Artykuł metodologiczny

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60599

⸱

20 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infectious Diseases, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Immunology, Stanford University, 3Palo Alto Veterans Institute of Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest głównym patogenem szpitalnym o rosnącym znaczeniu dla ludzkiego zdrowia i chorób, szczególnie w przypadku przewlekłych infekcji ran u pacjentów z cukrzycą i hospitalizowanych. Istnieje pilna potrzeba stworzenia modeli przewlekłych infekcji, które pomogą w badaniu patogenezy ran i opracowywaniu nowych terapii przeciwko temu patogenowi. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje opóźnioną inokulację 24 godziny po zranieniu wycinającym na całej grubości. Zakażenie tymczasowej macierzy rany obecne w tym czasie zapobiega szybkiemu usuwaniu lub rozprzestrzenianiu się infekcji, a zamiast tego ustanawia przewlekłą infekcję trwającą 7–10 dni bez konieczności implantacji ciał obcych lub supresji immunologicznej. Protokół ten naśladuje typowy czasowy przebieg infekcji pooperacyjnej u ludzi. Zastosowanie luminescencyjnego szczepu P. aeruginosa (PAO1:lux) pozwala na ilościową codzienną ocenę obciążenia bakteryjnego infekcjami ran P. aeruginosa. Ten nowatorski model może być użytecznym narzędziem w badaniach patogenezy bakteryjnej i opracowywaniu nowych terapii przewlekłych zakażeń ran wywołanych przez P. aeruginosa.

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) to Gram-ujemna bakteria w kształcie pałeczki o rosnącym znaczeniu dla ludzkiego zdrowia i choroby. Jest odpowiedzialny za dużą zachorowalność i śmiertelność w warunkach szpitalnych, szczególnie w przypadku zakażeń ran u pacjentów z obniżoną odpornością1,2. Pojawienie się wielolekoopornych szczepów tego patogenu dostarczyło dalszych impulsów do badań nad czynnikami przyczyniającymi się do zjadliwości P. aeruginosa, mechanizmami oporności P. aeruginosa na antybiotyki oraz nowymi metodami zapobiegania i leczenia tej śmiertelnej infekcji3. W związku z tym zapotrzebowanie na modele zwierzęce przewlekłego zakażenia ran jako narzędzia do badania tych pytań badawczych nigdy nie było większe.

Niestety, wiele modeli zwierzęcych infekcji P. aeruginosa ma tendencję do symulowania ostrej infekcji z szybkim ustąpieniem infekcji lub gwałtownym spadkiem z powodu sepsy4,5, co nie symuluje odpowiednio często przewlekłej natury tych infekcji. Aby rozwiązać ten problem, niektóre modele wykorzystują implantację ciał obcych, takich jak kulki agarowe, implanty silikonowe lub żele alginianowe6,7,8. Inne modele wykorzystują myszy, które mają obniżoną odporność z powodu zaawansowanego wieku, otyłości lub cukrzycy, lub za pomocą środków farmakologicznych, takich jak neutropenia wywołana cyklofosfamidem9,10,11,12. Jednak użycie ciał obcych lub gospodarzy z obniżoną odpornością prawdopodobnie zmienia miejscowy proces zapalny, co utrudnia zrozumienie patofizjologii związanej z przewlekłymi infekcjami ran u gospodarzy o normalnym układzie odpornościowym.

Opracowaliśmy chroniczny model zakażenia ran P. aeruginosa u myszy, który obejmuje opóźnione zaszczepienie bakteriami po zranieniu wycinającym. Opóźniona inokulacja pozwala na eksperymenty oceniające obciążenie bakteryjne trwające co najmniej 7 dni. Model ten otwiera nowe możliwości badania zarówno patogenezy, jak i nowych metod leczenia przewlekłych zakażeń P. aeruginosa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Stanforda.

