Artykuł metodologiczny

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

DOI:

10.3791/60644

⸱

17 marca 2020

 ,  ,  , 
1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System modelowy in vitro został opracowany w celu uchwycenia zmian architektonicznych tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Ten system organoidów stanowi unikalną platformę do badania ról różnych zmian wewnętrznych i zewnętrznych komórek nowotworowych, które modulują fenotyp guza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje guz-zręb odgrywają kluczową rolę w rozwoju raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC). Jednak zrozumienie, w jaki sposób te dynamiczne interakcje przyczyniają się do zmian w architekturze tkanek obserwowanych podczas nowotworzenia, pozostaje trudne ze względu na brak odpowiednich modeli. W tym protokole opisujemy generowanie modelu kokultury 3D przy użyciu pierwotnej hodowli komórkowej LUSC znanej jako TUM622. Komórki TUM622 zostały stworzone z ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta LUSC (PDX) i mają unikalną właściwość tworzenia struktur podobnych do worków po wysianiu w macierzy błony podstawnej. Pokazujemy, że TUM622 acini w kokulturze 3D podsumowują kluczowe cechy architektury tkankowej podczas progresji LUSC, a także dynamiczne interakcje między komórkami LUSC a składnikami mikrośrodowiska guza (TME), w tym macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Dalej dostosowujemy nasz główny protokół hodowli 3D, aby pokazać, w jaki sposób ten system może być wykorzystany do różnych dalszych analiz. Ogólnie rzecz biorąc, ten model organoidowy tworzy biologicznie bogatą i elastyczną platformę, która umożliwia uzyskanie wglądu w wewnętrzne i zewnętrzne mechanizmy komórki, które sprzyjają zakłócaniu architektury nabłonka podczas progresji raka i pomogą w poszukiwaniu nowych celów terapeutycznych i markerów diagnostycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Rak płaskonabłonkowy płuca (LUSC), który jest drugim najczęstszym typem niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) i stanowi około 30% wszystkich nowotworów płuc, jest często diagnozowany w zaawansowanych stadiach i ma złe rokowanie1. Możliwości leczenia pacjentów z LUSC są główną niezaspokojoną potrzebą, którą można poprawić dzięki lepszemu zrozumieniu podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych, które napędzają nowotworzenie LUSC.

Podobnie jak w przypadku większości nowotworów u ludzi, patogeneza LUSC charakteryzuje się zaburzeniem nienaruszonej, dobrze uporządkowanej architektury tkanki nabłonkowej2. Podczas tego procesu dochodzi do utraty prawidłowej polaryzacji komórek wierzchołkowo-podstawnych, kontaktów komórka-komórka i komórka-macierz, co pozwala na niekontrolowany wzrost i inwazyjne zachowanie komórek nowotworowych. Obecnie powszechnie uznaje się, że złośliwe cechy komórek nowotworowych nie mogą objawiać się bez istotnej interakcji między komórkami rakowymi a ich lokalnym mikrośrodowiskiem nowotworowym (TME)3. Kluczowe składniki TME, w tym macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), fibroblasty związane z rakiem (CAF), a także komórki śródbłonka i infiltrujące komórki odpornościowe, aktywnie kształtują TME i napędzają proces nowotworowy4. Niemniej jednak nasza obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób komórki nowotworowe i te kluczowe składniki TME oddziałują na siebie, napędzając zmiany w architekturze tkanek podczas progresji LUC, jest bardzo ograniczona.

