Przedstawione tutaj są szczegółowe metody preparowania i barwienia kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila przy użyciu BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Lipidy są niezbędne dla rozwoju zwierząt i fizjologicznej homeostazy. Rozregulowanie gospodarki lipidowej skutkuje różnymi wadami rozwojowymi i chorobami, takimi jak otyłość i stłuszczenie wątroby. Zwykle lipidy są przechowywane w kropelkach lipidów, które są wielofunkcyjnymi organellami magazynującymi lipidy w komórkach. Kropelki lipidów różnią się wielkością i liczbą w różnych tkankach i w różnych warunkach. Doniesiono, że kropelki lipidów są ściśle kontrolowane poprzez regulację ich biogenezy i degradacji. U Drosophila melanogaster enocyt jest ważną tkanką dla metabolizmu lipidów i został niedawno zidentyfikowany jako analog ludzkiej wątroby pod względem mobilizacji lipidów w odpowiedzi na stres. Jednak mechanizmy leżące u podstaw regulacji metabolizmu kropelek lipidów w enocytach pozostają nieuchwytne. Aby rozwiązać ten problem, niezwykle ważne jest opracowanie niezawodnej i czułej metody bezpośredniej wizualizacji dynamicznych zmian kropelek lipidów w enocytach podczas rozwoju i w warunkach stresowych. Korzystając z lipofilowego BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów, opisano tutaj szczegółowy protokół preparacji, a następnie barwienia kropelkami lipidów w enocytach larw Drosophila w odpowiedzi na głód. Pozwala to na jakościową analizę dynamiki kropelek lipidów w różnych warunkach za pomocą mikroskopii konfokalnej. Co więcej, ta szybka i wysoce powtarzalna metoda może być również stosowana w genetycznych badaniach przesiewowych do identyfikacji nowych czynników genetycznych związanych z metabolizmem kropelek lipidów w enocytach i innych tkankach.
Wprowadzenie
Lipidy są niezbędne do przetrwania komórek. Oprócz swojej tradycyjnej roli jako integralnych składników systemów błon komórkowych, lipidy odgrywają również kluczowe funkcje w dostarczaniu energii i transdukcji sygnałowej w całym cyklu życia poszczególnych zwierząt1. W związku z tym metabolizm lipidów musi być zgodny ze ścisłymi przepisami, aby utrzymać fizjologiczną hemostazę w komórkach. Wiadomo, że rozregulowanie gospodarki lipidowej prowadzi do różnych chorób, takich jak cukrzyca i stłuszczenie wątroby. Pomimo ogromnego znaczenia metabolizmu lipidów w zdrowiu zwierząt, mechanizmy leżące u podstaw regulacji metabolizmu lipidów pozostają w dużej mierze nieznane.
Drosophila jest szeroko stosowana od lat, odkąd profesor Thomas H. Morgan zaczął używać ich w badaniach dotyczących genetyki i innych podstawowych zagadnień biologicznych2. W ciągu ostatnich kilku dekad pojawiły się dowody na to, że Drosophila jest doskonałym organizmem modelowym w badaniu wielu chorób związanych z metabolizmem lipidów, takich jak otyłość1,3. W szczególności Drosophila ma wysoce konserwatywne geny metaboliczne z ludźmi i posiada podobne istotne tkanki/narządy i typy komórek do metabolizmu lipidów.
Na przykład, ciało tłuszczowe Drosophila, które jest odpowiedzialne za magazynowanie triacyloglicerydów, funkcjonuje analogicznie do ludzkiej tkanki tłuszczowej. Ostatnio wykazano, że grupa wyspecjalizowanych komórek podobnych do hepatocytów (tj. enocytów), które zostały zgłoszone jako funkcjonalny analog ludzkiej wątroby, jest zaangażowana w metabolizm kwasów tłuszczowych i węglowodorów u muszek owocowych4,5. Podobnie jak w przypadku wątroby ssaków, enocyty reagują na głód, aktywując tworzenie kropelek lipidów zarówno u larw, jak i dorosłych Drosophila, co powoduje akumulację kropelek lipidów u enocytów4,6,7,8. Anatomicznie enocyty są ściśle przylegające do podstawowej wewnętrznej powierzchni naskórka bocznego w skupiskach około sześciu komórek na półsegment brzuszny, co uniemożliwia wyizolowanie skupisk enocytów z naskórka. Dlatego enocyty muszą być przyczepione do naskórka podczas preparowania i barwienia.
