Artykuł metodologiczny

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60645

⸱

25 lutego 2020

 ,  , 
1Cofactor Genomics

W tym artykule

Podsumowanie

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Streszczenie

Immunoterapie są obiecujące w leczeniu pacjentów onkologicznych, ale złożona heterogeniczność mikrośrodowiska guza sprawia, że przewidywanie odpowiedzi na leczenie jest trudne. Wykazano, że zdolność do rozpoznawania względnych populacji komórek odpornościowych obecnych w tkance nowotworowej i wokół niej jest klinicznie istotna dla zrozumienia odpowiedzi, ale jest ograniczona przez tradycyjne techniki, takie jak cytometria przepływowa i immunohistochemia (IHC), ze względu na dużą wymaganą ilość tkanki, brak dokładnych markerów typu komórki oraz wiele przeszkód technicznych i logistycznych. Jeden test (np. Test profilowania immunologicznego ImmunoPrism) pokonuje te wyzwania, uwzględniając zarówno niewielkie ilości RNA, jak i wysoce zdegradowane RNA, wspólne cechy RNA wyekstrahowanego z klinicznie zarchiwizowanej tkanki guza stałego. Dostęp do testu jest możliwy za pośrednictwem zestawu odczynników i informatyki opartej na chmurze, która zapewnia kompleksowe, ilościowe, wysokoprzepustowe rozwiązanie do profilowania immunologicznego dla platform sekwencjonowania Illumina. Naukowcy zaczynają od zaledwie dwóch odcinków tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie lub 20-40 ng całkowitego RNA (w zależności od jakości próbki), a protokół generuje raport profilu immunologicznego określający ilościowo osiem typów komórek odpornościowych i dziesięć genów ucieczki immunologicznej, uzyskując pełny obraz mikrośrodowiska guza. Do wykorzystania uzyskanych danych nie jest wymagana dodatkowa analiza bioinformatyczna. Przy odpowiednich kohortach prób protokół może być również wykorzystany do identyfikacji statystycznie istotnych biomarkerów w populacji pacjentów będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Ilościowe oznaczanie limfocytów naciekających guz (TILs) oraz innych cząsteczek związanych z układem odpornościowym w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) próbkach tkanek guzów litych człowieka wykazało znaczną wartość w badaniach klinicznych1,2,3. Powszechne techniki, takie jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie kwasu rybonukleinowego (RNA) pojedynczych komórek, są użyteczne w przypadku świeżych tkanek i krwi4, lecz nie nadają się do analizy materiałów FFPE ze względu na brak możliwości przygotowania żywych zawiesin komórkowych. Obecne metody stosowane do ilościowego oznaczania tych komórek w tkankach FFPE wiążą się z istotnymi trudnościami. Immunohistochemia (IHC) i inne podobne procedury obrazowania wymagają specyficznych przeciwciał do wykrywania białek powierzchniowych komórek, co może być trudne do standaryzacji między laboratoriami w celu zapewnienia powtarzalności wyników ilościowych5. Platformy takie jak system nCounter opierają się na ekspresji pojedynczych genów w celu zdefiniowania kluczowych komórek odpornościowych6, co ogranicza czułość i swoistość detekcji. Dostępne są bardziej ogólne metody sekwencjonowania RNA w połączeniu z autonomicznymi narzędziami programowymi, jednak wymagają one znacznej optymalizacji i walidacji przed zastosowaniem7,8,9,10,11,12. Niedawne postępy w łączeniu laserowej mikrodysekcji (LCM) z sekwencjonowaniem RNA dla tkanek FFPE są obiecujące, jednak do badań translacyjnych mających na celu identyfikację wiarygodnych biomarkerów wymagane jest rozwiązanie o większej przepustowości typu „turnkey”13,14. Metody generowania wielowymiarowych biomarkerów, takie jak modelowanie odporności predykcyjnej (Predictive Immune Modeling), które definiują kohorty pacjentów, w tym osoby odpowiadające na terapię, podtypy nowotworów lub wyniki przeżywalności z wysoką dokładnością predykcyjną i istotnością statystyczną, stają się coraz ważniejsze w erze medycyny precyzyjnej i immunoterapii15,16.

Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano test profilowania immunologicznego umożliwiający czułe i specyficzne ilościowe oznaczenie komórek odpornościowych w tkance guza litego utrwalonej w FFPE, przy użyciu zestandaryzowanych odczynników do sekwencjonowania RNA i informatyki w chmurze. Oprócz możliwości analizy zdegradowanego RNA z tkanki FFPE, protokół pozwala na analizę RNA pochodzącego z ograniczonych próbek tkankowych, takich jak biopsje gruboigłowe, aspiraty igłowe oraz tkanki mikro- lub makro-wycięte. Dane RNA z każdej próbki są porównywane z bazą danych modeli ekspresji genów komórek odpornościowych, nazwanych immune Health Expression Models, w celu ilościowego oznaczenia komórek odpornościowych jako procentu całkowitej liczby komórek obecnych w próbce. W skrócie, modele te zostały zbudowane przy użyciu metod uczenia maszynowego w celu identyfikacji unikalnych wielogenowych wzorców ekspresji z danych całego transkryptomu, generowanych z oczyszczonych populacji komórek odpornościowych (izolowanych przy użyciu kanonicznych markerów powierzchniowych komórek)17,18. Wielowymiarowe modele Health Expression Models leżące u podstaw tej technologii pozwalają testowi na ilościowe oznaczenie każdej komórki odpornościowej jako procentu całkowitej liczby komórek obecnych w heterogenicznej mieszaninie. Umożliwia to badaczowi generowanie porównań komórek odpornościowych między próbkami oraz w obrębie jednej próbki, co wykazuje wartość kliniczną19,20. Inne zastosowania obejmują ilościowe oznaczenie odpowiedzi immunologicznej przed i po leczeniu, jak opisano w reprezentatywnych wynikach. Test dostarcza informacji o wielu cechach kontekstu immunologicznego guza i mikrośrodowiska guza, w tym o wartościach procentowych ośmiu typów komórek odpornościowych (pochodzących z modeli ekspresji genów): limfocytów T CD4+, limfocytów T CD8+, komórek Natural Killer CD56+, limfocytów B CD19+, monocytów CD14+, Tregs, makrofagów M1 oraz makrofagów M2. Ponadto test określa poziom ekspresji (w transkryptach na milion, czyli TPM) dziesięciu genów ucieczki immunologicznej: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 oraz ARG1.

Zestaw odczynników służy do przygotowania wysokiej jakości bibliotek gotowych do sekwencjonowania na platformie Illumina przy użyciu metody przygotowania bibliotek opartej na hybrydyzacyjnym wychwytywaniu, jak pokazano na Rysunku 1. Jeśli badacz nie posiada w swoim laboratorium platformy sekwencjonowania Illumina, może przekazać próbki do sekwencjonowania do laboratorium centralnego. Po wygenerowaniu dane z sekwencjonowania są przesyłane do portalu Prism Portal w celu zautomatyzowanej analizy, a użytkownik otrzymuje kompleksowy, ilościowy profil dla każdej pojedynczej próbki w formie Raportu Immunologicznego (Immune Report) (Rysunek 2A). Użytkownicy mogą również definiować grupowanie próbek w Prism Portal w celu wygenerowania Raportu Biomarkerów (Biomarker Report) (Rysunek 2B), który wyróżnia statystycznie istotne biomarkery różnicujące dwie kohorty pacjentów. Należy pamiętać, że dane generowane za pomocą zestawu odczynników są przeznaczone wyłącznie do celów badawczych i nie mogą być wykorzystywane do celów diagnostycznych.

Schemat procesu sekwencjonowania RNA; synteza cDNA, PCR, hybrydyzacja; diagram przepływu procesu.
Rysunek 1: Przegląd schematu postępowania. W tym protokole RNA jest najpierw konwertowane do cDNA. Następnie ligowane są adaptory do sekwencjonowania, a cDNA z ligowanymi adaptorami jest amplifikowane i znakowane kodami kreskowymi (barcoding) za pomocą PCR w celu utworzenia biblioteki przed wychwytywaniem. Następnie biotynilowane sondy są hybrydyzowane ze specyficznymi celami cDNA, które są następnie wychwytywane za pomocą kulek z streptawidyną. Niewiązane, nietarczowe cDNA są usuwane poprzez przemywanie. Końcowe wzbogacenie metodą PCR daje bibliotekę po wychwytywaniu, gotową do sekwencjonowania. *Całkowite RNA musi pochodzić z próbek ludzkich; może być RNA nienaruszone lub zdegradowane (FFPE). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Profilowanie ImmunoPrism, wykres typów komórek odpornościowych, wykres dokładności predykcyjnej, analiza biomarkerów.
Rysunek 2: Reprezentatywne raporty immunologiczne. Przepływ pracy generuje dwa raporty: indywidualny raport immunologiczny (A) dla każdej przetworzonej próbki oraz raport biomarkerów (B) dla zdefiniowanych kohort pacjentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół wymaga około 16 h czasu przygotowania (od całkowitego RNA do bibliotek gotowych do sekwencjonowania); istnieją jednak liczne opcjonalne punkty przerwania pracy, o czym wspomniano w protokole. Metoda ta wykorzystuje bogatą i dynamiczną naturę transkryptomiki, aby przejść od tradycyjnych biomarkerów opartych na pojedynczym analitycie do wielowymiarowych modeli ekspresji genów, co umożliwia kompleksową charakterystykę biologiczną próbek tkanek przy użyciu standaryzowanych odczynników i łatwych w obsłudze narzędzi programistycznych. Pozwala to badaczom na wykorzystanie nowoczesnej technologii we własnym laboratorium dzięki zastosowaniu uczenia maszynowego oraz bazy danych Modeli Ekspresji Zdrowia (Health Expression Models) w celu uzyskania dokładniejszych, ilościowych profili odpornościowych cennych próbek klinicznych oraz odkrycia wielowymiarowych biomarkerów RNA przy pełnej analizie statystycznej.

