Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Podsumowanie

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Streszczenie

Immunoterapie są obiecujące w leczeniu pacjentów onkologicznych, ale złożona heterogeniczność mikrośrodowiska guza sprawia, że przewidywanie odpowiedzi na leczenie jest trudne. Wykazano, że zdolność do rozpoznawania względnych populacji komórek odpornościowych obecnych w tkance nowotworowej i wokół niej jest klinicznie istotna dla zrozumienia odpowiedzi, ale jest ograniczona przez tradycyjne techniki, takie jak cytometria przepływowa i immunohistochemia (IHC), ze względu na dużą wymaganą ilość tkanki, brak dokładnych markerów typu komórki oraz wiele przeszkód technicznych i logistycznych. Jeden test (np. Test profilowania immunologicznego ImmunoPrism) pokonuje te wyzwania, uwzględniając zarówno niewielkie ilości RNA, jak i wysoce zdegradowane RNA, wspólne cechy RNA wyekstrahowanego z klinicznie zarchiwizowanej tkanki guza stałego. Dostęp do testu jest możliwy za pośrednictwem zestawu odczynników i informatyki opartej na chmurze, która zapewnia kompleksowe, ilościowe, wysokoprzepustowe rozwiązanie do profilowania immunologicznego dla platform sekwencjonowania Illumina. Naukowcy zaczynają od zaledwie dwóch odcinków tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie lub 20-40 ng całkowitego RNA (w zależności od jakości próbki), a protokół generuje raport profilu immunologicznego określający ilościowo osiem typów komórek odpornościowych i dziesięć genów ucieczki immunologicznej, uzyskując pełny obraz mikrośrodowiska guza. Do wykorzystania uzyskanych danych nie jest wymagana dodatkowa analiza bioinformatyczna. Przy odpowiednich kohortach prób protokół może być również wykorzystany do identyfikacji statystycznie istotnych biomarkerów w populacji pacjentów będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja limfocytów naciekających nowotwór (TIL) i innych cząsteczek związanych z odpornością w próbkach tkanek ludzkich z utrwalonymi w formalinie i parafinie (FFPE) wykazała wartość w badaniach klinicznych1^,2,3. Popularne techniki, takie jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie jednokomórkowego kwasu rybonukleinowego (RNA), są przydatne dla świeżych tkanek i krwi⁴, ale nie nadają się do analizy materiałów FFPE ze względu na niezdolność do tworzenia żywotnych zawiesin komórkowych. Obecne metody, które zostały wykorzystane do ilościowego określenia tych komórek w tkance FFPE, borykają się z poważnymi wyzwaniami. Immunohistochemia (IHC) i inne podobne procesy obrazowania wymagają specyficznych przeciwciał do wykrywania białek na powierzchni komórki, które mogą być trudne do standaryzacji w laboratoriach, aby umożliwić powtarzalną kwantyfikację⁵. Platformy takie jak system nCounter opierają się na ekspresji pojedynczych genów w celu zdefiniowania kluczowych komórek odpornościowych⁶, ograniczając czułość i swoistość wykrywania. Bardziej ogólne metody sekwencjonowania RNA, w połączeniu z samodzielnymi narzędziami programowymi, są dostępne, ale wymagają znacznej optymalizacji i walidacji przed użyciem^{7,8,9,10,11,12}. Ostatnie postępy w łączeniu mikrodysekcji wychwytywania laserowego (LCM) z sekwencjonowaniem RNA dla tkanki FFPE są obiecujące; Jednak do badań translacyjnych mających na celu identyfikację solidnych biomarkerów wymagane jest bardziej wydajne, gotowe rozwiązanie^13,14. Metody generowania wielowymiarowych biomarkerów, takie jak predykcyjne modelowanie immunologiczne, które definiują kohorty pacjentów, w tym osoby reagujące na terapię, podtypy raka lub wyniki przeżycia z wysoką dokładnością predykcyjną i istotnością statystyczną, stają się coraz ważniejsze w erze medycyny precyzyjnej i immunoterapii^15,16.

Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano test profilowania immunologicznego, który umożliwia czułą i specyficzną kwantyfikację komórek odpornościowych w tkance FFPE guza litego przy użyciu standaryzowanych odczynników do sekwencjonowania RNA i informatyki opartej na chmurze. Oprócz przyjmowania zdegradowanego RNA z tkanki FFPE, protokół jest w stanie pomieścić RNA pochodzące z ograniczających próbek tkanek, takich jak biopsje gruboigłowe, aspiraty igłowe oraz tkanki mikro- lub makropreparowane. Dane RNA z każdej próbki są porównywane z bazą danych modeli ekspresji genów komórek odpornościowych, zwanych modelami ekspresji zdrowia immunologicznego, w celu ilościowego określenia komórek odpornościowych jako procentu wszystkich komórek obecnych w próbce. Krótko mówiąc, modele te zostały zbudowane przy użyciu metod uczenia maszynowego w celu zidentyfikowania unikalnych wielogenowych wzorców ekspresji na podstawie danych całego transkryptomu wygenerowanych z oczyszczonych populacji komórek odpornościowych (wyizolowanych przy użyciu kanonicznych markerów powierzchni komórki)^17,18. Wielowymiarowe modele ekspresji zdrowotnej leżące u podstaw technologii umożliwiają testowi ilościowe określenie każdej komórki odpornościowej jako procentu wszystkich komórek obecnych w heterogenicznej mieszaninie. Dzięki temu badacz może generować porównania komórek odpornościowych między próbkami i wewnątrz próbek, które, jak wykazano, mają wartość kliniczną^19,20. Inne zastosowania obejmują kwantyfikację odpowiedzi immunologicznej przed i po leczeniu, zgodnie z opisem w reprezentatywnych wynikach. Test informuje o wielu cechach tekstury immunologicznej guza i mikrośrodowisku guza, w tym bezwzględnych procentach ośmiu typów komórek odpornościowych (pochodzących z modeli ekspresji genów): limfocyty T CD4 ⁺, limfocyty T CD8 ⁺, komórki NK CD56 ⁺, limfocyty B CD19 ⁺, monocyty CD14 ⁺, limfogi Treg, makrofagi M1 i makrofagi M2. Ponadto test informuje o ekspresji (w transkryptach na milion lub TPM) dziesięciu genów ucieczki immunologicznej: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 i ARG1.

Zestaw odczynników służy do przygotowania wysokiej jakości bibliotek do sekwencjonowania na platformie Illumina zgodnie z hybrydową metodą przygotowania biblioteki opartą na przechwytywaniu, jak pokazano na rysunku 1. Jeśli badacz nie ma w swoim laboratorium platformy sekwencjonowania Illumina, może przesłać swoje próbki do laboratorium podstawowego w celu sekwencjonowania. Po wygenerowaniu dane sekwencjonowania są przesyłane do portalu Prism w celu automatycznej analizy, a kompleksowy, ilościowy profil dla każdej pojedynczej próbki, w postaci raportu immunologicznego (rysunek 2A), jest zwracany użytkownikowi. Użytkownicy mogą również definiować grupowania próbek w portalu Prism w celu wygenerowania raportu biomarkerów (rysunek 2B), podkreślając statystycznie istotne biomarkery, które odróżniają dwie kohorty pacjentów. Co ważne, dane generowane przez zestaw odczynników są przeznaczone wyłącznie do celów badawczych i nie mogą być wykorzystywane do celów diagnostycznych.

Rysunek 1: Omówienie przepływu pracy. W tym protokole RNA jest najpierw przekształcane w cDNA. Adaptery do sekwencjonowania są ligowane, a cDNA ligowane adaptorowo jest amplifikowane i kodowane kreskowo za pomocą PCR w celu utworzenia biblioteki wstępnego wychwytywania. Biotynylowane sondy są następnie hybrydyzowane ze specyficznymi celami cDNA, które są następnie wychwytywane za pomocą kulek streptawidyny. Niezwiązany, nieukierunkowany cDNA jest usuwany przez mycie. Końcowe wzbogacenie PCR daje bibliotekę po przechwyceniu gotową do sekwencjonowania. *Całkowite RNA musi pochodzić z próbek ludzkich; może być nienaruszonym lub zdegradowanym (FFPE) RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne raporty immunologiczne. Przepływ pracy generuje dwa raporty, indywidualny raport immunologiczny (A) dla każdej przetwarzanej próbki oraz raport biomarkerów (B) dla zdefiniowanych kohort pacjentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół wymaga około 16 godzin czasu przygotowania (od całkowitego RNA do bibliotek gotowych do sekwencjonowania); jednak istnieje wiele opcjonalnych punktów zatrzymania, jak zaznaczono w protokole. Test wykorzystuje bogatą, dynamiczną naturę transkryptomiki, aby wyjść poza starsze biomarkery z pojedynczym analitem do wielowymiarowych modeli ekspresji genów, umożliwiając w ten sposób kompleksową charakterystykę biologiczną próbek tkanek za pomocą standaryzowanych odczynników i łatwych w użyciu narzędzi programowych. Umożliwia naukowcom wykorzystanie nowoczesnej technologii we własnym laboratorium, wykorzystując uczenie maszynowe i bazę danych modeli ekspresji zdrowotnej w celu uzyskania dokładniejszych, ilościowych profili immunologicznych cennych próbek klinicznych i odkrycia wielowymiarowych biomarkerów RNA z pełną analizą statystyczną.

