Artykuł metodologiczny

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60622

⸱

7 grudnia 2019

 ,  , 
1Division of Cancer, Department of Surgery and Cancer, Imperial College London, 2Centre for Cancer and Inflammation, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, 3German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Modele in vivo raka trzustki dostarczają nieocenionych narzędzi do badania dynamiki choroby, infiltracji immunologicznej i nowych strategii terapeutycznych. Ortotopowy model mysi może być wykonywany jednocześnie na dużych kohortach myszy immunokompetentnych, jest stosunkowo niedrogi i zachowuje pokrewne mikrośrodowisko tkankowe. Kwantyfikacja naciekania limfocytów T i aktywności cytotoksycznej w guzach ortotopowych stanowi użyteczny wskaźnik odpowiedzi przeciwnowotworowej.

Ten protokół opisuje metodologię chirurgicznego generowania ortotopowych guzów trzustki poprzez wstrzyknięcie niewielkiej liczby syngenicznych komórek nowotworowych zawieszonych w błonie podstawnej o pojemności 5 μl bezpośrednio do trzustki. Myszy z guzami ortotopowymi potrzebują około 30 dni, aby osiągnąć punkt końcowy, w którym to momencie guzy można pobrać i przetworzyć w celu scharakteryzowania aktywności komórek T naciekających nowotwór. Szybkie trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy i DNazy umożliwia ekstrakcję zawiesiny jednokomórkowej z guzów. Żywotność i markery powierzchni komórek odpornościowych wyekstrahowanych z guza są zachowane; w związku z tym nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym do wspomaganego przepływem sortowania komórek odpornościowych do hodowli lub ekstrakcji RNA, analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych. W tym miejscu opisujemy stymulację ex vivo populacji limfocytów T do wewnątrzkomórkowej kwantyfikacji cytokin (IFNγ i TNFα) i aktywności degranulacyjnej (CD107a) jako miary ogólnej cytotoksyczności. Trawiny całego guza stymulowano octanem mirystynianu forbolu i jonomycyną przez 5 godzin, w obecności przeciwciała anty-CD107a w celu zwiększenia produkcji cytokin i degranulacji. Dodanie brefeldyny A i monenzyny przez ostatnie 4 godziny przeprowadzono w celu zablokowania transportu zewnątrzkomórkowego i maksymalizacji wykrywania cytokin. Następnie przeprowadzono barwienie zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe komórek do analizy cytometrii przepływowej, w której określono ilościowo proporcję limfocytów T IFNγ+, TNFα+ i CD107a+ i CD4+ i CD8+.

Ta metoda stanowi bazę wyjściową do przeprowadzenia kompleksowej analizy mikrośrodowiska guza.

Wprowadzenie

Ta metoda szczegółowo opisuje, od początku do końca, procedurę chirurgiczną generowania ortotopowych guzów trzustki przy użyciu minimalnej ilości materiału komórkowego i późniejszą szybką dysocjację powstałych guzów w celu kompleksowej analizy populacji komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej, w tym analizy ex vivo funkcji komórek T.

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest agresywnym rakiem, który tylko 8% pacjentów przeżywa 5 lat1. Ponieważ mniej niż 20% pacjentów kwalifikuje się do resekcji chirurgicznej2, świeże próbki pacjentów nie są łatwo dostępne do badań, dlatego modele in vivo dostarczają niezbędnych narzędzi do badania tej choroby. Istnieje wiele mysich modeli PDAC: ortotopowy, podskórny, transgeniczny, dożylny i ksenoprzeszczep pobrany od pacjenta (PDX), szczegółowo opisany tutaj3. Opisany tutaj model ortotopowy pozwala na wstrzyknięcie syngenicznych komórek PDAC do trzustki myszy immunokompetentnych. Można to przeprowadzić w dużych kohortach myszy typu dzikiego lub zmutowanego, a tym samym zapewnia opłacalny i spójny model do porównywania środków terapeutycznych. Co ważne, model ortotopowy zapewnia pokrewne mikrośrodowisko dla wzrostu komórek nowotworowych i przerzutów w naszych rękach i innych4 do klinicznie istotnych miejsc (np. wątroby), co czyni go bardziej istotnym klinicznie niż modele podskórne lub indukowane chemicznie. Guzy ortotopowe wykazują kluczowe cechy PDAC, takie jak silna reakcja desmoplastyczna z dużą ilością fibroblastów i odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej5. Transgeniczne modele PDAC są złotym standardem modelu mysiego, a najczęściej stosowanym jest model KPC, który wyraża zmutowane KrasG12D/+ i Trp53R172H/+ w specyficznym dla trzustki promotorze Pdx-1-Cre6. Dodatkowe modele KPC i inne modele PDAC in vivo są przeglądane tutaj7. U myszy KPC spontanicznie rozwijają się guzy trzustki z postępem choroby, który wiernie odtwarza cechy ludzkiego PDAC6. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich modeli transgenicznych, program hodowlany jest kosztowny, progresja guza jest zmienna i dlatego często wymaga dużych kohort myszy. Modele PDX wykorzystują komórki nowotworowe lub fragmenty pochodzące od pacjenta, które są następnie hodowane ortotopowo lub, częściej, podskórnie u myszy z obniżoną odpornością. Modele ksenoprzeszczepów dostarczają użytecznych narzędzi do badań przesiewowych związków terapeutycznych i uwzględniają niejednorodność pacjentów. Nie zapewniają one jednak pełnego mikrośrodowiska odpornościowego, co ogranicza ich zastosowanie8,9.

Po ustaleniu, guzy ortotopowe zazwyczaj potrzebują około 1 miesiąca lub więcej na wzrost (w zależności od użytej linii komórkowej) i tworzą duże guzy, które można łatwo zobrazować za pomocą ultradźwięków lub rezonansu magnetycznego w celu śledzenia postępu i określenia skuteczności leczenia4,5,10. Jednak po wykładniczym wzroście ostatnia faza wzrostu guza może być szybka, więc większość schematów leczenia rozpoczyna się stosunkowo wcześnie (np. 14 dni)11,12. Układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowotworu, w tym w PDAC, który charakteryzuje się immunosupresyjnym naciekiem guza ze względnym niedostatkiem limfocytów T i częstą obecnością komórek szpikowych13. Wysoka obecność limfocytów T w PDAC zapewnia lepsze rokowanie14,15. Jednak inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, które łagodzą immunosupresję limfocytów T, takie jak anty-CTLA-416 i anty-PD-L117, nie wykazały korzyści klinicznych u pacjentów z PDAC, najprawdopodobniej dlatego, że ogólna reaktywność limfocytów T jest bardzo niska. Jednak czynniki, które pobudzają odpowiedź limfocytów T, takie jak anty-CD40, mogą przezwyciężyć oporność na anty-PD-L1/CTLA-418,19 i szczepienie allogeniczną szczepionką PDAC wydzielającą GM-CSF (GVAX) mogą zwiększyć immunogenność guzów PDAC20, co wskazuje, że wzmocnienie odpowiedzi limfocytów T stanowi ważną drogę terapeutyczną.

Kluczowe dla odpowiedzi przeciwnowotworowej limfocytów T jest rozpoznawanie antygenów pochodzących z nowotworu przez receptor limfocytów T (TCR) i późniejsza produkcja cytotoksycznych cytokin i granulek. Chociaż rozpoznawanie antygenu limfocytów T można określić za pomocą sekwencjonowania TCR, podejście to jest kosztowne i czasochłonne. Jednak kwantyfikacja podzbiorów limfocytów T naciekających nowotwór stanowi dobry wskaźnik odpowiedzi przeciwnowotworowej. Dalsze badania aktywności limfocytów T ex vivo pod kątem degranulacji, produkcji cytokin i innych czynników cytotoksycznych zapewniają głębszą analizę funkcjonalną. Testy te można wykonywać na świeżych próbkach guza, a wiele parametrów funkcji limfocytów T można szybko zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej.