Protokół

Próbki tkanek ludzkich wykorzystane w Reprezentatywnych Wynikach pokazanych tutaj zostały zakupione od renomowanego podmiotu (TriStar Technology Group) i posiadają świadomą zgodę dawcy pozwalającą na prowadzenie badań akademickich i komercyjnych, a także zgodę kompetentnej komisji etycznej.

Część I: Przygotowanie biblioteki przed przechwytywaniem

1. Kwantyfikacja i kwalifikacja RNA

  1. Określ ilościowo RNA za pomocą testu fluorometrycznego w celu określenia odpowiednich danych wejściowych do testu. Oceń jakość wejściowego RNA za pomocą elektroforezy w celu określenia liczby integralności RNA (RIN) i procentu fragmentów >200 nukleotydów (DV200).
    1. W przypadku nienaruszonych (RIN > 7) lub częściowo zdegradowanych próbek RNA (RIN = 2 do 7) postępuj zgodnie z krokami przygotowania biblioteki dla wysokiej jakości/nienaruszonego RNA, zaczynając od kroku 2.1. Jakość RNA jest ważna dla wyboru prawidłowego czasu fragmentacji w programie Thermal Cycler #1 (tabela uzupełniająca 2).
    2. W przypadku próbek o wysokiej degradacji (np. RIN = 1 do 2 lub FFPE) należy określić wartość DV200. Próbki te nie wymagają fragmentacji i będą postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi zdegradowanego RNA, zaczynając od kroku 2.2.
  2. Przygotować odpowiednią ilość całkowitego RNA dla każdej próbki, rozcieńczając 20 ng RNA (wysokiej jakości/nienaruszone RNA z RIN > 2) lub 40 ng RNA (zdegradowane/FFPE RNA z DV200 > 20%) do 5 μl w wodzie wolnej od nukleaz. Nie zaleca się przetwarzania próbek za pomocą DV200 < 20%. W przypadku kontrolnych próbek RNA dostarczonych z zestawem należy rozcieńczyć 1 μl odpowiedniego RNA w 4 μl wody wolnej od nukleaz. Próbki kontrolne zostaną poddane takiemu samemu przetwarzaniu, jak opisano dla materiałów RNA wysokiej jakości (nienaruszonej) lub zdegradowanej (FFPE), zgodnie z oznaczeniem. Patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla wszystkich odczynników zawartych w zestawie.

2. Fragmentacja i gruntowanie RNA

  1. Postępuj zgodnie z krokiem 2.1.1, aby uzyskać wysokiej jakości/nienaruszone RNA z RIN > 2.
    1. Aby uzyskać wysokiej jakości RNA, złóż reakcję fragmentacji i gruntowania na lodzie w probówce PCR bez nukleazy zgodnie z tabelą 1.
      1. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie na krótko odwirować próbki w mikrowirówce
        UWAGA: Dla wszystkich wirowań wirówki w protokole zalecana jest prędkość ≥ 1,000 x g przez co najmniej 3 s.
      2. Umieść próbki w termocyklerze i użyj programu #1 (Tabela uzupełniająca 2).
      3. Natychmiast przenieś probówki do lodu i przystąp do syntezy pierwszej nici cDNA w celu uzyskania wysokiej jakości RNA (krok 3.1). W celu jednoczesnego przygotowania zarówno RNA wysokiej jakości, jak i FFPE, należy rozpocząć przygotowanie RNA FFPE (krok 2.2) podczas inkubacji fragmentacji.
Mieszanka do rozdrobnienia i gruntowaniaObjętość (μL)
Nienaruszony lub częściowo zdegradowany RNA (20 ng)5
Bufor reakcyjny do syntezy pierwszej nici4
Losowe podkłady1
Całkowita objętość10

Tabela 1: Reakcja fragmentacji i przygotowania dla wysokiej jakości RNA. Składniki reakcji fragmentacji i przygotowania do uzyskania wysokiej jakości RNA powinny być złożone i wymieszane na lodzie zgodnie z pokazanymi objętościami. Można przygotować i dodać do próbek RNA główną mieszankę buforu reakcyjnego do syntezy pierwszej nici i starterów losowych.

  1. Postępuj zgodnie z krokiem 2.2.1 dla zdegradowanego/FFPE RNA z DV200 > 20%.
    1. W przypadku wysoce zdegradowanego RNA (FFPE), które nie wymaga fragmentacji, należy przeprowadzić reakcję kondycjonowania zgodnie z opisem w tabeli 2. W przypadku nienaruszonego RNA należy pamiętać o wykonaniu kroku 2.1.
      1. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Następnie krótko odwirować próbki w mikrowirówce.
      2. Umieść próbki w termocyklerze i użyj programu #2 (Tabela uzupełniająca 2).
      3. Przenieś probówki do lodu i przystąp do syntezy pierwszej nici cDNA dla wysoce zdegradowanego (FFPE) RNA (krok 3.2).
Reakcja na gruntowanieObjętość (μL)
FFPE RNA (40 ng)5
Losowe podkłady1
Całkowita objętość6

Tabela 2: Losowa reakcja primingu dla wysoce zdegradowanego RNA. Składniki reakcji pobudzania dla wysoce zdegradowanego RNA powinny być złożone na lodzie w probówce PCR bez nukleaz.

3. Synteza pierwszej nici cDNA

  1. Postępuj zgodnie z krokiem 3.1.1, aby uzyskać wysokiej jakości/nienaruszone RNA z RIN > 2.
    1. Aby uzyskać nienaruszone RNA (wysokiej jakości), złóż reakcję syntezy pierwszej nici na lodzie w probówce PCR bez nukleaz zgodnie z tabelą 3.
      1. Utrzymując reakcje na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować próbki w mikrowirówce i przejść bezpośrednio do inkubacji syntezy pierwszej nici (etap 4).
Synteza pierwszej niciObjętość (μL)
Rozdrobnione i zapoczątkowane RNA (krok 2.1.3)10
Odczynnik do syntezy pierwszej nici8
Mieszanka enzymów do syntezy pierwszej nicicyfra arabska
Całkowita objętość20

Tabela 3: Reakcja syntezy pierwszej nici dla wysokiej jakości RNA. Składniki reakcji fragmentacji i przygotowania do uzyskania wysokiej jakości RNA powinny być łączone i mieszane na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Można przygotować główną mieszankę odczynnika do syntezy pierwszej nici i mieszanki enzymów do syntezy pierwszej nici i dodać ją do rozdrobnionych i zagruntowanych próbek RNA.

  1. Postępuj zgodnie z krokiem 3.2.1 dla zdegradowanego/FFPE RNA z DV200 > 20%.
    1. W przypadku wysoce zdegradowanego RNA (FFPE) należy przeprowadzić reakcję syntezy pierwszej nici na lodzie w probówce PCR bez nukleaz zgodnie z tabelą 4.
      1. Utrzymując reakcje na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować próbki w mikrowirówce i przejść bezpośrednio do inkubacji syntezy pierwszej nici (etap 4).
Synteza pierwszej niciObjętość (μL)
Zapoczątkowany RNA (krok 2.2.3)6
Bufor reakcyjny do syntezy pierwszej nici4
Odczynnik do swoistości dla pierwszej nici8
Mieszanka enzymów do syntezy pierwszej nicicyfra arabska
Całkowita objętość20

Tabela 4: Reakcja syntezy pierwszej nici dla wysoce zdegradowanego RNA. Składniki reakcji fragmentacji i pobudzania dla wysoce zdegradowanego RNA powinny być składane i mieszane na lodzie zgodnie z pokazanymi objętościami. Można przygotować i dodać do przygotowanych próbek RNA główną mieszankę buforu reakcyjnego do syntezy pierwszej nici, odczynnika specyficzności syntezy pierwszej nici i mieszanki enzymów syntezy pierwszej nici.

4. Inkubacja syntezy pierwszej nici

  1. Trzymając probówki na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować próbki w mikrowirówce. Inkubować próbki w podgrzanym termocyklerze zgodnie z programem #3 (Tabela uzupełniająca 2).