Protokół

Próbki tkanek ludzkich wykorzystane w Reprezentatywnych Wynikach pokazanych tutaj zostały zakupione od renomowanego podmiotu (TriStar Technology Group) i posiadają świadomą zgodę dawcy pozwalającą na prowadzenie badań akademickich i komercyjnych, a także zgodę kompetentnej komisji etycznej.

Część I: Przygotowanie biblioteki przed przechwytywaniem

1. Kwantyfikacja i kwalifikacja RNA

1. Określ ilościowo RNA za pomocą testu fluorometrycznego w celu określenia odpowiednich danych wejściowych do testu. Oceń jakość wejściowego RNA za pomocą elektroforezy w celu określenia liczby integralności RNA (RIN) i procentu fragmentów >200 nukleotydów (DV₂₀₀).
   1. W przypadku nienaruszonych (RIN > 7) lub częściowo zdegradowanych próbek RNA (RIN = 2 do 7) postępuj zgodnie z krokami przygotowania biblioteki dla wysokiej jakości/nienaruszonego RNA, zaczynając od kroku 2.1. Jakość RNA jest ważna dla wyboru prawidłowego czasu fragmentacji w programie Thermal Cycler #1 (tabela uzupełniająca 2).
   2. W przypadku próbek o wysokiej degradacji (np. RIN = 1 do 2 lub FFPE) należy określić wartość DV₂₀₀. Próbki te nie wymagają fragmentacji i będą postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi zdegradowanego RNA, zaczynając od kroku 2.2.
2. Przygotować odpowiednią ilość całkowitego RNA dla każdej próbki, rozcieńczając 20 ng RNA (wysokiej jakości/nienaruszone RNA z RIN > 2) lub 40 ng RNA (zdegradowane/FFPE RNA z DV₂₀₀ > 20%) do 5 μl w wodzie wolnej od nukleaz. Nie zaleca się przetwarzania próbek za pomocą DV₂₀₀ < 20%. W przypadku kontrolnych próbek RNA dostarczonych z zestawem należy rozcieńczyć 1 μl odpowiedniego RNA w 4 μl wody wolnej od nukleaz. Próbki kontrolne zostaną poddane takiemu samemu przetwarzaniu, jak opisano dla materiałów RNA wysokiej jakości (nienaruszonej) lub zdegradowanej (FFPE), zgodnie z oznaczeniem. Patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla wszystkich odczynników zawartych w zestawie.

2. Fragmentacja i gruntowanie RNA

1. Postępuj zgodnie z krokiem 2.1.1, aby uzyskać wysokiej jakości/nienaruszone RNA z RIN > 2.
   1. Aby uzyskać wysokiej jakości RNA, złóż reakcję fragmentacji i gruntowania na lodzie w probówce PCR bez nukleazy zgodnie z tabelą 1.
      1. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie na krótko odwirować próbki w mikrowirówce
         UWAGA: Dla wszystkich wirowań wirówki w protokole zalecana jest prędkość ≥ 1,000 x g przez co najmniej 3 s.
      2. Umieść próbki w termocyklerze i użyj programu #1 (Tabela uzupełniająca 2).
      3. Natychmiast przenieś probówki do lodu i przystąp do syntezy pierwszej nici cDNA w celu uzyskania wysokiej jakości RNA (krok 3.1). W celu jednoczesnego przygotowania zarówno RNA wysokiej jakości, jak i FFPE, należy rozpocząć przygotowanie RNA FFPE (krok 2.2) podczas inkubacji fragmentacji.

Mieszanka do rozdrobnienia i gruntowania	Objętość (μL)
Nienaruszony lub częściowo zdegradowany RNA (20 ng)	5
Bufor reakcyjny do syntezy pierwszej nici	4
Losowe podkłady	1
Całkowita objętość	10

Tabela 1: Reakcja fragmentacji i przygotowania dla wysokiej jakości RNA. Składniki reakcji fragmentacji i przygotowania do uzyskania wysokiej jakości RNA powinny być złożone i wymieszane na lodzie zgodnie z pokazanymi objętościami. Można przygotować i dodać do próbek RNA główną mieszankę buforu reakcyjnego do syntezy pierwszej nici i starterów losowych.

2. Postępuj zgodnie z krokiem 2.2.1 dla zdegradowanego/FFPE RNA z DV₂₀₀ > 20%.
   1. W przypadku wysoce zdegradowanego RNA (FFPE), które nie wymaga fragmentacji, należy przeprowadzić reakcję kondycjonowania zgodnie z opisem w tabeli 2. W przypadku nienaruszonego RNA należy pamiętać o wykonaniu kroku 2.1.
      1. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie krótko odwirować próbki w mikrowirówce.
      2. Umieść próbki w termocyklerze i użyj programu #2 (Tabela uzupełniająca 2).
      3. Przenieś probówki do lodu i przystąp do syntezy pierwszej nici cDNA dla wysoce zdegradowanego (FFPE) RNA (krok 3.2).

Reakcja na gruntowanie	Objętość (μL)
FFPE RNA (40 ng)	5
Losowe podkłady	1
Całkowita objętość	6

Tabela 2: Losowa reakcja primingu dla wysoce zdegradowanego RNA. Składniki reakcji pobudzania dla wysoce zdegradowanego RNA powinny być złożone na lodzie w probówce PCR bez nukleaz.

3. Synteza pierwszej nici cDNA

1. Postępuj zgodnie z krokiem 3.1.1, aby uzyskać wysokiej jakości/nienaruszone RNA z RIN > 2.
   1. Aby uzyskać nienaruszone RNA (wysokiej jakości), złóż reakcję syntezy pierwszej nici na lodzie w probówce PCR bez nukleaz zgodnie z tabelą 3.
      1. Utrzymując reakcje na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować próbki w mikrowirówce i przejść bezpośrednio do inkubacji syntezy pierwszej nici (etap 4).

Synteza pierwszej nici	Objętość (μL)
Rozdrobnione i zapoczątkowane RNA (krok 2.1.3)	10
Odczynnik do syntezy pierwszej nici	8
Mieszanka enzymów do syntezy pierwszej nici	cyfra arabska
Całkowita objętość	20

Tabela 3: Reakcja syntezy pierwszej nici dla wysokiej jakości RNA. Składniki reakcji fragmentacji i przygotowania do uzyskania wysokiej jakości RNA powinny być łączone i mieszane na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Można przygotować główną mieszankę odczynnika do syntezy pierwszej nici i mieszanki enzymów do syntezy pierwszej nici i dodać ją do rozdrobnionych i zagruntowanych próbek RNA.

2. Postępuj zgodnie z krokiem 3.2.1 dla zdegradowanego/FFPE RNA z DV₂₀₀ > 20%.
   1. W przypadku wysoce zdegradowanego RNA (FFPE) należy przeprowadzić reakcję syntezy pierwszej nici na lodzie w probówce PCR bez nukleaz zgodnie z tabelą 4.
      1. Utrzymując reakcje na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować próbki w mikrowirówce i przejść bezpośrednio do inkubacji syntezy pierwszej nici (etap 4).

