Artykuł metodologiczny

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60602

⸱

21 maja 2020

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biotechnology, Swinburne University of Technology, 2Department of Molecular Genetics, Heterosis Research Group, Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 3Grain Quality and Nutrition Center, Applied Functional Genomics Cluster, International Rice Research Institute

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.

Streszczenie

Charakterystyka ekspresji genów zależy od jakości RNA. W kiełkujących, rozwijających się i dojrzałych nasionach zbóż ekstrakcja wysokiej jakości RNA jest często utrudniona ze względu na wysoką zawartość skrobi i cukru. Związki te mogą zmniejszać zarówno wydajność, jak i jakość wyekstrahowanego całkowitego RNA. Pogorszenie ilości i jakości całkowitego RNA może mieć następnie znaczący wpływ na dalsze analizy transkryptomiczne, które mogą nie odzwierciedlać dokładnie przestrzennej i/lub czasowej zmienności profilu ekspresji genów badanych próbek. W tym protokole opisujemy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji całkowitego RNA w ilości i jakości wystarczającej do zastosowania do analizy całego transkryptomu ziaren zbóż. Opisana metoda nadaje się do kilku dalszych zastosowań wykorzystywanych do profilowania transkryptomicznego rozwijających się, kiełkujących i dojrzałych nasion zbóż. Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu z wykorzystaniem platformy mikromacierzy. Metoda ta została specjalnie opracowana do profilowania ekspresji genów zbóż z opisanymi sekwencjami genomu. Opisano szczegółową procedurę od obsługi mikromacierzy do końcowej kontroli jakości. Obejmuje to syntezę cDNA, znakowanie cRNA, hybrydyzację mikromacierzy, skanowanie szkiełek, ekstrakcję cech i walidację jakości danych. Dane uzyskane tą metodą mogą być wykorzystane do scharakteryzowania transkryptomu zbóż podczas kiełkowania, na różnych etapach rozwoju ziarna lub w różnych warunkach stresu biotycznego lub abiotycznego. Zaprezentowane tutaj wyniki stanowią przykład wysokiej jakości danych transkryptomowych, które można poddać dalszym analizom bioinformatycznym, takim jak oznaczanie genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG), charakterystyka sieci regulacyjnych genów oraz prowadzenie badania asocjacyjnego całego transkryptomu (TWAS).

Wprowadzenie

Transkryptom reprezentuje kompletny zestaw transkryptów kwasu rybonukleinowego (RNA) wyrażonych przez genom organizmu w danym czasie, a w szczególności w warunkach środowiskowych i wzrostu. Każda komórka ma swój indywidualny transkryptom, który odzwierciedla jej aktualny stan fizjologiczny i metaboliczny. Zbiór komórek pochodzących z podobnej tkanki lub narządu jest używany w typowym badaniu transkryptomu, ale transkryptomika jednokomórkowa i przestrzennie rozdzielczona staje się coraz bardziej popularna1. Analizy transkryptomiczne rozpoczynają się od ekstrakcji całkowitego RNA z wybranej tkanki w określonym punkcie czasowym i w określonych warunkach wzrostu. W tym celu zalecamy zastosowanie nowo opracowanej metody ekstrakcji całkowitego RNA z próbek o wysokiej zawartości skrobi lub cukru, takich jak nasiona zbóż2. Porównanie transkryptomów między różnymi próbkami skutkuje identyfikacją cząsteczek RNA o różnej liczebności. Te cząsteczki RNA są uważane za geny o zróżnicowanej ekspresji (DEC). Obfitość transkryptów pochodzących z określonych genów markerowych może być następnie wykorzystana do oszacowania stanu rozwoju lub określenia odpowiedzi organizmu na fluktuacje środowiskowe. Geny bez wykrywalnych zmian w obfitości transkryptów w badanych punktach rozwojowych są często używane jako geny referencyjne lub porządkowe.

RNA jest zazwyczaj wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą różnych metod, takich jak Northern blotting i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT-PCR), ale obecne metody transkryptomiki o wysokiej przepustowości opierają się głównie na hybrydyzacji kwasów nukleinowych przy użyciu technologii mikromacierzy, jak również sekwencjonowania RNA (RNA-Seq). RNA-Seq jest obecnie bardzo popularny, ponieważ zapewnia kilka korzyści dla aplikacji transkryptomicznych o wysokiej przepustowości, jak omówiono w innym miejscu3,4. Chociaż jest to starsza technologia, profilowanie ekspresji genów za pomocą chipów mikromacierzy jest nadal szeroko stosowane, ponieważ jest to bardziej ugruntowana technologia, która wymaga mniejszego zaplecza w dziedzinie bioinformatyki. W porównaniu z sekwencją RNA, zestawy danych generowane w eksperymentach z mikromacierzami są mniejsze i łatwiejsze do analizy. Ponadto jest bardziej opłacalny, zwłaszcza jeśli mamy do czynienia z dużą liczbą próbek. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy analizy transkryptomiczne z wykorzystaniem technologii mikromacierzy w celu określenia roli centralnych węzłów regulacyjnych, które zarządzają sieciami molekularnymi i szlakami zaangażowanymi we wzrost, rozwój i metabolizm ziaren zbóż5,6,7,8,9. Rutynowo używamy go również do prowadzenia badań profilowania ekspresji genów w całym genomie, aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie reakcji ziaren zbóż na stresy abiotyczne10, a także w prowadzeniu badań asocjacji całego transkryptomu (TWAS) i mapowania sprzężeń w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za jakość ziarna zbóż i odżywianie11,12. Inne grupy również wykorzystały technologię mikromacierzy do stworzenia specyficznego dla rozwoju atlasu ekspresji genów w jęczmieniu13, rice14,15,16, sorhum17 i wheat18.

Celem tej publikacji jest dostarczenie krótkiego tekstowego podsumowania i szczegółowego wizualnego opisu metody, którą obecnie stosujemy w naszym laboratorium do transkryptomicznego profilowania ziaren zbóż za pomocą platformy mikromacierzy Agilent. Należy pamiętać, że dostępne są inne platformy mikromacierzy, ale nie zostaną one uwzględnione w tej metodzie. Protokół rozpoczynamy od przedstawienia szczegółowego opisu ekstrakcji RNA z rozwijających się lub kiełkujących nasion zbóż. Opierając się na naszym doświadczeniu, uzyskanie wysokiej jakości i dużej ilości transkryptomu nadającego się do dalszych analiz transkryptomicznych jest często wąskim gardłem przy użyciu tkanek nasion zbóż. Wypróbowaliśmy kilka dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji RNA, ale żaden z nich nie przyniósł zadowalających wyników. W związku z tym opracowaliśmy protokół ekstrakcji chemicznej w celu uzyskania surowego ekstraktu RNA, który jest następnie poddawany oczyszczaniu kolumnowemu przy użyciu dostępnego na rynku zestawu. Korzystając z tej metody, rutynowo i powtarzalnie uzyskujemy wysokiej jakości RNA2 (Rysunek 1), który może być używany w różnych dalszych aplikacjach do generowania profilu transkryptomu.

Protokół

1. Ekstrakcja i oczyszczanie całkowitego RNA

UWAGA: Zawsze pracuj pod wyciągiem, ponieważ ta metoda wiąże się z użyciem szkodliwych lotnych rozpuszczalników organicznych. Przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej probówkę z mikrofugą z wodą wolną od nukleaz w bloku grzewczym o temperaturze 50 °C. Ta woda wolna od nukleaz zostanie użyta do elucji całkowitego RNA z kolumny spinowej w kroku 1.8.

