Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

Transkryptom reprezentuje kompletny zestaw transkryptów kwasu rybonukleinowego (RNA) wyrażonych przez genom organizmu w danym czasie, a w szczególności w warunkach środowiskowych i wzrostu. Każda komórka ma swój indywidualny transkryptom, który odzwierciedla jej aktualny stan fizjologiczny i metaboliczny. Zbiór komórek pochodzących z podobnej tkanki lub narządu jest używany w typowym badaniu transkryptomu, ale transkryptomika jednokomórkowa i przestrzennie rozdzielczona staje się coraz bardziej popularna¹. Analizy transkryptomiczne rozpoczynają się od ekstrakcji całkowitego RNA z wybranej tkanki w określonym punkcie czasowym i w określonych warunkach wzrostu. W tym celu zalecamy zastosowanie nowo opracowanej metody ekstrakcji całkowitego RNA z próbek o wysokiej zawartości skrobi lub cukru, takich jak nasiona zbóż². Porównanie transkryptomów między różnymi próbkami skutkuje identyfikacją cząsteczek RNA o różnej liczebności. Te cząsteczki RNA są uważane za geny o zróżnicowanej ekspresji (DEC). Obfitość transkryptów pochodzących z określonych genów markerowych może być następnie wykorzystana do oszacowania stanu rozwoju lub określenia odpowiedzi organizmu na fluktuacje środowiskowe. Geny bez wykrywalnych zmian w obfitości transkryptów w badanych punktach rozwojowych są często używane jako geny referencyjne lub porządkowe.

RNA jest zazwyczaj wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą różnych metod, takich jak Northern blotting i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT-PCR), ale obecne metody transkryptomiki o wysokiej przepustowości opierają się głównie na hybrydyzacji kwasów nukleinowych przy użyciu technologii mikromacierzy, jak również sekwencjonowania RNA (RNA-Seq). RNA-Seq jest obecnie bardzo popularny, ponieważ zapewnia kilka korzyści dla aplikacji transkryptomicznych o wysokiej przepustowości, jak omówiono w innym miejscu^3,4. Chociaż jest to starsza technologia, profilowanie ekspresji genów za pomocą chipów mikromacierzy jest nadal szeroko stosowane, ponieważ jest to bardziej ugruntowana technologia, która wymaga mniejszego zaplecza w dziedzinie bioinformatyki. W porównaniu z sekwencją RNA, zestawy danych generowane w eksperymentach z mikromacierzami są mniejsze i łatwiejsze do analizy. Ponadto jest bardziej opłacalny, zwłaszcza jeśli mamy do czynienia z dużą liczbą próbek. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy analizy transkryptomiczne z wykorzystaniem technologii mikromacierzy w celu określenia roli centralnych węzłów regulacyjnych, które zarządzają sieciami molekularnymi i szlakami zaangażowanymi we wzrost, rozwój i metabolizm ziaren zbóż^5,6,7,8,9. Rutynowo używamy go również do prowadzenia badań profilowania ekspresji genów w całym genomie, aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie reakcji ziaren zbóż na stresy abiotyczne¹⁰, a także w prowadzeniu badań asocjacji całego transkryptomu (TWAS) i mapowania sprzężeń w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za jakość ziarna zbóż i odżywianie^11,12. Inne grupy również wykorzystały technologię mikromacierzy do stworzenia specyficznego dla rozwoju atlasu ekspresji genów w jęczmieniu¹³, rice^14,15,16, sorhum¹⁷ i wheat¹⁸.

Celem tej publikacji jest dostarczenie krótkiego tekstowego podsumowania i szczegółowego wizualnego opisu metody, którą obecnie stosujemy w naszym laboratorium do transkryptomicznego profilowania ziaren zbóż za pomocą platformy mikromacierzy Agilent. Należy pamiętać, że dostępne są inne platformy mikromacierzy, ale nie zostaną one uwzględnione w tej metodzie. Protokół rozpoczynamy od przedstawienia szczegółowego opisu ekstrakcji RNA z rozwijających się lub kiełkujących nasion zbóż. Opierając się na naszym doświadczeniu, uzyskanie wysokiej jakości i dużej ilości transkryptomu nadającego się do dalszych analiz transkryptomicznych jest często wąskim gardłem przy użyciu tkanek nasion zbóż. Wypróbowaliśmy kilka dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji RNA, ale żaden z nich nie przyniósł zadowalających wyników. W związku z tym opracowaliśmy protokół ekstrakcji chemicznej w celu uzyskania surowego ekstraktu RNA, który jest następnie poddawany oczyszczaniu kolumnowemu przy użyciu dostępnego na rynku zestawu. Korzystając z tej metody, rutynowo i powtarzalnie uzyskujemy wysokiej jakości RNA² (Rysunek 1), który może być używany w różnych dalszych aplikacjach do generowania profilu transkryptomu.