Synteza pierwszej nici	Objętość (μL)
Zapoczątkowany RNA (krok 2.2.3)	6
Bufor reakcyjny do syntezy pierwszej nici	4
Odczynnik do swoistości dla pierwszej nici	8
Mieszanka enzymów do syntezy pierwszej nici	cyfra arabska
Całkowita objętość	20

Tabela 4: Reakcja syntezy pierwszej nici dla wysoce zdegradowanego RNA. Składniki reakcji fragmentacji i pobudzania dla wysoce zdegradowanego RNA powinny być składane i mieszane na lodzie zgodnie z pokazanymi objętościami. Można przygotować i dodać do przygotowanych próbek RNA główną mieszankę buforu reakcyjnego do syntezy pierwszej nici, odczynnika specyficzności syntezy pierwszej nici i mieszanki enzymów syntezy pierwszej nici.

4. Inkubacja syntezy pierwszej nici

1. Trzymając probówki na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować próbki w mikrowirówce. Inkubować próbki w podgrzanym termocyklerze zgodnie z programem #3 (Tabela uzupełniająca 2).

5. Synteza drugiej nici cDNA

1. Przygotować reakcję syntezy drugiej nici cDNA na lodzie, łącząc składniki wymienione w tabeli 5, w tym produkt reakcji pierwszej nici z kroku 4.1.

Reakcja syntezy drugiej nici	Objętość (μL)
Produkt syntezy pierwszej nici (etap 4.1)	20
Bufor reakcyjny do syntezy drugiej nici	8
Mieszanka enzymów do syntezy drugiej nici	4
Woda wolna od nukleaz	Rozdział 48
Całkowita objętość	Rozdział 80

Tabela 5: Reakcja syntezy drugiej nici. Składniki reakcji syntezy drugiej nici cDNA należy złożyć i wymieszać na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Główną mieszankę buforu reakcyjnego syntezy drugiej nici, mieszanki enzymów syntezy drugiej nici i wody wolnej od nukleaz można przygotować i dodać do produktu syntezy pierwszej nici.

2. Trzymając probówki na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubować w termocyklerze zgodnie z programem #4 (Tabela uzupełniająca 2).

6. Oczyszczanie cDNA za pomocą koralików SPRI (odwracalna immobilizacja w fazie stałej)

1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
2. Dodać 144 μl zawieszonych kulek do reakcji syntezy drugiej nici (~80 μL). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Gdy roztwór będzie klarowny, ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają DNA.
4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówek znajdujących się na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
5. Powtórz krok 6.4 raz, co daje w sumie 2 etapy prania.
6. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw rurki na stojaku magnetycznym i susz koraliki na powietrzu przez około 3 minuty przy otwartej pokrywie lub do widocznego wyschnięcia. Nie należy przesuszać koralików, ponieważ może to spowodować mniejszy odzysk DNA.
7. Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 53 μl 0,1x bufor TE (dołączony do zestawu odczynników, patrz tabela uzupełniająca 1) do kulek. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Przenieść 50 μl supernatantu do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, próbki cDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

7. Zakończ naprawę biblioteki cDNA

1. Końcową reakcję naprawy należy zmontować na lodzie, łącząc składniki wymienione w tabeli 6 z produktem syntezy drugiej nici z kroku 6.8.

Rozdział Rozdział

Zakończ reakcję naprawy	Objętość (μL)
Produkt syntezy drugiej nici (etap 6.8)	50
Koniec bufora reakcyjnego naprawy	7
Zakończ naprawczą mieszankę enzymów	3
Całkowita objętość	60

Tabela 6: Reakcja na naprawę końcową. Składniki końcowej reakcji naprawy należy zmontować i wymieszać na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Można przygotować główną mieszankę buforu reakcyjnego naprawy końcowej i mieszanki enzymów naprawy końcowej i dodać ją do produktu syntezy drugiej nici.

2. Ustaw pipetę na 50 μl, a następnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Krótko odwirować, aby zebrać cały płyn z boków probówek. Ważne jest, aby dobrze wymieszać. Obecność niewielkiej ilości pęcherzyków nie będzie przeszkadzać w wydajności.
3. Inkubować próbki w termocyklerze zgodnie z programem #5 (Tabela uzupełniająca 2).

8. Podwiązanie adaptera

1. Przed rozpoczęciem reakcji ligacji należy rozcieńczyć adaptor w lodowatym buforze do rozcieńczania adaptora, jak pokazano w tabeli 7, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek plus 10% więcej. Rozcieńczony łącznik należy przechowywać na lodzie.

Rozcieńczenie ligacji	Objętość (μL)
Adapter	0,5
Bufor rozcieńczający adapter	cyfra arabska
Całkowita objętość	Rozdział 2.5

Tabela 7: Rozcieńczenie adaptora. Łącznik należy rozcieńczyć na lodzie za pomocą buforu rozcieńczającego do rozdzielacza zgodnie z podanymi objętościami.

2. Przeprowadzić reakcję ligacji na lodzie, dodając składniki opisane w tabeli 8, w podanej kolejności, do końcowego produktu reakcji przygotowawczej z kroku 7.3. Należy pamiętać, że Ligation Master Mix i Ligation Enhancer można mieszać z wyprzedzeniem. Mieszanina ta jest stabilna przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C. Nie mieszaj wstępnie Ligation Master Mix, Ligation Enhancer i Adaptor przed użyciem w Adaptor Ligation Step.

Rozdział pkt.

Reakcja podwiązania	Objętość (μL)
Koniec preparowanego DNA (krok 7.3)	60
Rozcieńczony adapter (krok 8.1)	Rozdział 2.5
Wzmacniacz podwiązania	1
Mistrz podwiązania Mix	Rozdział 30
Całkowita objętość	93,5

Tabela 8: Reakcja podwiązania. Składniki reakcji podwiązywania adaptera powinny być montowane na lodzie zgodnie z objętościami podanymi w podanej kolejności. Można przygotować główną mieszankę Ligation Enhancer i Ligation Master Mix i dodać ją do End Prepped DNA za pomocą rozcieńczonego adaptera. Nie mieszaj rozcieńczonego adaptora z Ligation Master Mix lub Ligation Enhancer przed zmieszaniem z DNA przygotowanym pod koniec.

3. Ustaw pipetę na 80 μl, a następnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Wykonaj szybkie wirowanie, aby zebrać cały płyn z boków rurek. Ligation Master Mix jest bardzo lepki. Należy zadbać o odpowiednie wymieszanie reakcji podwiązywania, ponieważ niepełne wymieszanie spowoduje zmniejszenie skuteczności ligacji. Obecność niewielkiej ilości pęcherzyków nie będzie przeszkadzać w wydajności.
4. Inkubować zgodnie z programem #6 (Tabela uzupełniająca 2), a następnie usunąć mieszaninę ligacji z termocyklera i dodać 3 μl enzymu do przetwarzania adaptora, co daje całkowitą objętość 96,5 μl.
5. Pipetować w górę i w dół kilka razy, aby dobrze wymieszać, a następnie inkubować zgodnie z programem #7 (Tabela uzupełniająca 2) przed natychmiastowym przystąpieniem do oczyszczania reakcji ligacji.

9. Oczyszczanie reakcji ligacji za pomocą SPRI Neads

1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
2. Dodać 87 μl zawieszonych kulek SPRI i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Po klarownym roztworze (~5 min) ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Nie wyrzucaj koralików.
4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówek znajdujących się na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz krok 9.4 raz, co daje w sumie 2 etapy prania.
5. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw rurki na stojaku magnetycznym i susz koraliki na powietrzu przez około 3 minuty przy otwartej pokrywie lub do widocznego wyschnięcia. Nie należy przesuszać koralików, ponieważ może to spowodować mniejszy odzysk DNA.
6. Wyjmij rurki z magnesu i dodaj 17 μl 0,1x buforu TE do kulek. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić probówki na stojaku magnetycznym, umożliwiając całkowite oddzielenie kulek od supernatantu.
7. Przenieść 15 μl supernatantu do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, DNA podwiązane adaptorem może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

10. Wzbogacanie metodą PCR DNA ligowanego adaptorowo

1. Ustawić reakcję PCR zgodnie z opisem w tabeli 9. Można przygotować i dodać Master Mix zawierający Pre-Capture PCR Master Mix i Universal Primer, a następnie dodać go do DNA ligowanego Adaptorem. W przypadku sekwencjonowania multipleksowego należy używać unikalnych starterów indeksowych dla każdej reakcji i dodawać do każdej próbki indywidualnie.