Limfocyty T CD8+ i CD4+ wytwarzają cytokiny, takie jak IFNγ i TNFα, aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną21. IFNɣ indukuje regulację MHCI w górę na komórkach docelowych, indukuje różnicowanie i rekrutację komórek odpornościowych oraz wspomaga śmierć komórki. Produkcja IFNγ przez limfocyty T CD8 + jest dobrze scharakteryzowana jako część odpowiedzi przeciwnowotworowej i koreluje z regresją guza22,23. TNFα to kolejna cytokina prozapalna wytwarzana zarówno przez limfocyty T CD8 +, jak i CD4 +. Zwiększa zależną od TCR aktywację i proliferację limfocytów T, wspomagając odpowiedź przeciwnowotworową. Po zaangażowaniu TCR, cytotoksyczne limfocyty T CD8 + mogą ulegać degranulacji, w której wstępnie uformowane lizosomy wydzielnicze zawierające cząsteczki cytotoksyczne są uwalniane do synapsy immunologicznej, powodując degradację komórek docelowych21. Cząsteczki te obejmują perforynę, białko, które wiąże się z błoną komórkową docelową, tworząc pory, które następnie zakłócają integralność błony i umożliwiają dyfuzję21 lub endocytosis24 innych cząsteczek cytotoksycznych, takich jak Granzyme B, bezpośrednio do cytoplazmy komórki docelowej. Granzyme B jest proteazą, która powoduje degradację wielu białek w komórce docelowej, prowadząc do śmierci komórki21. Uwolnienie takich cząsteczek wymaga egzocytozy endosomów na powierzchnię komórki, gdzie marker endosomalny CD107a (znany również jako LAMP-1) jest przejściowo włączony do błony komórkowej25.

Pomiar wydzielania cytokin przez limfocyty T wymaga ich izolacji za pomocą sortowania komórek wspomaganego przepływem lub testów separacji opartych na koralikach, które nie mogą być łatwo przeprowadzone na dużej liczbie próbek jednocześnie. Jednak pomiar cytokin wewnątrzkomórkowych nie wymaga żadnych etapów przed izolacją i może być łatwo wykonany na wielu próbkach jednocześnie, co pozwala na podejście o wyższej przepustowości. Ponieważ cytokiny są szybko wydzielane przez limfocyty T, poziomy wewnątrzkomórkowe mogą być niewykrywalne, a zatem limfocyty T wymagają stymulacji w celu zwiększenia podstawowej produkcji cytokin. Aby ocenić produkcję cytokin sterowanych antygenem, antygen rozpoznany przez TCR musi zostać przedstawiony limfocytowi T przez zaszczepiony APC in vitro. W przypadkach, gdy swoistość antygenu nie jest znana, wymagane jest szerokie podejście do stymulacji. Stymulację TCR można naśladować za pomocą kulek anty-CD3/28, które zapewniają zarówno aktywację TCR, jak i kostymulację, co indukuje produkcję i proliferację cytokin. Jednak bardziej opłacalną alternatywą jest zastosowanie PMA i jonomycyny, które razem szeroko aktywują szlaki sygnałowe, które prowadzą do syntezy i uwalniania cytokin wewnątrzkomórkowych. W szczególności PMA aktywuje kinazę białkową C (PKC), a jonomycyna podnosi wewnątrzkomórkowe jony Ca2+, co prowadzi do zwiększonej sygnalizacji komórkowej. W celu zachowania wewnątrzkomórkowej zawartości cytokin, stymulacja ta może być skutecznie połączona z inhibitorami transportu białek brefeldyną A i monenzyną, które blokują białka w Golgiego, a tym samym zapobiegają uwalnianiu zewnątrzkomórkowemu. Stosowanie PMA/jonomycyny jest dobrze znaną metodą stymulacji limfocytów T i istnieje silna korelacja między cytokinami uwalnianymi zewnątrzkomórkowo i wewnątrzkomórkowymi26. Stymulacja limfocytów T za pomocą PMA i jonomycyny zwiększa również transport lizosomów do błony komórkowej, a zatem CD107a zostaje przejściowo zintegrowany na powierzchni komórki, zanim zostanie ponownie wprowadzony do komórki. Poprzez włączenie przeciwciała anty-CD107a podczas stymulacji, możliwe jest wykorzystanie go jako markera aktywności degranulacji25.

Ta metoda szybko trawi guzy, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową. Na tym etapie poszczególne populacje mogą być bezpośrednio barwione do cytometrii przepływowej lub oczyszczane metodami dalszymi: sortowaniem komórek wspomaganym przepływem lub separacją magnetyczną. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki do analizy metodą cytometrii przepływowej umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu populacji komórek odpornościowych i ich markerów fenotypowych, zapewniając dokładną kwantyfikację liczby komórek odpornościowych i fenotypu.

Na koniec, opisany tutaj protokół trawienia zapobiega utracie markerów powierzchniowych komórek i utrzymuje żywotność komórek odpornościowych, umożliwiając komórkom odpornościowym przejście dalszych etapów oczyszczania komórek i hodowli zgodnie z wymaganiami. Jednak metoda ta nie została przetestowana pod kątem wyprowadzania komórek nabłonkowych z tego trawienia.

Protokół

Ortotopowe guzy trzustki zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem10 zgodnie z Ustawą o Zwierzętach i Procedurach Naukowych Ministerstwa Spraw Wewnętrznych Wielkiej Brytanii z 1986 r. oraz Dyrektywą Europejską 2010/63/UE. Wszystkie myszy monitorowano okołooperacyjnie pod kątem oznak bólu lub cierpienia, w tym między innymi utraty masy ciała (> 15% w ciągu 72 godzin lub 20% w dowolnym okresie), piloerekcji, zmrożenia oczu, przyspieszonego chodu, zgarbionego wyglądu, a także objawów zakażenia rany, w tym krwawienia, zaczerwienienia i owrzodzenia. Wzrost guza monitorowano za pomocą badania palpacyjnego, a dodatkowe objawy kliniczne, takie jak trudności w oddychaniu, żółtaczka i zimne kończyny, były również monitorowane w celu oceny, czy osiągnięto oznaki punktu końcowego. Wszystkie zabiegi powinny być przeprowadzane w sterylnych warunkach. Wszystkie odczynniki stosowane przed barwieniem metodą cytometrii przepływowej powinny być przygotowane w sterylnych warunkach.