Trójwymiarowa (3D) hodowla jest ważnym narzędziem do badania biologicznej aktywności wewnętrznych i zewnętrznych zmian w komórkach regulujących zmiany architektoniczne tkanek zarówno w normalnych, jak i chorych tkankach5. 3D kultury zapewniają odpowiedni kontekst strukturalny i funkcjonalny, którego zwykle brakuje w tradycyjnych kulturach dwuwymiarowych (2D). Dodane wymiary takich systemów bardziej naśladują tkanki in vivo w wielu aspektach fizjologii komórki i zachowań komórkowych, w tym proliferacji, różnicowania, migracji, ekspresji białek i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne. W ostatnich latach wysiłki różnych laboratoriów doprowadziły do opracowania modeli 3D in vitro zarówno dla normalnego płuca, jak i NSCLC6,7,8. Jednak model raka płaskonabłonkowego płuca, który mógłby podsumować zarówno dynamiczne zmiany architektoniczne tkanek podczas nowotworzenia, jak i uwzględnić kluczowe składniki zrębu, był niedostępny.

Tutaj opisujemy metody tworzenia nowatorskiego systemu kokultury 3-wymiarowej (3D) przy użyciu pierwotnych komórek LUSC pochodzących z PDX (określanych jako TUM622) i CAFów9,10. Zarówno TUM622, jak i CAF pochodzą od pacjenta z NSCLC ze słabo zróżnicowanymi nowotworami10. Po osadzeniu jako pojedyncze komórki w ECM, rzadka subpopulacja komórek TUM622 ma zdolność tworzenia organoidów o strukturach podobnych do worków, które wykazują prawidłową polaryzację komórek wierzchołkowo-podstawnych. Te struktury podobne do worków są hiperplastyczne, wykazują niejednorodną ekspresję markerów podobnych do macierzystych i różnicujących podobnych do pierwotnego guza, pozostając nieinwazyjnymi, a tym samym naśladują najwcześniejszy etap rozwoju LUC. Co ważne, wykazaliśmy, że architektura tkankowa struktur podobnych do worków może zostać zmieniona poprzez hamowanie wewnętrznych szlaków sygnałowych komórek za pomocą inhibitorów małocząsteczkowych lub dodanie kluczowych składników w ECM, takich jak CAF, z których ten ostatni zwiększa tworzenie acini i dodatkowo prowokuje acini do inwazyjności, gdy znajdują się w bliskiej odległości. Łącznie dane te sugerują, że ten system kohodowli 3D organoidów LUSC stanowi cenną platformę do badania dynamicznej wzajemności między komórkami LUSC a TME i może być zaadaptowany do monitorowania odpowiedzi komórek LUSC na leczenie farmakologiczne11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pasażowanie i hodowla komórek TUM622 i CAF w hodowlach 2D

  1. Pasażowanie i hodowla komórek TUM622
    1. Ciepła pożywka hodowlana 3D i odczynniki do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) dla komórek TUM622 w temperaturze 37 °C.
    2. Pasaż komórek TUM622 przy 80% zbiegu w kolbach 2D. Zwykle dzieje się to 1 tydzień po pasażu.
    3. Wyrzucić starą pożywkę z kolby T75 i przemyć raz 6 ml buforu HEPES. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na komórki.
    4. Odessać bufor HEPES. Dodaj 4 ml trypsyny/EDTA (0,25 mg/ml, patrz tabela materiałów) w celu szybkiego spłukania i wyrzuć trypsynę/EDTA.
    5. Dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Wyjąć kolby z inkubatora i postukać w kolby, aby poluzować komórki bez tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zwrócić kolby do inkubatora na dodatkowe 5 minut
      UWAGA: Długotrwała ekspozycja na trypsynę nieodwracalnie uszkodzi komórki i zmieni ich fenotyp, dlatego zaleca się ograniczenie czasu ekspozycji komórek na trypsynę.
    6. Upewnij się, że komórki odłączyły się i zdysocjowały pod mikroskopem świetlnym (4x lub 10x). Dodać 4 ml buforu neutralizacyjnego (bufor TNS) (patrz informacje o odczynniku do subkultur w Tabeli materiałów), a następnie 10 ml pożywki 3D (patrz Tabela materiałów).
    7. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej zdysocjować komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę przez sitko o pojemności 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    8. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    9. Nasiona 0,8 x 106 komórek/kolba T75 w 20 ml pożywki hodowlanej 3D (patrz tabela materiałów).
    10. Karm komórki co drugi dzień, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką.
  2. Pasażowanie i hodowla CAF
    1. Przejście CAF, gdy komórki osiągają zbieg. Zwykle dzieje się to po 5 dniach hodowli z podziału 1:2.
    2. Przygotuj pożywkę CAF za pomocą pożywki podstawowej RPMI z 20% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
    3. W kolbie T75 przepłukać CAF solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    4. Obserwować pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórki uległy dysocjacji w kolbie (4x lub 10x). Jeśli nie, przedłuż inkubację o kolejne 2-3 minuty.
    5. Gdy komórki odłączą się i zdysocjują, dodaj 10 ml pożywki hodowlanej 3D, aby zneutralizować trypsynę/EDTA i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dalej dysocjować CAF.
    6. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki 3D (patrz tabela materiałów) i umieścić w dwóch nowych kolbach T75.