  1. Oddzielnie zmielić próbki, z których każda zawiera co najmniej trzy kontrpróby biologiczne, na drobny proszek za pomocą wysterylizowanego moździerza i tłuczka, które są wstępnie schłodzone w ciekłym azocie.
    1. Zgarnij sproszkowane próbki za pomocą małej metalowej szpatułki zanurzonej w ciekłym azocie i umieść sproszkowane próbki w probówkach do mikrofug o pojemności 2,0 ml bez nukleaz, również wstępnie zanurzonych w ciekłym azocie. Próbki należy natychmiast przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (-80 °C) do dnia przeznaczonego na ekstrakcję RNA partią (PUNKT ZATRZYMANIA).
      UWAGA: Próbki nasion można zmielić na drobny proszek z łuskaniem lub bez. W przypadku ryżu rutynowo mielę próbki bez łuskania, ponieważ łuska zawiera krzemionkę, która może pomóc w procesie mielenia.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko i w ściśle określonych warunkach kriogenicznych. Jedną z opcji automatyzacji jest mielenie próbek za pomocą kriogenicznego młyna kulowego w celu zminimalizowania degradacji RNA i pogorszenia jakości.
  2. Otrzymać surowy ekstrakt RNA, używając około 200 mg oryginalnej próbki w proszku. Indywidualnie dodaj każdą próbkę do probówki do mikrofuzy bez nukleaz zawierającej 750 μl buforu do ekstrakcji RNA (100 mM Tris, pH 8,0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-merkaptoetanolu) i 500 μl fenolu:chloroformu:izoamylu (25:24:1).
    1. Mieszać wszystkie próbki w tym samym czasie przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wielorurowego mieszalnika wirowego ustawionego na dużą prędkość. Natychmiast trzymaj wszystkie probówki na lodzie przez dwie min.
      UWAGA: Zawsze pracuj wewnątrz dygestorium, szczególnie w przypadku wszystkich etapów związanych z fenolem, chloroformem i innymi rozpuszczalnikami organicznymi. Najlepiej użyć szerokiego dygestoria, który może pomieścić jedną wirówkę stołową, mieszalnik wirowy, wielorurowy mieszalnik wirowy i wielorurowy mieszalnik obrotowy.
  3. Oddzielić surowy ekstrakt RNA od szczątków przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 10 minut. Wykonaj wszystkie etapy wirowania w tych samych ustawieniach dla tej sekcji.
    1. Przenieść około 800 μl supernatantu do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 2,0 ml zawierającej 400 μl 1,2 M NaCl i 700 μl izopropanolu. Delikatnie wymieszaj roztwór przez inwersję 5x.
    2. Wytrącić RNA przez inkubację w zwykłej (-20 °C) lub ultraniskotemperaturowej zamrażarce (-80 °C), przez co najmniej 1 godzinę (lub noc).
      Punkt STOP lub PAUZA: po prostu przechowuj próbki w zwykłej zamrażarce w temperaturze -20 °C do zatrzymania na kilka godzin. W przypadku nocnego lub dłuższego postoju próbki należy przechowywać w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze (-80 °C).
  4. Otrzymać surowy granulat RNA przez odwirowanie przy 18 800 x g przez 15 min. Po odrzuceniu supernatantu należy oczyścić surowy osad RNA przez oczyszczanie kolumnowe za pomocą zestawu Mini Kit (tabela materiałów).
    1. Rozpuścić osad w świeżo przygotowanych 450 μl buforu RLT (przed użyciem dodać 100 μl β-merkaptoetanolu na 100 ml buforu RLT, przygotowywanego na świeżo dziennie). Zwiększyć rozpuszczanie wszystkich granulek, mieszając wszystkie probówki w temperaturze pokojowej w wielorurowym mieszalniku wirowym przez co najmniej 5 minut.
  5. Oczyść rozpuszczony osad RNA, przechodząc przez fioletową mini kolumnę wirową z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml. Wirować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 9 000 x g i wyrzucić fioletową mini kolumnę wirową.
    1. Dodać 0,5 objętości absolutnego etanolu (~225 μL) do oczyszczonego lizatu w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wymieszaj roztwór za pomocą tej samej plastikowej końcówki, pipetując kilka razy w górę i w dół.
  6. Zebrać oczyszczony RNA, natychmiast przenosząc roztwór do różowej mini kolumny wirowej z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml. Wirować przy 9 000 x g przez 15 s, aby zebrać RNA na membranę krzemionkową różowej kolumny wirowej min. Odrzucić przepływ i przepłukać RNA 350 μl buforu RW1 przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 15 s.
  7. Usunąć zanieczyszczające genomowe DNA poprzez dodanie 80 μl rozcieńczonej DNazy 1 (50 μl zamrożonej DNazy + 350 μl RDD przy użyciu zestawu DNazy) bezpośrednio na błonę i trawić przez inkubację w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut (PUNKT PAUZY).
    1. Zmyć DNazę 1, dodając 350 μl RW1 i wirując w temperaturze 9 000 x g przez 15 s. Powtórz dwa razy, ale tym razem przemyj 500 μl buforu RPE. Przenieść do nowej probówki o pojemności 2 ml i wirować w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty do wyschnięcia.
  8. Przenieś wysuszoną kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml wolnej od nukleazy. Proces elucji oczyszczonego ekstraktu RNA należy rozpocząć od dodania 50 μl wody wolnej od nukleaz (wstępnie podgrzanej w temperaturze 50 °C) i inkubacji przez 3 minuty w bloku grzewczym o temperaturze 50 °C.
    1. Po inkubacji wymyć całkowity ekstrakt RNA przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 1 minutę. Natychmiast umieścić wszystkie próbki na lodzie.
  9. Określ ilość i jakość całkowitego ekstraktu RNA, przeprowadzając odpowiednie rozcieńczenia (zwykle 1:10) w Nanodrop i BioAnalyzer przy użyciu odpowiednich protokołów producenta. Ekstrakty RNA powinny mieć co najmniej wartość RIN 8,0 i stężenie 50 ng/μL. Rysunek 1 przedstawia typowy wynik dla ekstraktów RNA uzyskanych z liści i nasion jęczmienia.
    PUNKT ZATRZYMANIA: Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. synteza cDNA, a następnie transkrypcja i znakowanie cRNA

UWAGA: Ten krok jest odpowiedni do jednoczesnego przetwarzania 24 próbek. Sugeruje się, aby cały etap był wykonywany w sposób ciągły w ciągu jednego dnia, ale identyfikowane są opcjonalne punkty zatrzymania i pauzy. Pamiętaj, aby wstępnie podgrzać trzy bloki grzewcze rurki do mikrofuge w temperaturze 80 °C, 65 °C i 37 °C przed rozpoczęciem poniższych kroków. Te ustawienia temperatury zostaną zmienione zgodnie z poniższymi krokami. Na przykład, blok grzewczy o temperaturze 37 °C zostanie ustawiony na 40 °C po przygotowaniu Spike Mix (lub jeśli został już wcześniej przygotowany). Przygotuj jednokolorową mieszankę Spike Mix, mieszankę promotora T7 i mieszankę główną cDNA za pomocą zestawu do znakowania ekspresji genów Low Input Quick Amp (patrz tabela materiałów) w oparciu o instrukcje producenta. Preparat ten jest zależny od ilości wyjściowych ekstraktów RNA, które zwykle wahają się od 10 do 200 ng dla całkowitego RNA lub 5 ng dla PolyA RNA. Rutynowo używamy 50 ng całkowitego RNA jako materiału wyjściowego do hybrydyzacji mikromacierzy2 oraz do metody, która zostanie opisana poniżej. Przygotowując mieszaninę wzorcową dla 24 próbek, należy dodać 2 dodatkowe reakcje, aby uwzględnić różnice w pipetowaniu. Na tym etapie zawsze używaj probówek do mikrofug bez nukleaz i wody bez nukleaz.