Rozdział

Wzbogacanie PCR	Objętość (μL)
DNA podwiązane adaptorowo (krok 10.1)	15
Wstępna mieszanka wzorcowa PCR	25
Uniwersalny podkład do PCR	5
Indeks (X) Elementarz	5
Całkowita objętość	50

Tabela 9: Wzbogacanie metodą PCR DNA podwiązanego adaptorowo. Składniki reakcji DNA ligowanego adaptorowo metodą PCR powinny być złożone i wymieszane na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Można przygotować i dodać do adaptorowo ligowanego DNA mieszankę wzorcową Pre-Capture PCR Master Mix i uniwersalnego podkładu PCR. W przypadku sekwencjonowania multipleksowego każda próbka powinna otrzymać unikalny Index Primer.

2. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Krótko odkręć probówki w mikrowirówce i umieść w termocyklerze i wykonaj amplifikację PCR za pomocą programu #8 (Tabela uzupełniająca 2).

11. Oczyszczanie reakcji PCR za pomocą kulek SPRI

1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
2. Do każdej reakcji PCR dodać 45 μl zawieszonych kulek (~50 μL). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Po klarownym roztworze (~5 min) ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików zawierających DNA.
4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówek znajdujących się w stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz krok 11.4 raz, co daje w sumie 2 kroki prania.
5. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw rurki na stojaku magnetycznym i susz koraliki na powietrzu przez około 3 minuty przy otwartej pokrywie lub do widocznego wyschnięcia. Nie należy przesuszać koralików, ponieważ może to spowodować mniejszy odzysk DNA.
6. Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 23 μl 0,1x bufor TE do kulek. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
7. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Przenieść 20 μl supernatantu do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, biblioteki Pre-Capture mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

12. Walidacja i kwantyfikacja biblioteki Pre-capture

1. Zmierz stężenie w bibliotece wstępnego wychwytywania za pomocą fluorometru i zestawu do testów o wysokiej czułości. Aby przejść do części II: Hybrydyzacja i wychwytywanie, wymagany jest minimalny plon 200 ng.
   1. Uruchom 1 μl biblioteki w cyfrowym systemie elektroforezy. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę, aby uniknąć przeciążenia układu o wysokiej czułości, zgodnie z zaleceniami protokołu producenta.
   2. Sprawdź, czy elektroferogram pokazuje wąski rozkład o wielkości piku około 250-400 pz (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 3 i Rysunek 4).
   3. Jeśli pik 128 pz (adapter-dimer) jest widoczny w śladach bioanalizatora, a intensywność sygnału jest ≥ intensywności sygnału z biblioteki 250-400 pz (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 5), a następnie zwiększ objętość próbki (z kroku 11.7) do 50 μL za pomocą 0,1x buforu TE i powtórz oczyszczanie kulek SPRI (krok 11). Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, biblioteki Pre-capture mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przed przejściem do części II: Hybrydyzacja i przechwytywanie immunoprism.

Część II: Hybrydyzacja i przechwytywanie

13. Połącz oligonukleotydy blokujące, DNA Cot-1, DNA biblioteki wstępnego przechwytywania i suche

1. Wymieszaj bibliotekę kodów kreskowych przygotowaną w kroku 11 i oznaczoną ilościowo w kroku 12 z DNA Cot-1 i oligonukleotydami blokującymi w probówce PCR bez nukleazy lub mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, jak pokazano w tabeli 10.

Odczynnik	Ilość/objętość
Biblioteka kodów kreskowych z kroku 10.10	200 ng
DNA COT-1	2 μg
Blokowanie oligonukleotydów	2 μl

Tabela 10: Hybrydyzacja Przygotowanie i suszenie. Komponenty, które mają być połączone w celu wysuszenia bibliotek w ramach przygotowań do hybrydyzacji, powinny być zestawione zgodnie z pokazanymi ilościami.

2. Wysuszyć zawartość probówki za pomocą koncentratora próżniowego ustawionego na 30-45 °C. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole. Po wysuszeniu probówki można przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej (15-25 °C) lub dłużej w temperaturze -20 °C.

14. Hybrydyzacja sond do wychwytywania DNA z biblioteką

1. Rozmrozić 2x Bufor do płukania kulek i bufor do hybrydyzacji, Wzmacniacz buforu hybrydyzacji, Panel sondy ImmunoPrism, 10x Bufor do płukania 1, 10x Bufor do płukania 2, 10x Bufor do płukania 3 i 10x Bufor do płukania Rygorystycznego w temperaturze pokojowej. Przed użyciem należy sprawdzić bufor hybrydyzacyjny pod kątem krystalizacji soli. Jeśli kryształy są obecne, podgrzać probówkę w temperaturze 65 °C, potrząsając z przerwami, aż do całkowitego rozpuszczenia buforu.
2. W temperaturze pokojowej utwórz Hybridization Master Mix w probówce. Pomnóż objętość przez liczbę próbek i dodaj 10% więcej, zgodnie z tabelą 11.

Mistrzowska mieszanka hybrydyzacji	Objętość (μL)
Bufor hybrydyzacyjny	8,5
Wzmacniacz bufora hybrydyzacji	2.7
Panel sondy ImmunoPrism	5
Woda wolna od nukleaz	0,8
Całkowita objętość	17

Tabela 11: Mieszanka główna hybrydyzacji. Składniki Hybridization Master Mix należy łączyć i mieszać w temperaturze pokojowej zgodnie z podanymi objętościami.

3. Wiruj lub pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Następnie dodaj 17 μl Hybridization Master Mix do każdej probówki zawierającej wysuszone DNA. Zamknąć probówki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Próbki należy zawirować, upewniając się, że są całkowicie wymieszane, a następnie krótko odwirować próbki w mikrowirówce. W razie potrzeby przenieść każdą próbkę z mikroprobówki o pojemności 1,5 ml do probówki do PCR bez nukleazy.
5. Umieść próbki w termocyklerze i uruchom Program #9 (Tabela Uzupełniająca 2).
   1. Podczas inkubacji należy przygotować do przemywania (etap 15) i kulki streptawidyny (etap 16), pozostawiając wystarczająco dużo czasu na wstępne podgrzanie i zrównoważenie kulek streptawidyny.

15. Przygotuj do mycia

UWAGA: do płukania są dostarczane jako 2x (Bufor do płukania kulek) lub 10x (wszystkie inne do płukania) stężone roztwory.

1. Podczas inkubacji hybrydyzacji rozcieńczyć 2x Bufor do płukania kulek i 10 razy Buffer do płukania, aby utworzyć 1x roztwory robocze, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek i dodając 10% więcej, zgodnie z tabelą 12. Jeśli 10x bufor do płukania 1 jest mętny, podgrzej butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C lub bloku grzewczym w celu ponownego zawieszenia cząstek. Zamrożone 1x Wash Buffers należy wymieszać po rozmrożeniu.

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.

do mycia	Skoncentrowany bufor (μl)	Woda wolna od nukleaz (μL)	Ogółem (μl)
Bufor do płukania koralików	150	150	300
Bufor do płukania 1	25	225	Z kolei 250
Bufor do płukania 2	15	135 Rozdział 135	150
Bufor do płukania 3	15	135 Rozdział 135	150
Rygorystyczny bufor do płukania	Rozdział 30	270	300

Tabela 12: Rozcieńczenie buforu myjącego. do przemywania o stężeniu należy rozcieńczyć wodą wolną od nukleaz o temperaturze pokojowej zgodnie z podanymi objętościami.

2. Podwielokrotnić 1x płuczące do probówek PCR bez nukleaz i umieścić w odpowiednich temperaturach, jak wskazano w tabeli 13. Należy pamiętać o dołączeniu wystarczającej ilości nadmiaru do pipetowania. W przypadku podgrzewanych należy użyć termocyklera ustawionego na 65 °C z pokrywą ustawioną na 70 °C.

szt. szt. szt. szt. szt. szt.

do mycia	Temperatura trzymania	Objętość/probówkę (μL)	Liczba probówek/próbkę
Bufor do płukania koralików	Temperatura względna (15-25 °C)	100	3
Bufor do płukania 1	65 °C	100	1
Bufor do płukania 1	Temperatura względna (15-25 °C)	150	1
Bufor do płukania 2	Temperatura względna (15-25 °C)	150	1
Bufor do płukania 3	Temperatura względna (15-25 °C)	150	1
Rygorystyczny bufor do płukania	65 °C	150	cyfra arabska

Tabela 13: Rozcieńczone do mycia. Rozcieńczone do przemywania należy podzielić na oddzielne probówki zgodnie z objętościami i liczbą probówek na próbkę. Przed użyciem myjące muszą być przechowywane we wskazanej temperaturze.