2. Posiewanie komórek TUM622 w macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli 3D

  1. Dzień przed eksperymentem rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. Plastikowe pipety (2 ml) i końcówki schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.
    UWAGA: Nie wszystkie partie macierzy błony podstawnej mają taką samą zdolność do wspierania wzrostu 3D komórek TUM622. Dlatego konieczne jest nabycie i przetestowanie wielu partii macierzy błony podstawnej w celu zidentyfikowania tych, które wspierają silne tworzenie acini. Zwykle wymaga to wyższego stężenia białka (16-18 mg/ml) w matrycy.
  2. W dniu eksperymentu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C należy umieścić ciepłą pożywkę hodowlaną 3D, bufor HEPES, trypsynę/EDTA i bufor neutralizujący trypsynę (TNS). Bezpośrednio przed założeniem kultury wyjmij rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodówki i umieść fiolkę na lodzie.
  3. Schłodzić płytki do hodowli tkankowych na metalowej platformie chłodzącej umieszczonej na lodzie. Umieść probówki wirówkowe na metalowym stojaku chłodzącym na lodzie.
  4. Korzystając z komórek TUM622 uzyskanych w kroku 1.1.7, oblicz żądaną liczbę komórek potrzebnych do posiewu. Zazwyczaj potrzeba 15 000-30 0000 komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Niższa gęstość jest bardziej odpowiednia do obrazowania i kwantyfikacji, podczas gdy wyższa gęstość jest preferowana podczas pobierania komórek do ekstrakcji RNA lub western blot.
  5. Przenieść zawiesinę komórek do schłodzonej probówki wirówkowej (każda probówka zawiera komórki do trzykrotnego posiania) i odwirować w temperaturze 300 x g w wirówce kubełkowej do zawieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  6. Ostrożnie odessać supernatant pipetą zasysającą przymocowaną do niefiltrowanej końcówki (20 μl), pozostawiając około 100 μl pożywki w probówce (jako wskazówkę należy użyć oznaczeń na probówce).
  7. Delikatnie postukaj w bok rurki, aby usunąć i oddzielić granulkę przed powrotem do stojaka chłodzącego.
  8. Używając wstępnie schłodzonych pipet o pojemności 2 ml, delikatnie wymieszaj matrycę, pipetując kilka razy w górę i w dół, utrzymując fiolkę w kontakcie z lodem. Pipetować z równą i umiarkowaną prędkością, aby podczas tej procedury do matrycy nie zostały wprowadzone pęcherzyki.
  9. Przenieść odpowiednią objętość matrycy do każdej probówki wirówkowej. W przypadku posiewu trzykrotnego na płytce 24-dołkowej dodaj 1,1 ml macierzy membrany podstawnej do każdej probówki.
  10. Używając wstępnie schłodzonych końcówek, odpipetuj matrycę w każdej probówce w górę i w dół około 10 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek.
  11. Przenieść 310 μl zawiesiny komórek/matryc do każdego dołka wstępnie schłodzonej płytki 24-dołkowej. Pipetę umieszcza się pod kątem 90° do powierzchni płytki, a zawiesinę dodaje się do środka studzienki. Zawieszenie powinno się rozłożyć i przykryć całą studnię bez konieczności przechylania płyty.
  12. Aby ułatwić dalszą analizę immunofluorescencyjną, umieść zawiesinę komórki/matrycy równolegle w szkiełkach z 2-dołkową komorą. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek/matryc do środka studzienki z 2-dołkowym szkiełkiem komorowym (patrz Tabela materiałów). Dzięki temu matryca może tworzyć strukturę przypominającą kopułę o znacznie mniejszej objętości.
  13. Włożyć płytkę i komorę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy. Zbadaj płytkę/szkiełko pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w matrycy (4x lub 10x).
  14. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki 3D do każdego dołka i 1,5 ml pożywki 3D do każdego dołka szkiełka komorowego, a następnie włóż je z powrotem do inkubatora.