1. Ekstrakcja i oczyszczanie całkowitego RNA

UWAGA: Zawsze pracuj pod wyciągiem, ponieważ ta metoda wiąże się z użyciem szkodliwych lotnych rozpuszczalników organicznych. Przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej probówkę z mikrofugą z wodą wolną od nukleaz w bloku grzewczym o temperaturze 50 °C. Ta woda wolna od nukleaz zostanie użyta do elucji całkowitego RNA z kolumny spinowej w kroku 1.8.

1. Oddzielnie zmielić próbki, z których każda zawiera co najmniej trzy kontrpróby biologiczne, na drobny proszek za pomocą wysterylizowanego moździerza i tłuczka, które są wstępnie schłodzone w ciekłym azocie.
   1. Zgarnij sproszkowane próbki za pomocą małej metalowej szpatułki zanurzonej w ciekłym azocie i umieść sproszkowane próbki w probówkach do mikrofug o pojemności 2,0 ml bez nukleaz, również wstępnie zanurzonych w ciekłym azocie. Próbki należy natychmiast przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (-80 °C) do dnia przeznaczonego na ekstrakcję RNA partią (PUNKT ZATRZYMANIA).
      UWAGA: Próbki nasion można zmielić na drobny proszek z łuskaniem lub bez. W przypadku ryżu rutynowo mielę próbki bez łuskania, ponieważ łuska zawiera krzemionkę, która może pomóc w procesie mielenia.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko i w ściśle określonych warunkach kriogenicznych. Jedną z opcji automatyzacji jest mielenie próbek za pomocą kriogenicznego młyna kulowego w celu zminimalizowania degradacji RNA i pogorszenia jakości.
2. Otrzymać surowy ekstrakt RNA, używając około 200 mg oryginalnej próbki w proszku. Indywidualnie dodaj każdą próbkę do probówki do mikrofuzy bez nukleaz zawierającej 750 μl buforu do ekstrakcji RNA (100 mM Tris, pH 8,0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-merkaptoetanolu) i 500 μl fenolu:chloroformu:izoamylu (25:24:1).
   1. Mieszać wszystkie próbki w tym samym czasie przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wielorurowego mieszalnika wirowego ustawionego na dużą prędkość. Natychmiast trzymaj wszystkie probówki na lodzie przez dwie min.
      UWAGA: Zawsze pracuj wewnątrz dygestorium, szczególnie w przypadku wszystkich etapów związanych z fenolem, chloroformem i innymi rozpuszczalnikami organicznymi. Najlepiej użyć szerokiego dygestoria, który może pomieścić jedną wirówkę stołową, mieszalnik wirowy, wielorurowy mieszalnik wirowy i wielorurowy mieszalnik obrotowy.
3. Oddzielić surowy ekstrakt RNA od szczątków przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 10 minut. Wykonaj wszystkie etapy wirowania w tych samych ustawieniach dla tej sekcji.
   1. Przenieść około 800 μl supernatantu do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 2,0 ml zawierającej 400 μl 1,2 M NaCl i 700 μl izopropanolu. Delikatnie wymieszaj roztwór przez inwersję 5x.
   2. Wytrącić RNA przez inkubację w zwykłej (-20 °C) lub ultraniskotemperaturowej zamrażarce (-80 °C), przez co najmniej 1 godzinę (lub noc).
      Punkt STOP lub PAUZA: po prostu przechowuj próbki w zwykłej zamrażarce w temperaturze -20 °C do zatrzymania na kilka godzin. W przypadku nocnego lub dłuższego postoju próbki należy przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (-80 °C).
4. Otrzymać surowy granulat RNA przez odwirowanie przy 18 800 x g przez 15 min. Po odrzuceniu supernatantu należy oczyścić surowy osad RNA przez oczyszczanie kolumnowe za pomocą zestawu Mini Kit (tabela materiałów).
   1. Rozpuścić osad w świeżo przygotowanych 450 μl buforu RLT (przed użyciem dodać 100 μl β-merkaptoetanolu na 100 ml buforu RLT, przygotowywanego na świeżo dziennie). Zwiększyć rozpuszczanie wszystkich granulek, mieszając wszystkie probówki w temperaturze pokojowej w wielorurowym mieszalniku wirowym przez co najmniej 5 minut.
5. Oczyść rozpuszczony osad RNA, przechodząc przez fioletową mini kolumnę wirową z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml. Wirować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 9 000 x g i wyrzucić fioletową mini kolumnę wirową.
   1. Dodać 0,5 objętości absolutnego etanolu (~225 μL) do oczyszczonego lizatu w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wymieszaj roztwór za pomocą tej samej plastikowej końcówki, pipetując kilka razy w górę i w dół.
6. Zebrać oczyszczony RNA, natychmiast przenosząc roztwór do różowej mini kolumny wirowej z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml. Wirować przy 9 000 x g przez 15 s, aby zebrać RNA na membranę krzemionkową różowej kolumny wirowej min. Odrzucić przepływ i przepłukać RNA 350 μl buforu RW1 przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 15 s.
7. Usunąć zanieczyszczające genomowe DNA poprzez dodanie 80 μl rozcieńczonej DNazy 1 (50 μl zamrożonej DNazy + 350 μl RDD przy użyciu zestawu DNazy) bezpośrednio na błonę i trawić przez inkubację w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut (PUNKT PAUZY).
   1. Zmyć DNazę 1, dodając 350 μl RW1 i wirując w temperaturze 9 000 x g przez 15 s. Powtórz dwa razy, ale tym razem przemyj 500 μl buforu RPE. Przenieść do nowej probówki o pojemności 2 ml i wirować w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty do wyschnięcia.
8. Przenieś wysuszoną kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml wolnej od nukleazy. Proces elucji oczyszczonego ekstraktu RNA należy rozpocząć od dodania 50 μl wody wolnej od nukleaz (wstępnie podgrzanej w temperaturze 50 °C) i inkubacji przez 3 minuty w bloku grzewczym o temperaturze 50 °C.
   1. Po inkubacji wymyć całkowity ekstrakt RNA przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 1 minutę. Natychmiast umieścić wszystkie próbki na lodzie.
9. Określ ilość i jakość całkowitego ekstraktu RNA, przeprowadzając odpowiednie rozcieńczenia (zwykle 1:10) w Nanodrop i BioAnalyzer przy użyciu odpowiednich protokołów producenta. Ekstrakty RNA powinny mieć co najmniej wartość RIN 8,0 i stężenie 50 ng/μL. Rysunek 1 przedstawia typowy wynik dla ekstraktów RNA uzyskanych z liści i nasion jęczmienia.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. synteza cDNA, a następnie transkrypcja i znakowanie cRNA