1. Przygotowanie i rozwój bakterii

  1. Wszystkie prace z P. aeruginosa i zwierzętami należy wykonywać z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego badacza i komitetu ds. wykorzystania zwierząt. Wszystkie opisane tutaj kroki z udziałem P. aeruginosa, w tym inokulację myszy, należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Luminescencyjny szczep PAO1:lux P. aeruginosa jest dostępny w naszym laboratorium na życzenie. Smuga PAO1, przechowywana jako zamrożony bulion glicerolowy, na agarze Lysogeny Bulion (LB). W przypadku luminescencyjnego szczepu PAO1:lux agar LB powinien zawierać selektywne antybiotyki (100 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml kanamycyny). Rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze bakteryjnym.
  3. Wybierz izolowaną kolonię i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C w 3 ml pożywki LB o pH 7,4. W przypadku szczepów luminescencyjnych bulion powinien zawierać 100 μg/ml karbenicyliny. Rosną w wstrząsających, tlenowych warunkach.

2. Przygotowanie procedury

  1. Niech cały personel wykonujący operację nosi czysty fartuch/fartuch laboratoryjny, maskę na twarz, siatkę na włosy i rękawiczki.
  2. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki i kleszcze. Używaj techniki aseptycznej do sterylizacji narzędzi między zwierzętami.
  3. Oczyść stół operacyjny etanolem i przygotuj czyste pole operacyjne.

3. Depilacja

  1. Znieczulij 8-12-tygodniowe myszy C57BL/6J za pomocą 1%-3% izofluranu. Badacze powinni postępować zgodnie z wytycznymi personelu weterynaryjnego swojej instytucji dotyczącymi znieczulenia podczas stosowania izofluranu.
    1. Rozpocznij znieczulenie od podania 1%-3% izofluranu i dostosuj natężenie przepływu tlenu do 1,5 l/min. Umieść mysz w komorze indukcyjnej.
    2. Ściśnij palec u nogi myszy, aby ocenić głębokość znieczulenia. Gdy mysz przestanie reagować na stymulację, wyjmij ją z komory indukcyjnej i połóż na stole operacyjnym z nosem w stożku nosowym z izofluranu.
    3. Nałóż lubrykant do oczu na oba oczy.
  2. Zważ mysz, aby uzyskać wyjściową masę przed zabiegiem.
  3. Umieść mysz w pozycji leżącej. Wstrzyknąć myszy podskórnie wstępnie podgrzany, sterylny 0,9% chlorek sodu w ilości 250 μl na każdym boku, co daje w sumie 500 μl.
  4. Ogol grzbietową część myszy za pomocą golarki elektrycznej. Golenie powinno odbywać się w innym miejscu niż stanowisko chirurgiczne, aby zapobiec zanieczyszczeniu rany włosami.
  5. Nałóż cienką warstwę balsamu do depilacji. Pozostaw balsam na 20–60 sekund. Usuń włosy i nadmiar balsamu za pomocą gazy zwilżonej ciepłą wodą. Po depilacji przystąp do procedury zranienia wycinającego.

