Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Podsumowanie

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Streszczenie

Zdolność do określania powinowactwa wiązania lipidów z białkami jest istotną częścią zrozumienia interakcji białko-lipid w transporcie błonowym, transdukcji sygnału i przebudowie cytoszkieletu. Klasycznymi narzędziami do pomiaru takich oddziaływań są powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC). Chociaż są to potężne narzędzia, podejścia te mają wady. ITC wymaga dużych ilości oczyszczonego białka, a także lipidów, które mogą być kosztowne i trudne do wyprodukowania. Co więcej, zarówno ITC, jak i SPR są bardzo czasochłonne, co może znacznie zwiększyć koszty przeprowadzania tych eksperymentów. Jednym ze sposobów na ominięcie tych ograniczeń jest zastosowanie stosunkowo nowej techniki termoforezy w mikroskali (MST). MST jest szybki i opłacalny przy użyciu niewielkich ilości próbki w celu uzyskania krzywej nasycenia dla danego zdarzenia wiązania. Obecnie dostępne są dwa rodzaje systemów MST. Jeden rodzaj MST wymaga znakowania fluoroforem w widmie niebieskim lub czerwonym. Drugi system opiera się na wewnętrznej fluorescencji aminokwasów aromatycznych w zakresie UV. Oba systemy wykrywają ruch cząsteczek w odpowiedzi na miejscową indukcję ciepła z lasera na podczerwień. Każde podejście ma swoje zalety i wady. Bezznacznikowy MST może wykorzystywać nieoznakowane białka natywne; jednak wiele analitów, w tym farmaceutyków, fluoryzuje w zakresie UV, co może zakłócać określenie dokładnych wartości _KD. Dla porównania, znakowany MST pozwala na większą różnorodność mierzalnych oddziaływań parami przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie sond przymocowanych do ligandów o mierzalnych absorbancjach w zakresie widzialnym w przeciwieństwie do UV, ograniczając potencjał zakłóceń sygnałów z analitów.

Wprowadzenie

Termoforeza w mikroskali jest stosunkowo nową techniką w określaniu stałych dysocjacji (K_D) oraz stałych inhibicji (IC₅₀) pomiędzy biochemicznie istotnymi ligandami. Wiodący komercyjny sprzedawca MST (np. NanoTemper) oferuje dwie popularne technologie MST: 1) Bezznacznikowy MST wymagający znacznika fluorescencyjnego oraz 2) znakowana termoforeza wykorzystująca naturalną fluorescencję białek zależną od liczby reszt aromatycznych obecnych w każdym białku¹. Wadą termoforezy bezznacznikowej jest to, że w większości przypadków nie pozwala ona na pomiar oddziaływań białko-białko. Możliwe jest jednak zmodyfikowanie białek bez aminokwasów aromatycznych, takich jak tryptofan, do stosowania w termoforezie bez etykiety².

MST mierzy ruch cząstek w odpowiedzi na indukcję mikroskopijnych pól temperatury zainicjowanych przez laser podczerwony w obecnie dostępnych technologiach¹. MST może być używany do pomiaru interakcji białko-białko, interakcji białko-lipid, białka-mała cząsteczka, eksperymentów konkurencyjnych, a nawet interakcji między małymi cząsteczkami, o ile można wytworzyć wystarczającą separację sygnału. Dodatkowo, MST pozwala na pomiar interakcji opartych na błonie-białku osadzonych w liposomach lub nanodyskach. Znakowana termoforeza wykorzystuje zastosowanie znaczników znakowanych fluorescencyjnie, co pozwala na chemicznie kontrolowaną separację sygnału między ligandem a analitem. Wartości_{K D} można uzyskać za pomocą termoforezy dla interakcji obejmujących wiązanie białek przy niskich stężeniach nanomolowych, co w większości przypadków jest znacznie niższym stężeniem białka niż to, co jest wymagane dla kalorymetrii izotermicznej (ITC)³. Dodatkowo, MST nie ma ścisłych wymagań dotyczących buforowania, jak jest to wymagane dla powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)⁴, a znakowana termoforeza może być nawet używana do pomiaru stałych wiązania białek będących przedmiotem zainteresowania z nie w pełni oczyszczonych roztworów białkowych⁵ z genetycznie wstawionymi znacznikami fluorescencyjnymi⁶. Wadą MST jest to, że parametrów kinetycznych nie można łatwo uzyskać dla MST, jak w SPR².