UWAGA: Ten krok jest odpowiedni do jednoczesnego przetwarzania 24 próbek. Sugeruje się, aby cały etap był wykonywany w sposób ciągły w ciągu jednego dnia, ale identyfikowane są opcjonalne punkty zatrzymania i pauzy. Pamiętaj, aby wstępnie podgrzać trzy bloki grzewcze rurki do mikrofuge w temperaturze 80 °C, 65 °C i 37 °C przed rozpoczęciem poniższych kroków. Te ustawienia temperatury zostaną zmienione zgodnie z poniższymi krokami. Na przykład, blok grzewczy o temperaturze 37 °C zostanie ustawiony na 40 °C po przygotowaniu Spike Mix (lub jeśli został już wcześniej przygotowany). Przygotuj jednokolorową mieszankę Spike Mix, mieszankę promotora T7 i mieszankę główną cDNA za pomocą zestawu do znakowania ekspresji genów Low Input Quick Amp (patrz tabela materiałów) w oparciu o instrukcje producenta. Preparat ten jest zależny od ilości wyjściowych ekstraktów RNA, które zwykle wahają się od 10 do 200 ng dla całkowitego RNA lub 5 ng dla PolyA RNA. Rutynowo używamy 50 ng całkowitego RNA jako materiału wyjściowego do hybrydyzacji mikromacierzy² oraz do metody, która zostanie opisana poniżej. Przygotowując mieszaninę wzorcową dla 24 próbek, należy dodać 2 dodatkowe reakcje, aby uwzględnić różnice w pipetowaniu. Na tym etapie zawsze używaj probówek do mikrofug bez nukleaz i wody bez nukleaz.