3. 3D Kokulturacja komórek TUM622 i CAF w macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Przygotować zawiesiny komórkowe TUM622 i CAF zgodnie z sekcją 2.
  2. Policz gęstość komórek CAF, pobierając 10 μl zawiesiny komórek i mieszając ją z 10 μl błękitu trypanowego.
  3. Dodać 10 μl mieszaniny do każdej z dwóch komór na hememytometrze, aby policzyć i obliczyć gęstość komórek.
    UWAGA: CAF mają nieregularne kształty i mogą nie być dokładnie zliczane na automatycznym liczniku komórek.
  4. Współosadzanie komórek TUM622 i CAF w macierzy błony podstawnej
    1. Na podstawie informacji o gęstości komórek oblicz żądaną liczbę komórek używanych do powlekania. CAF są wysiewane w stosunku 2:1 komórek TUM622. Na przykład dla 30 000 wysianych komórek TUM622 60 000 CAF jest osadzonych.
    2. Przenieś odpowiednią objętość TUM622 oraz zawiesinę komórek CAFs do tej samej probówki wirówkowej i postępuj zgodnie z krokami 2.5-2.11 w celu posiewu na płytki 24-dołkowe. W celu immunofluorescencji przenieś 60 μl mieszaniny TUM622/CAFs do szkiełek komorowych, jak opisano w kroku 2.12).
  5. Hodowla TUM622 z nałożonymi CAF w macierzy błony podstawnej (patrz tabela materiałów)
    1. Skonfiguruj monokulturę TUM622 zgodnie z krokami 2.5-2.13.
    2. Przenieś dwukrotność liczby zawiesiny CAF (w porównaniu z liczbą wysianych komórek TUM622) do probówki wirówkowej i wiruj przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić CAF w 1 ml pożywki hodowlanej 3D.
    4. Przenieś 1 ml zawiesiny CAFs do studzienki zawierającej osadzone komórki TUM622.