  1. Ze względu na wysoką wydajność, zazwyczaj rozcieńcza ekstrakt RNA 100-krotnie, aby zmieścił się w zakresie 50-100 ng. Opierając się na wynikach kwantyfikacji RNA w kroku 1.9, rozcieńczyć w stosunku 1:100, dodając 1 μl oczyszczonego ekstraktu RNA do 99 μl wody wolnej od nukleaz w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Określ rzeczywiste stężenie tego rozcieńczenia za pomocą Nanodrop.
    1. Wykonać drugie rozcieńczenie każdej całkowitej próbki RNA w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać 50 ng całkowitego RNA w końcowej objętości 1,5 μl. Przechowywać wszystkie próbki na lodzie.
  2. Przygotuj Spike Mix na podstawie instrukcji producenta. Ten krok jest również podsumowany w Püffeld et al. 20192. Użyj do tego bloku grzewczego o temperaturze 37 °C. Przechowywać pierwsze i drugie rozcieńczenie jednokolorowej mieszanki kolców w zamrażarce o ultraniskiej temperaturze (-80 °C) i przejść tylko przez osiem powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.
    1. Trzecie i czwarte rozcieńczenie należy przygotowywać codziennie na świeżo. Przed użyciem rozmrozić i przechowywać trzecie i czwarte rozcieńczenie mieszanki kolców na lodzie.
      UWAGA: Przelicz temperaturę bloku grzewczego 37 °C na 40 °C, gdy Spike Mix został przygotowany (lub jeśli był wcześniej przygotowany).
  3. Przed użyciem należy przygotować T7 Promoter Mix i przechowywać na lodzie. Dla 24 próbek wystarczy następujące elementy:
    20,8 μl promotora T7 primer
    + 26,0 μL wody wolnej od nukleaz
    = 46,8 μl całkowitej objętości T7 Promoter Mix
  4. Dodaj 1,8 μl T7 Promoter Primer Mix (krok 2.3) do każdej probówki do mikrofuge zawierającej 1,5 μl próbki 50 ng RNA z kroku 2.1. Dokładnie wymieszać składniki, kilkakrotnie pipetując. Denaturacja mieszaniny matrycy RNA i startera przez inkubację w bloku grzewczym o temperaturze 65 °C przez 10 minut. Natychmiast umieść rurki do mikrofuge na lodzie, przygotowując się do następnego kroku.
  5. Podczas denaturacji mieszanki matrycy i startera (krok 2.4), podgrzej wstępnie 5x bufor pierwszej nici w temperaturze 80 °C przez co najmniej 4 minuty. Szybko przygotuj syntezę cDNA Master Mix z zestawu do etykietowania Low Input Quick Amp (patrz tabela materiałów) w oparciu o instrukcje producenta. Dla 24 reakcji wystarczy następujące elementy:
    52,0 μl wstępnie podgrzanego 5x buforu pierwszej nici (krok 2,5)
    + 26,0 μL 0,1 mln naziemnej telewizji cyfrowej
    + 13,0 μl 10 mM dNTP mix
    + 31,2 μL RNase Block Mix
    = 122,2 μl całkowitej objętości syntezy cDNA Master Mix
    1. Rozmrozić każdy składnik na lodzie. Wymieszaj każdy składnik za pomocą delikatnego pipetowania. Przed użyciem Master Mix należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Po użyciu RNase Block Mix należy natychmiast umieścić z powrotem w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  6. Usunąć mieszaninę matrycy RNA i startera na lodzie (krok 2.4) i krótko odwirować w temperaturze pokojowej, aby odwirować całą zawartość na dno probówki do mikrofugi. Dozować 4,7 μl cDNA Master Mix (krok 2.5) do każdej probówki, mieszając ostrożnie, pipetując w górę i w dół. Całkowita objętość po dodaniu wszystkich składników powinna wynosić 8,0 μl.
    1. Syntetyzować cDNA przez 2 godziny w bloku cieplnym o temperaturze 40 °C. Podczas 2 godzinnej inkubacji zmienić temperaturę bloku grzewczego o temperaturze 65 °C na 70 °C w ramach przygotowań do inaktywacji cieplnej (etap 2.7).
      OPCJONALNY PUNKT PAUZY: Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C. Eksperyment można kontynuować następnego dnia po inaktywacji cieplnej (krok 2.7).
  7. Inkubować każdą probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 70 °C przez 15 minut, aby dezaktywować termicznie mieszaninę bloków RNazy. Natychmiast przenieść probówki na lód i inkubować przez co najmniej 5 minut.
  8. Gdy próbki znajdują się na lodzie przez 5 minut (krok 2.7), szybko przygotuj Transcription Master Mix. Wszystkie składniki można łączyć w temperaturze pokojowej, ale rozmrażać je na lodzie. Dla 24 próbek wystarczy następujące elementy:
    19,5 μl wody wolnej od nukleaz
    + 83,2 μl 5x bufor transkrypcyjny
    + 15,6 μl 0,1 mln naziemnej telewizji cyfrowej (DTT
    + 26,0 μl mieszanki NTP
    + 5,5 μl mieszanki polimerazy RNA T7
    + 6,2 μl cyjaniny 3-CTP (Cy3)
    = 156,0 μL całkowitej objętości Transcription Master Mix
    UWAGA: Mieszaninę polimerazy RNA T7 należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C i umieścić z powrotem natychmiast po użyciu. Co więcej, Cy3 jest wrażliwy na światło. W związku z tym mieszanie (krok 2.9) i dozowanie (krok 2.10) powinno odbywać się w warunkach słabego oświetlenia. W tym celu zwykle wyłączamy światło bezpośrednio nad stołem laboratoryjnym.
  9. Gdy probówki zostały poddane nagłemu ogrzewaniu i chłodzeniu (krok 2.7), na krótko odwiruj zawartość każdej próbki za pomocą mikrowirówki, aby zebrać cały płyn na dnie każdej probówki do mikrofuge. Dodać 6 μl Transcription Master Mix (krok 2.8), delikatnie pipetując w górę i w dół. Na tym etapie całkowita objętość tej reakcji powinna wynosić 16 μl. Inkubować probówki w temperaturze 40 °C przez 2 godziny w celu wytworzenia cRNA.
    znakowanego Cy3 OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Probówki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po transkrypcji.
  10. Podczas generowania cRNA (krok 2.9) ustaw temperaturę bloku grzewczego na 55 °C. Dodaj co najmniej jedną probówkę z wodą wolną od nukleaz do bloku grzewczego. Ta woda wolna od nukleaz zostanie wykorzystana do elucji oczyszczonego cRNA.
  11. Po transkrypcji i znakowaniu cRNA oczyść znakowane cRNA za pomocą RNeasy Mini Kit, jak opisano w kroku 3.