1. Ze względu na wysoką wydajność, zazwyczaj rozcieńcza ekstrakt RNA 100-krotnie, aby zmieścił się w zakresie 50-100 ng. Opierając się na wynikach kwantyfikacji RNA w kroku 1.9, rozcieńczyć w stosunku 1:100, dodając 1 μl oczyszczonego ekstraktu RNA do 99 μl wody wolnej od nukleaz w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Określ rzeczywiste stężenie tego rozcieńczenia za pomocą Nanodrop.
   1. Wykonać drugie rozcieńczenie każdej całkowitej próbki RNA w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać 50 ng całkowitego RNA w końcowej objętości 1,5 μl. Przechowywać wszystkie próbki na lodzie.
2. Przygotuj Spike Mix na podstawie instrukcji producenta. Ten krok jest również podsumowany w Püffeld et al. 2019². Użyj do tego bloku grzewczego o temperaturze 37 °C. Przechowywać pierwsze i drugie rozcieńczenie jednokolorowej mieszanki kolców w zamrażarce o ultraniskiej temperaturze (-80 °C) i przejść tylko przez osiem powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
   1. Trzecie i czwarte rozcieńczenie należy przygotowywać codziennie na świeżo. Przed użyciem rozmrozić i przechowywać trzecie i czwarte rozcieńczenie mieszanki kolców na lodzie.
      UWAGA: Przelicz temperaturę bloku grzewczego 37 °C na 40 °C, gdy Spike Mix został przygotowany (lub jeśli był wcześniej przygotowany).
3. Przed użyciem należy przygotować T7 Promoter Mix i przechowywać na lodzie. Dla 24 próbek wystarczy następujące elementy:
   20,8 μl promotora T7 primer
   + 26,0 μL wody wolnej od nukleaz
   = 46,8 μl całkowitej objętości T7 Promoter Mix
4. Dodaj 1,8 μl T7 Promoter Primer Mix (krok 2.3) do każdej probówki do mikrofuge zawierającej 1,5 μl próbki 50 ng RNA z kroku 2.1. Dokładnie wymieszać składniki, kilkakrotnie pipetując. Denaturacja mieszaniny matrycy RNA i startera przez inkubację w bloku grzewczym o temperaturze 65 °C przez 10 minut. Natychmiast umieść rurki do mikrofuge na lodzie, przygotowując się do następnego kroku.
5. Podczas denaturacji mieszanki matrycy i startera (krok 2.4), podgrzej wstępnie 5x bufor pierwszej nici w temperaturze 80 °C przez co najmniej 4 minuty. Szybko przygotuj syntezę cDNA Master Mix z zestawu do etykietowania Low Input Quick Amp (patrz tabela materiałów) w oparciu o instrukcje producenta. Dla 24 reakcji wystarczy następujące elementy:
   52,0 μl wstępnie podgrzanego 5x buforu pierwszej nici (krok 2,5)
   + 26,0 μL 0,1 mln naziemnej telewizji cyfrowej
   + 13,0 μl 10 mM dNTP mix
   + 31,2 μL RNase Block Mix
   = 122,2 μl całkowitej objętości syntezy cDNA Master Mix
   1. Rozmrozić każdy składnik na lodzie. Wymieszaj każdy składnik za pomocą delikatnego pipetowania. Przed użyciem Master Mix należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Po użyciu RNase Block Mix należy natychmiast umieścić z powrotem w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
6. Usunąć mieszaninę matrycy RNA i startera na lodzie (krok 2.4) i krótko odwirować w temperaturze pokojowej, aby odwirować całą zawartość na dno probówki do mikrofugi. Dozować 4,7 μl cDNA Master Mix (krok 2.5) do każdej probówki, mieszając ostrożnie, pipetując w górę i w dół. Całkowita objętość po dodaniu wszystkich składników powinna wynosić 8,0 μl.
   1. Syntetyzować cDNA przez 2 godziny w bloku cieplnym o temperaturze 40 °C. Podczas 2 godzinnej inkubacji zmienić temperaturę bloku grzewczego o temperaturze 65 °C na 70 °C w ramach przygotowań do inaktywacji cieplnej (etap 2.7).
      OPCJONALNY PUNKT PAUZY: Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C. Eksperyment można kontynuować następnego dnia po inaktywacji cieplnej (krok 2.7).
7. Inkubować każdą probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 70 °C przez 15 minut, aby dezaktywować termicznie mieszaninę bloków RNazy. Natychmiast przenieść probówki na lód i inkubować przez co najmniej 5 minut.
8. Gdy próbki znajdują się na lodzie przez 5 minut (krok 2.7), szybko przygotuj Transcription Master Mix. Wszystkie składniki można łączyć w temperaturze pokojowej, ale rozmrażać je na lodzie. Dla 24 próbek wystarczy następujące elementy:
   19,5 μl wody wolnej od nukleaz
   + 83,2 μl 5x bufor transkrypcyjny
   + 15,6 μl 0,1 mln naziemnej telewizji cyfrowej (DTT
   + 26,0 μl mieszanki NTP
   + 5,5 μl mieszanki polimerazy RNA T7
   + 6,2 μl cyjaniny 3-CTP (Cy3)
   = 156,0 μL całkowitej objętości Transcription Master Mix
   UWAGA: Mieszaninę polimerazy RNA T7 należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C i umieścić z powrotem natychmiast po użyciu. Co więcej, Cy3 jest wrażliwy na światło. W związku z tym mieszanie (krok 2.9) i dozowanie (krok 2.10) powinno odbywać się w warunkach słabego oświetlenia. W tym celu zwykle wyłączamy światło bezpośrednio nad stołem laboratoryjnym.
9. Gdy probówki zostały poddane nagłemu ogrzewaniu i chłodzeniu (krok 2.7), na krótko odwiruj zawartość każdej próbki za pomocą mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie każdej probówki do mikrofuge. Dodać 6 μl Transcription Master Mix (krok 2.8), delikatnie pipetując w górę i w dół. Na tym etapie całkowita objętość tej reakcji powinna wynosić 16 μl. Inkubować probówki w temperaturze 40 °C przez 2 godziny w celu wytworzenia cRNA.
   znakowanego Cy3 OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Probówki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po transkrypcji.
10. Podczas generowania cRNA (krok 2.9) ustaw temperaturę bloku grzewczego na 55 °C. Dodaj co najmniej jedną probówkę z wodą wolną od nukleaz do bloku grzewczego. Ta woda wolna od nukleaz zostanie wykorzystana do elucji oczyszczonego cRNA.
11. Po transkrypcji i znakowaniu cRNA oczyść znakowane cRNA za pomocą RNeasy Mini Kit, jak opisano w kroku 3.