4. Zbieranie TUM622 Acini do ekstrakcji RNA/białka i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

  1. Przygotować poprzedniego dnia bufor do przemywania i bufor do pobierania komórek zgodnie z protokołem zestawu do pobierania komórek 3D i schłodzić przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Trzymaj płytki w chłodziarce płytowej, a inne odczynniki na lodzie przed rozpoczęciem procesu ekstrakcji.
  3. Odessać pożywkę z dołków hodowlanych 3D bez dotykania matrycy i delikatnie przemyć studzienkę 3 razy 1 ml buforu do mycia.
  4. Odessać końcowe płukanie i dodać 1 ml buforu do zbierania komórek do każdej studzienki.
  5. Użyj końcówki pipety p1000, aby zeskrobać matrycę z każdej studzienki.
  6. Pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej zdysocjować matrycę.
  7. Przenieść 1 ml mieszanki do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj kolejny 1 ml bufora do zbioru do tej samej studzienki.
  8. Powtórz kroki 4.5-4.7 i przenieś całą mieszaninę tego samego dołka do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  9. Zakryj probówki i kołysz w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  10. Napełnić każdą probówkę lodowatym PBS do 10 ml, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Odessać supernatant bez dotykania osadu. Supernatant powinien zawierać fragmenty matrycy, ale wszystkie sferoidy powinny być zebrane na dnie probówki.
  12. Dodaj lodowaty PBS do drugiego prania. Odwróć rurkę kilka razy, aby oddzielić osad. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut.
  13. Podczas wirowania przygotuj bufor do lizy do zbierania białka i RNA.
  14. Ostrożnie odessać supernatant i dodać bufor do lizy do dalszego przetwarzania w celu zebrania białka lub RNA. Alternatywnie, komórki mogą być ponownie zawieszone w celu analizy przepływu/sortowania FACS lub szeregowego przejścia.

5. Immunofluorescencja TUM622 Acini

  1. Przygotować bufor immunofluorescencyjny (bufor IF: PBS z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 0,2% Triton X-100 i 0,05% Tween-20), pierwotny bufor blokujący (bufor IF z 10% surowicą kozą), wtórny bufor blokujący (pierwotny bufor blokujący z 20 μg/ml koziego anty-mysiego F(ab')2)
  2. Odessać pożywkę z szkiełek 2-dołkowych, spłukać raz PBS i ustawić szkiełko na chłodziarce z metalową płytką na lodzie. Szkiełko komory powinno pozostać na chłodnicy z metalową płytą do końca protokołu.
  3. Dodaj wstępnie schłodzony 4% PFA, aby utrwalić acini i inkubować na lodzie przez 20 minut.
  4. Usuń 4% PFA i umyj trzy razy po 2 ml wstępnie schłodzonego PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc na bujaku.
  5. Odessać PBS i przepuszczać 1,5 ml 0,5% Triton X-100 w PBS (wstępnie schłodzony) przez 20 minut. Pod koniec tej procedury struktura przypominająca kopułę stanie się luźna.
  6. Delikatnie zassać bufor przepuszczalności ze szkiełka komory, aby uniknąć utraty próbki. Osiąga się to poprzez dodanie cienkiej końcówki (20 μl) do pipety zasysającej i dociśnięcie końcówki w kierunku rogu komory.
  7. Umyj trzy razy 2 ml wstępnie schłodzonego PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc na bujaku.
  8. Zablokować próbkę za pomocą podstawowego buforu blokującego na lodzie na 1 godzinę.
  9. Usuń główny bufor blokujący i dodaj dodatkowy bufor blokujący i blok na 30 minut.
  10. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do pierwszorzędowego buforu blokującego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Stężenie stosowanych tutaj przeciwciał powinno być wyższe niż normalnie stosowane do barwienia komórek w hodowli 2D. Większość pierwszorzędowych przeciwciał użytych w tym badaniu rozcieńcza się w stosunku 1:100 (patrz tabela materiałów).
  11. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć próbkę 3 razy 2 ml zimnego buforu IF.
    UWAGA: Próbki mogą być luźne, należy zachować szczególną ostrożność podczas zasysania.
  12. Próbki należy inkubować w przeciwciałach drugorzędowych rozcieńczonych w pierwszorzędowym buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Preferowane przeciwciała drugorzędowe powinny być silnie adsorbowane krzyżowo, aby zmniejszyć barwienie tła. Większość przeciwciał drugorzędowych użytych w tym badaniu rozcieńcza się w rozcieńczeniu 1:200.
  13. Usunąć przeciwciała drugorzędowe i przemyć próbkę 3 razy 2 ml zimnego buforu IF.
    UWAGA: Próbki mogą być luźne, należy zachować szczególną ostrożność podczas zasysania.
  14. Dodaj PBS z DAPI (rozcieńczenie 1:1,000) podczas ostatniego prania, aby zabarwić jądro. Wykonaj kolejne 2 prania w PBS.
  15. Zobrazuj próbki pod mikroskopem konfokalnym w ciągu 3 dni.
    UWAGA: Ze względu na rozmiar organoidów i ograniczenia w odległości roboczej obiektywu, próbki są zwykle obrazowane w powiększeniu 10x lub 20x.

