Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły do analizy jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka, które są ważnymi metodami badania neuronalnych mechanizmów plastyczności wzrokowej w okresie krytycznym oraz wpływu określonych genów na rozwój wzrokowy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka w pierwszorzędowej korze wzrokowej myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Deprywacja wzroku mookularowego jest doskonałym eksperymentalnym paradygmatem do wywołania pierwotnej plastyczności reakcji kory wzrokowej. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedź kory na przeciwległe oko na bodziec jest znacznie silniejsza niż odpowiedź oka ipsilateralnego w obuocznym segmencie pierwszorzędowej kory wzrokowej myszy (V1). W okresie krytycznym u ssaków zszycie przeciwległego oka spowoduje szybką utratę reakcji komórek V1 na przeciwległą stymulację oka. Wraz z ciągłym rozwojem technologii transgenicznych, coraz więcej badań wykorzystuje myszy transgeniczne jako modele eksperymentalne do badania wpływu określonych genów na plastyczność dominacji oka (OD). W tym badaniu wprowadzamy szczegółowe protokoły deprywacji wzrokowej monokularu i obliczamy zmianę plastyczności OD u myszy V1. Po deprywacji jednoocznej (MD) przez 4 dni w okresie krytycznym, mierzone są krzywe dostrajania orientacji każdego neuronu, a krzywe strojenia neuronów warstwy czwartej w V1 są porównywane między stymulacją oczu ipsilateralnych i przeciwległych. Wskaźnik odchylenia kontralateralnego (CBI) można obliczyć przy użyciu wyniku OD oka każdej komórki, aby wskazać stopień plastyczności OD. Ta eksperymentalna technika jest ważna dla badania neuronalnych mechanizmów plastyczności OD w okresie krytycznym oraz dla badania roli określonych genów w rozwoju neuronalnym. Głównym ograniczeniem jest to, że ostre badanie nie może zbadać zmiany plastyczności neuronalnej tej samej myszy w innym czasie.
Wprowadzenie
Deprywacja wzroku monokularowego jest doskonałym eksperymentalnym paradygmatem do badania plastyczności V1. Aby zbadać znaczenie doświadczenia wzrokowego w rozwoju neuronalnym, David Hubel i Torsten Wiesel1,2 pozbawili kocięta normalnego widzenia w jednym oku w różnych punktach czasowych i na różne okresy czasu. Następnie zaobserwowali zmiany w intensywności odpowiedzi w V1 dla oczu pozbawionych i zdrowych. Ich wyniki wykazały nienormalnie niską liczbę neuronów reagujących na oko, które zostało zszyte w ciągu pierwszych trzech miesięcy. Jednak reakcje neuronów u kociąt pozostały identyczne pod każdym względem do tych z normalnego dorosłego oka kota, które było zszywane przez rok, a kocięta nie wyzdrowiały. MD u dorosłych kotów nie może indukować plastyczności OD. W związku z tym wpływ doświadczenia wzrokowego na okablowanie V1 jest silny podczas krótkiej, dobrze zdefiniowanej fazy rozwoju, przed i po której te same bodźce mają mniejszy wpływ. Taka faza zwiększonej podatności na bodźce wzrokowe jest znana jako krytyczny okres w korze wzrokowej.
Chociaż mysz jest zwierzęciem prowadzącym nocny tryb życia, poszczególne neurony w myszy V1 mają podobne właściwości do neuronów występujących u kotów3,4,5. W ostatnich latach, wraz z szybkim rozwojem technologii transgenicznej, coraz więcej badań z zakresu neuronauki wizualnej wykorzystuje myszy jako model eksperymentalny6,7,8. W badaniach wizualnych na myszach neuronaukowcy używają mutantów i nokautujących linii myszy, które umożliwiają kontrolę nad genetycznym składem myszy. Chociaż myszy V1 nie mają kolumn OD, pojedyncze neurony w strefie lornetki V1 wykazują znaczące właściwości OD. Na przykład większość komórek silniej reaguje na stymulację kontralateralną niż na stymulację ipsilateralną. Tymczasowe zamknięcie jednego oka w okresie krytycznym powoduje znaczące przesunięcie w rozkładzie indeksu OD9,10,11. W związku z tym MD można wykorzystać do ustanowienia modelu plastyczności OD w celu zbadania, w jaki sposób geny zaangażowane w zaburzenia rozwoju neuronów wpływają na plastyczność kory mózgowej in vivo.