1. Przygotowanie komórek nowotworowych do wstrzyknięcia

  1. Pobrać porcję błony podstawnej o temperaturze od -20 °C i umieścić na lodzie w temperaturze 4 °C na noc.
    UWAGA: Stężenie w membranie podstawnej może się różnić w zależności od partii; W związku z tym partie błon podstawnych specyficznych dla partii muszą być testowane in vivo, aby zapewnić odtwarzalność. Nowa partia błony podstawnej jest rozmrażana na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie porcjowana w podwielokrotnościach zdefiniowanych przez użytkownika, na lodzie, a następnie przechowywana w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebna. Minimalizuje to pipetowanie oraz zamrażanie i rozmrażanie w przypadku stosowania membrany podstawnej.
    1. Umieść sterylny PBS w temperaturze 4 °C na noc do schłodzenia.
    2. Sterylne końcówki do pipet o pojemności 200 μl i 1000 μl należy umieścić na noc w temperaturze -20 °C do schłodzenia.
  2. Używaj komórek nowotworowych, które są wolne od mykoplazmy, hodowanych przez co najmniej 2-10 pasaży po rozmrożeniu i w logarytmicznej fazie wzrostu przed zbiorem. Protokół ten wykorzystuje żeńską mysią linię komórkową pochodzącą z C57BL/6 KPC: TB32048 dostarczona jako hojny prezent przez laboratorium Davida Tuvesona.
    1. Gdy do pobrania potrzebne są komórki nowotworowe, należy usunąć pożywkę z kolby i dwukrotnie umyć komórki w PBS (wstępnie podgrzanym do temperatury 37 °C).
    2. Dodać 2x trypsynę (wstępnie podgrzaną do 37 °C) do kolby na 10 minut w temperaturze 37 °C (do kolby T175 dodać 5 ml).
    3. Po 10 minutach dodać równą objętość kompletnego podłoża (10% FBS, 1x penicylina, 1x streptomycyna w DMEM) do kolby i zdysocjować komórki, delikatnie stukając w kolbę i dobrze mieszając w pożywce.
    4. Przenieś komórki do probówki i wiruj przez 5 minut przy 300 x g i temperaturze pokojowej (RT).
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu w celu zliczenia komórek.
    6. Ponownie odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g i RT, a następnie usunąć supernatant.
    7. Zawiesić komórki we wstępnie schłodzonym PBS, aby osiągnąć stężenie 1x106 komórek/mL.
      UWAGA: To stężenie podstawowe przygotowuje się do osiągnięcia końcowego stężenia iniekcyjnego 1000 komórek w 5 μl. Odkryliśmy, że wstrzyknięcie mniejszej liczby komórek w małej objętości wstrzyknięcia zminimalizowało wyciek komórek, a tym samym zwiększyło odtwarzalność, jednak wzrost guza może być zależny od linii komórkowej, dlatego użytkownicy powinni zoptymalizować każdą linię komórkową.
  3. Obok tego umieść wstępnie podwielokrotną podwielokrotność membrany podstawnej na lodzie w okapie.
    1. Stosunek końcowego roztworu błony podstawnej, PBS i komórek nowotworowych w PBS przygotowanym do ininiecji wynosi 5:3:2. Dlatego do 500 μl podwielokrotności membrany podstawnej dodać 300 μl wstępnie schłodzonego PBS za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety o pojemności 1000 μl.
    2. Dodać PBS bezpośrednio do podwielokrotności membrany podstawnej, aby zminimalizować pipetowanie.
    3. Utrzymuj p1000 ustawiony na 300 μl i ponownie zawieś PBS i membranę podstawną, upewniając się, że rurka jest na lodzie, aby zachować membranę podstawną w stanie ciekłym.
    4. Po zakończeniu wyrzucania całej membrany podstawnej z końcówki p1000 pozostaw końcówkę w probówce, aby membrana podstawna/PBS mogła spłynąć po końcówce pipety.
    5. Po 5-10 minutach wyrzuć więcej membrany podstawnej z końcówki p1000 z powrotem do rurki i pozostaw rurkę do osadzenia na lodzie.
  4. Weź 200 μl zawieszonych komórek nowotworowych w PBS i dodaj bezpośrednio do błony podstawnej za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety o pojemności 200 μl.
    1. Weź świeżą, wstępnie schłodzoną końcówkę pipety p1000, ustaw pipetę na 300 μl i ponownie zawieś 30-40 razy. Preferowana jest większa końcówka pipety, ustawiona na małą objętość, ponieważ membrana podstawna może przesuwać się w górę końcówki i dotykać filtra końcówki pipety podczas ponownego zawieszania.
    2. Komórki nowotworowe są gotowe do wstrzyknięcia. Utrzymuj komórkę nowotworową/błonę podstawną na lodzie podczas operacji.

2. Ortotopowe wstrzykiwanie komórek nowotworowych

  1. Zaaklimatyzuj myszy w obiekcie dla zwierząt przez 7 dni.
    1. Około 2 godziny przed zabiegiem należy ogolić lewą stronę brzucha i plecy, a następnie podać przedoperacyjny środek przeciwbólowy podskórnie pod kark szyi (buprenorfina w dawce 50-100 μg/kg).
    2. Przygotuj pole operacyjne z matą grzewczą do położenia myszy i zasłonami na otaczający sprzęt i nad myszką. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne; Przygotuj wystarczającą liczbę zestawów narzędzi dla każdej myszy.
    3. Umieść mysz w komorze z 5% izofluranem iO2 do utraty przytomności.
    4. Przenieś mysz, leżąc na plecach, na matę grzewczą i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski, zwykle o niższym poziomie 2-3% izofluranu.
    5. Potwierdź głębokie znieczulenie, które można zidentyfikować po utracie odruchu wycofania pedału, gdy tylna łapa jest ściśnięta, a częstość oddechów monitora pozostaje stała.
    6. Przykryj ciało zasłoną, odsłaniając tylko ogoloną część. Upewnij się, że mysz jest bezpiecznie umieszczona w masce anestezjologicznej.
    7. Za pomocą sterylnego wacika nanieś roztwór jodu okrężnymi ruchami na ogolony obszar: zaczynając od środka i krążąc do krawędzi. Powtórz proces ponownie ze świeżym patyczkiem kosmetycznym i jodem.
  2. Użyj skalpela, aby wykonać 1 cm nacięcie bezpośrednio nad miejscem trzustki/śledziony (lewy górny ćwiartka). Do wykonania nacięcia można również użyć sterylnych nożyczek, jeśli jest to preferowane.
    1. Rozsuń skórę za pomocą kleszczy. Za pomocą nowych kleszczy zlokalizuj ścianę otrzewnej i za pomocą nożyczek wykonaj kolejne 1 cm nacięcie przez ścianę otrzewnej.
    2. Wyciągnij trzustkę, która może pochodzić ze śledzioną, z organizmu za pomocą drugiej pary kleszczy.
    3. Delikatnie odwróć fiolkę z komórkami nowotworowymi/błoną podstawną kilka razy, aby wymieszać.
    4. Przygotuj szklaną strzykawkę z 5 μl zawierającą 1000 komórek nowotworowych w błonie podstawnej i umieść na macie grzewczej na kilka sekund, aby mogła się ogrzać.
      UWAGA: Krótkie ogrzanie strzykawki pozwoli błonie podstawnej na rozpoczęcie krzepnięcia, aby ułatwić wstrzykiwanie bez przeciekania. Należy jednak mówić krótko, ponieważ pozostawiona zbyt długo błona podstawna całkowicie zestali się i nie zostanie wstrzyknięta. Użycie szklanej strzykawki pozwala na precyzyjne wstrzyknięcie małej objętości.
    5. Przytrzymaj trzustkę za ogon, aby ją wyprostować i włóż igłę bezpośrednio do środka trzustki, równolegle do samej trzustki, starając się uniknąć widocznych naczyń krwionośnych.
      UWAGA: Środek trzustki ma dużą powierzchnię i najłatwiej jest go wstrzyknąć. Jednak głowa lub ogon trzustki mogą być również specjalnie wstrzyknięte, jeśli jest to preferowane.
    6. Powoli wstrzyknąć 5 μl błony podstawnej do trzustki i trzymać igłę stabilnie w trzustce przez co najmniej 30 s po wstrzyknięciu, aby umożliwić zestalenie się błony podstawnej i zapobiec wyciekom. Błona podstawna powinna być widoczna, ponieważ utworzy się mały przezroczysty pęcherzyk; jednak może nie być widoczny.
      UWAGA: Można wstrzykiwać większe objętości komórek nowotworowych / błony podstawnej; Jednak dokładna objętość musi zostać przetestowana, aby upewnić się, że nie dojdzie do wycieku.
    7. Wyjąć igłę z trzustki i poczekać, aby upewnić się, że nie wystąpiło krwawienie. Delikatnie włóż trzustkę z powrotem do jamy brzusznej, uważając, aby nie dotknąć pęcherzyka błony podstawnej.
    8. Ściągnij ścianę otrzewnej do siebie i w razie potrzeby wykonaj pojedynczy szew lub dwa szwy przerwane.
    9. Ściągnij obie strony nacięcia skóry do siebie i w razie potrzeby wykonaj wiele przerywanych szwów lub włóż dwa klipsy chirurgiczne.
  3. Podać kolejne podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny w kark.
    1. Przenieś mysz do klatki podgrzanej w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut po operacji, aby utrzymać temperaturę ciała przed ponownym przeniesieniem do nowej klatki.
    2. Przygotuj dietę zacieru dostępną w klatce, aby zapewnić nawodnienie i masę ciała.
    3. Ponownie podaj znieczulenie pooperacyjne zgodnie z zaleceniami i uważnie obserwuj oznaki otwarcia rany, bólu lub infekcji oraz utraty wagi. W przypadku korzystania z klipsów chirurgicznych można je usunąć 7-10 dni później za pomocą narzędzia do usuwania klipsów.
    4. Po około 14 dniach tkanka bliznowata zagoi się na tyle, aby rozpocząć badanie palpacyjne jamy brzusznej. Ściśle monitoruj wielkość guza za pomocą badania palpacyjnego, aż myszy osiągną punkt końcowy.
    5. W punkcie końcowym mysz jest zabijana poprzez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie dekapitację. Skórę i jamę otrzewnową otwiera się za pomocą nożyczek, a guz trzustki wycina się za pomocą kleszczy do przytrzymania guza i nożyczek do usunięcia otaczającej tkanki.