3. Oczyszczanie cRNA

  1. Oczyść znakowane cRNA za pomocą RNeasy Mini Kit (patrz Tabela materiałów). Przygotuj w oparciu o instrukcje producenta. Na przykład Buffer RPE jest dostarczany w zestawie w postaci skoncentrowanej. Przed użyciem dodać 4 objętości absolutnego etanolu klasy biologii molekularnej (96-100%).
  2. Do każdej próbki dodać 84 μl wody wolnej od nukleaz, aby dostosować całkowitą objętość do 100 μl. Następnie do każdej probówki dodać 350 μl buforu RLT i 250 μl absolutnego etanolu. Dokładnie wymieszać pipetując.
  3. Przenieść 700 μl każdej mieszaniny na mini kolumnę wirową z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml. Zebrać znakowane cRNA na membranę przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 30 s przy 7,534 x g. Wylać przepływającą ciecz.
  4. Przemyć każdą próbkę w 500 μl buforu RPE. Odwirować i odrzucić przepływ, jak w poprzednim kroku. Powtórz ten krok raz, a następnie przejdź do następnego kroku.
  5. Przenieś mini kolumnę wirującą do nowej probówki zbiorczej. Wysuszyć próbki przez odwirowanie, jak w kroku 3.3.
  6. Przenieś mini kolumnę wirową do wolnej od nukleaz probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml, która jest dostarczana z zestawem. Eluować każdą znakowaną próbkę cRNA, dodając 30 μl wody wolnej od nukleaz (wstępnie podgrzanej w temperaturze 55 °C) bezpośrednio do filtra membranowego. Wzmocnić elucję poprzez inkubację w bloku grzewczym o temperaturze 55 °C przez 60 s.
  7. Zebrać znakowane cRNA przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przez 30 s przy 7,535 x g. Wyrzuć kolumnę wirową i zamknij każdą rurkę do mikrofuge. Natychmiast umieść każdą tubkę na lodzie.
    OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po elucji.
  8. Określ ilościowo cRNA za pomocą Nanodrop za pomocą funkcji mikromacierzy. Ustawić próbkę na RNA-40. Uzyskaj następujące wartości i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym: stężenie barwnika cyjaniny 3 (pmol/μL), współczynnik absorbancji RNA (260 nm/280 nm) i stężenie cRNA (ng/μL).
    PUNKT ZATRZYMANIA: Po odczycie próbki cRNA należy natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
  9. Oblicz wydajność cRNA i aktywność specyficzną zgodnie z opisem w Püffeld i in. 20192.

4. Hybrydyzacja i skanowanie mikromacierzy

UWAGA: Ten krok zajmuje tylko 3-4 godziny, a zatem hybrydyzacja 24 próbek może być rozpoczęta po obiedzie. Jeden operator może wygodnie obsługiwać do 4 szkiełek (32 próbki). Poranek następnego dnia przeznaczony jest na mycie i skanowanie preparatów z mikromacierzą. Dodatkowe przejazdy można następnie wykonać po południu drugiego dnia. Ten krok jest powtarzany, aż wszystkie próbki zostaną zhybrydyzowane i zeskanowane. Zdecydowanie zaleca się używanie bezbarwnych, bezpudrowych rękawic lateksowych do obsługi i obróbki szkiełek, aby upewnić się, że próbki nie są zanieczyszczone kolorowymi pigmentami, które mogą zakłócać analizy mikromacierzy. Oprócz dostępnych na rynku mikromacierzy, nasza grupa projektuje następujące niestandardowe macierze i można je zamówić w firmie Agilent: kod zamówienia 028827 dla jęczmienia (Hordeumvulgare), 054269 dla ryżu (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 dla ryżu (Oryzasativa subs. Indica) i 048923 dla pszenicy (Triticumaestivum).