Tutaj przedstawiamy eksperymentalną metodę MD i sugerujemy powszechnie stosowaną metodę (zapis elektrofizjologiczny) do analizy zmiany plastyczności OD podczas deprywacji wzroku monokularowego. Metoda ta jest szeroko stosowana w wielu laboratoriach od ponad 20 lat12,13,14,15,16. Istnieją również inne metody stosowane do pomiaru plastyczności OD, takie jak przewlekły zapis wizualnego potencjału wywołanego (VEP) 17 i wewnętrzne obrazowanie optyczne (IOI)18. Istotną zaletą tej ostrej metody jest to, że jest łatwa do naśladowania, a wyniki są niezwykle wiarygodne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
W niniejszym protokole samce myszy C57Bl/6 zostały pozyskane z Instytutu Zwierząt Laboratoryjnych Akademii Nauk Medycznych Syczuanu oraz Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Syczuanie. Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Nauki i Technologii Elektronicznej w Chinach.
1. Jednostronna deprywacja wzrokowa (MD) w 28. dniu po urodzeniu u myszy
- Narzędzia chirurgiczne, igłę do szycia (średnica 0,25 mm, średnica nici 0,07 mm) oraz patyczki bawełniane umieścić w aluminiowym pudełku i autoklawować w temperaturze 120 °C przez 0,5 h. Komorę sterylną zdezynfekować 75% etanolem. Narzędzia chirurgiczne wysuszyć w suszarce laboratoryjnej.
- Przygotować 2% roztwór agarozy i umieścić go w kąpieli wodnej w temperaturze 75 °C, aby zapobiec krzepnięciu.
- Do znieczulenia myszy zastosować izofluran zmieszany z tlenem (2% indukcja i 1,2–1,5% podtrzymanie). Myszy unieruchomić w aparacie stereotaksycznym i zastosować urządzenie do regulacji ciepła, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C i zapobiec hipotermii.
- Na oba oczy nanieść cienką warstwę maści do oczu na bazie wazeliny.
- Pod mikroskopem anatomicznym z oświetleniem zaszyć powiekę jednego oka. Przeciągnąć igłę przez obie strony powieki 2x (Rysunek 1A) i wykonać około czterech szwów.
- Zawiązać nić 2–3x, a następnie przyciąć. Na węzeł nanieść 3 μL kleju błyskawicznego, aby zwiększyć jego stabilność. Następnie odciąć nadmiar nici chirurgicznej.
- Wykonać u myszy dostryskę doprzewnowiskową buprenorfiny (1 mg/kg).
- Przenieść mysz na matę grzewczą, aby utrzymać temperaturę jej ciała na poziomie 37 °C i zapobiec hipotermii, oraz monitorować zwierzę aż do odzyskania przytomności.
- Gdy mysz całkowicie się obudzi, umieścić ją w osobnej klatce obserwacyjnej.
- Codziennie sprawdzać powieki, aby upewnić się, że pozostają zamknięte i nie są zainfekowane. Wykluczyć mysz w przypadku stwierdzenia otwarcia powieki.
- Przed rejestracją elektrofizjologiczną znieczulić mysz izofluranem zmieszanym z tlenem (2% indukcja i 1,2–1,5% podtrzymanie).
- Usunąć szwy za pomocą nożyczek okulistycznych, aby odsłonić gałkę oczną. Ostrożnie przyciąć powieki.
- Przepłukać oko roztworem do soczewek i sprawdzić przejrzystość oka pod mikroskopem. Wykluczyć myszy z mętnością rogówki lub oznakami infekcji.
2. Kraniotomia w obszarze binokularnym V1 myszy po deprywacji monokularnej w 4. dniu
- Po znieczuleniu myszy należy sprawdzić głębokość znieczulenia, obserwując brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi.