3. Trawienie guzów trzustki

  1. Umieść wypreparowany guz trzustki, guzy w miejscu przerzutów lub zdrową tkankę trzustki w lodowatym PBS i przechowuj na lodzie.
    1. Użyj kleszczy, aby przenieść guz na szalkę Petriego.
    2. Dodać 5,0 ml pożywki wytrawiającej (2 mg/ml kolagenazy, 0,025 mg/ml DNazy RPMI) do probówki o pojemności 50 ml; przechowywać na lodzie, aby zapobiec rozpoczęciu aktywności enzymów.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się kolagenazę typu V, która ma aktywność ≥1 jednostek/mg FALGPA i > 125 jednostek trawienia kolagenu (CDU)/mg ciała stałego. Podwielokrotności kolagenazy i DNazy można przechowywać w temperaturze -20 °C i rozmrażać na lodzie przed użyciem. Gdy oba są całkowicie rozpuszczone w sterylnym RPMI, można je przepuścić przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń. Kolagenaza musi być całkowicie rozpuszczona przed filtrowaniem, aby uniknąć utraty materiału.
    3. Weź małą porcję tego roztworu, aby pokryć guz na szalce Petriego.
    4. Użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby pociąć guz na małe kawałki o długości mniej niż 3 mm.
    5. Zeskrob kawałki guza do probówki i delikatnie odwróć rurkę, aż wszystkie kawałki zostaną zanurzone w pożywce trawiącej. Przechowywać na lodzie, jeśli konieczne jest przygotowanie innych próbek guza w partii.
    6. Przenieść na urządzenie wstrząsające na 20 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że wszystkie kawałki guza są zanurzone i nie przyklejają się do krawędzi rurki. Jeśli wstrząsanie nie jest możliwe, należy wirować próbkę co 5 minut, aby wspomóc trawienie.

4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z trawionego guza

  1. Natychmiast po etapie trawienia umieść probówkę na lodzie, aby spowolnić aktywność enzymu.
    1. Dodaj EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM i krótko zawiruj próbkę do wymieszania. To jeszcze bardziej spowolni aktywność enzymu.
    2. Otwórz probówkę i spłucz wszelkie odpady trawione przez guz z pokrywki probówki świeżym medium RPMI.
    3. Przygotuj sitko o pojemności 70 μm (rozmiar sitka w μm można dowolnie zmieniać) na otwartej probówce o pojemności 50 ml na lodzie.
    4. Wstępnie zwilż filtr medium.
    5. Ponownie zawiesić strawione komórki i umyć boki probówki za pomocą pasiaka o pojemności 25 ml lub większej. Szerszy otwór pasiaka jest ważny, aby umożliwić łatwe przejście gęstego trawienia.
    6. Przenieś cały płyn za pomocą paski o pojemności 25 ml na sitko.
    7. Rozgnieć guz na wierzchu filtra za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Zacieraj tylko bezpośrednio w górę iw dół, aby zminimalizować naprężenia ścinające komórki.
    8. Ciągle myj komórki przez sitko za pomocą RPMI. Upewnij się, że myjesz z wystarczającą siłą, aby przepchnąć komórki.
    9. Jeśli nadal jest materiał do zacierania, ale RPMI przestaje się przepłukiwać, sitko zostanie nasycone. Dlatego przenieś próbkę do nowego filtra i kontynuuj.
      UWAGA: Ostatecznie w filtrze pozostaną tylko składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, przez które powinny przejść wszystkie pojedyncze komórki.
  2. Wirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C.
    1. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pełnym RPMI i przejść bezpośrednio przez inny filtr, aby usunąć wszelką macierz zewnątrzkomórkową lub duże grudki komórek, których nie można odpowiednio zawiesić.
    2. W tym momencie, jeśli stymulacja nie jest wymagana, natychmiast wybarwij izolowane komórki do analizy cytometrii przepływowej, przechodząc do kroku 6.1. Alternatywnie, zawiesić je ponownie w pożywce zamrażającej (10% DMSO w FBS) i przechowywać w temperaturze -80 °C, a następnie długotrwale przechowywać w ciekłym azocie.
      UWAGA: Etap zamrażania może pozwolić na oczyszczenie komórek odpornościowych w późniejszym terminie; Jednak kwantyfikacja podzbiorów komórek odpornościowych może wymagać optymalizacji w celu potwierdzenia, że proces zamrażania/rozmrażania nie ma wpływu na liczbę komórek i fenotyp. Stymulację limfocytów T ex vivo najlepiej wykonywać na świeżych próbkach guza. W tym momencie próbka może być dalej oczyszczana przez usuwanie martwych komórek na podstawie kulek lub testy wzbogacania komórek odpornościowych, jeśli jest to wymagane.

5. Przygotowanie komórek do stymulacji ex vivo

  1. Policz komórki, aby osiągnąć stężenie 2 x 106/ 100 μL w kompletnym pożywce (RPMI 10 % FBS, 1X penicylina i 1 X streptomycyna).
    UWAGA: Duża liczba wszystkich posianych komórek zapewnia, że w tej próbce będzie wystarczająca ilość limfocytów T do analizy. Jednak liczbę tę można skalować w górę lub w dół w zależności od dostępności próbki i rzadkiego charakteru podzbiorów limfocytów T, które są przedmiotem zainteresowania.
    1. Umieść 100 μl komórek na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U.
    2. Dodać 100 μL kompletnej pożywki zawierającej 2x preparat PMA/ jonomycyny (w celu uzyskania końcowego stężenia odpowiednio 0,081 μM i 1,34 μM, zgodnie z zaleceniami producenta).
      UWAGA: Jeśli mierzysz degranulację/egzocytozę, uwzględnij tutaj również fluorescencyjnie sprzężony anty-mysi CD107a w pożywce. Należy również pobrać próbkę kontrolną, która nie zawiera CD107a.
    3. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 1 godzinę.
    4. Dodać 20 μL 10x preparatu brefeldyny A i monenzyny (do uzyskania końcowego stężenia odpowiednio 1,06 μM i 2,0 μM (zgodnie z zaleceniami producenta) w kompletnych pożywkach.
      UWAGA: Brefeldyna A i monenzyna są inhibitorami transportu białek, a tym samym blokują zewnątrzkomórkowe uwalnianie cytokin itp., umożliwiając ich wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku pomiaru uwalniania cytokin do supernatantu za pomocą testu ELISA lub podobnych metod – ten krok można pominąć.
    5. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na kolejne 4 godziny.