Lipidy są przechowywane w postaci kropelek lipidów, które są organellami z jednowarstwowymi błonami w komórkach9. Kropelki lipidów występują w prawie wszystkich typach komórek u różnych gatunków10. Dynamika kropelek lipidów, w tym ich wielkość i liczba, zmienia się w odpowiedzi na stresory środowiskowe. Jest to uważane za odzwierciedlenie stanu metabolicznego w odpowiedzi na stres, taki jak starzenie się i głód7,8. Dlatego tak ważne jest opracowanie wykonalnej i wiarygodnej metody jakościowego określania dynamiki kropelek lipidów w enocytach podczas rozwoju i w warunkach stresowych. W szczególności, u larw trzeciego stadium rozwojowego, enocyty zawierają niewiele lub nie zawierają żadnych wykrywalnych kropelek lipidów w warunkach karmienia, ale zawierają liczne duże kropelki lipidów po deprywacji żywieniowej4. Aby zweryfikować skuteczność tej metody, sugeruje się barwienie kropelkami lipidów w enocytach w warunkach głodu.
Obecnie dostępnych jest kilka barwników lipofilowych do barwienia kropelek lipidów, takich jak barwniki niefluorescencyjne Sudan Black i Oil Red O oraz barwniki fluorescencyjne Nile Red i BODIPY 493/50311. Sudan Black i Oil Red O są powszechnie stosowane do tkanek estrów cholesterolu i triacylogliceroli i można je łatwo wykryć za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak stosunkowo wysokie barwienie tła i stosunkowo niska rozdzielczość to dwa czynniki ograniczające jego zastosowania w jakościowej analizie dynamiki kropelek lipidów. Aby przezwyciężyć ograniczenia barwników niefluorescencyjnych, czerwień nilowa i BODIPY 493/503 są stosowane jako idealne substytuty barwienia kropelkami lipidów. Doniesiono, że czerwień nilowa może również wykrywać pewien nieestryfikowany cholesterol, co sprawia, że BODIPY 493/503 jest do pewnego stopnia bardziej specyficznym barwnikiem dla komórkowych kropelek lipidów12,13,14.
Przede wszystkim, aby zaspokoić potrzebę szybkiej i czułej analizy kropelek lipidów w enocytach, ten protokół przedstawia wykonalną i wysoce powtarzalną metodę barwienia specyficznego dla kropelek lipidów na bazie utrwalacza przy użyciu BODIPY 493/503 jako barwnika barwiącego. W tym raporcie enocyty są preparowane, a BODIPY 493/503 jest używany do barwienia kropelkami lipidów w enocytach, w których kropelki lipidów są wykrywane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Łatwość i przystępność cenowa tej procedury sprawiają, że idealnie nadaje się ona do modyfikacji i dalszego wykorzystania w innych zastosowaniach, takich jak cytometria przepływowa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Składanie jaj
- Przygotuj standardowy pokarm z mąki kukurydzianej do składania jaj.
nuta: Aby zapoznać się z przepisem i procedurą gotowania dla standardowej żywności z mąki kukurydzianej używanej tutaj, zobacz wcześniej opublikowane szczegóły15. - Przygotuj świeżą pastę drożdżową, dodając 6 ml wody destylowanej do 4 g aktywnych suszonych drożdży w probówce odśrodkowej o pojemności 50 ml. Użyj szpatułki, aby wymieszać i zrobić pastę.