  1. Wykonaj hybrydyzację mikromacierzy za pomocą zestawu do hybrydyzacji ekspresji genów (patrz tabela materiałów). Przygotuj 10x Środek Blokujący zgodnie ze specyfikacją producenta2. Podzielić 10x środek blokujący na porcje 200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Każda porcja wystarcza na maksymalnie 40 hybrydyzacji i jest stabilna do 2 miesięcy.
  2. W dniu przeznaczonym do hybrydyzacji mikromacierzy rozmrozić na lodzie jedną 200 μl podwielokrotności 10x środka blokującego. Ponadto należy wstępnie podgrzać piec do hybrydyzacji do 65 °C i wstępnie podgrzać blok grzewczy do 60 °C do użycia podczas fragmentacji cRNA.
  3. Przygotuj mieszankę fragmentacyjną dla każdej próbki zgodnie z opisem producenta2. W naszym laboratorium rutynowo używamy 600 ng liniowo amplifikowanego cRNA znakowanego Cy3 do hybrydyzacji w 8-pakowej mikromacierzy. W tym przypadku poniższa lista podsumowuje składniki mieszanki fragmentacyjnej na próbkę:
    600 ng liniowo amplifikowanego cRNA, znakowanego cyjaniną
    + 5 μL 10x Środek blokujący
    Dostosuj objętość do 24 μl za pomocą wody bez nukleaz
    + 1 μL 25x bufor do fragmentacji
    = 25 μl całkowitej objętości mieszanki do rozdrabniania
    1. Delikatnie wymieszaj próbki za pomocą mieszalnika wirowego. Krótko odwirować wszystkie próbki za pomocą mikrowirówki.
  4. Inkubować wszystkie próbki w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C dokładnie przez 30 minut. Natychmiast schłodzić każdą probówkę na lodzie przez jedną minutę, a następnie szybko przejść do następnego etapu.
  5. Aby całkowicie zatrzymać reakcję fragmentacji, dodaj 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM do każdej probówki. Mieszać delikatnie, pipetując w górę i w dół, uważając, aby podczas mieszania nie pojawiły się żadne bąbelki. Rutynowo używamy 25 μl buforu hybrydyzacyjnego, aby zatrzymać reakcję fragmentacji w formacie 8-paku mikromacierzy.
  6. Wirować wszystkie probówki przez 1 minutę w temperaturze pokojowej 15 750 x g. Szybko umieść wszystkie probówki na lodzie i załaduj każdą próbkę tak szybko, jak to możliwe.
  7. Przed opuszczeniem laboratorium na 17-godzinną nocną inkubację przygotuj zestaw do hybrydyzacji assembly2, jak opisano na filmie.
    1. KROK KRYTYCZNY: Przenieś każdą mieszankę hybrydyzacyjną i powoli dozuj na środku każdej uszczelki, zwracając szczególną uwagę, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków podczas dozowania. Rutynowo używamy 44 μl mieszanki hybrydyzacyjnej do formatu 8-paku mikromacierzy. Umieść również 44 μl 1x buforu hybrydyzacyjnego w nieużywanych studzienkach.
    2. Natychmiast umieść suwak mikromatrycy z prawidłową orientacją na suwaku uszczelki. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, aby nie rozlać żadnego płynu. Zamknij szczelnie zespół hybrydyzacyjny i obróć go, aby sprawdzić, czy nie zostały wprowadzone trwałe pęcherzyki powietrza. Wszystkie pęcherzyki powinny poruszać się w prowadnicy uszczelki.
  8. Umieść zespół komory hybrydyzacji w rotatorze pieca do hybrydyzacji. W przypadku korzystania z bufora hybrydyzacyjnego 2x GEx ustaw prędkość obrotową na 10 obr./min i hybrydyzuj w temperaturze 65 °C dokładnie przez 17 godzin.
  9. Umyj hybrydowe mikromacierze za pomocą zestawu do płukania ekspresji genów (patrz tabela materiałów). Przygotuj do płukania ekspresji genów 1 i 2 w oparciu o instrukcje producenta2. Dodaj 2 ml 10% Triton X-102 do obu (całkowicie opcjonalnie, ale zdecydowanie zalecane, aby zmniejszyć częstość występowania artefaktów mycia mikromacierzy)2.
  10. Przygotuj trzy zespoły komór mycia zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji2. Szczegółowe informacje na temat każdej komory mycia przedstawiono w poniższej tabeli (tabela 1).
  11. Porcję 500 ml buforu myjącego 1 umieścić w butelce z odczynnikiem o pojemności 1 l i pozostawić w temperaturze pokojowej otoczenia. Przygotuj dodatkową butelkę z odczynnikiem o pojemności 1 litra i oznacz etykietą "Wash Buffer 1 Reuse", aby zapisać bufor do płukania z pierwszej komory. Dodatkowo podajcie 500 ml buforu płuczącego 2 w butelce z odczynnikiem i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Nie opuszczaj laboratorium bez przygotowania kroków od 4.9 do 4.11. Są one niezbędne do etapów prania następnego dnia.
  12. Następnego dnia należy przygotować do płukania zgodnie z tabelą 2. Napełnij każde naczynie do trzech czwartych odpowiadającego mu bufora. Każdy bufor do mycia wystarcza na 4-5 szkiełek.
  13. Dokładnie po 17 godzinach hybrydyzacji weź jedną komorę hybrydyzacyjną i zdemontuj ją na stole laboratoryjnym wyłożonym niestrzępiącym się papierem, jak opisano w poprzedniej publikacji2.
    1. KROK KRYTYCZNY: Przenieś kanapkę z mikromacierzą do naczynia 1. Upewnij się, że kod kreskowy mikromacierzy jest skierowany do góry w pozycji pochylonej i unikaj zanurzania całego slajdu w buforze. Z każdym szkiełkiem do mikromacierzy należy obchodzić się z jego końcami i unikać dotykania aktywnej strony szkiełka.
    2. Oddziel dwa szkiełka za pomocą kleszczy2. Pozwól, aby uszczelka delikatnie opadła na dno naczynia 1, jednocześnie upewniając się, że suwak mikromacierzy jest mocno przytrzymany do następnego kroku.
  14. KROK KRYTYCZNY: Powoli podnieś szkiełka mikromacierzy na boki i natychmiast przenieś do stojaka na mikromacierz w Dish 2, jak opisano w poprzedniej publikacji2. Bardzo ważne jest, aby szkiełka do mikromacierzy były w minimalnym stopniu wystawione na działanie powietrza.
    1. Powtarzaj kroki 4.13 i 4.14, aż osiem szkiełek znajdzie się w stojaku. Rozłóż szkiełka mikromacierzy równomiernie wzdłuż stojaka. Ten krok może być wykonany przez jednego operatora bez pomocy dla maksymalnie 4 suwaków. Zamocuj uchwyt stojaka i przenieś cały zestaw Dish 2 do pierwszego mieszadła magnetycznego. Mieszaj delikatnie dokładnie przez 1 minutę.
  15. Mieszając przez 1 minutę (krok 4.14), przenieś naczynie 3 z mini inkubatora o temperaturze 37 °C i umieść na drugim mieszadle magnetycznym. Delikatnie umieść bufor myjący 2 (z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) na naczyniu 3. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas nalewania.
    1. Po 1 minucie mieszania (krok 4.14) delikatnie i powoli podnieś ruszt szkiełkowy z naczynia 2 i przenieś do naczynia 3. Wyjmij uchwyt rusztu i mieszaj dokładnie przez 1 minutę.
  16. Powoli i delikatnie podnieś ruszt przesuwny z naczynia 3. Upewnij się, że nie tworzy się kropelek buforowych2. Osusz boki każdego szkiełka, delikatnie dotykając niestrzępiącego się papieru. Umieść każde wysuszone szkiełko w pudełku na szkiełka i powtarzaj krok 4.16, aż wszystkie szkiełka z mikromacierzy znajdą się w pudełku ze szkiełkami. Suszyć przez około 15 min.
    OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA
  17. Umieść każde szkiełko z mikromacierzą w uchwycie na szkiełka, upewniając się, że kod kreskowy jest skierowany do góry.
    UWAGA: Poziom ozonu w pomieszczeniu z mikromacierzą powinien wynosić 50 ppb (100 μg/m3) lub mniej. Jest to całkowicie opcjonalne, ale zdecydowanie zalecane: użyj osłony ślizgowej z barierą ozonową, aby uniknąć degradacji barwników cyjaninowych wywołanej ozonem.
  18. Umieść zmontowane uchwyty na slajdy w karuzeli skanowania. Załaduj próbki w kolejności, na podstawie numeru kodu kreskowego. Preparaty należy natychmiast zeskanować za pomocą skanera z mikromacierzą (patrz Spis materiałów), zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji2.
  19. Po uruchomieniu poddaj dane ekstrakcji cech i walidacji kontroli jakości, zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji2.

Wyniki

Ta metoda została zoptymalizowana pod kątem ekstrakcji próbek nasion zbóż zawierających znaczne ilości zanieczyszczeń w postaci skrobi lub cukrów. Została ona opracowana w celu wyizolowania całkowitego RNA z 24 próbek nasion dziennie. Procedurę należy przeprowadzić w sposób ciągły w ciągu jednego dnia, jednak w całym protokole wskazano opcjonalne punkty przerwania i wstrzymania prac. Alternatywnie, użytkownik może zastosować preferowane zestawy do ekstrakcji RNA lub manualną metodę ekstrakcji chemicznej. Jednakże, w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia, dostępne komercyjnie zestawy do ekstrakcji RNA z roślin nie są odpowiednie dla nasion ze względu na znaczne ilości zanieczyszczeń w postaci skrobi, białek, cukrów i/lub lipidów. W opisanym podejściu ekstrakcja chemiczna surowego RNA jest uzupełniona o oczyszczanie kolumnowe przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA. Zazwyczaj zapewnia to RNA o wyższej jakości i wydajności. Rysunek 1 przedstawia wynik analizy BioAnalyzer w celu sprawdzenia jakości ekstrakcji RNA z zastosowaniem opisanej tutaj metody. Wyniki zaprezentowano dla liścia jęczmienia (próbki 1 i 2 reprezentujące próbki o niskiej zawartości skrobi) oraz nasion jęczmienia (próbki 3 i 4 reprezentujące próbki o wysokiej zawartości skrobi). Wartość wskaźnika integralności RNA (RIN) dla wszystkich próbek wynosi 10.