3. Oczyszczanie cRNA

1. Oczyść znakowane cRNA za pomocą RNeasy Mini Kit (patrz Tabela materiałów). Przygotuj w oparciu o instrukcje producenta. Na przykład Buffer RPE jest dostarczany w zestawie w postaci skoncentrowanej. Przed użyciem dodać 4 objętości absolutnego etanolu klasy biologii molekularnej (96-100%).
2. Do każdej próbki dodać 84 μl wody wolnej od nukleaz, aby dostosować całkowitą objętość do 100 μl. Następnie do każdej probówki dodać 350 μl buforu RLT i 250 μl absolutnego etanolu. Dokładnie wymieszać pipetując.
3. Przenieść 700 μl każdej mieszaniny na mini kolumnę wirową z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml. Zebrać znakowane cRNA na membranę przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 30 s przy 7,534 x g. Wylać przepływającą ciecz.
4. Przemyć każdą próbkę w 500 μl buforu RPE. Odwirować i odrzucić przepływ, jak w poprzednim kroku. Powtórz ten krok raz, a następnie przejdź do następnego kroku.
5. Przenieś mini kolumnę wirującą do nowej probówki zbiorczej. Wysuszyć próbki przez odwirowanie, jak w kroku 3.3.
6. Przenieś mini kolumnę wirową do wolnej od nukleaz probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, która jest dostarczana z zestawem. Eluować każdą znakowaną próbkę cRNA, dodając 30 μl wody wolnej od nukleaz (wstępnie podgrzanej w temperaturze 55 °C) bezpośrednio do filtra membranowego. Wzmocnić elucję poprzez inkubację w bloku grzewczym o temperaturze 55 °C przez 60 s.
7. Zebrać znakowane cRNA przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przez 30 s przy 7,535 x g. Wyrzuć kolumnę wirową i zamknij każdą rurkę do mikrofuge. Natychmiast umieść każdą tubkę na lodzie.
   OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po elucji.
8. Określ ilościowo cRNA za pomocą Nanodrop za pomocą funkcji mikromacierzy. Ustawić próbkę na RNA-40. Uzyskaj następujące wartości i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym: stężenie barwnika cyjaniny 3 (pmol/μL), współczynnik absorbancji RNA (260 nm/280 nm) i stężenie cRNA (ng/μL).
   PUNKT ZATRZYMANIA: Po odczycie próbki cRNA należy natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Oblicz wydajność cRNA i aktywność specyficzną zgodnie z opisem w Püffeld i in. 2019².

4. Hybrydyzacja i skanowanie mikromacierzy

UWAGA: Ten krok zajmuje tylko 3-4 godziny, a zatem hybrydyzacja 24 próbek może być rozpoczęta po obiedzie. Jeden operator może wygodnie obsługiwać do 4 szkiełek (32 próbki). Poranek następnego dnia przeznaczony jest na mycie i skanowanie preparatów z mikromacierzą. Dodatkowe przejazdy można następnie wykonać po południu drugiego dnia. Ten krok jest powtarzany, aż wszystkie próbki zostaną zhybrydyzowane i zeskanowane. Zdecydowanie zaleca się używanie bezbarwnych, bezpudrowych rękawic lateksowych do obsługi i obróbki szkiełek, aby upewnić się, że próbki nie są zanieczyszczone kolorowymi pigmentami, które mogą zakłócać analizy mikromacierzy. Oprócz dostępnych na rynku mikromacierzy, nasza grupa projektuje następujące niestandardowe macierze i można je zamówić w firmie Agilent: kod zamówienia 028827 dla jęczmienia (Hordeumvulgare), 054269 dla ryżu (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 dla ryżu (Oryzasativa subs. Indica) i 048923 dla pszenicy (Triticumaestivum).

