego filtra z nitrocelulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 10 kDa i przenieść retentat do probówki do mikrocentryfugi o niskim stopniu wiązania.
    7. Przemyć membranę filtra 2x 100 μL roztworu S Basal, mieszając w wirówce typu vortex przez 20 s i rozprowadzając bufor pipetą po filtrze. Dodać do początkowej próbki, aby uzyskać końcową objętość 500 µL.
    8. Dodać koktajl inhibitorów proteaz zgodnie z instrukcją producenta.
    9. Niezwłocznie przeprowadzić dalsze eksperymenty (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS itd.) lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Cytometry przepływowa w celu ilościowego oznaczenia liczebności EV

  1. Przygotowanie barwnika
    1. Przygotować roztwór stokowy DI-8-ANEPPS o stężeniu 10 mM, używając świeżego DMSO. Rozdzielić na aliquoty po 10 μL i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 1 mM, dodając 90 μL sterylnego filtrowanego PBS do probówki zawierającej 10 μL roztworu stokowego barwnika.
  2. Przygotowanie próbek doświadczalnych
    1. Do probówki do mikrocentryfugi dodać 840 μL roztworu S Basal. Następnie dodać 60 μL oczyszczonych EV otrzymanych w sekcji 4.2 i wymieszać na wirówce typu vortex.
    2. Odmiarkować 300 μL próbki do dwóch nowych probówek do mikrocentryfugi. Otrzymano w ten sposób zestaw doświadczalny trzech probówek, z których każda zawiera 300 μL rozcieńczonych EV. Probówki oznakować jako #1–3. Do próbek #2 i #3 dodać 7 μL roztworu stokowego DI-8-ANEPPS przygotowanego w punkcie 5.1.2. Następnie do probówki #3 dodać 7 μL 1% Triton-X 100. Każdą probówkę wymieszać na wirówce typu vortex.
    3. Próbkę #3 poddać sonikacji, umieszczając końcówkę sonikatora w środku próbki i aplikując 10 impulsów przy mocy 20% i cyklu pracy 30%.
      UWAGA: Należy upewnić się, że końcówka sondy sonikatora znajduje się w środku próbki, aby zminimalizować powstawanie piany. Piana może uszkodzić próbkę, powodując agregację EV.
    4. Do dwóch probówek do mikrocentryfugi dodać po 300 μL roztworu S Basal. Do drugiej probówki dodać 7 μL odczynnika roboczego DI-8-ANNEPS przygotowanego w kroku 5.1 i oznakować ją jako „Tylko barwnik”. Pozostałą probówkę oznakować jako „Tylko bufor”.
      UWAGA: Próbki kontrolne „Tylko barwnik” i „Tylko bufor” oraz próbki doświadczalne należy przygotować z tego samego źródła S Basal.
    5. Inkubować próbki w ciemności, z dala od bezpośredniego światła, w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  3. Przeprowadzenie eksperymentów FACS.
    1. Ustawić filtr wzbudzenia FACS na 488 nm (niebieski), a filtr emisji na 605 nm (pomarańczowy). Ustawić szybkość przepływu na 1,5 μL na min.
    2. Uruchomić mieszankę kalibracyjną FACS z nanikuleczkami (opcjonalnie, ale zalecane).
    3. Analizować każdą próbkę na urządzeniu FACS przez 3 min (180 s). Zanotować dokładny czas pomiaru w sekundach.
  4. Analiza danych FACS.
    1. Otworzyć pliki w oprogramowaniu do analizy FACS.
    2. Zmienić oś Y na 488-Org (Area), klikając na Axis i wybierając odpowiednią opcję z menu rozwijanego.
    3. Ustawić bramkę prostokątną rozpoczynającą się od góry wykresu, obejmującą poziom SALS od 102 do 104 (cząsteczki o rozmiarze <300 nm). Rozszerzyć bramkę w dół, aż obejmie 2,5% całkowitej liczby zdarzeń. Nazwać bramkę „zdarzenia DI-8-ANEPPS+”.
  5. Ilościowe oznaczenie zawartości EV w próbce
    1. Skopiować tę bramkę i wkleić ją do dwóch pozostałych próbek w zestawie doświadczalnym, a także do kontroli „Tylko bufor” i „Tylko barwnik”. Wyeksportować wyniki analizy do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Jeśli próbki FACS nie były analizowane przez zalecane 3 min (180 s), należy znormalizować wszystkie liczby zdarzeń w próbce do liczby zdarzeń na 180 s. Na przykład, jeśli próbka była analizowana przez 250 s, liczba zdarzeń DI-8-ANEPPS+ zostaje przeskalowana przez współczynnik 250 s/180 s.
    3. Usunąć zdarzenia tła barwnika, odejmując liczbę zdarzeń DI-8-ANEPPS+ w kontroli „Tylko barwnik” od liczby zdarzeń w próbce #2.
    4. Usunąć zdarzenia tła izotypowego, odejmując liczbę zdarzeń DI-8-ANEPPS+ w próbce #1.
    5. Usunąć zdarzenia niewrażliwe na detergent, odejmując liczbę zdarzeń DI-8-ANEPPS+ w próbce #3. Wartość ta stanowi liczbę rzeczywistych EV.
    6. Obliczyć liczbę EV w 1 μL próbki, dzieląc wartość obliczoną w kroku 5.5.5 przez objętość analizowaną w μL (analizowano 4,5 μL, jak opisano w kroku 5.3) i mnożąc przez czynnik rozcieńczenia (10x, jak opisano w kroku 2.5). Pomnożyć tę wartość przez liczbę μL pozostałych w preparacie EV. Jest to liczba EV dostępnych do dalszych analiz.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu FACS; detekcja EV za pomocą barwnika; etapy przygotowania próbek; wyniki w tabeli danych.
Rycina 2: Schemat przygotowania próbek do cytometrii przepływowej w celu ilościowego oznaczenia liczebności EV. (A) Preparat EV jest dzielony na trzy identyczne próbki. Próbka nr 1 stanowi ujemną kontrolę bez barwnika. Następnie do próbek nr 2 i nr 3 dodaje się DI-8-ANEPPS. Do próbki nr 3 dodaje się następnie Triton-X 100. Zielona strzałka wskazuje, że tylko próbka nr 3 jest w dalszej kolejności poddawana sonikacji. Dane z cytometrii pomagają określić absolutną liczbę EV wrażliwych na detergent w próbkach FACS, a następnie obliczyć liczebność EV w całym preparacie. Bramka do wyznaczania zdarzeń pozytywnych pod względem barwnika jest ustawiana na podstawie próbki nr 1, która nie zawiera barwnika. Czerwony zapis w danych w arkuszu ma na celu zilustrowanie, że zdarzenia pozytywne pod względem barwnika z próbki traktowanej detergentem są odejmowane od próbki z barwnikiem. (B) Równania do ilościowego oznaczania EV w próbce analizowanej metodą FACS i obliczania całkowitej liczby EV w próbce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Schemat procesów niezbędnych do generowania i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) przedstawiono na Rysunku 1. Typowy czas wymagany do ukończenia każdego etapu jest podany poniżej. Na Rysunku 2 przedstawiono schemat przygotowania próbek do analizy FACS z użyciem DI-8-ANEPPS (Rysunek 2A) oraz obliczenia niezbędne do oszacowania całkowitej liczby EV w próbce (Rysunek 2B).