- Umieścić i unieruchomić mysz w aparacie stereotaksycznym. Dostosować wysokość prętów usznych i wspornika zębowego, aby mózg był w pozycji płaskiej i stabilnej.
- Użyć mata grzewczego w celu utrzymania temperatury ciała.
- Nanieść maść do oczu na bazie wazeliny na powierzchnię oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.
- Usunąć sierść z głowy myszy, aby odsłonić skórę. Przetrzeć skórę naprzemiennie jodyną i 70% etanolem (3 razy).
- Wyciąć obszar skóry o wymiarach 8 x 8 mm między uszami, aby odsłonić czaszkę, a następnie usunąć tkankę skóry głowy. Następnie usunąć znajdującą się powyżej tkankę łączną za pomocą 30% nadtlenku wodoru.
- Wywiercić otwór o wymiarach 1 x 1 mm w czaszce nad móżdżkiem. W otworze zamocować małą śrubę kostną jako punkt odniesienia.
- Wykonać małą kraniotomię o średnicy 1 mm w binokularnym obszarze V1 w półkuli przeciwległej do oka pozbawionego stymulacji (Rysunek 1B, A-P: lambda -0.51–lambda +1.67 mm; M-L: -2.6– -3.0 mm; D-V: 0–1 mm). Ostrożnie usunąć fragment czaszki, nie uszkadzając mózgu.
- Przykryć odsłoniętą powierzchnię kory 75 μL 2% agarozy w temperaturze 40 °C, aby zapobiec wysychaniu.
- Zamocować elektrodę wolframową w ramie stereotaksycznej. Umieścić elektrodę wolframową pionowo na powierzchni odsłoniętej kory, w obszarze binokularnym V1, aby upewnić się, że rejestrowane komórki reagują na oba oczy.
- Używać patyczków bawełnianych do usuwania żelu do oczu i nanosić olej silikonowy na oko co 2 h.
3. Stymulacja wzrokowa i rejestracja elektrofizjologiczna
- Zasłoń jedno oko nieprzezroczystą plastikową płytką. Ustaw monitor LCD w odległości 23 cm od oka myszy.
- Zredukuj stężenie środka znieczulającego do 0,5–0,8%, gdy mysz zostanie w pełni znieczulona.
- Powoli wysuwaj mikroelektrodę za pomocą hydraulicznego mikromanipulatora olejowego. Zatrzymaj go, gdy zaobserwowany zostanie wysoki stosunek sygnału do szumu, a elektroda dotrze do warstwy 4 (Rysunek 1C, głębokość około 250–450 μm). Upewnij się, że współczynnik wzmocnienia jest ustawiony na 1 000, filtr na 300–100 Hz, a częstotliwość próbkowania na 40 Hz.
- Wyświetl na monitorze LED pełnopolową ruchomą kratkę sinusoidalną (Rysunek 1D, 12 kierunków, kontrast 100%, częstotliwość czasowa 2 Hz, częstotliwość przestrzenna 0,04 cykli na stopień).
- Zmierz odpowiedź komórki, stymulując osobno oko ipsilateralne i kontralateralne. Powtórz procedurę łącznie 3–5 razy.
- Zmierz odpowiedzi od pięciu do ośmiu komórek podczas każdego wprowadzenia elektrody. Wykonaj od czterech do sześciu wprowadzeń u każdej myszy.
- Po zakończeniu rejestracji zwiększ przepływ izofluranu do 5% lub więcej, kontynuuj ekspozycję na izofluran przez 1 min, a następnie wykonaj zwichnięcie szyi.
UWAGA: Poszczególne punkty wprowadzenia elektrody w strefie binokularnej V1 były oddalone od siebie o co najmniej 200 μm.
4. Off-line sortowanie impulsów i analiza danych
- Wykrywaj potencjały czynnościowe (spike'i), gdy surowy sygnał przekracza poziom progu. Wyrównaj zarejestrowane potencjały względem pierwszego piku dodatniego lub ujemnego. Użyj oprogramowania do wykrywania potencjałów pochodzących z różnych komórek.
- Ustaw dwa kursory: jeden dla odchylenia dodatniego, a drugi dla ujemnego. Zdefiniuj szablon potencjału (Rysunek 2A). Ustaw obszar szablonu tak, aby obejmował zakres z najistotniejszą zmiennością między różnymi klasami potencjałów.