4. Chirurgia wycinania ran pełnej grubości

  1. Buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu w dawce 0,6–1 mg/kg należy wstrzyknąć podskórnie za pomocą igły 25 G w środkową część grzbietu myszy. Buprenorfina o powolnym uwalnianiu zapewnia ulgę w bólu przez 48–72 godzin.
  2. Zdezynfekuj miejsce operowane. Przetrzyj powierzchnię grzbietową sterylnym wacikiem betadyny. Wytrzyj nadmiar betadyny sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem. Należy to wykonać 3 razy (na przemian z betadyną i alkoholem), pobierając wymaz, przesuwając się od środka w sposób okrężny do krawędzi. Pozostaw obszar do wyschnięcia na powietrzu.
  3. Stwórz zasłonę otaczającą pole operacyjne za pomocą sterylnej gazy lub plastikowej folii spożywczej.
  4. Rozciągnąć skórę napiętą doogonowo. Użyj sterylnego stempla do biopsji skóry o średnicy 6 mm, aby wykonać wstępne nacięcie przez lewy naskórek grzbietowy. Powtórz na prawym naskórku grzbietowym.
  5. Użyj kleszczy, aby przymocować skórę od środka lewego zarysowanego obszaru rany. Wytnij warstwy naskórka i skóry właściwej za pomocą nożyczek. Powtórz tę czynność w zarysowanym po prawej stronie obszarze rany, aby utworzyć symetryczne rany wycinające.
  6. Przemyć rany 50 μl jałowego roztworu soli fizjologicznej. Pozostaw miejsce operowane i otaczającą skórę do wyschnięcia na powietrzu. Następnie przykryj rany i grzbiet przezroczystym opatrunkiem foliowym.
  7. Umieść mysz z powrotem w czystej klatce. Dom 1 zwierzę w klatce.
  8. Umieść klatkę na poduszce grzewczej i monitoruj, aż mysz się obudzi.
  9. Wykonując powyższą operację na wielu zwierzętach, użyj gorącego sterylizatora kulkowego, aby wyczyścić wszystkie narzędzia chirurgiczne między zwierzętami.
  10. Odczekać 24 godziny, aby myszy doszły do siebie po zabiegu chirurgicznym i utworzyły tymczasową matrycę rany nad ranami przed przystąpieniem do inokulacji bakteriami.

5. Inokulacja P. aeruginosa

  1. Rozcieńczyć przez noc kulturę PAO1:lux do OD600 = 0,05 w 75 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml karbenicyliny i hodować bakterie, aż kultura znajdzie się we wczesnej fazie wykładniczej (OD600 ≈ 0,3). Powinno to zająć około 2-3 godzin.
  2. Rozcieńczyć PAO1:luks w PBS do stężenia (7,5 ± 2,5) x 102 jtk/ml. Należy upewnić się, że przygotowałeś nadmiar inokulum, aby zapewnić wystarczającą objętość i umożliwić posiew po eksperymencie. W przypadku transportu między obiektami (np. z laboratorium do wiwarium) należy użyć podwójnej hermetyzacji w szczelnym pudełku wyraźnie oznaczonym jako Biohazard.
  3. Wszystkie prace z P. aeruginosa i myszami należy wykonywać przy użyciu zatwierdzonych środków ochrony osobistej w szafie bezpieczeństwa biologicznego (BSC) zatwierdzonej przez poziom bezpieczeństwa biologicznego zwierząt 2 (ABSL-2). Sprzęt wielokrotnego użytku, taki jak waga, powinien być przykryty folią spożywczą, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  4. Znieczulenie za pomocą 3% izofluranu, jak opisano powyżej. Zważ mysz i zapisz wagę. Wstrzyknąć myszy podskórnie wstępnie podgrzany, sterylny 0,9% chlorek sodu w ilości 250 μl na każdym boku, co daje w sumie 500 μl.
  5. Jeśli przezroczysty opatrunek filmowy myszy odpadł w ciągu nocy, ostrożnie usuń powstały strup i załóż nowy opatrunek.
  6. Za pomocą strzykawki z nasadką zabezpieczającą tuberkuliny 27 G o pojemności 500 μl wstrzyknąć 40 μl zawiesiny PAO1:lux przez przezroczysty opatrunek do każdej rany. Do kontroli ran nieszczepionych/PBS należy używać różnych myszy, aby zapobiec zakażeniu krzyżowemu od strony przeciwnej.
  7. Umieść mysz z powrotem w klatce na poduszce grzewczej i monitoruj, aż się obudzi. Wszystkie myszy powinny być trzymane indywidualnie w oddzielnych klatkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  8. Zapewnij wysokokaloryczną pastę suplementu diety umieszczoną między granulkami żywności na podłodze klatki.
  9. Użyj pozostałego inokulum, aby pokryć płytkę agarową LB. Policz kolonie, aby potwierdzić liczbę podanych bakterii.