Reprezentatywne wyniki z 10 powtórzeń biologicznych przedstawiono na Rysunku 3A. Zmienność między powtórzeniami nie jest istotna, a typowy błąd standardowy średniej (S.E.M.) dla wielkości populacji wynosi nieco ponad 10% (Rysunek 3B). Filtrowanie nicieni i hodowla na świeżych płytkach o wysokim tempie wzrostu pozwoli na uzyskanie dużej populacji dorosłych osobników ciążnych, odpowiednich do synchronizacji metodą wybielania. Pojedyncza płytka z zagłodzonymi osobnikami przetworzona w ten sposób może dostarczyć populację eksperymentalną składającą się z 1 x 106 lub więcej zsynchronizowanych potomków, ponieważ każdy dorosły osobnik ciążny zawiera około 10 jaj. Możliwe jest utrzymanie dużych, zsynchronizowanych rozwojowo populacji poprzez filtrowanie jaj i larw przez filtr 40 μm w celu uzyskania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) od starszych zwierząt. Zatrzymane osobniki dorosłe przenosi się na świeże płytki o wysokim tempie wzrostu z gęstością 20 000 zwierząt na płytkę. Proces ten powtarzano co 2 dni. Rysunek 3C przedstawia trzy powtórzenia biologiczne populacji nicieni przenoszonych w ramach trzech transferów między płytkami. Przenoszenie zwierząt między płytkami skutkuje utratą około 10% osobników (Rysunek 3C), natomiast w etapie flotacji w sacharozie traconych jest około 20% zwierząt (Rysunek 3D).