3. Przygotować mieszaninę do ponownego zawieszania kulek w temperaturze pokojowej, jak pokazano w tabeli 14, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek i dodając 10% więcej.

Mieszanka do ponownego zawieszania koralików	Objętość (μL)
Bufor hybrydyzacyjny	8,5
Wzmacniacz bufora hybrydyzacji	2.7
Woda wolna od nukleaz	5,8
Całkowita objętość	17

Tabela 14: Mieszanka do ponownego zawieszania koralików. Składniki Bead Resuspension Mix należy zebrać i wymieszać w temperaturze pokojowej zgodnie z podanymi objętościami.

16. Przygotuj koraliki Streptavidin

1. Równowaga kulek streptawidyny w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Dokładnie wymieszaj kulki, wirując przez 15 s i podajec 50 μl kulek na przechwycenie do probówki PCR bez nukleazy.
2. Dodaj 100 μl 1x Bufor do płukania kulek (przygotowany w kroku 15.1) do każdej probówki. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, pozwalając kulkom całkowicie oddzielić się od supernatantu.
3. Usunąć i wyrzucić klarowny supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
4. Wykonaj następujące pranie.
   1. Wyjmij z stojaka magnetycznego. Dodaj 100 μl 1x Bufor do płukania kulek do każdej probówki zawierającej kulki, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
   2. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym, tak aby koraliki całkowicie oddzieliły się od supernatantu.
   3. Ostrożnie usunąć i wyrzucić klarowny supernatant.
5. Powtórz krok 16.4 raz, w sumie dwa prania.
6. Wyjmij z stojaka magnetycznego. Do każdej probówki dodać 17 μl mieszanki do ponownego zawieszania kulek z kroku 15.3. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Upewnij się, że koraliki nie są przyklejone do boków rurek. W razie potrzeby krótko zakręć rurkami, aby zebrać koraliki na dole.

17. Zwiąż hybrydowy cel z kulkami Streptawidyny

1. Po zakończeniu 4-godzinnej inkubacji hybrydyzacji wyjąć próbki z termocyklera i ustawić termocykler na inkubację w temperaturze 65 °C z podgrzewaną pokrywą ustawioną na 70 °C.
2. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 17 μl w pełni homogenizowanych kulek do próbek. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.
3. Zwiąż DNA z kulkami, umieszczając probówki w termocyklerze zgodnie z programem #10 (Tabela uzupełniająca 2). Podczas inkubacji należy na krótko wyjmować probówki paskowe co 10-12 minut i delikatnie wirować przez 3 sekundy, aby upewnić się, że kulki pozostają w zawiesinie. Alternatywnie można mieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Natychmiast przejdź do mycia kulek streptawidyny (krok 18).

18. Umyj kulki streptawidyny, aby usunąć niezwiązane DNA

1. Użyj 1x myjących z kroku 15.2 i przechowuj podgrzane w termocyklerze podczas prania.
2. Dodaj 100 μl podgrzanego 1x bufor do przemywania 1 do probówek z kroku 17.3. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu.
3. Odpipetować i wyrzucić supernatant, który zawiera niezwiązane DNA. Wyjmij z stojaka magnetycznego.
4. Wykonaj następujące pranie w temperaturze 65 °C.
   1. Dodaj 150 μl podgrzanego 1x Rygorystyczny bufor do mycia.
   2. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że koraliki są całkowicie zawieszone we wszystkich tubach.
   3. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
   4. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i wyrzucić supernatant, który zawiera niezwiązane DNA. Wyjmij z stojaka magnetycznego.
   5. Powtórz krok 18.4, aby uzyskać łącznie dwa rygorystyczne prania.
5. Wykonaj pierwsze pranie w temperaturze pokojowej.
   1. Dodaj 150 μl o temperaturze pokojowej 1x Bufor do mycia 1.
   2. Pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
   3. Zamknij probówki i inkubuj przez 2 minuty, na przemian delikatnie wirując przez 30 s i odpoczywając przez 30 sekund. Upewnij się, że koraliki we wszystkich studzienkach pozostają całkowicie zawieszone we wszystkich probówkach przez cały czas inkubacji.
   4. Krótko odwirować probówki.
   5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i odrzucić supernatant.
   6. Zamknąć probówki i krótko odwirować. Wróć do stojaka magnetycznego i użyj pipety o pojemności 10 μl, aby usunąć resztki buforu do płukania.
6. Wykonaj drugie pranie w temperaturze pokojowej.
   1. Dodaj 150 μl o temperaturze pokojowej 1x bufor do płukania 2.
   2. Pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
   3. Zamknij probówki i inkubuj przez 2 minuty, na przemian delikatnie wirując przez 30 s i odpoczywając przez 30 sekund. Upewnij się, że koraliki we wszystkich studzienkach pozostają całkowicie zawieszone we wszystkich probówkach przez cały czas inkubacji.
   4. Krótko odwirować probówki.
   5. Przenieś całą objętość kulek zawieszonych w buforze płuczącym 2 do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Ważne: Przenoszenie kulek do świeżych probówek jest ważne, aby uniknąć zanieczyszczenia poza celem.
   6. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i odrzucić supernatant.
   7. Zamknąć probówki i krótko odwirować. Wróć do stojaka magnetycznego i użyj pipety o pojemności 10 μl, aby usunąć resztki buforu do płukania.
7. Wykonaj trzecie pranie w temperaturze pokojowej.
   1. Dodaj 150 μl temperatury pokojowej 1x Bufor do płukania 3.
   2. Pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
   3. Zamknij probówki i inkubuj przez 2 minuty, na przemian delikatnie wirując przez 30 s i odpoczywając przez 30 sekund. Upewnij się, że koraliki we wszystkich studzienkach pozostają całkowicie zawieszone we wszystkich probówkach przez cały czas inkubacji.
   4. Krótko odwirować probówki.
   5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i odrzucić supernatant.
   6. Zamknąć probówki i krótko odwirować. Wróć do stojaka magnetycznego i użyj pipety o pojemności 10 μl, aby usunąć resztki buforu do płukania.
   7. Wyjmij ze stojaka magnetycznego i dodaj do kulek 20 μl wody wolnej od nukleaz
   .
   8. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby upewnić się, że wszelkie koraliki przyklejone do boku probówek zostały ponownie zawieszone.
8. Ważne: Nie wyrzucaj koralików. Użyj całych 20 μl zawieszonych kulek z przechwyconym DNA w kroku 19.

19. Wykonaj końcowe wzbogacanie PCR po schwytaniu

1. Przygotować MasterMix PCR po wychwyceniu zgodnie z poniższą tabelą, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek i dodając 10% więcej, zgodnie z tabelą 15.

Składnik MasterMix PCR po przechwyceniu	Objętość (μL)
PCR po schwytaniu MasterMix	25
Mieszanka starterów PCR po wychwyceniu	Wydanie orzeczenia 1,25
Woda wolna od nukleaz	Klasa 3,75
Całkowita objętość	Rozdział 30

Tabela 15: Mieszanka wzorcowa PCR po schwytaniu. Składniki Post-Capture PCR Master Mix należy złożyć i wymieszać na lodzie zgodnie z podanymi objętościami.

2. Dodać 30 μl Post-Capture PCR Master Mix do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość reakcji wynoszącą 50 μl. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
3. Umieść probówki PCR w termocyklerze i inkubuj zgodnie z programem #11 (Tabela uzupełniająca 2).