5. Synteza drugiej nici cDNA

  1. Przygotować reakcję syntezy drugiej nici cDNA na lodzie, łącząc składniki wymienione w tabeli 5, w tym produkt reakcji pierwszej nici z kroku 4.1.
Reakcja syntezy drugiej niciObjętość (μL)
Produkt syntezy pierwszej nici (etap 4.1)20
Bufor reakcyjny do syntezy drugiej nici8
Mieszanka enzymów do syntezy drugiej nici4
Woda wolna od nukleazRozdział 48
Całkowita objętośćRozdział 80

Tabela 5: Reakcja syntezy drugiej nici. Składniki reakcji syntezy drugiej nici cDNA należy złożyć i wymieszać na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Główną mieszankę buforu reakcyjnego syntezy drugiej nici, mieszanki enzymów syntezy drugiej nici i wody wolnej od nukleaz można przygotować i dodać do produktu syntezy pierwszej nici.

  1. Trzymając probówki na lodzie, dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubować w termocyklerze zgodnie z programem #4 (Tabela uzupełniająca 2).

6. Oczyszczanie cDNA za pomocą koralików SPRI (odwracalna immobilizacja w fazie stałej)

  1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
  2. Dodać 144 μl zawieszonych kulek do reakcji syntezy drugiej nici (~80 μL). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Gdy roztwór będzie klarowny, ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają DNA.
  4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówek znajdujących się na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  5. Powtórz krok 6.4 raz, co daje w sumie 2 etapy prania.
  6. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw rurki na stojaku magnetycznym i susz koraliki na powietrzu przez około 3 minuty przy otwartej pokrywie lub do widocznego wyschnięcia. Nie należy przesuszać koralików, ponieważ może to spowodować mniejszy odzysk DNA.
  7. Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 53 μl 0,1x bufor TE (dołączony do zestawu odczynników, patrz tabela uzupełniająca 1) do kulek. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  8. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Przenieść 50 μl supernatantu do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, próbki cDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

7. Zakończ naprawę biblioteki cDNA

  1. Końcową reakcję naprawy należy zmontować na lodzie, łącząc składniki wymienione w tabeli 6 z produktem syntezy drugiej nici z kroku 6.8.
Rozdział Rozdział
Zakończ reakcję naprawyObjętość (μL)
Produkt syntezy drugiej nici (etap 6.8)50
Koniec bufora reakcyjnego naprawy7
Zakończ naprawczą mieszankę enzymów3
Całkowita objętość60

Tabela 6: Reakcja na naprawę końcową. Składniki końcowej reakcji naprawy należy zmontować i wymieszać na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Można przygotować główną mieszankę buforu reakcyjnego naprawy końcowej i mieszanki enzymów naprawy końcowej i dodać ją do produktu syntezy drugiej nici.

  1. Ustaw pipetę na 50 μl, a następnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Krótko odwirować, aby zebrać cały płyn z boków probówek. Ważne jest, aby dobrze wymieszać. Obecność niewielkiej ilości pęcherzyków nie będzie przeszkadzać w wydajności.
  2. Inkubować próbki w termocyklerze zgodnie z programem #5 (Tabela uzupełniająca 2).

8. Podwiązanie adaptera

  1. Przed rozpoczęciem reakcji ligacji należy rozcieńczyć adaptor w lodowatym buforze do rozcieńczania adaptora, jak pokazano w tabeli 7, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek plus 10% więcej. Rozcieńczony łącznik należy przechowywać na lodzie.
Rozcieńczenie ligacjiObjętość (μL)
Adapter0,5
Bufor rozcieńczający adaptercyfra arabska
Całkowita objętośćRozdział 2.5

Tabela 7: Rozcieńczenie adaptora. Łącznik należy rozcieńczyć na lodzie za pomocą buforu rozcieńczającego do rozdzielacza zgodnie z podanymi objętościami.

  1. Przeprowadzić reakcję ligacji na lodzie, dodając składniki opisane w tabeli 8, w podanej kolejności, do końcowego produktu reakcji przygotowawczej z kroku 7.3. Należy pamiętać, że Ligation Master Mix i Ligation Enhancer można mieszać z wyprzedzeniem. Mieszanina ta jest stabilna przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C. Nie mieszaj wstępnie Ligation Master Mix, Ligation Enhancer i Adaptor przed użyciem w Adaptor Ligation Step.
Rozdział pkt.
Reakcja podwiązaniaObjętość (μL)
Koniec preparowanego DNA (krok 7.3)60
Rozcieńczony adapter (krok 8.1)Rozdział 2.5
Wzmacniacz podwiązania1
Mistrz podwiązania MixRozdział 30
Całkowita objętość93,5

Tabela 8: Reakcja podwiązania. Składniki reakcji podwiązywania adaptera powinny być montowane na lodzie zgodnie z objętościami podanymi w podanej kolejności. Można przygotować główną mieszankę Ligation Enhancer i Ligation Master Mix i dodać ją do End Prepped DNA za pomocą rozcieńczonego adaptera. Nie mieszaj rozcieńczonego adaptora z Ligation Master Mix lub Ligation Enhancer przed zmieszaniem z DNA przygotowanym pod koniec.

  1. Ustaw pipetę na 80 μl, a następnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Wykonaj szybkie wirowanie, aby zebrać cały płyn z boków rurek. Ligation Master Mix jest bardzo lepki. Należy zadbać o odpowiednie wymieszanie reakcji podwiązywania, ponieważ niepełne wymieszanie spowoduje zmniejszenie skuteczności ligacji. Obecność niewielkiej ilości pęcherzyków nie będzie przeszkadzać w wydajności.
  2. Inkubować zgodnie z programem #6 (Tabela uzupełniająca 2), a następnie usunąć mieszaninę ligacji z termocyklera i dodać 3 μl enzymu do przetwarzania adaptora, co daje całkowitą objętość 96,5 μl.
  3. Pipetować w górę i w dół kilka razy, aby dobrze wymieszać, a następnie inkubować zgodnie z programem #7 (Tabela uzupełniająca 2) przed natychmiastowym przystąpieniem do oczyszczania reakcji ligacji.

9. Oczyszczanie reakcji ligacji za pomocą SPRI Neads

  1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
  2. Dodać 87 μl zawieszonych kulek SPRI i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Po klarownym roztworze (~5 min) ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Nie wyrzucaj koralików.
  4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówek znajdujących się na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz krok 9.4 raz, co daje w sumie 2 etapy prania.
  5. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw rurki na stojaku magnetycznym i susz koraliki na powietrzu przez około 3 minuty przy otwartej pokrywie lub do widocznego wyschnięcia. Nie należy przesuszać koralików, ponieważ może to spowodować mniejszy odzysk DNA.
  6. Wyjmij rurki z magnesu i dodaj 17 μl 0,1x buforu TE do kulek. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić probówki na stojaku magnetycznym, umożliwiając całkowite oddzielenie kulek od supernatantu.
  7. Przenieść 15 μl supernatantu do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, DNA podwiązane adaptorem może być przechowywane w temperaturze -20 °C.

10. Wzbogacanie metodą PCR DNA ligowanego adaptorowo

  1. Ustawić reakcję PCR zgodnie z opisem w tabeli 9. Można przygotować i dodać Master Mix zawierający Pre-Capture PCR Master Mix i Universal Primer, a następnie dodać go do DNA ligowanego Adaptorem. W przypadku sekwencjonowania multipleksowego należy używać unikalnych starterów indeksowych dla każdej reakcji i dodawać do każdej próbki indywidualnie.
Rozdział
Wzbogacanie PCRObjętość (μL)
DNA podwiązane adaptorowo (krok 10.1)15
Wstępna mieszanka wzorcowa PCR25
Uniwersalny podkład do PCR5
Indeks (X) Elementarz5
Całkowita objętość50

Tabela 9: Wzbogacanie metodą PCR DNA podwiązanego adaptorowo. Składniki reakcji DNA ligowanego adaptorowo metodą PCR powinny być złożone i wymieszane na lodzie zgodnie z podanymi objętościami. Można przygotować i dodać do adaptorowo ligowanego DNA mieszankę wzorcową Pre-Capture PCR Master Mix i uniwersalnego podkładu PCR. W przypadku sekwencjonowania multipleksowego każda próbka powinna otrzymać unikalny Index Primer.

  1. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Krótko odkręć probówki w mikrowirówce i umieść w termocyklerze i wykonaj amplifikację PCR za pomocą programu #8 (Tabela uzupełniająca 2).