6. Barwienie zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe w cytometrii przepływowej

  1. Wyjmij płytkę i ponownie zawieś każdą studzienkę, aby przenieść cały materiał na płytę z dnem w kształcie litery V, umieszczoną na lodzie.
    UWAGA: Komórki nabłonkowe, makrofagi i inne przylegające komórki mogą nie zostać w pełni odzyskane przez ponowne zawieszenie. Ponieważ jednak dalsza analiza dotyczy tylko limfocytów T, nie stanowi to problemu.
    1. 6.1.1 Odwirować płytkę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C (o ile nie określono inaczej, należy stosować te warunki do kolejnych etapów).
    2. Usunąć supernatant, przesuwając płytkę do góry dnem jednym ostrym ruchem.
  2. Zawiesić ponownie w 50 μl dającego się utrwalić barwnika żywotności, przygotowanego w lodowato zimnym PBS. Podczas ponownego zawieszania należy ustawić pipetę na mniejszą objętość, aby uniknąć powstawania pęcherzyków.
    1. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w ciemności.
    2. Etap mycia: Dodać 100 μl buforu FACS, odwirować i usunąć supernatant.
  3. Zawiesić każdą studzienkę z 50 μl anty-CD16/CD32 (2,5 μg/ml) w buforze FACS (0,5% BSA, 2,0 mM EDTA w PBS) w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał detekcyjnych z receptorami Fc.
    1. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, w ciemności.
  4. Dodaj bezpośrednio do każdej studzienki 2x mastermix anty-mysich CD45, CD3, CD4 i CD8 sprzężonych z fluorochromem (w razie potrzeby można dodać dalsze markery zewnątrzkomórkowe) w buforze FACS.
    1. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, w ciemności.
    2. Etap mycia: Dodać 100 μl buforu FACS, odwirować i usunąć supernatant.
  5. Dodać 100 μl 1x wewnątrzkomórkowego buforu utrwalającego (IC) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
    1. Przygotować wirówkę w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 100 μl buforu FACS, odwirowywać przez 5 minut przy 300 x g i RT i usunąć supernatant. Powtórzyć z 1x buforem permeabilacyjnym i odwirowywać przez 5 minut przy 300 x g; Następnie usunąć supernatant.
  7. Dodaj 50 μl 1x mastermix anty-mysiego IFNγ, TNFα i innych markerów wewnątrzkomórkowych sprzężonych z fluorochromem przygotowanych w 1x buforze permeabilizacyjnym.
    1. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności.
    2. Dodać 100 μl buforu przepuszczalnego do przemycia. Następnie odwirować przez 5 minut przy 300 x g i RT i usunąć supernatant.
    3. Dodać 100 μl buforu FACS do przemycia, odwirować przez 5 minut przy 300 x g i RT i usunąć supernatant.
  8. Po tym końcowym odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w objętości zgodnej z cytometrem przepływowym. Może się to różnić w zależności od rozmiaru rurek FACS.
    1. Przenieś tę objętość do odpowiednich probówek FACS w celu akwizycji.
    2. Przykryj światłem i przechowuj w lodówce, a próbki należy pobrać w ciągu 24 godzin.

Wyniki

Po wstrzyknięciu 10 komórek TB32048 do trzustki, guzy ortotopowe rozwijają się w ciągu około 30 dni (Rycina 1A,B). Przeciekanie błony podstawowej podczas operacji może spowodować powstanie dużych guzów bezpośrednio na ścianie otrzewnej, które są wyraźnie widoczne przez skórę (Rycina 1C). Takie myszy zostaną wykluczone z badania. Jednak przy zachowaniu odpowiedniej techniki chirurgicznej częstotliwość przecieków jest zminimalizowana. Guzy ortotopowe pobrane w punkcie końcowym mogą osiągnąć znaczny rozmiar u myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego (Rycina 1D). Pobrane guzy ortotopowe wymagają trawienia kolagenazą/DNazą przez 20 min w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek (Rycina 2). Na tym etapie komórki pochodzące z guza można wysiać na płytkę z półkulistym dnem w zagęszczeniu 2 x 106 komórek/studzienkę. Liczbę wysianych komórek można dostosować w zależności od liczebności limfocytów T w próbce; liczbę komórek można zmniejszyć, jeśli gęstość limfocytów T jest wysoka. W tym momencie można również wysiać kontrolne próbki śledziony lub węzłów chłonnych w celu stymulacji. Każda studzienka jest stymulowana PMA i jonomycyną przez 5 h, a po 1 h inkubacji dodaje się brefeldynę A i monensynę w celu zablokowania pozakomórkowego uwalniania cytokin (Rycina 2). Po inkubacji próbki poddaje się barwieniu na epitopy zewnątrzkomórkowe oraz wewnątrzkomórkowe cytokiny w celu analizy metodą cytometrii przepływowej (Rycina 2).

Próbki śledziony i guzów pobrane od myszy z guzami ortotopowymi poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania zastosowana w analizie cytometrycznej śledziony i guzów ortotopowych wyklucza debris przy użyciu FSC-A, SSC-A, dublety poprzez FSC-A/FSC-H oraz SSC-A/SSC-W, a następnie martwe lub apoptotyczne komórki jako pozytywne pod kątem barwnika żywotności (fixable viability dye) (Ryc. 3A). Następnie wyodrębniono komórki odpornościowe jako CD45+, a następnie limfocyty T jako CD3+, z których zdefiniowano subpopulacje CD4+ i CD8+ (Ryc. 3A). Wykonano kontrolę FMO (fluorescence minus one) w celu określenia fluorescencji tła dla bramkowania oraz kontrolę z zastosowaniem wyłącznie brefeldyny A/monensyny w celu określenia podstawowej produkcji cytokin (Ryc. 3B-D).

W przypadku IFNγ inkubacja z brefeldyną A/monensyną nie spowodowała wzrostu poziomu IFNγ względem kontroli FMO zarówno w próbkach śledziony, jak i guza. Jednak dodanie PMA i jonomycyny zwiększyło % wewnątrzkomórkowego IFNɣ wykrywalnego w komórkach T CD4+ i CD8+ pochodzących zarówno ze śledziony, jak i z guza.

Limfocyty T CD4+ i CD8+ z śledziony, użyte jako kontrola dodatnia, wykazują relatywnie wyższą produkcję IFNγ niż podgrupy limfocytów T naciekających guz, średnio odpowiednio 6,60 ± 1,5% i 12,97 ± 3,4% w porównaniu do 4,81 ± 1,0% i 4,13 ± 1,3%, co wskazuje na występowanie immunosupresji w obrębie guza (Rycina 3B oraz 4A). Stosując tę samą strategię dla TNFα, zaobserwowano, że wysoki odsetek limfocytów T CD4+ z śledziony jest dodatni pod kątem wewnątrzkomórkowego TNFα (65,93 ± 2,3%) w porównaniu do limfocytów T CD4+ naciekających guz (2,45 ± 5,4%). Limfocyty T CD8+ z śledziony oraz naciekające guz produkują podobne poziomy TNFα (odpowiednio 25,15 ± 3,7% i 19,91 ± 5,1%) (Rycina 3C, Rycina 4B).