Rozkład larw i analiza populacji nicieni; wykresy danych z SEM, wykres skrzypcowy, wykresy słupkowe.
Rysunek 3: Kwantyfikacja dużych populacji C. elegans do analizy EV. (A) Porównanie liczby nicieni w stadium larwalnym L1 wyizolowanych z jednej niedawno głodzonej (<24 h) płytki o wysokim przyroście. Przedstawiono wartości dla każdego z 10 powtórzeń biologicznych. Suma wszystkich punktów danych z 10 powtórzeń została również przedstawiona w formie wykresu skrzypcowego oraz słupka z S.E.M. Wykazuje to, że jedna płytka z niedawno głodzonymi nicieniami dostarczy ~80 000 nicieni w stadium larwalnym L1. (B) S.E.M. dla pomiarów populacji z 15 różnych płytek z panelu A przedstawione jako pojedyncze punkty. Zazwyczaj S.E.M. jest nieco większe niż 10%. (C) Oszacowano trzy powtórzenia biologiczne populacji nicieni po każdym z dwóch przeniesień między płytkami co 4 h. Przenoszenie zwierząt między płytkami nie spowodowało istotnego zmniejszenia wielkości populacji. Wskazuje to, że przedstawiona tutaj metodologia przenoszenia nicieni nie prowadzi do znaczącej utraty zwierząt. (D) Pomiary populacji wykonane w trakcie trzech powtórzeń eksperymentu EV: liczba zwierząt oszacowana dla pierwotnych larw L1, które rozpoczęły eksperyment, liczba młodych dorosłych zwierząt odzyskanych metodą flotacji w sacharozie i gotowych do 24-godzinnego okresu inkubacji, oraz liczba zwierząt policzonych z preparatu EV po odzyskaniu sekretomu. Występuje niewielki, ale nieistotny spadek wielkości populacji między początkowym oszacowaniem populacji w stadium larwalnym L1 a późniejszym etapem, gdy zwierzęta są młodymi dorosłymi. Średni pomiar populacji L1 wyznaczono jako 100%, a wszystkie pozostałe pomiary przeskalowano w stosunku do tej wartości. Słupki błędów S.E.M. * = wartość p < 0,05, N.S. = nieistotne statystycznie w parametrycznym sparowanym teście t. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Stosunek białka do zwierzęcia jest użyteczną metryką służącą do charakteryzacji preparatu EV. Metryka ta może stanowić szybki sposób określania spójności między preparatami EV. Średnio 1 000 młodych dorosłych zwierząt typu dzikiego wydziela do środowiska 1 μg białek o masie większej niż 10 kDa (Rycina 4A). Gdy ta frakcja zostanie następnie rozdzielona za pomocą chromatografii wykluczania żelowego, profil elucji całkowitego białka wykazuje niewielki pik białkowy między 2–6 mL oraz duży pik po 8 mL. EV znajdują się w pierwszych 5 mL eluatu z kolumny (Rycina 4B). Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że pierwsze 5 mL eluatu z kolumny zawiera monodyspersyjną populację małych EV o rozmiarze ~150 nm (Rycina 4C). Transmisyjna mikroskopia elektronowa frakcji z chromatografii wykluczania żelowego ujawnia liczne EV w frakcji eluatu 2–6 mL, ale nie w późniejszych objętościach eluatu. EV charakteryzują się kształtem przypominającym kielich, co ułatwia ich odróżnienie od cząstek stałych, które w warunkach barwienia negatywowego pojawiają się jako punktowe jasne kropki (Rycina 4D).