11. Oczyszczanie reakcji PCR za pomocą kulek SPRI

  1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
  2. Do każdej reakcji PCR dodać 45 μl zawieszonych kulek (~50 μL). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Po klarownym roztworze (~5 min) ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików zawierających DNA.
  4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówek znajdujących się w stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz krok 11.4 raz, co daje w sumie 2 kroki prania.
  5. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw rurki na stojaku magnetycznym i susz koraliki na powietrzu przez około 3 minuty przy otwartej pokrywie lub do widocznego wyschnięcia. Nie należy przesuszać koralików, ponieważ może to spowodować mniejszy odzysk DNA.
  6. Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 23 μl 0,1x bufor TE do kulek. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Przenieść 20 μl supernatantu do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, biblioteki Pre-Capture mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

12. Walidacja i kwantyfikacja biblioteki Pre-capture

  1. Zmierz stężenie w bibliotece wstępnego wychwytywania za pomocą fluorometru i zestawu do testów o wysokiej czułości. Aby przejść do części II: Hybrydyzacja i wychwytywanie, wymagany jest minimalny plon 200 ng.
    1. Uruchom 1 μl biblioteki w cyfrowym systemie elektroforezy. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę, aby uniknąć przeciążenia układu o wysokiej czułości, zgodnie z zaleceniami protokołu producenta.
    2. Sprawdź, czy elektroferogram pokazuje wąski rozkład o wielkości piku około 250-400 pz (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 3 i Rysunek 4).
    3. Jeśli pik 128 pz (adapter-dimer) jest widoczny w śladach bioanalizatora, a intensywność sygnału jest ≥ intensywności sygnału z biblioteki 250-400 pz (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 5), a następnie zwiększ objętość próbki (z kroku 11.7) do 50 μL za pomocą 0,1x buforu TE i powtórz oczyszczanie kulek SPRI (krok 11). Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, biblioteki Pre-capture mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przed przejściem do części II: Hybrydyzacja i przechwytywanie immunoprism.

Część II: Hybrydyzacja i przechwytywanie

13. Połącz oligonukleotydy blokujące, DNA Cot-1, DNA biblioteki wstępnego przechwytywania i suche

  1. Wymieszaj bibliotekę kodów kreskowych przygotowaną w kroku 11 i oznaczoną ilościowo w kroku 12 z DNA Cot-1 i oligonukleotydami blokującymi w probówce PCR bez nukleazy lub mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, jak pokazano w tabeli 10.
OdczynnikIlość/objętość
Biblioteka kodów kreskowych z kroku 10.10200 ng
DNA COT-12 μg
Blokowanie oligonukleotydów2 μl

Tabela 10: Hybrydyzacja Przygotowanie i suszenie. Komponenty, które mają być połączone w celu wysuszenia bibliotek w ramach przygotowań do hybrydyzacji, powinny być zestawione zgodnie z pokazanymi ilościami.

  1. Wysuszyć zawartość probówki za pomocą koncentratora próżniowego ustawionego na 30-45 °C. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole. Po wysuszeniu probówki można przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej (15-25 °C) lub dłużej w temperaturze -20 °C.

14. Hybrydyzacja sond do wychwytywania DNA z biblioteką

  1. Rozmrozić 2x Bufor do płukania kulek i bufor do hybrydyzacji, Wzmacniacz buforu hybrydyzacji, Panel sondy ImmunoPrism, 10x Bufor do płukania 1, 10x Bufor do płukania 2, 10x Bufor do płukania 3 i 10x Bufor do płukania Rygorystycznego w temperaturze pokojowej. Przed użyciem należy sprawdzić bufor hybrydyzacyjny pod kątem krystalizacji soli. Jeśli kryształy są obecne, podgrzać probówkę w temperaturze 65 °C, potrząsając z przerwami, aż do całkowitego rozpuszczenia buforu.
  2. W temperaturze pokojowej utwórz Hybridization Master Mix w probówce. Pomnóż objętość przez liczbę próbek i dodaj 10% więcej, zgodnie z tabelą 11.
Mistrzowska mieszanka hybrydyzacjiObjętość (μL)
Bufor hybrydyzacyjny8,5
Wzmacniacz bufora hybrydyzacji2.7
Panel sondy ImmunoPrism5
Woda wolna od nukleaz0,8
Całkowita objętość17

Tabela 11: Mieszanka główna hybrydyzacji. Składniki Hybridization Master Mix należy łączyć i mieszać w temperaturze pokojowej zgodnie z podanymi objętościami.

  1. Wiruj lub pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Następnie dodaj 17 μl Hybridization Master Mix do każdej probówki zawierającej wysuszone DNA. Zamknąć probówki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Próbki należy zawirować, upewniając się, że są całkowicie wymieszane, a następnie krótko odwirować próbki w mikrowirówce. W razie potrzeby przenieść każdą próbkę z mikroprobówki o pojemności 1,5 ml do probówki do PCR bez nukleazy.
  3. Umieść próbki w termocyklerze i uruchom Program #9 (Tabela Uzupełniająca 2).
    1. Podczas inkubacji należy przygotować do przemywania (etap 15) i kulki streptawidyny (etap 16), pozostawiając wystarczająco dużo czasu na wstępne podgrzanie i zrównoważenie kulek streptawidyny.

15. Przygotuj do mycia

UWAGA: do płukania są dostarczane jako 2x (Bufor do płukania kulek) lub 10x (wszystkie inne do płukania) stężone roztwory.

  1. Podczas inkubacji hybrydyzacji rozcieńczyć 2x Bufor do płukania kulek i 10 razy Buffer do płukania, aby utworzyć 1x roztwory robocze, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek i dodając 10% więcej, zgodnie z tabelą 12. Jeśli 10x bufor do płukania 1 jest mętny, podgrzej butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C lub bloku grzewczym w celu ponownego zawieszenia cząstek. Zamrożone 1x Wash Buffers należy wymieszać po rozmrożeniu.
szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
do myciaSkoncentrowany bufor (μl)Woda wolna od nukleaz (μL)Ogółem (μl)
Bufor do płukania koralików150150300
Bufor do płukania 125225Z kolei 250
Bufor do płukania 215135 Rozdział 135150
Bufor do płukania 315135 Rozdział 135150
Rygorystyczny bufor do płukaniaRozdział 30270300

Tabela 12: Rozcieńczenie buforu myjącego. do przemywania o stężeniu należy rozcieńczyć wodą wolną od nukleaz o temperaturze pokojowej zgodnie z podanymi objętościami.

  1. Podwielokrotnić 1x płuczące do probówek PCR bez nukleaz i umieścić w odpowiednich temperaturach, jak wskazano w tabeli 13. Należy pamiętać o dołączeniu wystarczającej ilości nadmiaru do pipetowania. W przypadku podgrzewanych należy użyć termocyklera ustawionego na 65 °C z pokrywą ustawioną na 70 °C.
szt. szt. szt. szt. szt. szt.
do myciaTemperatura trzymaniaObjętość/probówkę (μL)Liczba probówek/próbkę
Bufor do płukania koralikówTemperatura względna (15-25 °C)1003
Bufor do płukania 165 °C1001
Bufor do płukania 1Temperatura względna (15-25 °C)1501
Bufor do płukania 2Temperatura względna (15-25 °C)1501
Bufor do płukania 3Temperatura względna (15-25 °C)1501
Rygorystyczny bufor do płukania65 °C150cyfra arabska

Tabela 13: Rozcieńczone do mycia. Rozcieńczone do przemywania należy podzielić na oddzielne probówki zgodnie z objętościami i liczbą probówek na próbkę. Przed użyciem myjące muszą być przechowywane we wskazanej temperaturze.

  1. Przygotować mieszaninę do ponownego zawieszania kulek w temperaturze pokojowej, jak pokazano w tabeli 14, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek i dodając 10% więcej.
Mieszanka do ponownego zawieszania koralikówObjętość (μL)
Bufor hybrydyzacyjny8,5
Wzmacniacz bufora hybrydyzacji2.7
Woda wolna od nukleaz5,8
Całkowita objętość17

Tabela 14: Mieszanka do ponownego zawieszania koralików. Składniki Bead Resuspension Mix należy zebrać i wymieszać w temperaturze pokojowej zgodnie z podanymi objętościami.

16. Przygotuj koraliki Streptavidin

  1. Równowaga kulek streptawidyny w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Dokładnie wymieszaj kulki, wirując przez 15 s i podajec 50 μl kulek na przechwycenie do probówki PCR bez nukleazy.
  2. Dodaj 100 μl 1x Bufor do płukania kulek (przygotowany w kroku 15.1) do każdej probówki. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, pozwalając kulkom całkowicie oddzielić się od supernatantu.
  3. Usunąć i wyrzucić klarowny supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików.
  4. Wykonaj następujące pranie.
    1. Wyjmij z stojaka magnetycznego. Dodaj 100 μl 1x Bufor do płukania kulek do każdej probówki zawierającej kulki, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
    2. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym, tak aby koraliki całkowicie oddzieliły się od supernatantu.
    3. Ostrożnie usunąć i wyrzucić klarowny supernatant.
  5. Powtórz krok 16.4 raz, w sumie dwa prania.
  6. Wyjmij z stojaka magnetycznego. Do każdej probówki dodać 17 μl mieszanki do ponownego zawieszania kulek z kroku 15.3. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Upewnij się, że koraliki nie są przyklejone do boków rurek. W razie potrzeby krótko zakręć rurkami, aby zebrać koraliki na dole.