Wreszcie, CD107a jest markerem endosomalnym, który jest przejściowo ekspresowany na powierzchni komórki podczas egzocytozy granul cytotoksycznych i cytokin, w związku z czym jest on stosowany jako marker zastępczy dla cytotoksyczności. Korzyścią z barwienia CD107a podczas stymulacji jest to, że całe przejściowo ekspresowane na powierzchni komórek CD107a zostanie wychwycone przez przeciwciało fluorescencyjne. Bazowe poziomy CD107a pokazano w komórkach traktowanych wyłącznie brefeldyną A/monensyną. W przypadku śledzionowych limfocytów T CD8+ stymulacja PMA/ionomycyną zwiększa wykrywany poziom CD107a, przy czym najsilniejszą upregulację zaobserwowano w komórkach CD8+, w których poziom CD107a+ wynosił 23,95 ± 3,5%, w porównaniu do 5,8 ± 1,9% w naciekających guz komórkach CD8+, co wskazuje na większy stopień degranulacji w przypadku śledzionowych CD8+. Z drugiej strony, śledzionowe i naciekające guz komórki CD4+ wykazywały porównywalne poziomy CD107a, odpowiednio 9,37 ± 1,5% i 1,50 ± 1,8% (Rysunek 3D i 4C).

Podsumowując, wyniki te wskazują, że guzy ortotopowe mogą być generowane poprzez wstrzyknięcie bardzo niskiej liczby (1 0) komórek nowotworowych do trzustki. Guzy te można szybko przetrawić w celu izolacji limfocytów T do stymulacji ex vivo. Wykrywanie cytokin wewnątrzkomórkowych jest możliwe i podkreśla podstawowy poziom immunosupresji naciekających limfocytów T w porównaniu z limfocytami T w wtórnych narządach limfatycznych.

Badanie wzrostu guza ortotopijnego; oś czasu, zabieg chirurgiczny, wyciek Matrigelu i wykres wagi guza.
Rycina 1: Generowanie ortotopowych guzów trzustki. (A) Harmonogram in vivo eksperymenty. (B) Wygląd makroskopowy guzów ortotopowych w jamie brzusznej (lewo) oraz po wycięciu (prawo), gdzie przedstawiony guz został przecięty na pół. (C) Dowody na nieszczelność błony podstawnej podczas operacji mogą prowadzić do rozwoju guzów widocznych przez skórę (górne zdjęcie) oraz formujących się na ścianie otrzewnej (dolne zdjęcie). (D) Masa ortotopowych guzów trzustki pobranych od myszy, które osiągnęły punkt końcowy (n=2). Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz; wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM. Dane na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanej pracy.10. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Harmonogram przetwarzania komórek; rozdrabnianie guza, wysiew, inkubacja, etapy barwienia; przygotowanie do cytometrii przepływowej.
Rycina 2: Schemat przetwarzania guzów ortotopowych do ex vivo Stymulacja limfocytów T. Po pobraniu guzy trzustki są szybko trawione w kolagenazie (2 mg/ml) i DNazie (0,025 mg/ml) przez 20 min w temperaturze 37 °CNastępnie komórki resuspenduje się w stężeniu 2 x 106/ml w pełnej pożywce RPMI i wysiano na płytkę z wypukłym dnem (U-bottom). Dodano koktajl stymulujący z PMA i jonomycyną na 5 h, po czym do hodowli można również dodać przeciwciało anty-mysie CD107a. Po 1 h inkubacji dodano blokery transportu wewnątrzkomórkowego: brefeldynę A i monensynę. Po ex vivo po stymulacji komórki przenosi się do płytki z dnem w kształcie litery V w celu barwienia barwnikiem żywotności do utrwalania (w PBS) przez 20 min 4 °CKomórki przemywa się buforem FACS, a następnie inkubuje z przeciwciałami anty-CD16/32 (blokada FcR) przez 15 min (w buforze FACS), po czym inkubuje się je z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami zewnątrzkomórkowymi przez kolejne 30 min (w buforze FACS). Komórki ponownie przemywa się buforem FACS i resuspenderuje w buforze do fiksacji wewnątrzkomórkowej na 20 min. Następnie komórki przemywa się raz buforem FACS i raz 1x buforem do permeabilizacji. Komórki resuspenderuje się w fluorescencyjnie znakowanych przeciwciałach wewnątrzkomórkowych w temperaturze pokojowej przez 1 h (w 1x buforze do permeabilizacji). Komórki przemywa się raz 1x buforem do permeabilizacji i raz buforem FACS, a następnie resuspenderuje w buforze FACS w celu przeprowadzenia analizy na cytometrze przepływowym w ciągu 24 h. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometryczna komórek śledziony/guza; aktywacja limfocytów T; wykresy SSC-A, IFNγ, TNFα, CD107a.
Rysunek 3: Analiza cytometryczna przepływowa ex vivo stymulowane limfocyty T pochodzące ze śledziony oraz z guza. (A) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej zastosowana dla próbek śledziony (kontroli pozytywnej) oraz guzów ortotopowych. Komórki oddzielono od debris przy użyciu parametrów FSC-A/SSC-A, a następnie wyizolowano pojedyncze komórki za pomocą parametrów FSC-A/FSC-H oraz SSC-A/SSC-W. Komórki martwe lub apoptotyczne wykluczono przy użyciu utrwalanego barwnika żywotności FVD506, natomiast komórki odpornościowe wyselekcjonowano za pomocą markera CD45.+Następnie CD3+ Limfocyty T i CD4+ oraz CD8+ zdefiniowano podgrupy. Dane uzyskano za pomocą cytometru BD Fortessa. (BStrategia bramowania zastosowana do ilościowego oznaczenia IFNγ+ CD4+ oraz CD8+ Limfocyty T. Próbki w pełni stymulowane (PMA/ionomycyna/brefeldyna A/monensyna) poddaje się kontroli FMO (fluorescent minus one), aby określić fluorescencję tła. Kontrolę z samą brefeldyną A i monensyną (tylko B+M) stosuje się do wyznaczenia podstawowego poziomu produkcji cytokin. Następnie próbkę w pełni stymulowaną wykorzystuje się do obliczenia procentowej zawartości IFNγ.+ Limfocyty T. (C) Strategia bramkowania zastosowana do ilościowego oznaczenia TNFα+ CD4+ oraz CD8+ Limfocyty T. Próbki w pełni stymulowane (PMA/ionomycyna/brefeldyna A/monensyna) poddaje się kontroli FMO w celu określenia fluorescencji tła. Kontrolę z użyciem wyłącznie brefeldyny A/monensyny (tylko B+M) stosuje się do określenia podstawowego poziomu produkcji cytokin. Następnie wykorzystuje się próbkę w pełni stymulowaną do obliczenia procentowego udziału TNFα.+ Limfocyty T.DStrategia bramowania zastosowana do zdefiniowania CD107a+ CD4+ oraz CD8+ Limfocyty T. W próbkach w pełni stymulowanych (PMA/ionomycyna/brefeldyna A/monensyna) stosuje się kontrolę FMO w celu określenia fluorescencji tła. Kontrolę z samą brefeldyną A/monensyną (tylko B+M) stosuje się do określenia podstawowego poziomu degranulacji. Następnie próbka w pełni stymulowana służy do obliczenia wartości % CD107a.+ Limfocyty T. Wszystkie dane z cytometrii przepływowej przeanalizowano w programie FlowJo w wersji 10.6.1. Dane na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanej pracy.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ekspresja cytokin w limfocytach T CD4/CD8 w śledzionie i guzie; %IFNγ, %TNFα, %CD107a; wykresy słupkowe.
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie ex vivo aktywność limfocytów T pochodzących ze śledziony i guza. Odsetek CD4+ oraz CD8+ limfocyty T wykazujące ekspresję (A) IFNγ+ (B) TNFα+ oraz (C) CD107a+ ilość określono w śledzionie (n=4) i guzie (n=7) myszy z ortotopowym guzem. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz, a słupki błędów przedstawiają średnią ± SEM. Istotność statystyczną sprawdzono za pomocą nieparzystego testu t, gdzie * = p<0,05 oraz *** = p<0,01. Wszystkie dane przeanalizowano przy użyciu programu Prism 8. Dane przedstawione na tej rycinie zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanej pracy10. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Modele in vivo raka trzustki dostarczają nieocenionych narzędzi do zrozumienia progresji choroby i oceny nowych celów terapeutycznych3. W szczególności model ortotopowy jest opłacalnym i powtarzalnym modelem, który może być stosowany jednocześnie w dużych kohortach myszy 4,27. Model ortotopowy zapewnia również pokrewne mikrośrodowisko i nienaruszony układ odpornościowy dla wzrostu guza, co czyni go bardziej odpowiednim niż modele podskórne i PDX. Odkryliśmy jednak, że niektóre elementy infiltracji immunologicznej mogą się różnić między modelem ortotopowym a myszami KPC, złotym standardem mysiego modelu10. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy może być przyspieszony wzrost guza obserwowany w modelu ortotopowym. Dalsze różnice w gęstości podzbiorów komórek odpornościowych opisano między modelem ortotopowym a podskórnym 3,28. Dlatego, chociaż transgeniczny model KPC jest bardziej kosztownyi zmienny6, kluczowe wyniki powinny być weryfikowane w małej kohorcie myszy KPC, jeśli to możliwe.

