Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60646

⸱

25 lipca 2020

 , 
1Center for Individualized Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Streszczenie

Prezentujemy tutaj zintegrowane podejście do testowania skuteczności terapii celowanych, które łączy technologie sekwencjonowania nowej generacji, analizy celów terapeutycznych i monitorowanie odpowiedzi na leki za pomocą ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Strategia ta została zweryfikowana na przykładzie guzów jajnika. Protokół sekwencjonowania nowej generacji (MPseq) wykorzystano do identyfikacji zmian strukturalnych, a następnie przeprowadzono analizę potencjalnie możliwych do ukierunkowania zmian. Ludzkie nowotwory wyhodowane u myszy z obniżoną odpornością leczono lekami dobranymi na podstawie analiz genomicznych. Wyniki wykazały dobrą korelację między przewidywanymi i obserwowanymi odpowiedziami w modelu PDX. Przedstawione podejście może być wykorzystane do przetestowania skuteczności leczenia skojarzonego i wspomóc spersonalizowane leczenie pacjentów z nawrotami raka, szczególnie w przypadkach, gdy standardowa terapia zawodzi i istnieje potrzeba stosowania leków poza wskazaniami rejestracyjnymi.

Wprowadzenie

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), które są generowane z implantacji fragmentów guza pacjenta myszom z niedoborem odporności, stały się potężnym modelem przedklinicznym, który pomaga w spersonalizowanej opiece przeciwnowotworowej. Modele PDX zostały z powodzeniem opracowane dla różnych nowotworów złośliwych u ludzi. Należą do nich rak piersi i jajnika, czerniak złośliwy, rak jelita grubego, gruczolakorak trzustki i niedrobnokomórkowy rak płuc1,2,3,4,5. Tkanka nowotworowa może być wszczepiana ortotopowo lub heterotopowo. Pierwsza, uważana za dokładniejszą, ale trudną technicznie, polega na przeszczepieniu bezpośrednio do narządu pochodzenia nowotworowego. Uważa się, że tego typu modele dokładnie naśladują histologię pierwotnego guza ze względu na "naturalne" mikrośrodowisko dla guza6,7. Na przykład przeszczep ortotopowy do kaletki jajnika myszy spowodował rozsiew guza do jamy otrzewnej i wytworzenie wodobrzusza, typowe dla raka jajnika8. Podobnie, wstrzyknięcie guzów piersi do klatki piersiowej zamiast do gruczołu sutkowego w jamie brzusznej wpłynęło na wskaźnik sukcesu PDX i zachowanie9. Jednak modele ortotopowe wymagają zaawansowanych systemów obrazowania do monitorowania wzrostu guza. Heterotopowa implantacja guza litego jest zazwyczaj wykonywana poprzez wszczepienie tkanki do podskórnego boku myszy, co pozwala na łatwiejsze monitorowanie wzrostu guza i jest tańsze i mniej czasochłonne7. Jednak guzy rozrosłe podskórnie rzadko dają przerzuty, w przeciwieństwie do obserwowanych w przypadku implantacji ortotopowej10.

Wykazano, że wskaźnik powodzenia przeszczepu jest różny i w dużym stopniu zależy od typu nowotworu. Stwierdzono, że bardziej agresywne nowotwory i próbki tkanek zawierające większy procent komórek nowotworowych mają lepsze wskaźniki sukcesu12,13. W związku z tym wykazano, że guzy pochodzące z miejsc przerzutów wszczepiają się z częstotliwością 50-80%, podczas gdy te z miejsc pierwotnych wszczepiają się z częstotliwością tak niską jak 14%12. W przeciwieństwie do tego, tkanka zawierająca komórki martwicze i mniej żywotnych komórek nowotworowych słabo się wszczepia. Wzrost guza może być również wspomagany przez dodanie białek macierzy błony podstawnej do mieszanki tkankowej w momencie wstrzyknięcia myszom14 bez uszczerbku dla właściwości oryginalnego guza. Stwierdzono również, że wielkość i liczba fragmentów tkanki przeznaczonych do implantacji wpływają na wskaźnik powodzenia wszczepienia. Odnotowano większe wskaźniki wchłaniania guza w przypadku implantacji w torebce podnerkowej w porównaniu z implantacją podskórną ze względu na zdolność torebki podnerkowej do utrzymania pierwotnego zrębu guza i dostarczania komórek zrębu gospodarza15.

Większość badań wykorzystuje myszy z niedoborem odporności NOD/SCID, które nie mają komórek NK"16 i wykazano, że zwiększają one wszczepienie, wzrost i przerzuty guza w porównaniu z innymi szczepami14. Wymagane jest jednak dodatkowe monitorowanie, ponieważ chłoniaki grasicy mogą rozwinąć się już w wieku 3-4 miesięcy13. W przeszczepach guzów jajników hodowanych u myszy SCID, wzrost komórek B został skutecznie zahamowany przez rytuksymab, zapobiegając rozwojowi chłoniaków, ale bez wpływu na wszczepienie guzów jajnika17.