1. Wykonaj hybrydyzację mikromacierzy za pomocą zestawu do hybrydyzacji ekspresji genów (patrz tabela materiałów). Przygotuj 10x Środek Blokujący zgodnie ze specyfikacją producenta². Podzielić 10x środek blokujący na porcje 200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Każda porcja wystarcza na maksymalnie 40 hybrydyzacji i jest stabilna do 2 miesięcy.
2. W dniu przeznaczonym do hybrydyzacji mikromacierzy rozmrozić na lodzie jedną 200 μl podwielokrotności 10x środka blokującego. Ponadto należy wstępnie podgrzać piec do hybrydyzacji do 65 °C i wstępnie podgrzać blok grzewczy do 60 °C do użycia podczas fragmentacji cRNA.
3. Przygotuj mieszankę fragmentacyjną dla każdej próbki zgodnie z opisem producenta². W naszym laboratorium rutynowo używamy 600 ng liniowo amplifikowanego cRNA znakowanego Cy3 do hybrydyzacji w 8-pakowej mikromacierzy. W tym przypadku poniższa lista podsumowuje składniki mieszanki fragmentacyjnej na próbkę:
   600 ng liniowo amplifikowanego cRNA, znakowanego cyjaniną
   + 5 μL 10x Środek blokujący
   Dostosuj objętość do 24 μl za pomocą wody bez nukleaz
   + 1 μL 25x bufor do fragmentacji
   = 25 μl całkowitej objętości mieszanki do rozdrabniania
   1. Delikatnie wymieszaj próbki za pomocą mieszalnika wirowego. Krótko odwirować wszystkie próbki za pomocą mikrowirówki.
4. Inkubować wszystkie próbki w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C dokładnie przez 30 minut. Natychmiast schłodzić każdą probówkę na lodzie przez jedną minutę, a następnie szybko przejść do następnego etapu.
5. Aby całkowicie zatrzymać reakcję fragmentacji, dodaj 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM do każdej probówki. Mieszać delikatnie, pipetując w górę i w dół, uważając, aby podczas mieszania nie pojawiły się żadne bąbelki. Rutynowo używamy 25 μl buforu hybrydyzacyjnego, aby zatrzymać reakcję fragmentacji w formacie 8-paku mikromacierzy.
6. Wirować wszystkie probówki przez 1 minutę w temperaturze pokojowej 15 750 x g. Szybko umieść wszystkie probówki na lodzie i załaduj każdą próbkę tak szybko, jak to możliwe.
7. Przed opuszczeniem laboratorium na 17-godzinną nocną inkubację przygotuj zestaw do hybrydyzacji assembly², jak opisano na filmie.
   1. KROK KRYTYCZNY: Przenieś każdą mieszankę hybrydyzacyjną i powoli dozuj na środku każdej uszczelki, zwracając szczególną uwagę, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków podczas dozowania. Rutynowo używamy 44 μl mieszanki hybrydyzacyjnej do formatu 8-paku mikromacierzy. Umieść również 44 μl 1x buforu hybrydyzacyjnego w nieużywanych studzienkach.
   2. Natychmiast umieść suwak mikromatrycy z prawidłową orientacją na suwaku uszczelki. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, aby nie rozlać żadnego płynu. Zamknij szczelnie zespół hybrydyzacyjny i obróć go, aby sprawdzić, czy nie zostały wprowadzone trwałe pęcherzyki powietrza. Wszystkie pęcherzyki powinny poruszać się w prowadnicy uszczelki.
8. Umieść zespół komory hybrydyzacji w rotatorze pieca do hybrydyzacji. W przypadku korzystania z bufora hybrydyzacyjnego 2x GEx ustaw prędkość obrotową na 10 obr./min i hybrydyzuj w temperaturze 65 °C dokładnie przez 17 godzin.
9. Umyj hybrydowe mikromacierze za pomocą zestawu do płukania ekspresji genów (patrz tabela materiałów). Przygotuj do płukania ekspresji genów 1 i 2 w oparciu o instrukcje producenta². Dodaj 2 ml 10% Triton X-102 do obu (całkowicie opcjonalnie, ale zdecydowanie zalecane, aby zmniejszyć częstość występowania artefaktów mycia mikromacierzy)².
10. Przygotuj trzy zespoły komór mycia zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji². Szczegółowe informacje na temat każdej komory mycia przedstawiono w poniższej tabeli (tabela 1).
11. Porcję 500 ml buforu myjącego 1 umieścić w butelce z odczynnikiem o pojemności 1 l i pozostawić w temperaturze pokojowej otoczenia. Przygotuj dodatkową butelkę z odczynnikiem o pojemności 1 litra i oznacz etykietą "Wash Buffer 1 Reuse", aby zapisać bufor do płukania z pierwszej komory. Dodatkowo podajcie 500 ml buforu płuczącego 2 w butelce z odczynnikiem i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Nie opuszczaj laboratorium bez przygotowania kroków od 4.9 do 4.11. Są one niezbędne do etapów prania następnego dnia.
12. Następnego dnia należy przygotować do płukania zgodnie z tabelą 2. Napełnij każde naczynie do trzech czwartych odpowiadającego mu bufora. Każdy bufor do mycia wystarcza na 4-5 szkiełek.
13. Dokładnie po 17 godzinach hybrydyzacji weź jedną komorę hybrydyzacyjną i zdemontuj ją na stole laboratoryjnym wyłożonym niestrzępiącym się papierem, jak opisano w poprzedniej publikacji².
    1. KROK KRYTYCZNY: Przenieś kanapkę z mikromacierzą do naczynia 1. Upewnij się, że kod kreskowy mikromacierzy jest skierowany do góry w pozycji pochylonej i unikaj zanurzania całego slajdu w buforze. Z każdym szkiełkiem do mikromacierzy należy obchodzić się z jego końcami i unikać dotykania aktywnej strony szkiełka.
    2. Oddziel dwa szkiełka za pomocą kleszczy². Pozwól, aby uszczelka delikatnie opadła na dno naczynia 1, jednocześnie upewniając się, że suwak mikromacierzy jest mocno przytrzymany do następnego kroku.
14. KROK KRYTYCZNY: Powoli podnieś szkiełka mikromacierzy na boki i natychmiast przenieś do stojaka na mikromacierz w Dish 2, jak opisano w poprzedniej publikacji². Bardzo ważne jest, aby szkiełka do mikromacierzy były w minimalnym stopniu wystawione na działanie powietrza.
    1. Powtarzaj kroki 4.13 i 4.14, aż osiem szkiełek znajdzie się w stojaku. Rozłóż szkiełka mikromacierzy równomiernie wzdłuż stojaka. Ten krok może być wykonany przez jednego operatora bez pomocy dla maksymalnie 4 suwaków. Zamocuj uchwyt stojaka i przenieś cały zestaw Dish 2 do pierwszego mieszadła magnetycznego. Mieszaj delikatnie dokładnie przez 1 minutę.
15. Mieszając przez 1 minutę (krok 4.14), przenieś naczynie 3 z mini inkubatora o temperaturze 37 °C i umieść na drugim mieszadle magnetycznym. Delikatnie umieść bufor myjący 2 (z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) na naczyniu 3. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas nalewania.
    1. Po 1 minucie mieszania (krok 4.14) delikatnie i powoli podnieś ruszt szkiełkowy z naczynia 2 i przenieś do naczynia 3. Wyjmij uchwyt rusztu i mieszaj dokładnie przez 1 minutę.
16. Powoli i delikatnie podnieś ruszt przesuwny z naczynia 3. Upewnij się, że nie tworzy się kropelek buforowych². Osusz boki każdego szkiełka, delikatnie dotykając niestrzępiącego się papieru. Umieść każde wysuszone szkiełko w pudełku na szkiełka i powtarzaj krok 4.16, aż wszystkie szkiełka z mikromacierzy znajdą się w pudełku ze szkiełkami. Suszyć przez około 15 min.
    OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA
17. Umieść każde szkiełko z mikromacierzą w uchwycie na szkiełka, upewniając się, że kod kreskowy jest skierowany do góry.
    UWAGA: Poziom ozonu w pomieszczeniu z mikromacierzą powinien wynosić 50 ppb (100 μg/^m3) lub mniej. Jest to całkowicie opcjonalne, ale zdecydowanie zalecane: użyj osłony ślizgowej z barierą ozonową, aby uniknąć degradacji barwników cyjaninowych wywołanej ozonem.
18. Umieść zmontowane uchwyty na slajdy w karuzeli skanowania. Załaduj próbki w kolejności, na podstawie numeru kodu kreskowego. Preparaty należy natychmiast zeskanować za pomocą skanera z mikromacierzą (patrz Spis materiałów), zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji².
19. Po uruchomieniu poddaj dane ekstrakcji cech i walidacji kontroli jakości, zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji².