Przygotowanie komórek nowotworowych do operacji ortotopowej jest krytycznym krokiem w protokole. Komórki powinny zawsze znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu i być wolne od mykoplazmy i infekcji. Operację ortotopową należy odłożyć, jeśli istnieją jakiekolwiek obawy dotyczące wzrostu komórek nowotworowych. Zastosowanie błony podstawnej poprawia częstość występowania guza w porównaniu z wstrzykiwaniem komórek bez niej29 i zmniejsza przeciek komórek, a tym samym rozprzestrzenianie się otrzewnej27. Jednak po zawieszeniu w błonie podstawnej komórki nowotworowe należy szybko wstrzyknąć (w ciągu 2 godzin), aby uniknąć utraty komórek. Liczba komórek nowotworowych wymaganych do wytworzenia guzów jest prawdopodobnie zależna od linii komórkowej, a zakres liczby komórek powinien być badany (np. od 100 do 100 000), co może również określić czas do osiągnięcia punktu końcowego. Jest prawdopodobne, że będzie istniał margines błędu podczas przygotowywania 1000 komórek na mysz do wstrzyknięcia; Dlatego, jeśli wymagana jest wielodniowa operacja, leczenie grup powinno być równomiernie rozłożone na dni, aby kontrolować efekty partii. Większość kroków chirurgicznych można modyfikować w zależności od preferencji; Należy jednak zachować ostrożność, aby nie naruszyć błony podstawnej podczas wymiany trzustki w jamie brzusznej lub zamykania ściany otrzewnej. Nieszczelność błony podstawnej może powodować wzrost komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej, które tworzą się szybko i mogą skutkować koniecznością wcześniejszego poświęcenia zwierzęcia.

Idealnie byłoby, gdyby guzy trzustki zostały szybko strawione po zbiorach i natychmiast przygotowane do stymulacji ex vivo. Jednak może to nie być możliwe, jeśli do zebrania jest duża partia guzów, w takim przypadku guzy powinny być trzymane na lodzie i trawione partiami. Wykazano, że rodzaj, stężenie i czas ekspozycji na enzymy trawienne wpływają na dużą liczbę cząsteczek powierzchniowych komórek odpornościowych 30,31,32. Czas trawienia jest również celowo krótki, aby ograniczyć śmierć komórki33. Strawione komórki można zamrozić w pożywce zamrażającej w celu długotrwałego przechowywania; Jednak podczas rozmrażania nastąpi pewna utrata komórek. Proces trawienia może być mniej niż optymalny, jeśli kawałki guza nie zostaną wystarczająco pokrojone w kostkę przed inkubacją kolagenazy, co będzie widoczne, ponieważ twarde kawałki guza pozostaną w filtrze po trawieniu. Stężenie kolagenazy można obniżyć, jeśli pracujesz ze zdrową trzustką lub guzami we wczesnym stadium; Doniesienia na temat ekstrakcji zdrowych komórek przewodowych trzustki wykorzystują znacznie niższe stężenia34. Podczas trawienia należy spodziewać się wysokiego stopnia obumarcia komórek nabłonkowych; Jednak komórki odpornościowe powinny dobrze tolerować ten proces. Istnieją alternatywne metody izolowania żywotnych komórek nabłonka w celu wzrostu organoidów35 lub zachowania architektury tkankowej36.

Modyfikacje protokołu stymulacji można łatwo wprowadzić, w zależności od pożądanego odczytu i analizowanych komórek odpornościowych (np. makrofagów lub limfocytów B). Stosowanie odczynników do panstymulacji PMA/jonomycyny nie dyskryminuje swoistości antygenu TCR, dzięki czemu jest przydatne, gdy antygen nie jest znany. Jednak produkcja IFNɣ jest ściśle związana z zaangażowaniem TCR37 i zarówno produkcja IFNɣ, jak i TNFα mają kluczowe znaczenie w odpowiedziach przeciwnowotworowych PDAC38. Stymulacja PMA/jonomycyny odzwierciedla maksymalną zdolność limfocytów T do wytwarzania cytokin, które mogą, ale nie muszą, być wytwarzane przez limfocyty T w mikrośrodowisku guza. Produkcję endogenną można zmierzyć bez potrzeby stymulacji; Jednak poziomy mogą być znacznie niższe lub niewykrywalne. Istnieją alternatywne metody stymulacji limfocytów T: kulki pokryte anty-CD3/28, które również nie wymagają antygenu ani innych populacji komórek odpornościowych. Zaletą tej metody jest umożliwienie ilościowego określenia produkcji cytokin przez określone podzbiory limfocytów T bez konieczności stosowania metod separacji. Można również dodać inne markery cytotoksyczności (granzym B i perforyna A), aktywności (IL-2) lub immunosupresji (IL-10)21. Jednak wysokiej jakości przeciwciała cytometrii przepływowej nie są dostępne do wykrycia wszystkich cytokin i czynników będących przedmiotem zainteresowania. W związku z tym, jeśli wymagane są inne zastosowania, takie jak ELISA, stymulację można przeprowadzić bez włączania brefeldyny A/monenzyny, co pozwala na uwalnianie cytokin do supernatantu. Należy jednak zauważyć, że pozwoli to na całkowite uwolnienie cytokin komórkowych i nie będzie możliwe określenie, które populacje komórek się do tego przyczyniły.