Rycina 1 przedstawia reprezentatywny żel oczyszczonego ekstraktu RNA, którego jakość została sprawdzona za pomocą Bioanalizatora. Próbki 1 i 2 to typowe wyniki dla próbek o niskiej zawartości skrobi, takich jak liście jęczmienia, w których widoczne są dodatkowe prążki rRNA pochodzące z chloroplastów. Próbki 3 i 4 to reprezentatywne wyniki dla próbek o wysokiej zawartości skrobi, takich jak nasiona jęczmienia, wykazujące rRNA 18S i 28S. Należy pamiętać, że w przypadku zielonych tkanek roślinnych, takich jak próbki liści, nie można obliczyć zautomatyzowanej wartości RIN ze względu na rRNA chloroplastów. Jednakże integralność i wysoką jakość można stwierdzić wizualnie na podstawie braku produktów degradacji, które zazwyczaj pojawiają się jako rozmycie o niskiej masie cząsteczkowej. Wartość RIN dla próbek nasion o wysokiej zawartości skrobi, takich jak nasiona jęczmienia, wynosi zazwyczaj 10 przy zastosowaniu protokołu opisanego w niniejszej pracy.

Dodatkowo przedstawiamy tutaj reprezentatywne dane z eksperymentu w serii czasowej dla dwóch elitarnych linii inbrednych jęczmienia (Sofiara i Victoriana) wykorzystanych do analizy jakości słodowniczej19. Podczas procesu słodowania skrobia jest przekształcana w cukier. W związku z tym próbki reprezentują tkanki o zmiennych proporcjach zawartości skrobi i cukru. Ponieważ przemysłowy proces słodowania jest podobny do procesu kiełkowania, przeanalizowano transkryptomy dwóch linii jęczmienia różniących się jakością słodowniczą. RNA wyekstrahowano z kiełkujących nasion w 2, 24, 48, 72, 120, 144 i 196 h po imbibicji w trzech powtórzeniach biologicznych. Przygotowanie RNA oraz hybrydyzacja z dostosowaną macierzą mikroarray dla jęczmienia zostały przeprowadzone zgodnie z powyższym opisem. Rycina 2 przedstawia znormalizowany odczyt siatki z hybrydyzacji mikroarray zawarty w raporcie kontroli jakości (QC) (Rycina 3) oraz histogram wykrytych sygnałów. Siatka prezentuje przykład sygnałów pochodzących z każdego narożnika płytki, w tym kropki odczytu tła oraz spike-in używane do kalibracji. Histogram wskazuje odchylenie wykrywalnych kropek z odpowiednimi intensywnościami sygnału. Pomyślna hybrydyzacja daje szeroką krzywą o kształcie Gaussa z jedynie niewielkimi wartościami odstającymi, jak pokazano na rycinie. Nieudane hybrydyzacje mogą skutkować silnym przesunięciem w jedną stronę („green monsters”).

Na koniec, reprezentatywny wynik dopuszczalnych wartości przedstawiono w kolumnie 4 na Rysunku 3. Aby wykazać wiarygodność przeprowadzonych eksperymentów, wyniki poddano dalszej ocenie przy użyciu oprogramowania GeneSpring. Zebrane dane zaprezentowano w formie analizy głównych składowych (PCA). PCA integruje wartości wybranych punktów (genów) jako wektor. Liczba ewaluowanych punktów może wynosić od kilkuset do wszystkich punktów na płytce i zależy od użytego oprogramowania. Każda płytka (próbka) generuje jedną wartość (wektor), która wynika z zintegrowanych intensywności sygnałów dla analizowanych punktów. Zatem względna pozycja na wykresie (PCA) wskazuje na podobieństwo próbek względem siebie. Im bliżej siebie znajdują się próbki, tym są bardziej podobne. Powtórzenia techniczne powinny znajdować się bliżej siebie niż biologiczne, a powtórzenia biologiczne danej próbki powinny tworzyć ciaśniejszą grupę niż próbki z różnych punktów czasowych, tkanek lub warunków.

Obraz elektroforezy żelowej przedstawiający wyniki rozdzielenia DNA, drabinka z markerami wielkości nukleotydów.
Rycina 1: Podsumowanie przebiegu elektroforezy uzyskane po sprawdzeniu jakości RNA za pomocą Bioanalyzera. Próbki 1 i 2 to tkanka liścia jęczmienia, na co wskazują dodatkowe prążki rybosomalne z chloroplastów. Próbki 3 i 4 to tkanka nasion jęczmienia z widocznymi prążkami 18S i 28S rRNA. Współczynnik RIN nie zawsze jest obliczany dla tkanek zielonych, takich jak liście, ale na podstawie żelu jakość RNA jest bardzo dobra. Wartość RIN dla próbek 3 i 4 wynosi 10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopu przedstawiający wzór fluorescencji; histogram analizujący rozkład sygnału.
Rysunek 2: Raport QC z udanej hybrydyzacji mikromacierzy jęczmienia. Znak + wskazuje wykryte sygnały na siatce we wszystkich narożnikach płytki. Histogram przedstawia liczbę sygnałów sklasyfikowanych według intensywności sygnału (fluorescencji) jako logarytm po odjęciu tła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela metryk oceny; wyniki analizy danych obejmują wartości sygnału, nachylenia i granicy wykrywalności.
Rysunek 3: Podsumowanie kontroli jakości (QC) po hybrydyzacji i skanowaniu. Wartości dla zhybrydyzowanego preparatu podano w kolumnie 2 (wartość), a zakres akceptowalnych wartości przedstawiono w kolumnie 4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zespół komory płukaniaTreść i etykietaCel
Naczynie 1Opróżnić, pozostawić na blacie laboratoryjnym do następnego dniaNastępnego dnia napełnić buforem płuczącym 1 (Wash Buffer 1), używanym do demontażu szkiełek z mikromacierzą
Szalka 2Dodaj jedną kasetę do szkiełek mikroarray oraz mały magnetyczny mieszadło; opisz jako „Bufor piorący 1”, pozostaw na blacie laboratoryjnym do następnego dniaSłuży do mycia płytek z mikroarrays buforem do mycia 1 (Wash Buffer 1) następnego dnia
Szalka 3Dodaj jeden mały pasek magnetyczny, oznacz go etykietą „Wash Buffer 2” i umieść w 37 °C mini inkubatorSłuży do przemywania szkiełek z macierzą mikroarray buforem do przemywania 2 (Wash Buffer 2) następnego dnia wewnątrz 37 °C mini inkubator

Tabela 1: Przygotowanie zestawów komór płuczących.

KrokiSzalkaBufor piorącyTemperaturaCzas
Demontaż11OtoczeniaTak szybko, jak to możliwe
(Krok 4.13)
Pierwsze przemycie21Otoczenia1 min
(Krok 4.14)
Drugie przemywanie3237 °C1 min
(Krok 4.15)

Tabela 2: Temperatura i czas inkubacji dla zestawów komory płuczącej.

Dyskusja

Opisana metoda zapewnia wysoce powtarzalne wyniki dla wysokowydajnych i wysokiej jakości ekstraktów RNA (ryc. 1). Opierając się na naszym doświadczeniu, zalecamy do analizy trzy kontrpróby biologiczne dla jednego genotypu, etapu lub stanu. Aby móc wykryć statystycznie istotne różnice, należy wziąć pod uwagę ogólną obfitość mRNA. Należy jednak pamiętać, że wymagana jest początkowa ilość 200 mg próbek tkanek w trzech egzemplarzach na etapie ekstrakcji RNA. W związku z tym w przypadku eksperymentów, w których bierze udział ograniczona liczba próbek, takich jak genetycznie modyfikowane materiały roślinne, metoda ta może nie być odpowiednia.