Ta metoda jest zoptymalizowana do ekstrakcji próbek nasion zbóż zawierających znaczne ilości zanieczyszczającej skrobi lub cukrów. Jest przeznaczony do ekstrakcji całkowitego RNA z 24 próbek nasion dziennie. Powinien być prowadzony w sposób ciągły w ciągu jednego dnia, ale opcjonalne punkty zatrzymania i pauzy są określone w całym protokole. Alternatywnie czytelnik może skorzystać z preferowanych zestawów do ekstrakcji RNA lub ręcznej metody ekstrakcji chemicznej. Jednak w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia, dostępne na rynku zestawy do ekstrakcji roślinnego RNA nie są odpowiednie dla nasion ze względu na znaczne ilości skrobi, białka, zanieczyszczenia cukrem i/lub lipidami. W opisanej metodzie po chemicznej ekstrakcji surowego RNA następuje oczyszczanie kolumny za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA. To zazwyczaj zapewnia RNA o wyższej jakości i wydajności. Rysunek 1 pokazuje wynik testu BioAnalyzer w celu sprawdzenia jakości ekstrakcji RNA przy użyciu opisanej tutaj metody. Wyniki przedstawiono dla liści jęczmienia (próbki 1 i 2 reprezentujące próbki o niskiej zawartości skrobi) oraz nasion jęczmienia (próbki 3 i 4 reprezentujące próbki o wysokiej zawartości skrobi). Wartość integralności RNA (RIN) dla wszystkich próbek wynosi 10.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny żel oczyszczonego ekstraktu RNA, którego jakość została przetestowana za pomocą bioanalizatora. Próbki 1 i 2 są typowymi wynikami dla próbek o niskiej zawartości skrobi, takich jak liście jęczmienia, w których widoczne są dodatkowe prążki rRNA z chloroplastów. Próbki 3 i 4 są reprezentatywnymi wynikami dla próbek o wysokiej zawartości skrobi, takich jak nasiona jęczmienia, wykazujących 18S i 28S rRNA. Należy pamiętać, że nie można obliczyć automatycznej wartości RIN dla zielonych tkanek roślinnych, takich jak próbki liści, ze względu na chloroplast rRNA. Jednak integralność i wysoką jakość można wizualnie stwierdzić na podstawie braku jakichkolwiek produktów degradacji, które zwykle objawiają się rozmazem o niskiej zawartości cząsteczkowej. Wartość RIN dla próbek nasion o wysokiej zawartości skrobi, takich jak nasiona jęczmienia, wynosi zwykle 10 przy użyciu protokołu opisanego w tym artykule.