17. Zwiąż hybrydowy cel z kulkami Streptawidyny

  1. Po zakończeniu 4-godzinnej inkubacji hybrydyzacji wyjąć próbki z termocyklera i ustawić termocykler na inkubację w temperaturze 65 °C z podgrzewaną pokrywą ustawioną na 70 °C.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 17 μl w pełni homogenizowanych kulek do próbek. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.
  3. Zwiąż DNA z kulkami, umieszczając probówki w termocyklerze zgodnie z programem #10 (Tabela uzupełniająca 2). Podczas inkubacji należy na krótko wyjmować probówki paskowe co 10-12 minut i delikatnie wirować przez 3 sekundy, aby upewnić się, że kulki pozostają w zawiesinie. Alternatywnie można mieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Natychmiast przejdź do mycia kulek streptawidyny (krok 18).

18. Umyj kulki streptawidyny, aby usunąć niezwiązane DNA

  1. Użyj 1x myjących z kroku 15.2 i przechowuj podgrzane w termocyklerze podczas prania.
  2. Dodaj 100 μl podgrzanego 1x bufor do przemywania 1 do probówek z kroku 17.3. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu.
  3. Odpipetować i wyrzucić supernatant, który zawiera niezwiązane DNA. Wyjmij z stojaka magnetycznego.
  4. Wykonaj następujące pranie w temperaturze 65 °C.
    1. Dodaj 150 μl podgrzanego 1x Rygorystyczny bufor do mycia.
    2. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza. Upewnij się, że koraliki są całkowicie zawieszone we wszystkich tubach.
    3. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
    4. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i wyrzucić supernatant, który zawiera niezwiązane DNA. Wyjmij z stojaka magnetycznego.
    5. Powtórz krok 18.4, aby uzyskać łącznie dwa rygorystyczne prania.
  5. Wykonaj pierwsze pranie w temperaturze pokojowej.
    1. Dodaj 150 μl o temperaturze pokojowej 1x Bufor do mycia 1.
    2. Pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
    3. Zamknij probówki i inkubuj przez 2 minuty, na przemian delikatnie wirując przez 30 s i odpoczywając przez 30 sekund. Upewnij się, że koraliki we wszystkich studzienkach pozostają całkowicie zawieszone we wszystkich probówkach przez cały czas inkubacji.
    4. Krótko odwirować probówki.
    5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i odrzucić supernatant.
    6. Zamknąć probówki i krótko odwirować. Wróć do stojaka magnetycznego i użyj pipety o pojemności 10 μl, aby usunąć resztki buforu do płukania.
  6. Wykonaj drugie pranie w temperaturze pokojowej.
    1. Dodaj 150 μl o temperaturze pokojowej 1x bufor do płukania 2.
    2. Pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
    3. Zamknij probówki i inkubuj przez 2 minuty, na przemian delikatnie wirując przez 30 s i odpoczywając przez 30 sekund. Upewnij się, że koraliki we wszystkich studzienkach pozostają całkowicie zawieszone we wszystkich probówkach przez cały czas inkubacji.
    4. Krótko odwirować probówki.
    5. Przenieś całą objętość kulek zawieszonych w buforze płuczącym 2 do czystych probówek PCR wolnych od nukleaz. Ważne: Przenoszenie kulek do świeżych probówek jest ważne, aby uniknąć zanieczyszczenia poza celem.
    6. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i odrzucić supernatant.
    7. Zamknąć probówki i krótko odwirować. Wróć do stojaka magnetycznego i użyj pipety o pojemności 10 μl, aby usunąć resztki buforu do płukania.
  7. Wykonaj trzecie pranie w temperaturze pokojowej.
    1. Dodaj 150 μl temperatury pokojowej 1x Bufor do płukania 3.
    2. Pipetuj w górę i w dół od 10 do 20 razy, aby całkowicie zawiesić kulki.
    3. Zamknij probówki i inkubuj przez 2 minuty, na przemian delikatnie wirując przez 30 s i odpoczywając przez 30 sekund. Upewnij się, że koraliki we wszystkich studzienkach pozostają całkowicie zawieszone we wszystkich probówkach przez cały czas inkubacji.
    4. Krótko odwirować probówki.
    5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, tak aby kulki całkowicie oddzieliły się od supernatantu. Odpipetować i odrzucić supernatant.
    6. Zamknąć probówki i krótko odwirować. Wróć do stojaka magnetycznego i użyj pipety o pojemności 10 μl, aby usunąć resztki buforu do płukania.
    7. Wyjmij ze stojaka magnetycznego i dodaj do kulek 20 μl wody wolnej od nukleaz
      8. .
    8. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby upewnić się, że wszelkie koraliki przyklejone do boku probówek zostały ponownie zawieszone.
  8. Ważne: Nie wyrzucaj koralików. Użyj całych 20 μl zawieszonych kulek z przechwyconym DNA w kroku 19.

19. Wykonaj końcowe wzbogacanie PCR po schwytaniu

  1. Przygotować MasterMix PCR po wychwyceniu zgodnie z poniższą tabelą, mnożąc przez wymaganą liczbę próbek i dodając 10% więcej, zgodnie z tabelą 15.
Składnik MasterMix PCR po przechwyceniuObjętość (μL)
PCR po schwytaniu MasterMix25
Mieszanka starterów PCR po wychwyceniuWydanie orzeczenia 1,25
Woda wolna od nukleazKlasa 3,75
Całkowita objętośćRozdział 30

Tabela 15: Mieszanka wzorcowa PCR po schwytaniu. Składniki Post-Capture PCR Master Mix należy złożyć i wymieszać na lodzie zgodnie z podanymi objętościami.

  1. Dodać 30 μl Post-Capture PCR Master Mix do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość reakcji wynoszącą 50 μl. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
  2. Umieść probówki PCR w termocyklerze i inkubuj zgodnie z programem #11 (Tabela uzupełniająca 2).

20. Oczyszczanie fragmentów PCR po schwytaniu

  1. Pozwól koralikom SPRI ogrzać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut przed użyciem, a następnie wiruj koraliki SPRI przez około 30 sekund, aby ponownie zawiesić.
  2. Dodać 75 μl zawieszonych kulek do każdego wychwytu wzbogaconego PCR (50 μl). Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Kulki streptawidyny nie będą przeszkadzać w oczyszczaniu kulek SPRI. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Krótko obrócić probówki w mikrowirówce i umieścić probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu. Gdy roztwór będzie klarowny, ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają DNA.
  4. Dodaj 180 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki znajdującej się w stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  5. Powtórz krok 20.4 raz, co daje w sumie 2 etapy prania.
  6. Całkowicie usuń resztki etanolu. Pozostaw probówkę na stojaku magnetycznym i wysusz na powietrzu przez 3 minuty z otwartą pokrywką lub do widocznego wyschnięcia. Nie susz koralików zbyt mocno. Może to skutkować mniejszą regeneracją DNA.
  7. Wyjmij rurkę z magnesu. Eluuj DNA z kulek, dodając 22 μl 0,1x buforu TE. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny.
  8. Usunąć 20 μl supernatantu i przenieść do czystej, wolnej od nukleazy probówki do PCR, uważając, aby nie naruszyć kulek. Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

21. Walidacja i kwantyfikacja biblioteki

  1. Zmierz stężenie przechwyconej biblioteki za pomocą fluorometru i zestawu do testów o wysokiej czułości.
  2. Zmierz średnią długość fragmentu przechwyconej biblioteki za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości do elektroforezy cyfrowej i oblicz średni rozmiar fragmentu dla każdej biblioteki za pomocą oprogramowania systemowego. Średni rozmiar fragmentu powinien wynosić około 250-400 pz (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 6 i Rysunek 7). Jest to opcjonalny punkt zatrzymania w protokole, ukończone biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

22. Sekwencjonowanie na platformie sekwencjonowania

  1. W przypadku sekwencjonowania należy rozcieńczyć biblioteki do 2 nM i postępować zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi ładowania i obsługi sekwencera. Biblioteki sekwencji do minimalnej głębokości 15 milionów odczytów pojedynczych końcówek o długości co najmniej 50 pz.