20. Oczyszczanie fragmentów PCR po schwytaniu

1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
2. Dodać 75 μl zawieszonych kulek do każdego wychwytu wzbogaconego PCR (50 μl). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Kulki streptawidyny nie będą przeszkadzać w oczyszczaniu kulek SPRI. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Gdy roztwór będzie klarowny, ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają DNA.
4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki znajdującej się w stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
5. Powtórz krok 20.4 raz, co daje w sumie 2 etapy prania.
6. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw probówkę na stojaku magnetycznym i wysusz na powietrzu przez 3 minuty z otwartą pokrywką lub do widocznego wyschnięcia. Nie susz koralików zbyt mocno. Może to skutkować mniejszą regeneracją DNA.
7. Wyjmij rurkę z magnesu. Eluuj DNA z kulek, dodając 22 μl 0,1x buforu TE. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny.
8. Usunąć 20 μl supernatantu i przenieść do czystej, wolnej od nukleazy probówki do PCR, uważając, aby nie naruszyć kulek. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

21. Walidacja i kwantyfikacja biblioteki

1. Zmierz stężenie przechwyconej biblioteki za pomocą fluorometru i zestawu do testów o wysokiej czułości.
2. Zmierz średnią długość fragmentu przechwyconej biblioteki za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości do elektroforezy cyfrowej i oblicz średni rozmiar fragmentu dla każdej biblioteki za pomocą oprogramowania systemowego. Średni rozmiar fragmentu powinien wynosić około 250-400 pz (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 6 i Rysunek 7). Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, ukończone biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

22. Sekwencjonowanie na platformie sekwencjonowania

1. W przypadku sekwencjonowania należy rozcieńczyć biblioteki do 2 nM i postępować zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi ładowania i obsługi sekwencera. Biblioteki sekwencji do minimalnej głębokości 15 milionów odczytów pojedynczych końcówek o długości co najmniej 50 pz.

23. Analiza danych sekwencjonowania w celu wygenerowania profili immunologicznych i odkrycia biomarkerów za pomocą portalu Prism, narzędzia informatycznego opartego na chmurze

1. Utwórz konto Prism, odwiedzając stronę https://prism.cofactorgenomics.com/
2. Po zalogowaniu kliknij Prześlij nowy projekt na górnym pasku narzędzi z dowolnej strony w Prism, aby przesłać zdemultipleksowane pliki sekwencjonowania FASTQ lub przesłać pliki przechowywane w BaseSpace za pomocą konta Prism.
3. Wypełnij formularz Nowy projekt, podając nazwę projektu i próbki według grupy lub kohorty. Grupowanie próbek i odpowiadające im nazwy grupowania są niezbędne do wygenerowania raportu z odkrycia biomarkerów. Należy pamiętać, że do wygenerowania raportu z odkrycia biomarkerów wymagane są co najmniej 3 próbki na grupę. Kliknij przycisk Uruchom aplikację, aby przesłać formularz; Jeśli się powiedzie, pojawi się strona z potwierdzeniem.
4. Po zalogowaniu kliknij Zobacz wyniki na górnym pasku narzędzi lub na dowolnej stronie Prism. Prism umożliwia użytkownikowi sprawdzenie statusu zgłoszonych projektów oraz przeglądanie raportów dotyczących próbek i biomarkerów dla każdego projektu. Pojawi się tabela projektów, które użytkownik utworzył na Prism. Tabela zawiera trzy kolumny z nazwami stanu, nazwy i daty przesłania.
   UWAGA: Status każdego projektu może być następujący:
   • "Uruchomione", gdzie aktualnie uruchomiona jest analiza projektu, lub
   • "Sukces", w którym analiza projektu jest kompletna, a raporty są dostępne.
5. Jeśli analiza projektu została zakończona (oznaczona statusem "Powodzenie"), wyświetl raporty z poszczególnych próbek i raport z odkrycia biomarkerów. Należy pamiętać, że raport z odkrycia biomarkerów będzie dostępny tylko wtedy, gdy projekt będzie zawierał wymagane minimum trzy próbki na grupę.
   1. Aby uzyskać dostęp do tych raportów, wróć do tabeli projektów i kliknij nazwę projektu. Na tej stronie projektu będzie znajdować się tabela z wierszem dla każdej próbki w projekcie. Kliknij łącze w każdym wierszu w kolumnie Raport, aby uzyskać dostęp do indywidualnego raportu dla każdej próbki. Bezpośrednio pod tabelą kliknij link do raportu z odkrycia biomarkerów. Jeśli na tej stronie nie ma żadnych linków, oznacza to, że analiza projektu nie została zakończona.

Wyniki

W całym protokole istnieje wiele punktów kontrolnych, które umożliwiają użytkownikowi ocenę jakości i ilości generowanych materiałów. Po kroku 12 opisanym w protokole generowany jest elektroferogram, jak pokazano na rysunku Rysunek 3, reprezentatywny dla typowej biblioteki wstępnego wychwytywania dla nienaruszonej próbki RNA (RIN = 7,8).

Rysunek 3: Typowy ślad bioanalizatora z biblioteki wstępnego przechwytywania dla nienaruszonej próbki RNA. Biblioteki wstępnego przechwytywania pojawiają się jako szeroki szczyt o rozmiarze około 250-400 par zasad (bp). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernego wzmocnienia, na co wskazuje drugi pik około 1000 pz pokazany w Rysunek 4, reprezentatywny elektroferogram biblioteki pre-capture wygenerowanej z próbki RNA FFPE (DV₂₀₀ = 46). Jeśli ten pik jest mały w stosunku do głównego piku (około 250-400 par zasad (bp), jak pokazano), nie będzie przeszkadzał w dalszych krokach lub analizie. Jeśli drugi pik jest duży w stosunku do piku 250-400 pz, bibliotekę wstępnego przechwytywania można przetworzyć przy mniejszej liczbie cykli PCR, aby zmniejszyć nadmierne wzmocnienie.

Rysunek 4: Typowy ślad bioanalizatora biblioteki Pre-capture dla próbki RNA FFPE. Drugi szczyt w okolicach 1000 pz wskazuje na nadmierne wzmocnienie. Jeśli ten pik jest mały w stosunku do głównego piku około 250-400 pz (jak pokazano), nie będzie kolidował z dalszymi krokami lub analizą. Jeśli drugi pik jest duży w stosunku do piku 250-400 pz, bibliotekę wstępnego wychwytywania można przetworzyć przy mniejszej liczbie cykli PCR w celu zmniejszenia nadmiernego wzmocnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jak opisano w kroku 12.1.3, obecność dimerów adaptera powinna zostać oceniona w celu określenia, czy konieczne jest dodatkowe czyszczenie. Elektroferogramy pokazane na Rysunek 5 reprezentują niedopuszczalne (Rysunek 5A, DV₂₀₀ = 33) i akceptowalne (Rysunek 5B, DV₂₀₀ = 46) poziomy adaptera, pojawiający się jako ostry szczyt około 128 pz.

Rysunek 5: Ślady bioanalizatora w bibliotece wstępnego przechwytywania. Dimer adaptera pojawia się jako ostry pik około 128 pz. (A) Nadmierne dimery adaptera są obecne w tym elektroferomimie. (B) Dopuszczalne poziomy dimerów adaptera są przedstawione w tym śladzie. Oba ślady wskazują na łagodne nadmierne amplifikacje, ale nie powinno to zakłócać testu ImmunoPrism. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po zakończeniu protokołu, przed sekwencjonowaniem, końcowe biblioteki są ponownie oceniane za pomocą elektroforezy cyfrowej. Biblioteki wykonane z RNA FFPE mają zwykle mniejszy średni rozkład rozmiaru niż biblioteki wykonane z nienaruszonego RNA. W przypadku nienaruszonych próbek RNA wynikowy ślad powinien wyglądać podobnie do Rysunek 6 (RIN = 9,5). W przypadku zdegradowanego RNA lub FFPE wynikowy ślad powinien wyglądać podobnie do Rysunek 7 (DV₂₀₀ = 36).

Rysunek 6: Typowy ślad bioanalizatora z biblioteki końcowej dla nienaruszonej próbki RNA. Końcowe biblioteki pojawiają się jako szeroki szczyt o rozmiarze około 250-400 par zasad (bp). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Typowy ślad bioanalizatora z biblioteki końcowej dla próbki RNA FFPE. Biblioteki wykonane z RNA FFPE mają zwykle mniejszy średni rozkład rozmiaru niż biblioteki wykonane z nienaruszonego RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jak opisano, wyniki wygenerowane za pomocą tego protokołu mogą być zastosowane na dwa kluczowe sposoby, jak pokazano w Rysunek 8.

Rysunek 8: Dwa przypadki użycia protokołu. Wyniki uzyskane za pomocą tego testu profilowania immunologicznego są stosowane w dwóch kluczowych zastosowaniach translacyjnych. (A) Pierwszy przypadek użycia rozpoczyna się od ludzkiej tkanki guza litego (w tym archiwów FFPE) i generuje indywidualny profil immunologiczny próbki. (B) Po wygenerowaniu dla kohorty próbek ludzkich, dane są łączone za pomocą portalu Prism w celu wygenerowania wielowymiarowego biomarkera i odpowiadającego mu raportu o biomarkerach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zademonstrować każdy z tych przypadków użycia, dołączono reprezentatywne dane z małego badania translacyjnego²¹. Próbki użyte w tym badaniu to zestaw próbek od 7 pacjentów zdiagnozowanych i leczonych z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Próbki są dopasowaną do pacjenta tkanką guza litego z biopsji przed i po zabiegu. Najpierw poszczególne próbki zostały przeanalizowane w celu wygenerowania profilu immunologicznego, takiego jak przykładowy raport pokazany na Rysunek 9.