Ponadto, prezentujemy tutaj również reprezentatywne dane z eksperymentu z dwoma elitarnymi liniami wsobnymi jęczmienia (Sofiara i Victoriana) użytymi do analizy jakości słodu19. Podczas procesu słodowania skrobia jest przekształcana w cukier. W związku z tym próbki reprezentują tkanki o różnych proporcjach zawartości skrobi i cukru. Ze względu na to, że proces słodowania przemysłowego jest podobny do procesu kiełkowania, analizie poddano transkryptomy dwóch linii jęczmienia różniących się jakością słodowania. RNA ekstrahowano z kiełkujących nasion po 2, 24, 48, 72, 120, 144 i 196 godzinach po wchłonięciu w biologicznych potrójnych ilościach. Przygotowanie RNA i hybrydyzację z dostosowanym chipem mikromacierzy jęczmiennej przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Rysunek 2 pokazuje znormalizowaną siatkę odczytaną z hybrydyzacji mikromacierzy podanej w raporcie kontroli jakości (QC) (Rysunek 3) oraz wykres histogramu dla wykrytych sygnałów. Siatka przedstawia przykład sygnałów pochodnych z każdego rogu chipa, w tym tła i punktów odczytu impulsów używanych do kalibracji. Histogram wskazuje odchylenie wykrywalnych kropek o odpowiedniej intensywności sygnału. Udana hybrydyzacja daje szeroką krzywą w kształcie Gaussa z niewielkimi wartościami odstającymi, jak pokazano na rysunku. Nieudane hybrydyzacje mogą skutkować silnym przesunięciem w jedną stronę ("zielone potwory").

Na koniec, reprezentatywny wynik dopuszczalnych wartości jest pokazany w kolumnie 4 Rysunek 3. Aby wskazać wiarygodność przeprowadzonych eksperymentów, wyniki są dalej oceniane za pomocą oprogramowania GeneSpring. Zebrane dane prezentowane są w formie analizy głównych składowych (PCA). PCA integruje wartości wybranych kropek (genów) jako wektor. Liczba ocenianych punktów, które są używane, może wahać się od kilkuset do całego chipa i jest zależna od używanego oprogramowania. Każdy chip (próbka) daje jedną wartość (wektor), która wynika ze zintegrowanych intensywności sygnału dla analizowanych punktów. W związku z tym względne położenie na wykresie (PCA) wskazuje na podobieństwo próbek do siebie. Im bliżej znajdują się próbki, tym bardziej są do siebie podobne. Kontrpróby techniczne powinny znajdować się bliżej siebie niż kontrpróby biologiczne, a kontrpróby biologiczne próbki powinny skupiać się bliżej siebie niż próbki z różnych punktów czasowych, tkanek lub warunków.

Rysunek 1: Podsumowanie przebiegu pliku elektroforezy uzyskane po sprawdzeniu jakości RNA za pomocą Bioanalyzera. Próbki 1 i 2 to tkanka liści jęczmienia, na co wskazują dodatkowe pasma rybosomalne z chloroplastów. Próbki 3 i 4 to tkanka nasion jęczmienia z pokazanymi prążkami 18S i 28S rRNA. Współczynnik RIN nie zawsze jest obliczany dla tkanek zielonych, takich jak liść, ale według żelu jakość RNA jest bardzo dobra. Wartość RIN dla próbek 3 i 4 wynosi 10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Raport kontroli jakości z udanej hybrydyzacji mikromacierzy jęczmienia. Znak + oznacza wykryte sygnały na siatce ze wszystkich zakątków chipa. Histogram pokazuje liczbę sygnałów skategoryzowanych według intensywności sygnału (fluorescencji) jako logarytm po odjęciu tła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Podsumowanie kontroli jakości (QC) po hybrydyzacji i skanowaniu. Wartości dla szkiełka hybrydowego są podane w kolumnie 2 (wartość), a zakres dopuszczalnych wartości jest pokazany w kolumnie 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przygotowanie zestawów komory mycia.

Tabela 2: Temperatura i czas inkubacji dla zespołów komory mycia.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.