23. Analiza danych sekwencjonowania w celu wygenerowania profili immunologicznych i odkrycia biomarkerów za pomocą portalu Prism, narzędzia informatycznego opartego na chmurze

  1. Utwórz konto Prism, odwiedzając stronę https://prism.cofactorgenomics.com/
  2. Po zalogowaniu kliknij Prześlij nowy projekt na górnym pasku narzędzi z dowolnej strony w Prism, aby przesłać zdemultipleksowane pliki sekwencjonowania FASTQ lub przesłać pliki przechowywane w BaseSpace za pomocą konta Prism.
  3. Wypełnij formularz Nowy projekt, podając nazwę projektu i próbki według grupy lub kohorty. Grupowanie próbek i odpowiadające im nazwy grupowania są niezbędne do wygenerowania raportu z odkrycia biomarkerów. Należy pamiętać, że do wygenerowania raportu z odkrycia biomarkerów wymagane są co najmniej 3 próbki na grupę. Kliknij przycisk Uruchom aplikację, aby przesłać formularz; Jeśli się powiedzie, pojawi się strona z potwierdzeniem.
  4. Po zalogowaniu kliknij Zobacz wyniki na górnym pasku narzędzi lub na dowolnej stronie Prism. Prism umożliwia użytkownikowi sprawdzenie statusu zgłoszonych projektów oraz przeglądanie raportów dotyczących próbek i biomarkerów dla każdego projektu. Pojawi się tabela projektów, które użytkownik utworzył na Prism. Tabela zawiera trzy kolumny z nazwami stanu, nazwy i daty przesłania.
    UWAGA: Status każdego projektu może być następujący:
    • "Uruchomione", gdzie aktualnie uruchomiona jest analiza projektu, lub
    • "Sukces", w którym analiza projektu jest kompletna, a raporty są dostępne.
  5. Jeśli analiza projektu została zakończona (oznaczona statusem "Powodzenie"), wyświetl raporty z poszczególnych próbek i raport z odkrycia biomarkerów. Należy pamiętać, że raport z odkrycia biomarkerów będzie dostępny tylko wtedy, gdy projekt będzie zawierał wymagane minimum trzy próbki na grupę.
    1. Aby uzyskać dostęp do tych raportów, wróć do tabeli projektów i kliknij nazwę projektu. Na tej stronie projektu będzie znajdować się tabela z wierszem dla każdej próbki w projekcie. Kliknij łącze w każdym wierszu w kolumnie Raport, aby uzyskać dostęp do indywidualnego raportu dla każdej próbki. Bezpośrednio pod tabelą kliknij link do raportu z odkrycia biomarkerów. Jeśli na tej stronie nie ma żadnych linków, oznacza to, że analiza projektu nie została zakończona.

Wyniki

W całym protokole znajduje się szereg punktów kontrolnych, które umożliwiają użytkownikowi ocenę jakości i ilości wytworzonych materiałów. Po wykonaniu Kroku 12 opisanego w protokole generowany jest elektroferogram przedstawiony na Rysunku 3, który jest reprezentatywny dla typowej biblioteki przed etapem wychwytu dla nienaruszonej próbki RNA (RIN = 7,8).

Wykres analizy elektroforezy, rozdział DNA, jednostki fluorescencji w funkcji par zasad, dane o pikach.
Rysunek 3: Typowy ślad z Bioanalyzera dla biblioteki przed wychwytem (Pre-capture Library) dla nieuszkodzonej próbki RNA. Biblioteki przed wychwytem objawiają się jako szeroki pik o rozmiarze około 250-400 par zasad (bp). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernej amplifikacji, na co wskazuje drugi pik w okolicach 1 000 bp widoczny na Ryc. 4, która przedstawia reprezentatywny elektroferogram biblioteki przed wzbogaceniem (pre-capture library) wygenerowanej z próbki RNA FFPE (DV200 = 46). Jeśli pik ten jest mały w stosunku do piku głównego (około 250-400 par zasad (bp), jak pokazano), nie będzie on zakłócał kolejnych etapów lub analizy. Jeśli drugi pik jest duży w stosunku do piku 250-400 bp, bibliotekę przed wzbogaceniem można przygotować ponownie, stosując mniejszą liczbę cykli PCR w celu ograniczenia nadmiernej amplifikacji.

Elektroferogram przedstawiający analizę fragmentów DNA, intensywność piku w funkcji wielkości fragmentu, skala w bp.
Rycina 4: Typowy ślad Bioanalyzer biblioteki przed wychwytem dla próbki RNA FFPE. Drugi pik w okolicy 1 000 bp wskazuje na nadmierną amplifikację. Jeśli pik ten jest mały w stosunku do głównego piku w zakresie 250-400 bp (jak pokazano), nie będzie on zakłócać kolejnych etapów lub analizy. Jeśli drugi pik jest duży w stosunku do piku 250-400 bp, bibliotekę przed wychwytem można przygotować ponownie, stosując mniejszą liczbę cykli PCR w celu ograniczenia nadmiernej amplifikacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zgodnie z opisem w kroku 12.1.3, należy ocenić obecność dimerów adapterów, aby ustalić, czy konieczne jest dodatkowe oczyszczanie. Elektroforeogramy przedstawione na Rysunku 5 są reprezentatywne dla nieakceptowalnych (Rysunek 5A, DV200 = 33) oraz akceptowalnych (Rysunek 5B, DV200 = 46) poziomów dimerów adapterów, które pojawiają się jako ostry pik w okolicach 128 bp.

Porównanie wykresów spektroskopowych przedstawiające piki absorpcji; analiza składu chemicznego.
Rycina 5: Ślady Bioanalizera biblioteki przed wychwytem. Dimer adaptora pojawia się jako ostry pik w okolicach 128 bp. (A) Na tym elektroferogramie widoczne są nadmierne ilości dimerów adaptorów. (B) Ten ślad przedstawia akceptowalne poziomy dimerów adaptorów. Oba ślady wykazują oznaki lekkiej nadamplifikacji, co jednak nie powinno zakłócać przebiegu analizy ImmunoPrism. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Po zakończeniu protokołu, przed sekwencjonowaniem, końcowe biblioteki są ponownie oceniane za pomocą elektroforezy cyfrowej. Biblioteki przygotowane z RNA z materiałów FFPE mają tendencję do mniejszego średniego rozkładu wielkości niż biblioteki przygotowane z nienaruszonego RNA. W przypadku próbek nienaruszonego RNA uzyskany ślad powinien być zbliżony do Rysunku 6 (RIN = 9,5). W przypadku RNA zdegradowanego lub z materiałów FFPE uzyskany ślad powinien być zbliżony do Rysunku 7 (DV200 = 36).

Elektroferogram; wynik elektroforezy kapilarnej; analiza fragmentów DNA; wykres intensywności piku.
Rysunek 6: Typowy ślad Bioanalyzer końcowej biblioteki dla nieuszkodzonej próbki RNA. Końcowe biblioteki pojawiają się jako szeroki pik o rozmiarze około 250-400 par zasad (bp). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki elektroforezy; wykres analizy piku; rozdział fragmentów DNA; FU vs bp.
Rycina 7: Typowy ślad Bioanalyzer końcowej biblioteki dla próbki RNA FFPE. Biblioteki przygotowane z RNA FFPE mają tendencję do mniejszej średniej rozkładu wielkości niż biblioteki przygotowane z nienaruszonego RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Jak opisano, wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu mogą być zastosowane w dwa kluczowe sposoby, co przedstawiono na Rysunku 8.

Indywidualne i wielowymiarowe profilowanie immunologiczne; sekwencjonowanie RNA; schemat; odkrywanie biomarkerów.
Rycina 8: Dwa zastosowania protokołu. Wyniki uzyskane za pomocą tego testu profilowania immunologicznego są wykorzystywane w dwóch kluczowych zastosowaniach translacyjnych. (A) Pierwszy przypadek zastosowania rozpoczyna się od ludzkiej tkanki guza litego (w tym archiwów FFPE) i generuje indywidualny profil immunologiczny dla próbki. (B) Po uzyskaniu danych dla kohorty ludzkich próbek są one łączone za pomocą Prism Portal w celu wygenerowania wielowymiarowego biomarkera i odpowiadającego mu Raportu o Biomarkerze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby zademonstrować każdy z tych przypadków użycia, dołączono reprezentatywne dane z niewielkiego badania translacyjnego21. Próbki wykorzystane w tym badaniu stanowią zestaw preparatów od 7 pacjentów zdiagnozowanych i leczonych z powodu niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Próbki to dopasowane do pacjentów tkanki guza litego pobrane z biopsji przed i po leczeniu. W pierwszej kolejności przeanalizowano poszczególne próbki w celu stworzenia profilu immunologicznego, takiego jak przykładowy raport przedstawiony na Rysunku 9.

Wykres i wynik raportu ImmunoPrism; analiza profilu immunologicznego; limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B.
Rysunek 9: Przykład indywidualnego raportu immunologicznego dla próbki NSCLC. Potok przetwarzania Prism Portal generuje raport graficzny dla każdej przetworzonej próbki; tutaj przedstawiono reprezentatywny raport wygenerowany dla próbki guza litego NSCLC. (A) Przednia strona raportu graficznie przedstawia podział komórek immunologicznych obecnych w próbce RNA wyekstrahowanej z tkanki FFPE. (B) Rewers raportu zawiera tabelę komórek immunologicznych (w wartościach procentowych bezwzględnych) oraz ekspresję genów ucieczki (w liczbie transkryptyw na milion, TPM), a także oświadczenie dotyczące wydajności analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Profile immunologiczne sprzed i po leczeniu mogą posłużyć do zrozumienia, w jaki sposób terapia (w niniejszym badaniu chemioterapia lub radioterapia) zmodyfikowała mikrośrodowisko guza. Przykład przedstawiono na Rysunku 10, gdzie pokazano zmiany procentowe dla każdego rodzaju komórek odpornościowych oraz całkowitą zawartość komórek immunologicznych przed i po chemioterapii u jednego pacjenta.