Rycina 9: Przykładowy indywidualny raport immunologiczny dla próbki niedrobnokomórkowego raka płuca. Potok Prism Portal generuje raport graficzny dla każdej przetwarzanej próbki, z reprezentatywnym raportem wygenerowanym dla próbki guza litego NSCLC pokazanej tutaj. (A) Pierwsza strona raportu przedstawia graficznie rozkład komórek odpornościowych obecnych w próbce RNA wyekstrahowanej z tkanki FFPE. (B) Odwrotna strona raportu zawiera tabelę komórek odpornościowych (w procentach bezwzględnych) i ekspresję genów ucieczki (w transkryptach na milion lub TPM), a także zestawienie wyników testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Profile immunologiczne przed i po leczeniu mogą być wykorzystane do zrozumienia, w jaki sposób terapia (chemioterapia lub radioterapia, w tym badaniu) zmieniła mikrośrodowisko guza. Przykład jest pokazany w Rysunek 10, gdzie zmiany procentowe dla każdej komórki odpornościowej i całkowita zawartość immunologiczna są pokazane przed i po chemioterapii, dla jednego pacjenta.

Rycina 10: Przykładowe wyniki przed i po zabiegu. Przedstawiono dane dotyczące poszczególnych komórek odpornościowych i całkowitej zawartości układu odpornościowego wygenerowane z próbek pobranych przed i po leczeniu od jednego pacjenta z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. W tym przykładzie pacjent otrzymał schemat chemioterapii jako leczenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pacjenci mogą być grupowani według kryteriów, takich jak wyniki kliniczne lub fenotypy dla porównania. Na przykład w Rysunek 11, próbki w badaniu NSCLC zostały porównane według czasu do progresji choroby po leczeniu. W podgrupie pacjentów wystąpił nawrót choroby w ciągu >18 miesięcy, a w innej podgrupie postępował szybciej w ciągu ≤18 miesięcy. Mediana wartości delta (różnica między wartościami przed i po leczeniu) jest porównywana dla każdej próbki w celu zidentyfikowania przypuszczalnych biomarkerów progresji choroby.

Rycina 11: Przykładowe porównanie wyników klinicznych. Ilościowe zmiany między procentową zawartością komórek odpornościowych w dopasowanych próbkach NSCLC przed i po leczeniu obliczono i podano jako wartość "delta". Te zaznaczone na żółto pokazują wyraźne zmiany sygnału między statusem przeżycia. Niebieskie słupki reprezentują medianę wartości delta dla >18 miesięcy do progresji choroby, pomarańczowe słupki reprezentują medianę wartości delta dla ≤18 miesięcy do progresji choroby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, podobne grupowanie próbek może być wykorzystane do przyjrzenia się próbkom przed leczeniem w celu identyfikacji biomarkerów predykcyjnych za pomocą Portalu Prism do wygenerowania raportu o biomarkerach. Pokazany na Rysunek 12, ten sam fenotyp kliniczny (progresja choroby), jak opisano powyżej, definiuje grupy próbek. W tym przykładzie dwa geny ucieczki immunologicznej zostały zidentyfikowane jako statystycznie istotne różnicowniki grup próbek (CD47 i OX40, pokazane w dolnym panelu Figura 12A). W tym przykładzie, ponieważ poszczególne biomarkery genów są solidne i mają wyraźną istotność statystyczną, wielowymiarowy biomarker nie dodaje znaczącej wartości predykcyjnej (ImmunoPrism, jak oznaczono na wykresie słupkowym w prawym górnym rogu Rysunek 12B). Pełna tabela danych, w tym wyniki dla wszystkich 18 analitów do testu, jest podsumowana na odwrocie raportu, w tym analiza statystyczna i krótkie podsumowanie metod.

Rycina 12: Przykładowy raport dotyczący biomarkerów dla próbek niedrobnokomórkowego raka płuca. Pipeline Biomarker Discovery dostarcza wizualny raport z poszczególnych biomarkerów oraz wielowymiarowy biomarker uczenia maszynowego ze szczegółowymi statystykami. (A) Na potrzeby tego badania zidentyfikowano dwa indywidualne biomarkery (CD47 i OX40) jako statystycznie istotne dla zdefiniowania progresji choroby z progiem 18 miesięcy. (B) Szczegółowe informacje na temat metody i pełne wyniki znajdują się na odwrocie sprawozdania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Materiały z zestawu odczynników. Znajduje się tam lista materiałów zawartych w zestawie ImmunoPrism Kit wraz z numerami części, do których odwołuje się protokół producenta. Wszystkie inne wymagane urządzenia i materiały są wymienione w Tabeli Materiałów. Odwiedź stronę https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/ dla kart charakterystyki (SDS). Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 2: Programy termocyklerów. Zalecane programy cyklerów, do których odwołuje się cały protokół, są podsumowane w celu ułatwienia programowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 3: Przewodnik po indeksie sekwencjonowania. Startery indeksowe znajdujące się w zestawie odczynników są wymienione; Do każdej reakcji dodawany jest unikalny starter w celu demultipleksowania po sekwencjonowaniu. Dostępne są również zalecane kombinacje multipleksowania niskiego poziomu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Protokół wymaga 20 ng nienaruszonego lub 40 ng wysoce zdegradowanego (FFPE) RNA. Próbka RNA powinna być wolna od DNA, soli (np. Mg²⁺ lub soli guanidyny), dwuwartościowych czynników chelatujących kationy (np. EDTA, EGTA, cytrynian) lub substancji organicznych (np. fenolu i etanolu). Nie zaleca się postępowania z próbkami RNA, które mają DV₂₀₀ <20%. Zdecydowanie zaleca się stosowanie wbudowanego kontrolnego RNA, ponieważ te kontrole zapewniają środki do oceny wydajności w całym protokole, od przygotowania biblioteki po analizę.

Protokół przeznaczony jest do wykonania przy użyciu 0,2 ml probówek paskowych do PCR. Jeśli jest to preferowane, protokół można również wykonać przy użyciu dołków w 96-dołkowej płytce PCR. Po prostu użyj dołków 96-dołkowej płytki PCR zamiast wszystkich odniesień do probówek do PCR lub probówek paskowych. Używaj płytek PCR tylko z przezroczystymi dołkami, ponieważ bardzo ważne jest wizualne potwierdzenie całkowitego ponownego zawieszenia kulek podczas oczyszczania kulek i etapów mycia.

Przez cały czas trwania protokołu odczynniki należy przechowywać w stanie zamrożonym lub na lodzie, chyba że określono inaczej. Nie używaj odczynników, dopóki nie zostaną całkowicie rozmrożone. Pamiętaj, aby dokładnie wymieszać wszystkie odczynniki przed użyciem.

Enzymy należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia i natychmiast po użyciu powrócić do temperatury -20 °C. Używaj tylko wody wolnej od nukleaz molekularnych; nie zaleca się używania wody uzdatnionej przez DEPC. Podczas pipetowania w celu wymieszania należy delikatnie zassać i dozować co najmniej 50% całkowitej objętości, aż roztwory dobrze się wymieszają. Odpipetować wszystkie mieszanki wzorcowe zawierające enzymy. Użycie wiru do mieszania enzymów może prowadzić do denaturacji i pogorszyć ich wydajność. Podczas oczyszczania kulek używaj świeżo przygotowanych 80% roztworów etanolu z etanolu molekularnego. Stosowanie roztworów etanolu, które nie są świeże, może skutkować niższymi plonami. Unikaj nadmiernego suszenia kulek, ponieważ może to zmniejszyć wydajność elucji (kulki wyglądają na popękane, jeśli są nadmiernie wysuszone).