- Przygotuj butelki do składania jaj, napełniając je jedzeniem z mąki kukurydzianej i rozprowadź około 1 g pasty drożdżowej na powierzchni żywności z mąki kukurydzianej za pomocą szpatułki.
- Umieść muchy o pożądanych genotypach w butelce do składania jaj i umieść ją w inkubatorze o stałej temperaturze 25 °C i wilgotności 60%.
nuta: Idealne krzyżówki składają się zwykle ze 150 dziewiczych much i co najmniej 75 samców. Trzymanie much w ciemności poprzez umieszczenie światłoszczelnego pudełka na butelkach do składania jaj zwiększy szybkość rozmnażania. - Przed pobraniem jaj pozwól muchom złożyć jaja przez 1 godzinę, aby umożliwić usunięcie wszystkich starych jaj, które pozostają przechowywane w jajowodach samic.
- Pozwól muchom złożyć jaja w nowej butelce do składania jaj przez 1 godzinę i wyjmij dorosłe osobniki z butelki.
nuta: Kontroluj czas składania jaj, aby zminimalizować zakres rozwoju w celu uzyskania larw w precyzyjnie kontrolowanym stadium rozwojowym. - Pozostawić jaja do rozwinięcia się przez 84 godziny w larwy trzeciego stadium rozwojowego w inkubatorze w temperaturze 25 °C w cyklu 12 godzin/12 godzin światła i ciemności.
2. Leczenie głodu u larw
UWAGA: Jak wspomniano powyżej, u larw trzeciego stadium rozwojowego, w normalnych warunkach żywieniowych w enocytach jest niewiele lub nie ma ich wcale, ale w warunkach stresu, takich jak głód, w oenocytach mogą powstać liczne duże kropelki lipidów. Aby dokładniej zweryfikować tę metodę, konieczne jest wstępne poddanie tych larw obróbce w celu wywołania biogenezy kropelek lipidów w enocytach. Tutaj jako paradygmat wybrano przebieg głodu wynoszący 12 godzin, 24 godziny i 36 godzin. W szczególności krótki okres głodu (np. 3 godziny) jest wystarczający do wywołania wykrywalnych kropelek lipidów w enocytach. Czas głodu może się różnić w zależności od konkretnych celów i ustawień eksperymentalnych.
- Zrób komory do głodzenia i zabiegów kontrolnych.
- W przypadku komór do leczenia głodowego: umieścić bibułę filtracyjną o odpowiednim rozmiarze na szalce Petriego o średnicy 6 cm i odpipetować 1 ml PBS na bibułę filtracyjną.
- W przypadku komór kontrolnych do zabiegów: umieść 5 ml standardowego pokarmu z mąki kukurydzianej Bloomington na szalce Petriego.
- Za pomocą szpatułki delikatnie wykop górną warstwę pokarmu zawierającego larwy, które nadal zagrzebują się w pożywieniu i przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną 5 ml PBS. Delikatnie wymieszaj larwy w PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pokarmowe z larw i uczynić je tak czystymi, jak to tylko możliwe.
- Użyj małego pędzla, aby zebrać 40 larw trzeciego stadium rozwojowego o tej samej przybliżonej wielkości. Posortuj je losowo do komory głodowej lub kontrolnej, z 20 larwami każda.
- Umieścić komory w inkubatorze w temperaturze 25 °C przy wilgotności 60% i pozostawić na rozwój przez 12 godzin, 24 godziny i 36 godzin leczenia.
nuta: W przypadku larw w komorze głodowej dodawaj 1 ml PBS co 12 godzin, aby uniknąć odwodnienia larw.