- Wykorzystaj analizę głównych składowych (PCA), aby rozdzielić je na klastry. Metody klastrowania mogą się różnić w zależności od laboratorium.
- Klasyfikuj potencjały graniczne przy użyciu algorytmu K-średnich.
- Skorelowanie orientacji z częstotliwością wyładowań potencjałów i wykreśl krzywe dostrojenia orientacji dla oka ipsilateralnego i kontralateralnego.
- Oblicz wskaźnik OD dla pojedynczej jednostki, który reprezentuje stosunek siły odpowiedzi kontralateralnej do ipsilateralnej:
gdzie Rcontra i Ripsi to odpowiednio optymalna odpowiedź komórki dla oka kontralateralnego i ipsilateralnego, a Rspon to aktywność spontaniczna komórki. - Przypisz wartości OD w zakresie 1–7 w następujący sposób: od −1 do −0,75 = 1; od −0,75 do −0,45 = 2; od −0,45 do −0,15 = 3; od −0,15 do 0,15 = 4; od 0,15 do 0,45 = 5; od 0,45 do 0,75 = 6; oraz od 0,75 do 1 = 7.
- Oblicz wskaźnik preferencji kontralateralnej (CBI):
gdzie N to liczba komórek, a nx to liczba komórek z wartościami OD równymi x.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisane tutaj wyniki eksperymentalne umożliwiają pomyślne pomiary plastyczności MD i OD u myszy po deprywacji oraz bez deprywacji podczas okresu krytycznego (P19–P32). Rysunek 1 przedstawia sposób wykonywania rejestracji pojedynczych jednostek w warstwie 4 obszaru V1 w strefie binokularnej w celu porównania odpowiedzi oka ipsilateralnego i kontralateralnego 4 dni po MD. Rysunek 2 pokazuje sortowanie impulsów (spike sorting) oraz pomiary dostrojenia orientacyjneg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy szczegółowy protokół MD i pomiaru plastyczności OD za pomocą rejestracji pojedynczej jednostki. Protokół ten jest szeroko stosowany w neuronauce wizualnej. Chociaż protokół MD nie jest skomplikowany, istnieje kilka krytycznych procedur chirurgicznych, których należy dokładnie przestrzegać. Po pierwsze, są dwa ważne detale zapewniające jakość szwów. Szew jest wystarczająco stabilny, jeśli szwy są skoncentrowane w przyśrodkowej części powieki. Ponadto na główkę węzła nakłada się 3 μl kleju, aby zwiększyć stab...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81571770, 81771925, 81861128001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 502 klej | M& G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Karta nabycia | National Institument | PCI-6250 | |
| Wzmacniacz Agarose | Biowest | G-10 | |
| AM | Model 1800 | ||
| Atropine | Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd | A135946-5 | |
| Aparat stereotaktyczny mózgu | RWD Life Science Co., Ltd | 68001 | |
| Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Rozwiązania w zakresie soczewek kontaktowych | Pekin Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd. | ||
| Waciki bawełniane | Henan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd | ||
| Uchwyt na cienką igłę | SuZhou Stronger Medical Instruments Co., Ltd | CZQ1370 | |
| Kleszcz | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53320A | |
| Kleszcz | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 53072 | |
| Kleszcz | 66 Vision Tech Co., Ltd. | #5 | |
| Poduszka grzewcza | Stryker | TP 700 T | |
| Iluminator | Motic China Group Co., Ltd. | MLC-150C | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22 | |
| Monitor LCD | Philips (China) Investment Co., Ltd. | 39PHF3251/T3 | |
| Mikroskop | SOPTOP | SZMT1 | |
| Nieinwazyjny monitor parametrów życiowych | Mouseox | ||
| Oil | NARISHIGE International Ltd. | PC-5N06022 | |
| Żel pod oczy z wazeliną | Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd. | 17C801 | |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, Wielka Brytania | Spike2 Wersja 9 | |
| Nożyczki chirurgiczne | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54010 | |
| Nożyczki chirurgiczne | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54002 | |
| Igła do szwów | Ningbo Medical Co., Ltd | 3/8 łuk 2,5 * 8 | |
| Elektroda wolframowa | FHC, Inc | L504-01B | |
| Xylocaine | Huaqing |
Bibliografia
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Effects of monocular deprivation in kittens. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).
- Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. Critical period for monocular deprivation in the cat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 67 (1), 197-202 (1992).
- Guire, E. S., Lickey, M. E., Gordon, B. Critical period for the monocular deprivation effect in rats: assessment with sweep visually evoked potentials. Journal of Neurophysiology. 81 (1), 121-128 (1999).
- Wang, L., Sarnaik, R., Rangarajan, K. V., Liu, X., Cang, J. Visual receptive field properties of neurons in the superficial superior colliculus of the mouse. Journal of Neuroscience. 30 (49), 16573-16584 (2010).
- Niell, C. M. Cell Types, circuits, and receptive fields in the mouse visual cortex. Annual Review of Neuroscience. 38 (1), 413-431 (2015).
- Lee, S. H., et al. Activation of specific interneurons improves V1 feature selectivity and visual perception. Nature. 488 (8), 379-383 (2012).
- Cossell, L., et al. Functional organization of excitatory synaptic strength in primary visual cortex. Nature. 518 (2), 399-403 (2015).
- Lacaruso, M. F., Gasler, L. T., Hofer, S. B. Synaptic organization of visual space in primary visual cortex. Nature. 547 (7), 449-452 (2017).
- Metin, C., Godement, P., Imbert, M. The primary visual cortex in the mouse: Receptive field properties and functional organization. Experimental Brain Research. 69 (3), 594-612 (1988).
- Marshel, J. H., Garrett, M. E., Nauhaus, I., Callaway, E. M. Functional specialization of seven mouse visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1040-1054 (2011).
- Gordon, J. A., Stryker, M. P. Experience-dependent plasticity of binocular responses in the primary visual cortex of the mouse. The Journal of Neuroscience. 16 (10), 3274-3286 (1996).
- McGee, A. W., Yang, Y., Fischer, Q. S., Daw, N. W., Strittmatter, S. M. Experience-driven plasticity of visual cortex limited by myelin and Nogo receptor. Science. 309 (5744), 2222-2226 (2005).
- Sawtell, N. B., et al. NMDA receptor-dependent ocular dominance plasticity in adult visual cortex. Neuron. 38 (6), 977-985 (2003).
- Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D., Bonhoeffer, T., Hubener, M. Prior experience enhances plasticity in adult visual cortex. Nature Neuroscience. 9 (12), 127-132 (2006).
- Crozier, R. A., Wang, Y., Liu, C., Bear, M. F. Deprivation-induced synaptic depression by distinct mechanisms in different layers of mouse visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (4), 1383-1388 (2007).
- Tagawa, Y., Kanold, P. O., Majdan, M., Shatz, C. J. Multiple periods of functional ocular dominance plasticity in mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 8 (3), 380-388 (2005).
- Lickey, M. E., Pham, T. A., Gordon, B. Swept contrast visual evoked potentials and their plasticity following monocular deprivation in mice. Vision Research. 44, 3381-3387 (2004).
- Cang, J., Kalatsky, V. A., Lowel, S., Stryker, M. P. Optical imaging of the intrinsic signal as a measure of cortical plasticity in the mouse. Vision Neuroscience. 22 (5), 685-691 (2005).
- Khan, I. U., et al. Evaluation of different suturing techniques for cystotomy closure in canines. Journal of Animal & Plant Sciences. 23 (4), 981-985 (2013).
- Weisman, D. L., Smeak, D. D., Birchard, S. J., Zweigart, S. L. Comparison of a continuous suture pattern with a simple interrupted pattern for enteric closure in dogs and cats: 83 cases (1991-1997). Journal of the American Veterinary Medical Association. 214 (10), 1507-1510 (1999).
- Heneghan, C. P. H., Thornton, C., Navaratnarajah, M., Jones, J. G. Effect of isoflurane on the auditory evoked response in man. BJA: British Journal of Anaesthesia. 59 (3), 277-282 (1987).
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomenal. Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