Analiza białek za pomocą chromatografii, wykresów i mikroskopii; przedstawia profile elucji i obrazy cząsteczek.
Rysunek 4: Oczyszczanie EV C. elegans z całkowitej wydzielonej biomasy. (A) Przedstawiono wykres stosunku całkowitej ilości białek większych niż 10 kDa do liczby nicieni inkubowanych w preparacie dla 10 powtórzeń biologicznych. Większość preparatów zawierała 1 μg białka na 1 000 osobników. (B) Profil elucji białek z kolumny z żywicą o objętości 10 mL, na którą naniesiono 1 mL skoncentrowanego sekretomu. Frakcje, które zostały połączone do dalszych analiz, są zaznaczone kolorowymi obszarami. (C) Analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA) połączonych frakcji elucji z żywicy w zakresie 2–6 mL. Szary obszar oznacza 95% przedział ufności. (D) Analiza TEM połączonych frakcji elucji z żywicy. Materiał wyjściowy zawierał zarówno cząsteczki przypominające pęcherzyki, jak i cząsteczki niepęcherzykowe. Połączona frakcja elucji 2–6 mL była wzbogacona w pęcherzyki, z niewielką ilością cząsteczek niepęcherzykowych. Połączone frakcje 7–11 mL zawierały niewiele cząsteczek przypominających pęcherzyki, ale wiele cząsteczek niepęcherzykowych. Frakcje elucji 12–15 mL zawierały wyłącznie cząsteczki niepęcherzykowe. Wszystkie mikrofotografie przedstawiono w tym samym powiększeniu. Pasek skali = 200 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Aby bezpośrednio porównać charakterystykę cytometrii przepływowej między pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) C. elegans a ludzkimi EV, oczyszczono EV z pożywek kondycjonowanych hodowli ludzkich neuronów za pomocą tej metody. Cytometria przepływowa rozdziela cząsteczki na podstawie rozpraszania światła. Rozpraszanie światła pod małym kątem (SALS) koreluje w przybliżeniu z rozmiarem, a rozpraszanie światła pod dużym kątem (LALS) koreluje z wewnętrzną strukturą błony. Większość całkowitych zdarzeń z próbek preparatów EV zarówno z hodowli komórkowych, jak i z C. elegans jest ściśle skupiona w klastrze centrowanym wokół 103 SALS i 104 LALS (Rycina 5A). Histogram zdarzeń z próbki EV C. elegans posortowanych według SALS pokazuje, że wszystkie preparaty osiągają szczyt przy ~103 (Rycina 5B).

Wykresy równowagi statycznej, histogram, porównanie EV C. elegans i komórek hiPS; analiza cytometrii przepływowej.
Rycina 5: EV C. elegans są wyraźnie zdefiniowane przez swoje właściwości rozpraszania światła. (A) Histogram zdarzeń SALS w trzech powtórzeniach biologicznych EV C. elegans. ~80% całkowitej liczby zdarzeń w próbce mieści się w wąskiej, wyraźnie zdefiniowanej populacji. Podobnie jak w analizie śledzenia nanocząstek (NTA), wykazuje to, że rozkład wielkości EV C. elegans jest monodyspersyjny. Dla porównania przedstawiono histogram buforu S Basal użytego do rozcieńczenia próbek. (B) Porównanie właściwości refrakcyjnych EV C. elegans oraz EV z ludzkich kultur komórkowych, oczyszczonych metodami opisanymi w niniejszym tekście. Oba typy EV konsekwentnie wykazują porównywalne rozkłady rozpraszania światła pod krótkim i długim kątem (SALS i LALS). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Barwnik DI-8-ANEPPS skutecznie znakuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) C. elegans, konsekwentnie wykazując większość wszystkich zdarzeń zarówno w próbkach pochodzących od C. elegans, jak i z hodowli komórkowych. Kuleczki kalibracyjne oraz kontrole przedstawiono na Rysunku 6A. Poszczególne wykresy rozrzutu FACS przedstawiono dla próbki C. elegans przygotowanej z 200 000 osobników (#1) oraz dwóch próbek przygotowanych z 500 000 osobników (Rysunek 6B). Analizie poddano również EVs z 100 mL (#1) lub 200 mL (#2,3) hodowli komórkowej (Rysunek 6C). Zarówno próbki pochodzące od C. elegans, jak i z hodowli komórkowych wykazały liczne zdarzenia fluorescencyjne, które znikały po potraktowaniu 0,05% Triton-X 100 i lekkiej sonikacji. Dowodzi to, że znakowane zdarzenia są labilne na detergent struktury fosfolipidowe (pęcherzyki), a nie niewrażliwe na detergent stałe agregaty lipoprotein. Obfitość EVs obliczono jako różnicę między liczbą zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+ w frakcjach bez detergentu (-) i z detergentem (+) pomniejszoną o zdarzenia w kontroli z samym barwnikiem (Dye Only). Dla przejrzystości dane przedstawione indywidualnie na Rysunku 6B i Rysunku 6C zostały podsumowane w formie wykresów słupkowych na Rysunku 6D i Rysunku 6E. Obfitość oczyszczonych EVs nie różniła się znacząco między preparatami pochodzącymi od C. elegans a tymi z hodowli komórkowej (Rysunek 6F).