3. Sekcja enocytów
- Użyj małego pędzla, aby wybrać larwy w odpowiednim wieku (12 godzin, 24 godziny lub 36 godzin po zabiegu), a następnie przenieś je na nową szalkę Petriego wypełnioną 5 ml lodowatego PBS do umycia.
nuta: Powtórz krok 2.2 w przypadku larw w komorze kontrolnej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia żywności. - Napełnij płytkę preparacyjną lodowatym PBS i za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy na płytkę preparacyjną. Umieść płytkę separacyjną pod mikroskopem stereoskopowym w celu wykonania następującego etapu sekcji.
nuta: Lodowata temperatura pomoże spowolnić ruchy larw i ułatwi preparację. - Obróć larwy brzuszną stroną do góry i grzbietową do dołu i delikatnie przytrzymaj w miejscu za pomocą kleszczy. Przymocuj larwy do płytki preparcyjnej, umieszczając szpilkę do wypreparowania przez gardło na przednim końcu, a drugą szpilkę przez przetchlinkę na tylnym końcu.
nuta: Stronę grzbietową najłatwiej zidentyfikować po obecności pni grzbietowych tchawicy. - Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby naciąć (wzdłużnie) naskórek od przodu do tylnego końca.
- Usuń wewnętrzną tkankę naskórka za pomocą kleszczy.
nuta: Należy zachować ostrożność podczas usuwania gałęzi tchawicy, aby uniknąć uszkodzenia enocytów, które są zlokalizowane na wewnętrznej powierzchni naskórka. - Za pomocą kleszczy wyjmij szpilki preparacyjne i przenieś naskórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej PBS na lodzie.
- Kontynuuj sekcję innych larw zgodnie z procedurą opisaną powyżej.
4. Barwienie kropelkami lipidów
- Inkubuj wypreparowany naskórek w buforze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze.
nuta: Bufor utrwalający zawiera 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. - Usuń bufor utrwalający, a następnie szybko umyj. Aby przeprowadzić szybkie płukanie, dodaj 1 ml PBS w temperaturze pokojowej do probówki po usunięciu PFA, delikatnie zawieś ponownie chusteczki i wyrzuć PBS.
ostrożność: Bufor utrwalający zawiera PFA, który jest szkodliwy dla zdrowia ludzkiego. Ważne jest, aby prawidłowo zutylizować bufor utrwalający jako odpad niebezpieczny. - Przemyć próbki 3 razy przez 5 minut każda za pomocą PBS, aby wypłukać wszystkie możliwe pozostałości PFA.
- Inkubować naskórek za pomocą BODIPY 493/503 (1 μg/ml; patrz tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze.
nuta: Począwszy od tego etapu, owiń probówkę mikrowirówki kawałkiem folii aluminiowej, aby chronić próbki przed światłem i zminimalizować możliwe fotowybielanie. - Usunąć roztwór barwiący BODIPY 493/503 i przemyć próbki 3x przez 10 minut każda za pomocą PBS, aby całkowicie usunąć resztki barwników.
5. Montaż i obrazowanie
- Umieścić 6 μl podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym.
nuta: Medium montażowe służy do wydłużenia czasu wykrywania ze względu na jego właściwości zapobiegające blaknięciu. - Użyj kleszczyków, aby podnieść jeden naskórek i delikatnie usuń resztki PBS za pomocą chusteczki.
- Umieść naskórek w podłożu montażowym i dostosuj jego orientację tak, aby jego wewnętrzna powierzchnia zawierająca enocyty znajdowała się na dole, a jego zewnętrzna powierzchnia znajdowała się na górze.
- Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na naskórek.
nuta: W razie potrzeby usunąć nadmiar materiału montażowego wyciekającego spod szkiełka nakrywkowego za pomocą ściereczki. Aby ułatwić obrazowanie, delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe kleszkami, aby podczas obserwacji szkiełka przez mikroskop można było łatwo zobrazować klaster enocytów w jednej płaszczyźnie. Alternatywnie możliwe jest przecięcie naskórka na dwie półnaskórki przez środkową linię, aby uniknąć zwijania się całego naskórka podczas montowania tkanek. - Nałóż bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić.