Pomiary termoforezy zależą od lokalnej różnicy temperatur roztworu. Ciepło to może być generowane przez laser na podczerwień. Urządzenie MST posiada detektor fluorescencji sprzężony z wiązką podczerwieni (IR) i może wychwytywać zmiany fluorescencji na podstawie lokalnych zmian stężenia cząsteczek fluorescencji w punkcie, w którym celowany jest laser IR. Urządzenie MST wykorzystuje laser ukierunkowany na podczerwień sprzężony bezpośrednio z detektorem fluorescencji skupionym w tym samym punkcie, w którym wytwarzane jest ciepło w roztworze. Pozwala to na solidne wykrywanie zmian temperatury odpowiadających zubożeniu cząsteczek w punkcie ciepła generowanego przez laser IR. Zmierzona fluorescencja na ogół zmniejsza się bliżej lasera IR w odpowiedzi na wzrost temperatury. Różnice mierzone w wyniku mogą wynikać z wielu czynników, w tym ładunku, wielkości lub entropii solwatacji. Różnice te są mierzone jako zmiany fluorescencji w odpowiedzi na indukcję ciepła lub ruch cząsteczek z gorących do chłodniejszych części naczynia włosowatego.

Podczas ładowania kapilary danym roztworem, ważne jest, aby pozostawić powietrze na obu końcach kapilary i nie obciążać kapilary całkowicie pełnej. W komercyjnej kapilarze mieści się około 10 μl roztworu. Można osiągnąć dokładne pomiary przy użyciu 5 μl roztworu, o ile roztwór jest manipulowany do środka kapilary, nie ma pęcherzyków powietrza (potencjalnie odgazowuje się przed załadowaniem kapilary) i należy zachować ostrożność przy ładowaniu stojaka, aby nie przepychać roztworu ze środka kapilary, gdzie celowany jest laser na podczerwień. Jeśli laser nie wejdzie w pełny kontakt z roztworem, wynikiem najprawdopodobniej będzie jeden z trzech bezużytecznych wyników dla tego stężenia: 1) brak lub niska detekcja fluorescencji, 2) wyższa detekcja fluorescencji (potencjalnie z postrzępionym pikiem) lub 3) detekcja fluorescencji w innych wartościach z danego miareczkowania, ale z postrzępionym i niezaokrąglonym pikiem.

Dla termoforezy znakowanej optymalne jest posiadanie sygnału fluorescencji powyżej 200 i poniżej 2000 jednostek fluorescencji⁷. Urządzenie MST wykorzystuje zakres intensywności diod LED od 0 do 100, które można wybrać tak, aby uzyskać sygnał powyżej 200 lub poniżej 2000. Alternatywnie można użyć różnych stężeń znakowanego liganda, aby zmodyfikować sygnał fluorescencji do optymalnego poziomu. Ważne jest, aby przeprowadzić skanowanie nasadki z danym pomiarem MST jako odniesieniem podczas analizy danych, ponieważ słabe skanowanie nasadki może często skutkować punktem, który można później określić jako wartość odstającą. Każdy przebieg powinien zająć około 30 minut, jeśli mierzy się pojedynczą moc MST za pomocą skanowania nasadki. Komercyjne urządzenia pozwalają na zmiany mocy MST. W starszych wersjach oprogramowania można to ustawić w zakresie od 0 do 100; a w nowszych wersjach można wybrać niski, średni lub wysoki MST. Aby uzyskać wiarygodne ślady, badacz może być zmuszony do wypróbowania każdego z nich i zdecydowania, które ustawienie MST daje najbardziej wiarygodne dane dla danej interakcji.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄ i 2 mM KH₂PO_4, pH 7,4¹.
2. Przygotować barwnik NTA-Atto 647 N. Rozcieńczyć podstawowy barwnik NTA-Atto 647 N do 100 nM ze 100% roztworu DMSO do PBS bez Tween.
3. Ekspresja Vam7-His8 – Białko jako białko fuzyjne w E. coli i oczyszczanie za pomocą Ni-NTA i chromatografii wykluczania wielkości⁸.
4. Miareczkować analit w buforze PBS. Jeśli analit znajduje się w innym buforze, znakowany MST nie jest szczególnie wrażliwy na niewielkie różnice w buforze od cząsteczek takich jak DMSO, chyba że zawartość buforu analitu wchodzi w interakcję ze znakowanym białkiem.