6. Obrazowanie in vivo zakażonych ran

  1. Postępuj zgodnie z protokołami hermetyczności BSL-2 dotyczącymi transportu myszy do i z instrumentu do obrazowania, w tym przy użyciu dodatkowego pojemnika. Należy uważać, aby nie przenieść ani nie upuścić żadnej ściółki zwierzęcej podczas przenoszenia myszy do komory indukcyjnej lub przyrządu do obrazowania.
  2. Wywołać znieczulenie myszy za pomocą wziewnego 1%-3% izofluranu w komorze indukcyjnej, jak opisano w kroku 3.1.
  3. Po znieczuleniu myszy umieść ją w pozycji leżącej w komorze obrazowania optycznego systemu obrazowania z nosem w stożku nosowym izofluranu.
  4. Otwórz oprogramowanie.
  5. Parametry akwizycji będą się różnić w zależności od liczby zwierząt obrazowanych jednocześnie i intensywności bioluminescencji. Podstawowe parametry, które należy ustawić, to czas ekspozycji, binning, przysłona i pole widzenia (FOV). Nasze domyślne ustawienia początkowe to czas ekspozycji 30 sekund, binning low (2), f/stop 1.2 i FOV 25. Dostosuj te ustawienia w razie potrzeby w zależności od potrzeb badacza.
  6. Analizuj dane dotyczące luminescencji za pomocą programu do obrazowania (patrz tabela materiałów). Luminescencja będzie reprezentowana jako pseudokolorowy obraz nałożony na kolorową fotografię myszy.
    1. Utwórz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu rany i zmierz średni wykryty strumień (fotony/sekundę). Należy pamiętać, że dane mogą być również raportowane jako promieniowanie (fotony/sekunda/cm²/steradian), ale tak długo, jak odległość platformy obrazowania od kamery pozostaje stała między obrazowaniami, strumień jest wystarczający.
    2. Zmierz tło, tworząc zwrot z inwestycji w losowym obszarze na platformie obrazowania. Odejmij liczbę fotonów tła na sekundę.
    3. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
  7. Wykonuj obrazowanie zgodnie z powyższym opisem tak często, jak dziennie, aby śledzić postęp infekcji.

7. Postępowanie pooperacyjne

  1. Monitoruj myszy zgodnie z wytycznymi określonymi w protokole IACUC badacza. Monitorujemy wszystkie myszy codziennie przez pierwsze 4 dni, a następnie co drugi dzień, aż do końca eksperymentu. Waż myszy raz dziennie przez pierwsze 4 dni po operacji w BSC. Wstrzyknąć 250 μl 0,9% chlorku sodu podskórnie w 1. i 2. dniu po zakażeniu.
  2. Sprawdź, czy u myszy nie ma oznak bólu/niepokoju, w tym zgarbionej postawy, niechlujnej sierści, letargu, trudności w oddychaniu, grymasu twarzy i utraty wagi.
  3. Jeśli zwierzęta wykazują oznaki pogarszającego się stanu zdrowia, skonsultuj się z weterynarzem. Każda mysz, która wydaje się wykazywać pogarszające się oznaki bólu/niepokoju i utratę masy ciała o 20% lub więcej, powinna zostać poddana eutanazji.