- Umieść szkiełka w światłoodpornym pudełku na próbki i pozwól lakierowi do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, co może zająć 5-10 minut.
- Kontynuuj analizę mikroskopową. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego (powiększenie 63x ze zoptymalizowanymi ustawieniami filtra GFP lub FITC, wzbudzenie = 488 nm, emisja = 503 nm), aby uzyskać czyste i czułe sygnały o zminimalizowanym tle.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowe wykonanie tej procedury powinno skutkować wyraźnym barwieniem kropli lipidowych, co pozwoli określić liczbę i rozmiar kropli lipidowych w oenocytach. Rycina 1A, A', A'' wykazuje, że w oenocytach larw karmionych w sposób prawidłowy na różnych etapach rozwoju znajduje się niewiele wykrywalnych kropli lipidowych (zielone kropki). Rycina 1B,B',B'' wykazuje zwiększoną liczbę kropel lipidowy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wśród tych opisanych powyżej w tym protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, a jednym z nich jest okres składania jaj. Jako tkanka mobilizująca lipidy, enocyt jest bardzo wrażliwy na stan odżywienia 6,8. Wydłużony czas składania jaj może skutkować zatłoczonymi larwami i zwiększoną konkurencją pokarmową, co prowadzi do niedokładnych wyników. Zastosowany w tym protokole 1-godzinny okres składania jaj pozwala larwom rozwijać się bez konkurencji żywieniowej. Z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31671422, 31529004 i 31601112), Projektu 111 (D18010), Projektu Lokalnych Zespołów Innowacyjnych i Badawczych Programu Talentów Rzeki Guangdong Perl (2017BT01S155) oraz Chińskiej Fundacji Nauki Podoktorskiej (2018M640767).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka wirówkowa 50 ml | Corning | 430829 | 50 ml |
| 6 cm szalka Petriego | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | Do pokarmu na muchy | ||
| Folia | aluminiowa N/A | N/A | Chroń klon przed światłem |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Barwnik barwiący kropelki lipidów |
| Mikroskop | konfokalnyLeica | Leica TSC SP5 | Obrazowanie konfokalne |
| Syrop | Do pokarmu dla much | ||
| Mąka | Do pokarmu dla much | ||
| Szkiełko nakrywkowe | Citoglas | 10212424C | 20 i razy; 20 mm, grubość 0,13-0,17 |
| Trzpień preparacyjny | N/A | N/A | |
| Płytka preparcyjna | NIE | DOTYCZY | |
| Bibuła filtracyjna | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Średnica: 11 cm |
| Bufor utrwalający | N/A | N/A | 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x |
| PBS Kleszcz | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Inkubator | Jiangnan | SPX-380 | Do hodowli much |
| Probówka do mikrowirówek | Axygen | MCT-150-C | 1,5 ml |
| Szkiełko mikroskopowe | Citoglas | 10127105P-G | |
| Medium montażowe | VECTASHIELDAntifade Medium montażowe | H-1000 | Medium do montażu Antifade |
| Lakier do paznokci | PanEra | AAPR419 | Uszczelnij szkiełko nakrywkowe |
| Pędzel | N/A | /A | |
| PBS | N/ | A N/A | 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7,4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Nożyczki nożycowe | Smartdata | Medical SR81 | Vannas Wiosenne nożyczki |
| Mąka | Do pokarmu dla much | ||
| Szpatułka | N/A | N/A | |
| Standardowa karma z mąki kukurydzianej | NIE | dotyczy | Zgodnie ze standardowym przepisem na żywność z mąki kukurydzianej |
| Bloomington Stereo mikroskop | Leica | Leica S6E | Do rozwarstwiania tkanek |
| Wytrzyj papier | N/A | N/D | |
| Drożdże | Do pokarmu dla much | ||
| yw | Przechowywane jako zapas laboratoryjny | N/A | Drosophila |
Bibliografia
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center. , Indiana University Bloomington. https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019).
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell? Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