Zmiany procentowe komórek odpornościowych przed i po eksperymencie; wykres liniowy; limfocyty T CD4+, CD8+; badanie immunologiczne.
Rysunek 10: Przykład wyników przed i po leczeniu. Przedstawiono dane dotyczące poszczególnych komórek odpornościowych oraz całkowitej zawartości komórek odpornościowych uzyskane z próbek pobranych przed i po leczeniu od jednego pacjenta z NSCLC. W tym przykładzie pacjent otrzymał schemat chemioterapii jako formę leczenia. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pacjentów można pogrupować według kryteriów takich jak wyniki kliniczne lub fenotypy w celu przeprowadzenia porównania. Na przykład na Rysunku 11 próbki w badaniu NSCLC zostały porównane pod kątem czasu do progresji choroby po leczeniu. Podgrupa pacjentów wykazała nawrót choroby w czasie >18 miesięcy, a inna podgrupa progresję szybciej, w czasie ≤18 miesięcy. Wartości mediany delta (różnica między wartościami przed i po leczeniu) są porównywane dla każdej próbki w celu zidentyfikowania potencjalnych biomarkerów progresji choroby.

Wykres słupkowy procentowej zawartości komórek odpornościowych z porównaniem grup wiekowych; limfocyty T CD4, limfocyty T CD8, limfocyty B, monocyty.
Rycina 11: Przykład porównania wyników klinicznych. Obliczono ilościowe zmiany procentowej zawartości komórek odpornościowych w dopasowanych próbkach NSCLC pobranych przed i po leczeniu, które przedstawiono jako wartość „delta”. Elementy wyróżnione na żółto wskazują wyraźne zmiany sygnału w zależności od statusu przeżycia. Niebieskie słupki reprezentują mediany wartości delta dla czasu do progresji choroby >18 miesięcy, a pomarańczowe słupki reprezentują mediany wartości delta dla czasu do progresji choroby ≤18 miesięcy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Na koniec, podobne grupowania próbek można wykorzystać do analizy konkretnie próbek pobranych przed leczeniem w celu zidentyfikowania biomarkerów prognostycznych, wykorzystując portal Prism Portal do wygenerowania raportu z biomarkerami (Biomarker Report). Jak pokazano na Rysunku 12, grupowanie próbek definiuje ten sam fenotyp kliniczny (progresja choroby), który opisano powyżej. W tym przykładzie dwa geny ucieczki immunologicznej zostały zidentyfikowane jako statystycznie istotne czynniki różnicujące grupy próbek (CD47 i OX40, pokazane na dolnym panelu Rysunku 12A). W tym przypadku, ponieważ poszczególne biomarkery genowe są wiarygodne i wykazują wyraźną istotność statystyczną, wielowymiarowy biomarker nie wnosi znaczącej wartości prognostycznej (ImmunoPrism, oznaczone na górnym prawym wykresie słupkowym Rysunku 12B). Pełna tabela danych, zawierająca wyniki dla wszystkich 18 analitów w teście, wraz z analizą statystyczną i krótkim podsumowaniem metod, znajduje się na odwrocie raportu.

Raport z badania biomarkerów ImmunoPrism podkreślający dokładność prognostyczną wraz z wykresem danych dotyczących wydajności analitycznej.
Rysunek 12: Przykład raportu z badania biomarkerów dla próbek NSCLC. Proces odkrywania biomarkerów dostarcza raport wizualny dla poszczególnych biomarkerów oraz wielowymiarowy biomarker opracowany za pomocą uczenia maszynowego, wraz ze szczegółowymi statystykami. (A) W niniejszym badaniu proces ten zidentyfikował dwa pojedyncze biomarkery (CD47 i OX40) jako istotne statystycznie dla określenia progresji choroby przy progu 18 miesięcy. (B) Szczegóły dotyczące metody oraz pełne wyniki znajdują się na odwrocie raportu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Materiały z zestawu odczynników. Zamieszczono listę materiałów dostarczonych w zestawie ImmunoPrism wraz z numerami katalogowymi wskazanymi w protokole producenta. Wszystkie pozostałe wymagane urządzenia i materiały znajdują się w Tabeli materiałów. Karty charakterystyki (SDS) są dostępne pod adresem https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 2: Programy termocyklera. Rekomendowane programy cyklera przywoływane w całym protokole zostały podsumowane w celu ułatwienia programowania. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 3: Przewodnik po indeksach sekwencjonowania. Wymienione zostały primery indeksowe zawarte w zestawie odczynników; do każdej reakcji dodaje się unikalny primer w celu demultipleksowania po sekwencjonowaniu. Podano również zalecane kombinacje dla multipleksowania na niskim poziomie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Protokół wymaga 20 ng nienaruszonego lub 40 ng wysoce zdegradowanego (FFPE) RNA. Próbka RNA powinna być wolna od DNA, soli (np. Mg2+ lub soli guanidyny), dwuwartościowych czynników chelatujących kationy (np. EDTA, EGTA, cytrynian) lub substancji organicznych (np. fenolu i etanolu). Nie zaleca się postępowania z próbkami RNA, które mają DV200 <20%. Zdecydowanie zaleca się stosowanie wbudowanego kontrolnego RNA, ponieważ te kontrole zapewniają środki do oceny wydajności w całym protokole, od przygotowania biblioteki po analizę.

Protokół przeznaczony jest do wykonania przy użyciu 0,2 ml probówek paskowych do PCR. Jeśli jest to preferowane, protokół można również wykonać przy użyciu dołków w 96-dołkowej płytce PCR. Po prostu użyj dołków 96-dołkowej płytki PCR zamiast wszystkich odniesień do probówek do PCR lub probówek paskowych. Używaj płytek PCR tylko z przezroczystymi dołkami, ponieważ bardzo ważne jest wizualne potwierdzenie całkowitego ponownego zawieszenia kulek podczas oczyszczania kulek i etapów mycia.

Przez cały czas trwania protokołu odczynniki należy przechowywać w stanie zamrożonym lub na lodzie, chyba że określono inaczej. Nie używaj odczynników, dopóki nie zostaną całkowicie rozmrożone. Pamiętaj, aby dokładnie wymieszać wszystkie odczynniki przed użyciem.

Enzymy należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia i natychmiast po użyciu powrócić do temperatury -20 °C. Używaj tylko wody wolnej od nukleaz molekularnych; nie zaleca się używania wody uzdatnionej przez DEPC. Podczas pipetowania w celu wymieszania należy delikatnie zassać i dozować co najmniej 50% całkowitej objętości, aż roztwory dobrze się wymieszają. Odpipetować wszystkie mieszanki wzorcowe zawierające enzymy. Użycie wiru do mieszania enzymów może prowadzić do denaturacji i pogorszyć ich wydajność. Podczas oczyszczania kulek używaj świeżo przygotowanych 80% roztworów etanolu z etanolu molekularnego. Stosowanie roztworów etanolu, które nie są świeże, może skutkować niższymi plonami. Unikaj nadmiernego suszenia kulek, ponieważ może to zmniejszyć wydajność elucji (kulki wyglądają na popękane, jeśli są nadmiernie wysuszone).

Jak opisano w kroku 10, do każdej reakcji dodawane są unikalne startery indeksowe. Opierając się na sekwencjach tych wskaźników, dla multipleksowania niskopoziomowego, pewne kombinacje indeksów są optymalne. Sekwencje tych wskaźników są wymagane do demultipleksacji danych po sekwencjonowaniu. Sekwencje i zalecane kombinacje multipleksowania podano w tabeli uzupełniającej 3. Na tym samym etapie należy zauważyć, że liczba zalecanych cykli PCR różni się w zależności od jakości użytego RNA i może być wymagana pewna optymalizacja, aby zapobiec nadmiernej amplifikacji PCR. W przypadku ImmunoPrism Intact Control RNA i innych wysokiej jakości RNA rozpocznij optymalizację od 10 cykli PCR. W przypadku RNA kontrolnego ImmunoPrism FFPE i innych wysoce zdegradowanych/FFPE RNA rozpocznij optymalizację od 15 cykli PCR. Zaleca się stworzenie biblioteki testowej przy użyciu RNA reprezentatywnego dla analizowanego materiału w celu optymalizacji cykli PCR. Należy zastosować minimalną liczbę cykli PCR, które konsekwentnie zapewniają wystarczającą wydajność biblioteki wstępnego wychwytywania (>200 ng). Wtórny pik około 1000 pz na śladzie bioanalizatora wskazuje na nadmierną amplifikację (ryc. 4). Nadmierne wzmocnienie powinno być zminimalizowane, ale obecność małego piku wtórnego nie będzie kolidować z wynikami testu.