Wykres cytometrii przepływowej do analizy EV z wykorzystaniem C. elegans i hodowli komórkowych z barwnikami białkowymi.
Rycina 6: Przykłady danych z cytometrii przepływowej wykorzystanych do obliczenia liczebności EV. (A) Aby zapewnić bezpośrednią porównywalność liczby zdarzeń między próbkami, kontrole „sam bufor” oraz „bufor i sam barwnik” muszą być analizowane przy tej samej prędkości przepływu i czasie pomiaru co frakcje próbek EV. W bramce DI-8-ANEPPS występuje bardzo mało zdarzeń. (B) Reprezentatywne wyniki protokołu z użyciem DI-8-ANEPPS i traktowania detergentem dla C. elegans. Przedstawiono trzy powtórzenia biologiczne. Powtórzenie biologiczne nr 1 przygotowano z 200 000 osobników, natomiast nr 2 i 3 z 500 000 osobników. Zniknięcie EV po traktowaniu detergentem jest wyraźne we wszystkich przypadkach. (C) Reprezentatywne wyniki protokołu z użyciem DI-8-ANEPPS i traktowania detergentem z wykorzystaniem kondycjonowanej pożywki z ludzkich hodowli komórkowych. Powtórzenia biologiczne nr 1 i 2 przygotowano z 200 mL kondycjonowanej pożywki, natomiast powtórzenie biologiczne nr 3 ze 100 mL. (D) Wykres słupkowy danych zebranych z trzech powtórzeń biologicznych EV z C. elegans. Słupki błędów = S.E.M. Sparowane dwustronne testy t między grupami traktowania. *** = p value < 0.001. (E) Wykres słupkowy danych zebranych z trzech powtórzeń biologicznych EV pochodzących z hodowli komórkowych. Sparowane dwustronne testy t między grupami traktowania. *** = p value < 0.001 (F) Liczbę zdarzeń wrażliwych na detergent, znakowanych barwnikiem na μL, obliczono dla wszystkich powtórzeń biologicznych C. elegans oraz hodowli komórkowych. Wartości dla obu źródeł próbek EV nie różnią się znacząco. Sparowane dwustronne testy t między grupami traktowania p value = 0.685. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1 zawiera surowe wartości eksperymentalne dla pełnej objętości 4.5 μL każdego analizowanego typu próbki. Całkowita liczba zdarzeń zebranych z frakcji EV oczyszczonych z 500 000 zwierząt była od 10 do 20 razy większa niż tło liczby cząstek zebranych z samego buforu, podczas gdy frakcja oczyszczona z 200 000 zwierząt zawierała około 2 razy więcej zdarzeń niż sam bufor. Dla każdej próbki przedstawiono również liczbę zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+. Metryki te można zaimportować do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć liczbę barwnikowo dodatnich, wrażliwych na detergenty EV, zgodnie z powyższym opisem. Na przykład liczbę EV w 1 mL pierwszego biologicznego powtórzenia C. elegans obliczono by w następujący sposób:

(18 974 – 3 853 - 1 487) x (10/4,5) x 1 000 = 30 297 778.