2. Przygotowanie urządzenia MST

1. Włącz wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia.
2. Otwórz oprogramowanie sterujące i upewnij się, że laptop jest włączony i ma stan połączenia na komputerze podłączonym do urządzenia.
3. Wprowadź ustawienia fluorescencji i MST dla tego eksperymentu. Ustaw MST Przed na 3 s, MST na 30 s, a Odzyskiwanie fluorescencji (Fluo.) po 1 s. Przed pomiarem wstępnej fluorescencji i nie wymaga długich czasów; MST to rzeczywista ilość czasu, w którym należy osiągnąć równowagę po indukcji ciepła.
4. Tabela kapilarek: Dla każdej rurki kapilarnej wprowadź nazwę celu (liganda), nazwę liganda (analitu), stężenie celu oraz najwyższe stężenie miareczkowania i użyj współczynnika miareczkowania autouzupełniania. Na przykład wprowadź 50 nM dla docelowego stężenia Vam7-His8, Vam7-His8 jako nazwę celu, (kwas 1,2-dioctanoylfosfatydowy) Di-C8 PA jako nazwę liganda i najwyższe stężenie liganda, wybierając 1:1 i przeciągając w dół do miejsc autouzupełniania 2-16.
5. Uruchom skanowanie nasadki, aby wybrać odpowiednią diodę LED (20% diody LED (ustawienie wstępne)) w oparciu o sygnał białka docelowego i dostosuj od 200 do 2000 jednostek fluorescencji dla znakowanego MST. Skany czapek powinny pokazywać jednolite, zaokrąglone szczyty w kształcie dzwonu.
6. Wybierz zakres mocy MST i wprowadź wartości dla każdej z nich, aby przetestować najbardziej niezawodne dopasowanie wiązania, a następnie naciśnij Start Cap Scan + Measurement, skanując różne wartości w celu określenia najlepszych warunków pracy dla danej testowanej interakcji.
7. Określ moc MST z najlepszym dopasowaniem za pomocą oprogramowania analitycznego i ustawienia wstępnego dla termoforezy za pomocą Tjump. Analizuj pasowania zgodnie z większością separacji fluorescencji między najniższym i najwyższym stężeniem w porównaniu z mocą MST z najlepszym dopasowaniem i wybierz moc MST do prób powtórzonych.
8. Określ, czy między pierwszym a drugim uruchomieniem nastąpiło fotowybielanie, przechodząc do oprogramowania do analizy i przełączając analizę w tryb ekspercki. Następnie do analizy wybierz fluorescencję zamiast termoforezy. Wybierz tryb eksperta, a następnie fotowybielanie.

3. Przygotowanie próbek do oznakowania MST

1. Doprowadzić roztwór Vam7-His8 do stężenia 200 nM w PBS bez Tween.
2. Doprowadź barwnik NTA-Atto 647 do 100 nM w PBS bez Tween.
3. Wymieszać barwnik Vam7-His8 i NTA-Atto 647 w stosunku objętościowym 1:1 i pozostawić w temperaturze pokojowej pod przykryciem światła przez 30 minut. Oznaczyć odpowiednie stężenie białka docelowego, jak w sekcji 2.5 (patrz Suplement dotyczący wykorzystania KD barwnika Ni-NTA, jak pokazano na filmie).
4. Odwirowywać mieszaninę barwnika NTA-Atto 647 N i białka przez 10 minut w ciemnym pomieszczeniu przy użyciu wirówki stołowej o sile około 8,161 g.
5. Po doświadczeniu mieszaninę należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub w czasie eksperymentu na lodzie w celu ponownego użycia w ciągu kilku godzin, jeśli jest to konieczne, aby zapobiec denaturacji białka.
6. Użyj wyszukiwarki stężeń NT, aby określić zakres stężeń potrzebny do miareczkowania.
7. Doprowadzić Di-C8 PA do odpowiedniego maksymalnego stężenia w wodzie.
8. Miareczkować analit, stosując seryjne rozcieńczanie w stosunku 1:1 w buforze PBS dla 16 stężeń w oparciu o poprzedni krok. W przeciwieństwie do SPR, termoforeza nie jest tak wrażliwa na różnice.