Aby zminimalizować utratę próbki i uniknąć wymiany probówek, Krok 13 można wykonać w probówkach PCR, probówkach paskowych lub 96-dołkowej płytce PCR zamiast mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, jeśli pozwala na to koncentrator próżniowy. Wirnik można zdemontować w wielu koncentratorach. Dzięki temu rurki lub płyty paskowe mogą paskować się w próżni. Zatężanie próżni można następnie uruchomić przy użyciu ustawienia suszenia wodnego bez wirowania. Zapoznaj się z instrukcją obsługi koncentratora próżniowego, aby uzyskać instrukcje. Jeśli próbki są suszone w probówkach paskowych lub na płytce 96-dołkowej, etap hybrydyzacji można przeprowadzić w tym samym naczyniu.

Podczas kroku 17 pamiętaj, aby wirować co 10-12 minut, aby zwiększyć skuteczność wychwytywania koralików. Podczas mieszania ostrożnie trzymaj nakrętki tubek z ciepłymi paskami, aby zapobiec otwieraniu się probówek.

Mycie opisane w kroku 18 ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia wysokiego zanieczyszczenia niespecyficznego i należy ich ściśle przestrzegać. Należy pamiętać o całkowitym ponownym zawieszeniu kulek przy każdym myciu, całkowicie usunąć do mycia, a podczas mycia Wash Buffer 2 przenieść próbki do świeżej probówki paskowej (krok 18.6.5). Upewnij się, że kulki streptawidyny są całkowicie ponownie zawieszone i pozostają w zawiesinie przez cały czas inkubacji. Rozpryskiwanie się nasadek tubusu nie wpłynie negatywnie na chwytanie. Podczas mycia w temperaturze pokojowej można użyć mieszalnika wirowego z mikropłytkami do wirowania próbek przez cały dwuminutowy okres inkubacji w celu łatwiejszego ponownego zawieszenia. Nie pozwól, aby kulki streptawidyny wyschły. W razie potrzeby przedłuż inkubacje w, aby uniknąć wysuszenia kulek. Jeśli używasz więcej niż jednej tubki paskowej, pracuj z jedną tubką paskową na raz przy każdym praniu, podczas gdy pozostałe tubki paskowe znajdują się w termocyklerze. Może to pomóc uniknąć nadmiernego wysuszenia kulek lub pośpiechu, co skutkuje słabym ponownym zawieszeniem lub innymi nieoptymalnymi technikami. Dla początkujących użytkowników nie zaleca się przetwarzania więcej niż 8 reakcji biblioteki jednocześnie.

Obecne techniki profilowania immunologicznego dostarczają kontinuum informacji - od tysięcy punktów danych, które wymagają znaczącej interpretacji (sekwencjonowanie RNA) do pojedynczego, dyskretnego punktu danych (IHC single-plex). Opisany tutaj protokół reprezentuje podejście, które znajduje się gdzieś pośrodku, z ukierunkowanym zakresem umożliwiającym wysoką czułość, ale przechwytującym tylko podzbiór klinicznie istotnych danych transkryptomicznych. Ze względu na charakter masowej ekstrakcji RNA, protokół ten nie dostarcza informacji na temat relacji przestrzennych między komórkami odpornościowymi a mikrośrodowiskiem guza, jednak wyniki mogą być uzupełnione technologiami obrazowania w celu dodania tych informacji. Istnieje niezliczona ilość zastosowań danych generowanych przez ten protokół, ponieważ jest wiele do nauczenia się o biologii raka jako choroby i terapiach opracowywanych w celu jego leczenia. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, indywidualny raport immunologiczny jest przydatny do zrozumienia, w jaki sposób profil immunologiczny pacjenta może się zmienić w odpowiedzi na zdarzenia, takie jak progresja choroby lub leczenie. Podczas gdy przedstawione tutaj wyniki dostarczają kilku przykładowych przypadków użycia, inne zastosowania, takie jak badanie mechanizmu działania terapii i identyfikacja przypuszczalnych biomarkerów wyników klinicznych, takich jak wolne od progresji i całkowite przeżycie, są również praktyczne. Podczas korzystania z tego protokołu do zastosowań związanych z odkrywaniem biomarkerów ważne jest, aby dobrze zaprojektować badanie, aby zapewnić analizę jednorodnych populacji, uwzględnienie wystarczającej liczby próbek dla mocy statystycznej i uwzględnienie źródeł błędu systematycznego. Ze względu na skoncentrowany, uproszczony charakter testu, możliwe jest wyobrażenie sobie drogi do walidacji klinicznej i dalszego zastosowania tych biomarkerów po ich odkryciu.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są zatrudnieni przez Cofactor Genomics, Inc., firmę, która opracowała i produkuje zestaw odczynników ImmunoPrism oraz narzędzia informatyczne wykorzystane w tym artykule. Test ImmunoPrism jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych i nie jest przeznaczony do stosowania w procedurach diagnostycznych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować TriStar Technology Group za dostarczenie próbek biologicznych do reprezentatywnych wyników, a także całemu zespołowi molekularnemu, analitycznemu, produktowemu i komercyjnemu w Cofactor Genomics za ich techniczną wiedzę i wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 ml PCR 8 probówekUSA Scientific1402-2700USA Scientific 0,2 ml PCR 8-tubowy pasek
200 Proof EthanolMilliporeSigmaEX0276-1Przygotuj 80% przez zmieszanie z wodą wolną od nukleaz w dniu eksperymentu
96-dołkowe termocykleryBioRad1861096
Koraliki do odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI)Beckman-CoulterA63882Agencourt AMPure XP – Koraliki oczyszczające PCR
Cyfrowe chipy i zestaw do elektroforezyAgilent Technologies5067-4626Chipy i zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości
Cyfrowy system elektroforezyAgilent TechnologiesG2939AABioanalizator elektroforezy Agilent 2100
Koraliki streptawidynyThermoFisher Scientific65306Dynabeads M-270 Streptawidin
ImmunoPrism Kit & ndash; 24 reakcjeCofactor GenomicsCFGK-302Cofactor ImmunoPrism Zestaw do profilowania immunologicznego – 24 reakcje
Ludzki Cot-1 DNAThermoFisher Scientific15279011Marka Invitrogen
Magnetyczny stojak separacyjnyAlpaqua/InvitrogenA001322/12331D96-dołkowy magnetyczny stojak na pierścień
Eppendorf22620701
Probówki do mikrowirówekUSA Scientific1415-2600USA Scientific 1,5 ml probówka do mikrowirówek o niskiej przyczepności
NastępnySeq550IlluminaSY-415-1002Do tego protokołu można użyć dowolnego sekwenatora Illumina
Woda wolna od nukleazThermoFisher ScientificAM9937
Zestaw do ekstrakcji pryzmatuCofactor GenomicsCFGK-401Zestaw do ekstrakcji pryzmatu kofaktora FFPE i ndash; 24 próbki
Oczyszczone RNA-oczyszczone z próbek tkanek ludzkich
FluorometrThermoFisher ScientificQ33226System Qubit 4
Probówki do testów fluorometrycznychAxygenPCR-05-C0,5 ml cienkościenne probówki do PCR z płaskimi nasadkami
Zestaw odczynników fluorometrycznych o wysokiej czułościLife TechnologiesQ32854Zestaw
do oznaczania kubitów dsDNA HSKoncentrator próżniowyEppendorf22820001VacufugePlus
Mieszarka wirowaVWR10153-838
Łaźnia wodna lub blok grzewczyVWR/USA ScientificNA/2510-1102Łaźnia wodna VWR/USA Naukowy blok grzewczy

Bibliografia

  1. Brambilla, E., et al. Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).
  2. Iacono, D., et al. Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations. Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).
  3. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
  4. Sierant, M. C., Choi, J. Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools. Genomics Inform. 16, (2018).
  5. Klauschen, F., et al. Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning. Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).
  6. Danaher, P., et al. Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18(2017).
  7. Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology. 18 (1), 220(2017).
  8. Newman, A. M., et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).
  9. Becht, E., et al. Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression. Genome Biology. 17 (1), 218(2016).
  10. Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. Data normalization considerations for digital tumor dissection. Genome Biology. 18 (1), 128(2017).
  11. Chen, S. H., et al. A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues. BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154(2018).
  12. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications. 4, 2612(2013).
  13. Foley, J. W., et al. Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ. Genome Research. , (2019).
  14. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  15. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO. , OncologyPRO. https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer (2019).
  16. Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs. JAMA Network Open. 2 (5), e192535(2019).
  17. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  18. Schillebeeckx, I., et al. Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting. Journal of Molecular Diagnostics. 21, Baltimore, MD. (2019).
  19. Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma. Medical Oncology. 35 (3), 25(2018).
  20. Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer. Human Pathology. 69, 110-117 (2017).
  21. Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting. Cancer Research. 79 (13 Suppl), Atlanta, GA. (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikro rodowisko guzaprofilowanie immunologicznemodele ekspresji stanu zdrowia oparte na RNAtkanka guza litegotkanka FFPEukierunkowane wychwytywaniemodele ekspresji gen wkwantyfikacja kom rek odporno ciowychgeny ucieczki immunologicznejwielowymiarowy biomarker
Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.