Tabela 1: Zestawienie danych z cytometrii przepływowej. Dane przedstawione na Rysunku 6 są zaprezentowane w formie arkusza kalkulacyjnego. Dla każdej próbki wskazano całkowitą liczbę zdarzeń oraz liczbę zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+. Każdy powtórz biologiczny jest ułożony w kolejności próbek nr 1–3 zgodnie z protokołem. Wskaźniki te wykazują, że całkowita liczba zdarzeń zebranych z próbek C. elegans przygotowanych z 500 000 osobników lub 200 mL mediów kondycjonowanych kulturą komórkową była 10–20x większa niż tło cząstek zebranych z samego buforu, podczas gdy powtórz biologiczny oczyszczony z 200 000 osobników zawierał około 2x więcej zdarzeń całkowitych niż sam bufor. Dla każdej próbki przedstawiono również liczbę zdarzeń w bramce DI-8-ANEPPS+. Dane te można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia całkowitej liczby EV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Podstawowym wyzwaniem w dziedzinie pojazdów elektrycznych jest oddzielenie szerokiej gamy podtypów pojazdów elektrycznych2. Opisane tutaj metody wykorzystują filtrację, wirowanie różnicowe i chromatografię wykluczania wielkości do wygenerowania czystej populacji małych EV, ponieważ wcześniej wykazano, że EV ~100 nm są wydzielane do środowiska zewnętrznego i funkcjonują w fizjologicznie istotnych szlakach komunikacyjnych16. EV oczyszczone za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość mogą nadal być mieszaniną egzosomów i małych mikropęcherzyków, ponieważ te podklasy EV mają podobną wielkość. Podklasy EV kręgowców są zwykle rozdzielane przez immunoprecypitację, ponieważ ta metoda izoluje EV poprzez wiązanie się z selektywnymi markerami białek błonowych. Opisane metody ułatwiają identyfikację białek markerowych błony EV C. elegans . W związku z tym w przyszłości możliwe będzie dalsze rozdzielanie małych podklas EV za pomocą analogicznych metod immunoprecypitacji. Teoretycznie immunoprecypitacja może izolować EV od dobrze odżywionych robaków, ponieważ EV E. coli nie powinny wchodzić w interakcje z przeciwciałem. Naukowcy zainteresowani identyfikacją białek i ładunków genetycznych większych podklas EV (>200 nm) mogą to zrobić, pomijając etap filtracji 0,22 μm, a następnie analizując osad, a nie supernatant. Odkrycie obfitości białek i ładunków genetycznych w dużych EV pozwoli na bardziej wszechstronne zrozumienie procesów fizjologicznych zachodzących w sekretomie C. elegans . Oprócz wydzielania do środowiska, EV C. elegans są przenoszone wewnętrznie między tkankami. W związku z tym metody te izolują tylko podzbiór całkowitych EV C. elegans . Jednak wykrycie ładunku wewnętrznych pojazdów elektrycznych nie jest możliwe, ponieważ nie ma metody oddzielania pojazdów elektrycznych od zlizowanych robaków. Analiza ładunku tego podzbioru EV wydzielanego zewnętrznie dostarcza środków do identyfikacji potencjalnych ogólnych markerów białkowych EV zdolnych do znakowania również wewnętrznych EV.

Skala przygotowania EV będzie zależała od wymagań eksperymentu. W sumie 500 000 młodych dorosłych zapewnia wystarczającą ilość EV do równoległego przeprowadzania cytometrii przepływowej, LC-MS-MS i analizy RNAseq. Liczba ta może być skalowana w górę lub w dół w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Największym praktycznym czynnikiem przemawiającym za zwiększeniem skali jest wymagana liczba płytek o wysokości 10 cm. Płytki o wysokim wzroście przygotowane z 500 μl 20-krotnie skoncentrowanej przez noc kultury NA22 będą wspierać populację ~ 50 000 dorosłych osobników od stadium larwalnego L1 do pierwszego dnia dorosłości. Dlatego, aby przeprowadzić eksperyment z 500 000 dorosłych osobników, potrzebnych jest 13 płytek o wysokim wzroście: jedna płytka do wygenerowania populacji L1, dwie płytki do wygenerowania dorosłych osobników do bielenia i 10 płytek do wzrostu zwierząt doświadczalnych. Wskaźniki te zależą od warunków siewu i wzrostu bakterii na płytkach o wysokim wzroście. Dlatego zaleca się wykonanie wszystkich płytek w ustandaryzowany sposób, a następnie kalibrację ze znanymi ilościami zwierząt.