6. Przygotowanie próbek kultur 3D do badań immunohistochemicznych

  1. Odessać pożywkę z szkiełek z 2-dołkową komorą i raz spłukać PBS.
  2. Utrwal kultury 3D w 4% PFA w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Usunąć 4% PFA, otoczyć kultury 2,5 ml żelu do próbek histologicznych (patrz tabela materiałów) i umieścić szkiełko w temperaturze 4 °C do zestalenia się przez co najmniej 1 godzinę.
  4. Przenieś próbki otoczone żelem do próbek histologicznych do kaset tkankowych i przetwarzaj je w automatycznym procesorze próbek tkanek przez noc.
  5. Zanurz próbki w wosku parafinowym i przygotuj do podziału12.

7. 3D Test cytotoksyczności dla badania przesiewowego związków (przykład dla jednej płytki 96-dołkowej)

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić 96-dołkową płytkę na chłodziarce płytkowej, zbiornik o pojemności 25 ml na chłodziarce zbiornikowej i stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
  2. Przygotować zawiesiny macierzy komórkowej komórek TUM622 we wstępnie schłodzonej stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, dodając do komórek odpowiednią objętość macierzy błony podstawnej. Pożądana gęstość komórek TUM622 wynosi 10 000 komórek na 70-75 μl macierzy błony podstawnej. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby umożliwić równomierne wymieszanie komórek w matrycy.
  3. Przesunąć płytę z chłodnicą płytową i zbiornik z chłodnicą zbiornika z dala od lodu na suchą powierzchnię, aby uniknąć kontaktu matrycy membrany podstawnej z lodem podczas przenoszenia.
  4. Przenieś mieszaninę komórek matrycowych do zbiornika chłodzącego bez tworzenia pęcherzyków.
  5. Za pomocą mechanicznej pipety wielokanałowej (10-300 μl) przenieś 70-75 μl komórek mieszankowych do każdego odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce.
  6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, aby matryca błony podstawnej zestaliła się.
  7. Dodać 100 μl pożywki we wszystkich rzędach i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
  8. Rozpocznij dawkowanie mieszanki następnego dnia lub później, w zależności od celu eksperymentu.
  9. Sferoidy mogą być ponownie podawane i dozowane co 2-3 dni przez okres do 10 dni, usuwając zużyte podłoża za pomocą 8- lub 12-dołkowego kolektora próżniowego i zastępując je świeżymi pożywkami z pożądanymi związkami lub bez.
  10. Liczbę sferoid TUM622 można określić ilościowo za pomocą imagera 3D zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TUM622 i CAFy w kulturze 2D
Rysunek 1 przedstawia typową morfologię komórek TUM622 i CAF w hodowli 2D. Komórki TUM622 są zaokrąglone dużymi jądrami, podczas gdy CAF są płaskie i wydłużone. Komórki TUM622 mogą osiągnąć 80% -90% zbiegu w hodowli. Dalsza proliferacja prowadzi do powstania większej liczby, ale mniejszych komórek zagregowanych w kolonie, które nie mają bezpośredniego kontaktu. W przeciwieństwie do tego, CAF wolą rosnąć przy wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzy to niejednorodne tkanki złożone z komórek rakowych współistniejących obok komórek zrębu, takich jak fibroblasty związane z rakiem, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe w ECM. Razem te różnorodne składniki komunikują się ze sobą i wpływają na mikrośrodowisko