Produkcja IFNγ jest dominującą cechą odpowiedzi przeciwnowotworowej limfocytów T, często stosowaną jako substytut rozpoznawania antygenu TCR 37,38. Inne metody in vivo, które dokładniej definiują odpowiedzi specyficzne dla antygenu, wykorzystują komórki nowotworowe wyrażające znany antygen, taki jak albumina jaja kurzego lub SV40. Uniwersalny antygen może być następnie wykorzystany ex vivo do testowania rozpoznawania limfocytów T lub w połączeniu z myszą gospodarza z ograniczeniami TCR. Alternatywnie, gdy antygen jest nieznany, kwantyfikacja ekspansji klonalnej komórek T może być przeprowadzona przez sekwencjonowanie masowe TCR lub ostatnio sekwencjonowanie TCR pojedynczej komórki39,40. Aby w pełni zrozumieć stan wewnątrznowotworowej odpowiedzi limfocytów T, należy również zmierzyć markery wskazujące na wyczerpanie lub receptory hamujące, w tym: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Jak również markery efektorowych limfocytów T (CD44hi, CD62lo) i aktywności proliferacyjnej, rozcieńczenie Ki67 + lub CSFE 41,42,43,44. Ogólnie rzecz biorąc, model ortotopowy stanowi użyteczną platformę do szybkiego testowania strategii terapeutycznych, w szczególności takich, które mogą modulować odpowiedź przeciwnowotworową komórek T, które można następnie zwalidować na mniejszej kohorcie myszy transgenicznych (KPC).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Animal Technician Service oraz dr Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Wielka Brytania) za ich pomoc podczas operacji ortotopowej. Chcielibyśmy również podziękować dr Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Wielka Brytania) za jej wskazówki w zakresie techniki chirurgicznej, dr Cristinie Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londyn, Wielka Brytania) za porady dotyczące trawienia guza oraz dr Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londyn, Zjednoczone Królestwo) za porady dotyczące protokołów stymulacji limfocytów T ex vivo. Chcielibyśmy również podziękować Radzie Badań Medycznych (MRC), Funduszowi Badań nad Rakiem Trzustki (PCFR) i Ovarian Cancer Action, które sfinansowały te badania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nici wchłanialne vicryl powlekane o rozmiarze 6/0EthiconW9500T
70 μ m Sitko do komórek o porachFisher Scientific 11597522
9 mm Klipsy Clay AdamsVetTech SolutionsIN015A
PE (klon 1D4B)Biolegend1216121:100 do pożywki
hodowlanej anty-CD16/CD32BD Biosciences553142Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:200
anty-CD3 PerCP eFluor710 (klon 17A2)Biolegend46-0032Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:50
anty-CD4 FITC (klon GK1.5)eBioscience11-0041Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:100
anty-CD45 Brilliant Violet 605 (klon 30-F11)Biolegend103140Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:200
anty-CD8 Brilliant Violet 421 (klon 53-6.7)Biolegend100738Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:100
anty-IFN-gamma PE/Cy7 (klon XMG1.2)Biolegend505826Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:50
anty-TNF-alfa Alexa Fluor 647 (klon MP6-X)Biolegend506314Stosować przy końcowym rozcieńczeniu 1:50
BD Matrigel Podłoże z membraną podstawną o wysokim stężeniuBD Biosciences354248Podwielokrotność na lodzie i przechowywać w temperaturze -20 ° Deg; C
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA4503
Koktajl stymulacji komórek (500x) (12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) i jonomycyna)eBioscience00-4970-031x Stężenie końcowe PMA 0,081 i mu; M, jonomycyna 1,34 i mu; M
Clay Adams Autoclip ApplierVetTech SolutionsIN015B
Clay Adams Autoclip removerVetTech SolutionsIN015B
Kolagenaza typu V z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC92632 mg / ml w pożywce
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100 ml
DMEM Wysoka zawartość glukozy (4,5 g / L) z L-glutaminaPAAE15-810
DNaza (dezoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej typu II-S) zapas 10 mg / ml w 0,15 M NaClSigma-AldrichD4513Końcowe stężenie w pożywce wytrawiającej 0,025 mg / ml
Możliwy do ustalenia barwnik żywotności 506 (FVD506)eBioscience65-0866Stosować w 1:200 w PBS
Surowica cielęca płodu (FCS)GE HealthcareA15-10410% w RPMI
Strzykawka Hamilton seria 700, 25 μ L objętość, końcówka skośna igły o rozmiarze 22sFisher Scientific10100332
Bufor do utrwalania wewnątrzkomórkowego i bufor do permeabilizacji wewnątrzkomórkowejeBioscience88-8824-00Rozcieńczyć bufor permeabilizacyjny do 1x w H2O
Penicylina/streptomycynaPAA15140122100 jednostek/ml Penicyliny, 100 μ g/ml Streptomycyna
Koktajl inhibitorów transportu białek (500x) (brefeldyna A i monesyna)eBioscience00-4980-031x Stężenie końcowe Brefeldin A 10,6 μ M, monenzyna 2 & mu; M
RPMI-1640 (zawiera 0,3 g/l glutaminy)Sigma-AldrichR8758
Chirurgiczne ostrze skalpela nr 10Swann-Morton0501
Roztwór trypsyny-EDTA 10xSigma-Aldrich594-18CTrypsyna (0,1%) EDTA (0,4%) stężenie końcowe
U-bottomed 96 płytka mikrodołkowaVWR734-2080
Uniwersalne aplikatory z bawełnianą końcówką - 6 cal x 100MedisaveUN982
96-dołkowa płytka mikrodołkowa z dnem w kształcie litery VVWR735-0184
anty-CD107a

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Conroy, T., et al. Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer. European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).
  3. Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery. Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).
  4. Tseng, W. W., et al. Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host. Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).
  5. Majumder, K., et al. A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies. Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).
  6. Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
  7. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
  8. Witkiewicz, A. K., et al. Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer. Cell Reports. , (2016).
  9. Nicolle, R., et al. Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts. Cell Reports. , (2017).
  10. Spear, S., et al. Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells. Frontiers in Immunology. 10, 542(2019).
  11. Zhu, Y., et al. CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models. Cancer Research. , (2014).
  12. Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer. PLoS Computational Biology. , (2013).
  13. Clark, C. E., et al. Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
  14. Fukunaga, A., et al. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma. Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).
  15. Tewari, N., et al. The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer. 13 (1), 436(2013).
  16. Royal, R. E., et al. Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).
  17. Brahmer, J. R., et al. Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).
  18. Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
  19. Beatty, G. L., et al. CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
  20. Lutz, E. R., et al. Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation. Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).
  21. Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).
  22. Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion. International Journal of Molecular Sciences. , (2018).
  23. Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion. Frontiers in Immunology. , (2018).
  24. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nature Immunology. , (2011).
  25. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  26. Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques. Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).
  27. Partecke, L. I., et al. A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines. European Surgical Research. , (2011).
  28. An, X., et al. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  29. Jiang, Y. J., et al. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel. World Journal of Gastroenterology. , (2014).
  30. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).
  32. Liu, Q., et al. Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells. Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).
  33. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).
  34. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO Journal. , (2013).
  35. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
  36. Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. , (2019).
  37. Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ. The Journal of Immunology. , (2016).
  38. Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. , (2015).
  39. Singh, M., et al. High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes. Nature Communications. 10 (1), 3120(2019).
  40. Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer. Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).
  41. Schietinger, A., et al. Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis. Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).
  42. Raghav, S. K., et al. Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients. Journal of Clinical Investigation. , (2011).
  43. Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors. The Journal of Clinical Investigation. , (2014).
  44. Miller, B. C., et al. Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade. Nature Immunology. , (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

T limfocyty naciekające guzanaliza cytometrycznaprotokół trawienia guzatrawienie enzymatyczneoznaczanie ilości cytokin wewnątrzkomórkowychtest degranulacji CD107astymulacja PMA i jonomycynątraktowanie brefeldyną A i monensyną
Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.