Podczas hybrydyzacji mikromacierzy najważniejsze są następujące kroki: (1) ładowanie próbek do szkiełka uszczelki (krok 4.7) i (2) mycie matryc po hybrydyzacji (kroki 4.13 i 4.14). Ładowanie próbki należy wykonywać bardzo ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i rozlewania cieczy. Należy zachować ostrożność podczas umieszczania szkiełka do mikromacierzy na suwaku uszczelki zawierającym załadowane próbki: strona DNA (z nakrapianymi sondami) powinna być skierowana w dół, aby umożliwić hybrydyzację. W przypadku mycia mikromacierzy drugi etap mycia jest szczególnie krytyczny: w tym przypadku wyjmowanie szkiełek z bufora myjącego 2 musi odbywać się bardzo powoli (10 s), aby uniknąć artefaktów buforowych na szkiełkach, które mogą zakłócać gromadzenie i analizę danych.

Aby otrzymać wyniki eksperymentu hybrydyzacji, które kwalifikują się do dalszej analizy bioinformatycznej, należy przestrzegać kilku ważnych kryteriów. Raport kontroli jakości, który jest generowany po wykonaniu powyższego protokołu, daje dobre wyobrażenie o tym, co należy poprawić i które dane są w stanie użytecznym (rysunek 3). Pierwszą otrzymaną informacją jest wizualizowana siatka (rysunek 2). W tym miejscu można bezpośrednio sprawdzić, czy wszystkie obszary do odczytu fluorescencji są prawidłowo wyrównane. Jeśli nastąpi wizualnie wykrywalne przesunięcie, wpłynie to na wszystkie inne wartości (tło, intensywność sygnału itp.), a odczyt z tego układu nie będzie mógł być użyty. Na przeglądzie (Rozkład przestrzenny wszystkich wartości odstających) można łatwo dostrzec wszelkie zanieczyszczenia (np. kurz lub włosy), które miały wpływ na wynik. Brud można usunąć, delikatnie i ponownie skanując chip. Histogram wykresu sygnału, jak wspomniano powyżej, powinien dać szeroką krzywą w kształcie Gaussa, z niewielkimi wartościami odstającymi (rysunek 2). W zależności od analizowanej tkanki (ryc. 1), krzywa ta może wyglądać inaczej i może wydawać się mieć dwa piki lub jeden dominujący pik z ramieniem. Nie będzie to miało wpływu na jakość danych. Tylko silnie przesunięty pik lub wysokie sygnały na krawędziach wskazują na problemy, takie jak "zielone potwory" (zbyt wysokie natężenia fluorescencji), których nie można usunąć przez pranie i należy je zgłosić producentowi chipa. Ponadto "Wykres rozkładu przestrzennego dla mediany sygnałów" powinien różnić się wokół wspólnej wartości. Powinno to mieścić się w zakresie od 40 do 100, w zależności od ogólnego odczytu intensywności analizowanego chipa. Kolejną ważną kontrolą jakości jest ocena skoku danych: Wykres logarytmiczny dla skoku sygnałów powinien dawać liniową i regularną linię. Wreszcie, tabela "metryk oceny" daje dobry i wiarygodny obraz otrzymanych wyników. W tym miejscu producent podaje zakres wartości, które można sklasyfikować jako Doskonały, Dobry i Oceniający (Rysunek 3). Z naszego doświadczenia wynika, że niektóre wartości nie zawsze mogą być stosowane do wszystkich żetonów. W przypadku niestandardowych chipsów ryżowych "wartość niekontrolna" była często poza zakresem, ale nie wpływa znacząco na dalsze przetwarzanie danych. Ponadto zakres "NegControl" może zostać rozszerzony w zależności od tkanki, organizmu i ogólnej wydajności chipa do <80. Z naszego doświadczenia wynika, że zakres oceny dla wartości E1 med CV może zostać rozszerzony do <9, a nie <8. Dzięki temu możliwa jest właściwa ocena wszystkich danych odczytanych przez chip. Ogólnie rzecz biorąc, należy zawsze pamiętać, że niezależne repliki biologiczne zawsze dają najbardziej wiarygodny wynik.

Zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest fakt, że stanowi ona opłacalną, wysokoprzepustową metodę profilowania transkrypcji. Co więcej, dalsza analiza danych jest łatwiejsza i bardziej ugruntowana. Pomimo zalet, istnieją pewne ograniczenia tej techniki, takie jak liczba genów, które można przeanalizować. Mikromacierz może jedynie ułatwić analizę genów wcześniej wykrytych sond na tablicy. Dlatego technika ta ma zastosowanie tylko do gatunków roślin ze zsekwencjonowanymi genomami i w pełni opisanymi genami. Przewidujemy, że transkryptomika oparta na mikromacierzach będzie nadal bardzo przydatna i istotna nie tylko dla profilowania ekspresji genów, ale także dla innych dalszych procesów bioinformatycznych, takich jak analizy sieci regulacyjnych genów i badania asocjacyjne całego transkryptomu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana w ramach obszaru tematycznego CGIAR Global Rice Agri-Food System CRP, RICE, Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia (STRASA) Phase III, oraz IZN (Interdisciplinary Centre for Crop Plant Research, Halle (Saale), Niemcy. Dziękujemy Mandy Püffeld za doskonałą pomoc techniczną oraz dr Isabel Marii Mora-Ramirez za podzielenie się informacjami i doświadczeniami związanymi z chipsami pszennymi. Dziękujemy dr Rhondzie Meyer (RG Heterosis, IPK Gatersleben, Niemcy) za komentarze i krytyczną lekturę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ß-merkaptoetanolRoth4227.3Dodać 300 ul do 20 ml Bufor do ekstrakcji RNA bezpośrednio przed użyciem
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesAby określić jakość i ilość ekstraktu RNA
Kostkarka do lodu RóżnemarkiAby utrzymać próbki na lodzie podczas przetwarzania próbki
Kolba DewaraRóżne markiUżywany jako pojemnik na ciekły azot
Etanol, absolutnyRoth9065.1
Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genówAgilent Technologies5188-5242Składniki zestawu:
2X bufor hybrydyzacyjny Hi-RPM
25X bufor fragmentacji
10X Środek blokujący ekspresję genów
Zestaw do mycia ekspresji genówAgilent Technologies5188-5325Elementy zestawu:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Blok grzewczyRóżne markiZaleca się posiadanie co najmniej jednego bloku grzewczego na probówki 1,5 ml i drugiego na probówki 2,0 ml
Piec do hybrydyzacjiAgilentG2545APiec ze stali nierdzewnej przeznaczony do hybrydyzacji mikromacierzy firmy Sheldon Manufacturing, używany do hybrydyzacji próbki w mikromacierzy przez noc.
Zestaw prowadnic do uszczelek hybrydyzacyjnychAgilentG2534-60014
powietrza iQAirAby upewnić się, że eksperyment jest przeprowadzany w obszarze o niskiej zawartości ozonu
IsopropanolRoth9866.5
Niestrzępiący się papier, KimwipesKimberly-Clark ProfessionalKC34155
Low Input Quick Amp Labeling KitAgilent Technologies5190-2305< strong> Składniki zestawu: < / strong>
T7 Primer
5x bufor pierwszej nici
0,1 m DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x bufor transkrypcyjny
NTP Mix
Mieszanka polimerazy RNA T7
Woda wolna od nukleaz
Cyjanina 3-CTP
Metalowa szpatułka, małyUpewnij się, że mała metalowa szpatułka może zmieścić się w probówkach do mikrofuge, aby zapewnić łatwe nabieranie próbek.
Zalecany jest skaner mikromatrycowyAgilent TechnologiesAgilent SureScan lub Agilent C
Probówki do mikromatryc, wolne od nukleazRóżne markiMikrowirówka o pojemności 2,0 ml i 1,5 ml
Eppendorf5810 RZaleca się posiadanie co najmniej jednej mikrorurki do mikrofug o temperaturze otoczenia i niskiej temperaturze z wirnikami, które mogą pomieścić po 24 probówki
do mikrofug o pojemności 1,5 ml i 2,0 mlMini inkubatorLabnetI5110-230VKażdy mały inkubator się nada.
Moździerz i tłuczekKażdy mały ceramiczny lub marmurowy moździerz i tłuczek, który może wytrzymać mielenie kriogeniczne przy użyciu ciekłego azotu.
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
Nanodrop 1000Peqlab / Thermofisher
Woda bez nukleazBiozym351900302
Jednokolorowy zestaw kolców RNAAgilent5188-5282Elementy zestawu:
Jednokolorowy zestaw osłon ślizgowych RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
AgilentG2505-60550Opcjonalna, ale wysoce zalecana
probówka do PCR, 0,2 ml, bez RNazStratageneZ376426
Fenol:chloroform:mieszanina izoamylu (25:24:1)RothA156.2
Końcówki do pipet, bez nukleazy, końcówki filtrująceRóżne markiAby pomieścić objętości 2, 20, 20, 100, 200 i 1000 ul
Zestaw pipet RóżnemarkiDla objętości 2, 20, 20, 100, 200 i 1000 ul
Bufor do ekstrakcji RNA10 mM Tri-HCl pH 8,0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1,5% EDTA
15 ul/ml β-merkaptoetanol		Rutynowo używamy chemikaliów Roth lub Sigma; Dodaj β-merkaptoetanol świeży codzienny
zestaw DNazy bez RNazQiagen79254
RNeasy Mini KitQiagen74104Składniki zestawu:
Mini kolumna wirująca RNeasy (różowa)
1,5 ml Probówki zbiorcze
2 ml Probówki zbiorcze
Bufor RLT
Bufor RW
Bufor RPE
Woda wolna od nukleaz
RNeasy Plant Mini KitElementy zestawu Qiagen74904Accessories:
RNeasy mini wirująca kolumna (różowa)
QIAshredder wirująca (fioletowa)
1,5 ml probówki zbiorcze
2 ml Probówki zbiorcze
Bufor RLT
Bufor RLC
Bufor RW1
Bufor RPE
Woda wolna od nukleaz
Uchwyty do szkiełek do skanera mikromacierzy DNAAgilentG2505-60525
Szkiełko barwiące z wyjmowanym stojakiemDWK Life Sciences 900200Fisher Scientific 08-812Polecamy DWK Life Sciences Wheaton™ Szklane 20-szkiełkowe naczynie do barwienia ze zdejmowanym stojakiem (w komplecie z naczyniem, pokrywą i szklanym stojakiem na prowadnice)
Chlorek soduRothP029.1
Zamrażarka ultraniskotemperaturowaRóżne markiMożliwość przechowywania próbki w temperaturze -80 & stopni; C
Mikser wirowyRóżne markiCo najmniej jeden do jednorurowego miksera wirowego, a drugi do tego może mieszać wirowo wiele rurek
Oczyszczacz