Jak opisano w kroku 10, do każdej reakcji dodawane są unikalne startery indeksowe. Opierając się na sekwencjach tych wskaźników, dla multipleksowania niskopoziomowego, pewne kombinacje indeksów są optymalne. Sekwencje tych wskaźników są wymagane do demultipleksacji danych po sekwencjonowaniu. Sekwencje i zalecane kombinacje multipleksowania podano w tabeli uzupełniającej 3. Na tym samym etapie należy zauważyć, że liczba zalecanych cykli PCR różni się w zależności od jakości użytego RNA i może być wymagana pewna optymalizacja, aby zapobiec nadmiernej amplifikacji PCR. W przypadku ImmunoPrism Intact Control RNA i innych wysokiej jakości RNA rozpocznij optymalizację od 10 cykli PCR. W przypadku RNA kontrolnego ImmunoPrism FFPE i innych wysoce zdegradowanych/FFPE RNA rozpocznij optymalizację od 15 cykli PCR. Zaleca się stworzenie biblioteki testowej przy użyciu RNA reprezentatywnego dla analizowanego materiału w celu optymalizacji cykli PCR. Należy zastosować minimalną liczbę cykli PCR, które konsekwentnie zapewniają wystarczającą wydajność biblioteki wstępnego wychwytywania (>200 ng). Wtórny pik około 1000 pz na śladzie bioanalizatora wskazuje na nadmierną amplifikację (ryc. 4). Nadmierne wzmocnienie powinno być zminimalizowane, ale obecność małego piku wtórnego nie będzie kolidować z wynikami testu.

Aby zminimalizować utratę próbki i uniknąć wymiany probówek, Krok 13 można wykonać w probówkach PCR, probówkach paskowych lub 96-dołkowej płytce PCR zamiast mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, jeśli pozwala na to koncentrator próżniowy. Wirnik można zdemontować w wielu koncentratorach. Dzięki temu rurki lub płyty paskowe mogą paskować się w próżni. Zatężanie próżni można następnie uruchomić przy użyciu ustawienia suszenia wodnego bez wirowania. Zapoznaj się z instrukcją obsługi koncentratora próżniowego, aby uzyskać instrukcje. Jeśli próbki są suszone w probówkach paskowych lub na płytce 96-dołkowej, etap hybrydyzacji można przeprowadzić w tym samym naczyniu.

Podczas kroku 17 pamiętaj, aby wirować co 10-12 minut, aby zwiększyć skuteczność wychwytywania koralików. Podczas mieszania ostrożnie trzymaj nakrętki tubek z ciepłymi paskami, aby zapobiec otwieraniu się probówek.

Mycie opisane w kroku 18 ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia wysokiego zanieczyszczenia niespecyficznego i należy ich ściśle przestrzegać. Należy pamiętać o całkowitym ponownym zawieszeniu kulek przy każdym myciu, całkowicie usunąć do mycia, a podczas mycia Wash Buffer 2 przenieść próbki do świeżej probówki paskowej (krok 18.6.5). Upewnij się, że kulki streptawidyny są całkowicie ponownie zawieszone i pozostają w zawiesinie przez cały czas inkubacji. Rozpryskiwanie się nasadek tubusu nie wpłynie negatywnie na chwytanie. Podczas mycia w temperaturze pokojowej można użyć mieszalnika wirowego z mikropłytkami do wirowania próbek przez cały dwuminutowy okres inkubacji w celu łatwiejszego ponownego zawieszenia. Nie pozwól, aby kulki streptawidyny wyschły. W razie potrzeby przedłuż inkubacje w, aby uniknąć wysuszenia kulek. Jeśli używasz więcej niż jednej tubki paskowej, pracuj z jedną tubką paskową na raz przy każdym praniu, podczas gdy pozostałe tubki paskowe znajdują się w termocyklerze. Może to pomóc uniknąć nadmiernego wysuszenia kulek lub pośpiechu, co skutkuje słabym ponownym zawieszeniem lub innymi nieoptymalnymi technikami. Dla początkujących użytkowników nie zaleca się przetwarzania więcej niż 8 reakcji biblioteki jednocześnie.

Obecne techniki profilowania immunologicznego dostarczają kontinuum informacji - od tysięcy punktów danych, które wymagają znaczącej interpretacji (sekwencjonowanie RNA) do pojedynczego, dyskretnego punktu danych (IHC single-plex). Opisany tutaj protokół reprezentuje podejście, które znajduje się gdzieś pośrodku, z ukierunkowanym zakresem umożliwiającym wysoką czułość, ale przechwytującym tylko podzbiór klinicznie istotnych danych transkryptomicznych. Ze względu na charakter masowej ekstrakcji RNA, protokół ten nie dostarcza informacji na temat relacji przestrzennych między komórkami odpornościowymi a mikrośrodowiskiem guza, jednak wyniki mogą być uzupełnione technologiami obrazowania w celu dodania tych informacji. Istnieje niezliczona ilość zastosowań danych generowanych przez ten protokół, ponieważ jest wiele do nauczenia się o biologii raka jako choroby i terapiach opracowywanych w celu jego leczenia. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, indywidualny raport immunologiczny jest przydatny do zrozumienia, w jaki sposób profil immunologiczny pacjenta może się zmienić w odpowiedzi na zdarzenia, takie jak progresja choroby lub leczenie. Podczas gdy przedstawione tutaj wyniki dostarczają kilku przykładowych przypadków użycia, inne zastosowania, takie jak badanie mechanizmu działania terapii i identyfikacja przypuszczalnych biomarkerów wyników klinicznych, takich jak wolne od progresji i całkowite przeżycie, są również praktyczne. Podczas korzystania z tego protokołu do zastosowań związanych z odkrywaniem biomarkerów ważne jest, aby dobrze zaprojektować badanie, aby zapewnić analizę jednorodnych populacji, uwzględnienie wystarczającej liczby próbek dla mocy statystycznej i uwzględnienie źródeł błędu systematycznego. Ze względu na skoncentrowany, uproszczony charakter testu, możliwe jest wyobrażenie sobie drogi do walidacji klinicznej i dalszego zastosowania tych biomarkerów po ich odkryciu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 ml PCR 8 probówek	USA Scientific	1402-2700	USA Scientific 0,2 ml PCR 8-tubowy pasek
200 Proof Ethanol	MilliporeSigma	EX0276-1	Przygotuj 80% przez zmieszanie z wodą wolną od nukleaz w dniu eksperymentu
96-dołkowe termocyklery	BioRad	1861096
Koraliki do odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI)	Beckman-Coulter	A63882	Agencourt AMPure XP – Koraliki oczyszczające PCR
Cyfrowe chipy i zestaw do elektroforezy	Agilent Technologies	5067-4626	Chipy i zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości
Cyfrowy system elektroforezy	Agilent Technologies	G2939AA	Bioanalizator elektroforezy Agilent 2100
Koraliki streptawidyny	ThermoFisher Scientific	65306	Dynabeads M-270 Streptawidin
ImmunoPrism Kit & ndash; 24 reakcje	Cofactor Genomics	CFGK-302	Cofactor ImmunoPrism Zestaw do profilowania immunologicznego – 24 reakcje
Ludzki Cot-1 DNA	ThermoFisher Scientific	15279011	Marka Invitrogen
Magnetyczny stojak separacyjny	Alpaqua/Invitrogen	A001322/12331D	96-dołkowy magnetyczny stojak na pierścień
	Eppendorf	22620701
Probówki do mikrowirówek	USA Scientific	1415-2600	USA Scientific 1,5 ml probówka do mikrowirówek o niskiej przyczepności
NastępnySeq550	Illumina	SY-415-1002	Do tego protokołu można użyć dowolnego sekwenatora Illumina
Woda wolna od nukleaz	ThermoFisher Scientific	AM9937
Zestaw do ekstrakcji pryzmatu	Cofactor Genomics	CFGK-401	Zestaw do ekstrakcji pryzmatu kofaktora FFPE i ndash; 24 próbki
Oczyszczone RNA	-		oczyszczone z próbek tkanek ludzkich
Fluorometr	ThermoFisher Scientific	Q33226	System Qubit 4
Probówki do testów fluorometrycznych	Axygen	PCR-05-C	0,5 ml cienkościenne probówki do PCR z płaskimi nasadkami
Zestaw odczynników fluorometrycznych o wysokiej czułości	Life Technologies	Q32854	Zestaw
do oznaczania kubitów dsDNA HSKoncentrator próżniowy	Eppendorf	22820001	VacufugePlus
Mieszarka wirowa	VWR	10153-838
Łaźnia wodna lub blok grzewczy	VWR/USA Scientific	NA/2510-1102	Łaźnia wodna VWR/USA Naukowy blok grzewczy