Robaki są liczone na dwóch etapach procesu uprawy: 1) przed wysiewem robaków na talerze i 2) przed wygenerowaniem kondycjonowanego podłoża. Wykazano, że gęstość hodowli zwierząt wpływa na zachowanie, rozwój i reakcje na stres 15,16,17,18, a zatem może również wpływać na ładunki EV. Dlatego, aby zapewnić stałą gęstość uprawy, konieczne jest dokładne oszacowanie populacji robaków. Ilościowe określenie liczby robaków w dziewięciu kroplach daje statystyczną pewność szacunków populacji. Istotne jest, aby traktować każdą kroplę indywidualnie, wirując między każdą kroplą i wkładając pipetę w tej samej odległości do zawiesiny ślimaka. Podjęcie tych środków ostrożności zapewni wartości S.E.M. na poziomie ~5-10% całej populacji. Jeśli S.E.M. dla populacji robaków jest wyższy niż 20%, to coś poszło nie tak.

Po 24-godzinnym okresie inkubacji wolnej od bakterii, młode, dzikie C. elegans pełzają natychmiast po dodaniu do trawnika bakteryjnego. Oznacza to, że inkubacja nie wpływa poważnie na ich zdrowie. Jednak ten etap ma wpływ na fizjologię zwierząt, a zatem może mieć wpływ na skład ładunków EV. Dlatego podczas pracy z bardzo chorymi genotypami lub starszymi zwierzętami konieczne jest sprawdzenie żywotności po etapie inkubacji. Jeśli nie wszystkie zwierzęta przeżyją inkubację, należy zwiększyć wielkość populacji doświadczalnej i skrócić czas inkubacji. Podczas pracy z dużymi ilościami kondycjonowanych mediów bardziej praktyczne jest użycie koncentratora z mieszanymi ogniwami z filtrem wykonanym z regenerowanej nitrocelulozy. EV nie wiążą się z tą chemią filtra tak mocno, jak inne typy filtrów14.

Stosunek całkowitego białka odzyskanego z kondycjonowanej pożywki do liczby zwierząt inkubowanych w celu wytworzenia preparatu jest użytecznym wskaźnikiem. Jeśli wskaźnik ten jest znacznie wyższy niż oczekiwano, możliwe jest, że szacunki populacji były błędne lub że zwierzęta padły i pogorszyły się w kondycjonowanych pożywkach. Jeśli stosunek ten jest znacznie niższy niż oczekiwano, część białka mogła zostać utracona na filtrach podczas procesu zagęszczania. Podczas gdy metody FACS bezpośrednio określają ilościowo EV w przygotowaniu, ta metryka jest przydatna, ponieważ może uwidocznić anomalie próbki na wczesnym etapie procesu. Inną przydatną metodą weryfikacji jakości przygotowania EV jest transmisyjna mikroskopia elektronowa, jak pokazano na rysunku 4D. Chociaż protokół transmisyjnej mikroskopii elektronowej nie jest formalnie uwzględniony w tym artykule dotyczącym metod ze względu na długość, można go przeprowadzić standardowymi metodami. Zaleca się przeprowadzenie tego typu analizy, przynajmniej na początku, jako metody uzupełniającej do FACS do oceny jakości preparatów EV. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć świeżo opróżnionych siatek formvarowo-węglowych i zabarwić próbki 2% kwasem fosfatungstycznym zamiast octanem uranylu.

DI-8-ANEPPS został wybrany, ponieważ wykazano, że ilościowo znakuje błony EV, przewyższając inne ogólne barwniki EV z próbkami biopsji człowieka i liposomami25. Pomiary są szybkie, a czas pobierania każdej próbki wynosi tylko 3 minuty. Kwantyfikacja wrażliwych na detergenty EV ma bezpośrednie znaczenie funkcjonalne, ponieważ wykorzystuje fundamentalne fizyczne rozróżnienie między EV a stałymi agregatami lipoprotein. Co ważne, na metodę tę nie ma wpływu ilość białka całkowitego ani liczba agregatów innych niż EV, a zatem może w sposób bezstronny określić ilościowo EV uzyskane za pomocą różnych metod oczyszczania. Wskaźnik EV zweryfikowany przez FACS, który tutaj opisujemy, byłby szczególnie pomocny w badaniach, które pokazują fizjologiczne skutki oczyszczonych pojazdów elektrycznych. Ustanowienie metodologii FACS jako uniwersalnego wskaźnika, tak aby bezwzględna obfitość pojazdów elektrycznych mogła być bezpośrednio porównywana w różnych badaniach, może być również korzystna dla całej branży pojazdów elektrycznych. Barwniki Vital mogą również oznaczać EV C. elegans , ale nie są one tak jasne jak EV oznaczone Di-8-ANEPPS.