guza, odgrywając aktywną rolę w napędzaniu nowotworzenia, procesu, który obejmuje postępujące zmiany w architekturze guza. Idealnie byłoby, gdyby model rozwoju nowotworu in vitro był w stanie uchwycić dynamiczne zmiany w architekturze tkanek obserwowane w l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorami są pracownicy i akcjonariusze firmy Pfizer Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Magali Guffroy, Johnowi Kreegerowi i Stephani Bisulco z grupy Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker za wsparcie w zakresie patologii/histologii oraz Michaelowi Arensmanowi za krytyczną recenzję manuskryptu. Dziękujemy również Programowi Podoktoranckiemu firmy Pfizer oraz grupie badawczo-rozwojowej ds. onkologii, a w szczególności Robertowi Abrahamowi, Puja Sapra, Karen Widbin i Jennifer Tejeda za wsparcie programu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka do wzrostu nabłonka oskrzeliLonzaCC-3170BEGM
Sitko do komórek 40umThermoFisher352340Do przepuszczania komórek TUM622
Rozszczepione przeciwciało kaspazy 3Technologia sygnalizacji komórkowej9661 (RRID: AB_2341188)Rabbit
CoolRack CFT30BiocisionBCS-138Do hodowli 3D
CoolSink XT96FBiocisionBCS-536Do hodowli 3D
Zestaw do zbierania komórek Cultrex 3DBio-Techne3448-020-K
Cultrex (preferowany do kohodowli)Bio-Techne3443-005-01Do hodowli 3D
Przeciwciało CXCR4AbcamAb124824 (RRID: AB_10975635)Przeciwciało
E-kadherynyBD Biosciences610182 (RRID: AB_397581)Mysz
GelCountOxford OptronixDo liczenia i pomiarów przeciwciał Acini
GM130BD Biosciences610822 (RRID: AB_398141)
Mouse Goat SerumVectorLabs S1000 (RRID: AB_2336615)Do immunofluorescencji
Inaktywowany termicznie FBSGibco10082-147Do CAFs
Żel do próbek histologicznychRichard Allan ScientificHG-4000-012Dla immunofluorescencji
Integryna alfa 6 przeciwciałoMillipore SigmaMab1378 (RRID: AB_2128317)Szczurze
przeciwciało inwolukrynoweAbcam Ab68(RRID: AB_305656)Mysie
przeciwciało Ki67Abcam Ab15580(RRID: AB_443209)Rabbit
Lab-Tec II z komorą # 1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowegoNalge Nunc International155379 (2)Dla kultury 3D
Lab-Tec II komorowy #1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowegoNalge Nunc International155409 (8)Do hodowli 3D
L-glutaminaGibco25030-081Dla CAFów
Matrigel (preferowany do monohodowli)Corning356231Do hodowli 3D
przeciwciało p63Technologia sygnalizacji komórkowej13109 (SRRID:AB_2637091)Kojec dla królików
/ paciorkowiecGibco15140-122Dla odczynników do subkultur CAFs
ReagentPackLonzaCC-5034Do dysocjacji komórek TUM622
RPMIThermoFisher11875-093Do CAFów
Przeciwciało Sox2Technologia sygnalizacji komórkowej3579 (RRID: AB_2195767)
Rabbit TrypLE ExpressGibco12604-021Do dysocjacji CAF
Vi-CellBechman CoulterAutomatyczny licznik komórek
Przeciwciało wimentynyAbcamAb92547 (RRID: AB_10562134)przeciwciała przeciwko
beta-kateniniekrólika2677s (RRID: AB_1030943)Mysz
królika Technologia sygnalizacji komórkowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511(2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowy system kokulturyinterakcje mi dzy guzem a zr bkiemmacierz b ony podstawnejfibroblasty zwi zane z nowotworemkom rki TUM622model organoidowyanaliza immunofluorescencyjnacytometria przep ywowaprzesiew lek w

Powiązane artykuły