4. MST próbek

1. Włącz urządzenie i podłączony laptop.
2. Naciśnij strzałkę w górę z przodu maszyny i wysuń stojak na kapilary.
3. Załaduj kapilary do stojaka o najwyższym stężeniu w pozycji 1.
4. W oprogramowaniu sterującym wybierz czerwony kanał odpowiadający NTA-Atto 647 N.
5. Wprowadź informacje o stężeniu, położeniu i nazwie dla każdej kapilary w tabeli naczyń włosowatych.
6. Uruchom skanowanie kapilarne, naciskając Start Cap Scan przy 20% diodzie LED (ustawienie wstępne) i dostosuj zgodnie z 200 do 2000 jednostek fluorescencji za pomocą ustawień intensywności diody LED lub stężenia liganda (znakowanego białka).
7. Wybierz zakres mocy MST.
8. Rozpocznij skanowanie nasadki + pomiar MST.
9. Analizuj za pomocą oprogramowania analitycznego.

5. Analiza danych MST

UWAGA: Oprogramowanie do analizy dostarczone przez Nanotemper jest zastrzeżone i jest wykonywane przy użyciu analizy powinowactwa M.O. Istnieją różne sposoby pomiaru powinowactwa wiązania w oparciu o fluorescencję lub termoforezę. Nowsze wersje tego oprogramowania są wstępnie ustawione na automatyczną ocenę danych za pomocą termoforezy i są zaprogramowane na korzystanie z termoforezy z Tjump wykorzystującym oba pomiary. Alternatywnie można wybrać sam Tjump lub samą termoforezę. Dodatkowo oprogramowanie analityczne umożliwia oszacowanie powinowactwa za pomocą wstępnej fluorescencji. Dostęp do tych ustawień można uzyskać tylko w trybie eksperta.

1. Ustaw strategię oceny w oprogramowaniu analitycznym na ekspert, klikając pole błyskawicy obok zestawu danych na ekranie Wybór danych. Oprogramowanie analityczne jest wstępnie ustawione na analizę MST; jednak badacz może wybrać opcję Utwórz nową analizę i wybrać opcję Wstępna analiza fluorescencji, aby oszacować powinowactwo wiązania na podstawie początkowej fluorescencji. Dostępny jest również tryb Expert dla wstępnej fluorescencji. W opisanej poniżej analizie zastosowano termoforezę i Tjump w celu oznaczenia K_D prezentowanego Vam7-His8 z jego naturalnym substratem, kwasem lipidowym fosfatydowym.

Wyniki

Jest to przykładowy wynik analizy powinowactwa. Oznakowany MST został wykorzystany do oznaczenia stałej wiązania Vam7-His8 do rozpuszczalnego dioctanoilowego (DiC8) PA jednego z jego naturalnych substratów⁹. Rysunek 1 przedstawia ślady termoforetyczne z jednej próby miareczkowania DiC8 PA w stosunku 1:1, rozpoczynając od 500 μM przeciwko 50 nM Vam7-His8. Przedstawiono fluorescencję początkową (czas przed włączeniem lasera podczerwonego), Tjump (czas bezpośrednio ...

Dyskusja

Określenie wiązania Vam7-His8 z DiC8-PA zapewniło solidnie dopasowany K_D dla danej interakcji, który ma nieco niższe powinowactwo niż zmierzone K_D liposomów Vam7-His8 do PA (nieopublikowane). Różnica ta jest najprawdopodobniej spowodowana brakiem błony, co na ogół skutkuje niższym powinowactwem do specyficznych dla błony interakcji wiązania lipidów, a zatem pokazuje rolę rusztowania błony liposomowej w tej interakcji¹¹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cy5 Maleimid Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	Do etykietowania białek
Graphpad Prsim	Oprogramowanie
Monolith NT.115 Kapilary (1000 sztuk)	Nanotemper	MO-K022	Kapilary do MST
Monolith NT.115	maszyna Nanotemper		Sprzęt uniwersytecki
NTA-Atto 647 N	Sigma	Etykieta 2175	dla Jego tagów
Fosfatydyloinozytol 3-fosforan diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid do eksperymentów wiążących

Graphpad