To podejście do oczyszczania wykorzystuje aktywne wydzielanie pojazdów elektrycznych poza ciałami nienaruszonych, żywych robaków. Pozwala to na wyizolowanie EV C. elegans o porównywalnej czystości i liczebności jak z hodowli komórkowej, co jest wystarczające do identyfikacji setek ładunków białek i RNA za pomocą analizy LC-MS-MS i RNAseq26. W ten sposób duża biblioteka odczynników dostępnych do badań nad C. elegans może być wykorzystana do zbadania wpływu zaburzeń genetycznych i fizjologicznych na skład ładunku EV.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy Nickowi Terzopoulosowi za płytki robaków i odczynniki; Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC) przy Biurze Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440) za linię nicieni N2; dr Lucia Vojtech za pomoc w analizie śledzenia nanocząstek; Dr Jessica Young i dr Marie Claire za pożywki komórkowe kondycjonowane neuronalnie pochodzące z hiPSC; Wai Pang za pomoc w obrazowaniu TEM. Praca ta była wspierana przez grant NIH P30AG013280 dla MK oraz grant NIH AG054098 dla JCR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m jednostki filtracyjneGenesee25-233Do klarowania kondycjonowanych mediów z zanieczyszczeń
1% roztwór Triton X-100ThermoFisherHFH10Dodaj to do 0,05% do lizy EV
10 cm wysokie płytkiwzrostu N/AN/DDo hodowli dużych populacji robaków
Kolby z przegrodą denną o pojemności 2 lThermoFisher4110-2000PKDo przeprowadzania separacji EV z wykluczeniem wielkości
40 μ m siatkaAmazonCMY-0040-C / 5PK-05Użyj tego, aby oddzielić dorosłe robaki od stadiów larwalnych
5 i mu; m siatkaAmazonCMN-0005-CUżyj tego, aby oddzielić L1 od innych stadiów robaków
6 cm normalny wzrost pożywka do uprawy robakówN/AN/ADo hodowli małych populacji robaków
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 10 kD mwcoMilliporeSigmaC7715Do koncentracji elucji wykluczającej rozmiar
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 10 kD mwcoMilliporeSigmaC78144Do zagęszczania kondycjonowanych mediów
Cytometr przepływowy Apogee A50ApogeeTen cytometr przepływowy specjalizuje się w rozdzielaniu cząstek o rozmiarach nanometrowych
ApogeeMixApogee1493Oceń rozpraszanie światła i fluorescencję FACS
DI-8-ANEPPSThermoFisherD3167Dodaj to przy 20 uM, aby oznaczyć EVs
Jednorazowa kolumnachromatograficznaBioRad7321010Do przeprowadzania separacji EV z wykluczeniem wielkości
ŻeletynaMilliporeSigmaG9391-100GDo leczenia końcówek pipet, aby robaki nie przywierały
Inhibitor proteazy HALTThermoFisher87785Dodaj do próbki EV, aby zapobiec degradacji białek
Probówki do zbierania wiązań niskobiałkowychThermoFisher90410Użyj ich do próbek EV
NaClSigmaS7653-1KGDo flotacji sacharozy robaków
S Bufor podstawowy N/AN/APrzepis w żywicy WormBook
Sepharose CL-2BMilliporeSigmaCL2B300-100MLDo przeprowadzania separacji EV z wykluczeniem wielkości
Mała wytrząsarka orbitalnaABC Scientific83211301Użyj tego do inkubacji robaka S Podstawowa
sacharozaSigmaS8501-5KGDo unoszenia sacharozy na rynku robaków

Bibliografia

  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  3. Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
  4. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
  5. Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228(2012).
  6. Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589(2013).
  7. Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
  8. Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  9. Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
  10. Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
  11. Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069(2019).
  12. Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
  13. Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
  14. Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
  15. Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
  16. Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
  17. Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
  18. Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
  20. Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502(2016).
  21. Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940(2016).
  22. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  23. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  24. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
  25. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
  26. Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EV z C elegansoczyszczanie EVchromatografia elowacytometria przep ywowasynchronizacja nicienigenerowanie sekretomuinhibitor proteazyTriton X 100sonda potencjometrycznaanaliza RNA SEQ

Powiązane artykuły