Bibliografia

  1. Wang, X., et al. Three-dimensional intact-tissue sequencing of single-cell transcriptional states. Science. 361 (6400), (2018).
  2. Püffeld, M., Seiler, C., Kuhlmann, M., Sreenivasulu, N., Butardo, V. M. Analysis of Developing Rice Grain Transcriptome Using the Agilent Microarray Platform. Methods in Molecular Biology. 1892, 277-300 (2019).
  3. Martin, L., Fei, Z., Giovannoni, J., Rose, J. Catalyzing plant science research with RNA-seq. Frontiers in Plant Science. 4 (66), (2013).
  4. Hrdlickova, R., Toloue, M., Tian, B. RNA-Seq methods for transcriptome analysis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  5. Radchuk, V. V., et al. Spatiotemporal profiling of starch biosynthesis and degradation in the developing barley grain. Plant Physiology. 150 (1), 190-204 (2009).
  6. Sreenivasulu, N. Systems biology of seeds: deciphering the molecular mechanisms of seed storage, dormancy and onset of germination. Plant Cell Reports. 36 (5), 633-635 (2017).
  7. Sreenivasulu, N., Wobus, U. Seed-development programs: a systems biology-based comparison between dicots and monocots. Annual Review of Plant Biology. 64, 189-217 (2013).
  8. Butardo, V. M. Jr, et al. Systems Genetics Identifies a Novel Regulatory Domain of Amylose Synthesis. Plant Physiology. 173 (1), 887-906 (2017).
  9. de Guzman, M. K., et al. Investigating glycemic potential of rice by unraveling compositional variations in mature grain and starch mobilization patterns during seed germination. Scientific Reports. 7 (1), 5854(2017).
  10. Sreenivasulu, N., Sunkar, R., Wobus, U., Strickert, M. Array platforms and bioinformatics tools for the analysis of plant transcriptome in response to abiotic stress. Methods in Molecular Biology. 639, 71-93 (2010).
  11. Anacleto, R., et al. Integrating a genome-wide association study with a large-scale transcriptome analysis to predict genetic regions influencing the glycaemic index and texture in rice. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  12. Pietsch, C., Sreenivasulu, N., Wobus, U., Roder, M. S. Linkage mapping of putative regulator genes of barley grain development characterized by expression profiling. BMC Plant Biology. 9, 4(2009).
  13. Druka, A., et al. An atlas of gene expression from seed to seed through barley development. Functional & Integrative Genomics. 6 (3), 202-211 (2006).
  14. Fujita, M., et al. Rice Expression Atlas In Reproductive Development. Plant and Cell Physiology. 51 (12), 2060-2081 (2010).
  15. Wang, L., et al. A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice. The Plant Journal. 61 (5), 752-766 (2010).
  16. Yamakawa, H., Hakata, M. Atlas of rice grain filling-related metabolism under high temperature: Joint analysis of metabolome and transcriptome demonstrated inhibition of starch accumulation and induction of amino acid accumulation. Plant and Cell Physiology. 51 (5), 795-809 (2010).
  17. Shakoor, N., et al. A Sorghum bicolor expression atlas reveals dynamic genotype-specific expression profiles for vegetative tissues of grain, sweet and bioenergy sorghums. BMC Plant Biology. 14, 35(2014).
  18. Yu, Y. L., et al. Transcriptome analysis reveals key differentially expressed genes involved in wheat grain development. Crop Journal. 4 (2), 92-106 (2016).
  19. Kochevenko, A., et al. Identification of QTL hot spots for malting quality in two elite breeding lines with distinct tolerance to abiotic stress. BMC Plant Biology. 18 (1), 106(2018).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling
Posted by JoVE Editors on 6/26/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. Two author names were updated.

The names were corrected from:

Christianne Seiler
Nese Sreeenivasulu

to:

Christiane Seiler
Nese Sreenivasulu

Tagi

Ekstrakcja RNAhybrydyzacja mikromacierzyanaliza transkryptomusynteza cDNAznakowanie cRNAskanowanie preparatówekstrakcja cechwalidacja jakości danych
Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.