8. Wycięcie rany

  1. Pod koniec eksperymentu należy złożyć myszy w ofierze za pomocą inhalacji CO2, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Zwłoki zwierzęce należy utylizować zgodnie z protokołami ABSL-2 instytucji.
  2. Wyciskaj łóżka ran za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy w BSC. Umieść każde łożysko rany w 1 ml sterylnego PBS w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml. Zmiel tkankę rany nożyczkami. Wszystkie rany powinny być traktowane jako ASBL-2, nawet jeśli nie są uważane za zakażone.
  3. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Wirować każdą probówkę przez 10 s i seryjnie rozcieńczać ścieki bakteryjne w PBS. Umieść rozcieńczone ścieki bakteryjne na agarze LB, aby wyliczyć obciążenie bakteryjne.
  4. Za zakażone rany należy rozważyć, jeśli sygnał luminescencyjny w ranie jest powyżej luminescencji tła i w ściekach z rany wykryto więcej bakterii niż w ranach zaszczepionych PBS jako kontrolą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując luminescencyjny szczep PAO1 z plazmidem kodującym system reporterowy luxABCDE (PAO1:lux), wykonaliśmy u myszy rany wycinane, które po 24 h zaszczepiliśmy planktonicznymi P. aeruginosa, a następnie mierzyliśmy obciążenie bakteryjne w czasie (Rysunek 1 i Rysunek 2). Reprezentatywny obraz uzyskany za pomocą optycznego systemu obrazowania wykazuje, że model ten prowadzi do wykrywalnej luminescencji (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy nowatorski model zakażenia ran P. aeruginosa z opóźnioną inokulacją. Strategia opóźniania inokulacji bakteriami do 24 godzin po zranieniu wycinającym umożliwia ocenę zakażeń ran w okresie 1 tygodnia. Dzięki zastosowaniu luminescencyjnego szczepu P. aeruginosa możliwe jest śledzenie postępu infekcji przez cały przebieg infekcji. Dłuższy przebieg infekcji w porównaniu z innymi modelami zakażenia P. aeruginosa stworzy nowe możliwości badania interakcji gospodarz-patogen i nowych tera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Wektor konstrukcji luminescencyjnej pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 był wspaniałym prezentem od J. Hardy'ego. Schematy zostały stworzone za pomocą BioRender.com. Dziękujemy laboratorium G. Gurtnera za porady dotyczące modelu zakażenia rany. Dziękujemy również T. Doyle'owi z Centrum Innowacji w Obrazowaniu In Vivo Uniwersytetu Stanforda za jego wiedzę techniczną. Praca ta była wspierana przez granty R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 oraz granty ze Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust i Cystic Fibrosis Foundation (CFF) dla P.L.B. C.R.D była wspierana przez T32AI007502. Stypendium Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering oraz stypendium Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship wspierane przez J.M.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwańHospira2484457
18 G x 1 sterylna igłaBD305195
25 G x 1 1/5 sterylna igłaBD305127
Wacik nasączony alkoholemOprogramowanie do326895
AuraInstrumenty spektralne Obrazowanienie dotyczy
BetadinePurdue Frederick Company19-065534
Buprenorfina SR LABZoopharmn/a
samce myszy C57BL/6JJednorazowy
6mmIntegra33-36
Drobne nożyczki - Narzędzia naukowe z węglika wolframu14568-09
Suchy sterylizator z kulkami szklanymiAparat Harvard61-0183
Granulowany agarFisher BioReagentsBP9744
Podkładka grzewczaMilliard804879481218
Strzykawka insulinowa z igłą 28 GSystem329461
Lago XInstrumenty spektralne Obrazowanienie dotyczy
bulionu LBFisher BioReagentsBP1426
Leur-Lok 1 mL strzykawkaTrymer do włosów BD309628
Mini ArcoWahl Professional919152
Nair Balsam do depilacji z olejkiem dla niemowlątChurch i Dwightn/aDostępne w każdej aptece
Kleszcze ośmiokątneFine Science Tools11041-08
Szalka PetriegoSokół351029
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xCorning21-040-CV
Press and Seal Cling WrapGladn/a
SafetyGlide Strzykawka insulinowa z igłą 30 G305934
Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TWWaga 305934
Ohaus Scout ProSP202
Suplement dietyHenry Schein Zdrowie zwierząt29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm3M1624W
obrazowania dziurkacz do biopsji Jackson Laboratory 000664, obrazowania BD Strzykawka insulinowa BD BD

Bibliografia

  1. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  2. Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).
  3. Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
  4. Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85 (1), (2017).
  5. Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
  6. Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838(2016).
  7. van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).
  8. Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
  9. Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
  10. Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
  11. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  12. Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
  13. Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
  14. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie bioluminescencyjneliczenie koloniitworzenie ran pe noo ciennychobci enie bakteryjnemodel przewlek ej infekcjiinterakcje gospodarz patogenbezpiecze stwo BSL 2

Powiązane artykuły