Ostatnio myszy NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ), posiadające mutację zerową w genie kodującym łańcuch gamma receptora interleukiny 218, stały się często używanym szczepem do generowania modeli PDX. Stwierdzono, że nowotwory z uznanych modeli PDX pasażowanych do przyszłych pokoleń myszy zachowują właściwości histologiczne i molekularne przez 3 do 6 pokoleń19,20. Liczne badania wykazały, że wyniki leczenia w modelach PDX naśladują wyniki leczenia odpowiadających im pacjentów2,3,4,21,22,23. Wskaźnik odpowiedzi na chemioterapię w modelach PDX dla raka płuca i raka jelita grubego był podobny do tego w badaniach klinicznych dla tych samych leków24,25. Badania przeprowadzone na modelach PDX, opracowanych dla pacjentów włączonych do badań klinicznych, wykazały reakcje na testowane leki podobne do tych obserwowanych klinicznie u odpowiednich pacjentów2,3,4.

Wysokoprzepustowe analizy genomiczne guza pacjenta w połączeniu z modelami PDX dostarczają potężnego narzędzia do badania korelacji między specyficznymi zmianami genomowymi a odpowiedzią terapeutyczną. Zostały one opisane w kilku publikacjach26,27. Na przykład, odpowiedzi terapeutyczne na inhibitor EGFR cetuksymab w zestawie modeli PDX jelita grubego z amplifikacją EGFR były równoległe z odpowiedziami klinicznymi na cetuksymab u pacjentów28.

Istnieje kilka wyzwań związanych z rozwojem i zastosowaniem modeli PDX. Wśród nich jest heterogeniczność guza29,30, co może zagrozić dokładności interpretacji odpowiedzi na leczenie, ponieważ klon pojedynczej komórki o wyższej zdolności proliferacyjnej w PDX może wyrosnąć z innych31, co skutkuje utratą heterogeniczności. Dodatkowo, gdy do rozwoju PDX stosuje się biopsje pojedynczego guza, niektóre populacje komórek mogą zostać pominięte i nie będą reprezentowane w końcowym przeszczepie. Do implantacji zaleca się wielokrotne pobieranie próbek z tego samego guza, aby rozwiązać ten problem. Chociaż nowotwory PDX mają tendencję do zawierania wszystkich typów komórek pierwotnego guza dawcy, komórki te są stopniowo zastępowane przez komórki pochodzenia mysiego3. Wzajemne oddziaływanie między mysim zrębem a ludzkimi komórkami nowotworowymi w modelach PDX nie jest dobrze poznane. Niemniej jednak wykazano, że komórki zrębu rekapitulują mikrośrodowisko guza33.

Pomimo tych ograniczeń, modele PDX pozostają jednymi z najcenniejszych narzędzi do badań translacyjnych, jak również medycyny spersonalizowanej do wyboru terapii dla pacjentów. Główne zastosowania PDX obejmują odkrywanie biomarkerów i testowanie leków. Modele PDX są również z powodzeniem wykorzystywane do badania mechanizmów oporności na leki i identyfikowania strategii przezwyciężania oporności na leki34,35. Podejście opisane w niniejszym manuskrypcie pozwala badaczowi zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne w ludzkich nowotworach i ocenić skuteczność odpowiednich leków in vivo, u myszy z wszczepionymi guzami, które początkowo zostały scharakteryzowane genomicznie. Protokół wykorzystuje guzy jajnika wszczepiane dootrzewnowo, ale ma zastosowanie do każdego rodzaju nowotworu wystarczająco agresywnego, aby rosnąć u myszy2,3,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Świeże tkanki od pacjentek z rakiem jajnika, które wyraziły na to zgodę, zostały pobrane podczas operacji zmniejszenia masy ciała zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Wszystkie procedury i zabiegi na zwierzętach stosowane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i były zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Sekwencjonowanie i analiza par wiązań

UWAGA: Do sekwencjonowania par mate (MPseq) musi być używana zarówno świeża, jak i błyskawicznie zamrożona tkanka. Materiał zatopiony w parafinie nie jest odpowiedni, ponieważ zawiera fragmentaryczne DNA.

  1. Wyizoluj DNA z zamrożonej tkanki nowotworowej. Użyj oryginalnej próbki ludzkiej uzyskanej z materiału chirurgicznego lub biopsji36.
  2. Użyj 1000 ng DNA do stworzenia bibliotek MPseq i sekwencjonuj jako 2 próbki na linię na sekwencerze następnej generacji (patrz Tabela materiałów)36.
  3. Analizuj dane za pomocą zestawu algorytmów do wykrywania dużych aberracji chromosomowych (delecje, insercje, amplifikacje, inwersje i translokacje), jak opisano wcześniej36,37.

2. Wybór celów terapeutycznych

  1. Użyj ogólnodostępnego narzędzia Panda (Pathway and Annotation) lub analogicznego narzędzia, aby zidentyfikować możliwe do ukierunkowania zmiany (http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda).
    1. Sporządź listę genów, które są identyfikowane przez MSeq jako zmienione, w postaci prostego pliku rozdzielanego tabulatorami, używając standardowych akceptowanych symboli genów.
      UWAGA: Załączony przykład zawiera analizę wzmocnień i wzmocnień.
    2. Dodaj znak "#" do wiersza nagłówka listy, aby upewnić się, że nagłówek tabeli zostanie przeniesiony do widoku na poziomie ścieżki oprogramowania.
    3. Prześlij plik, klikając kartę nawigacyjną Prześlij zestaw adnotacji.
    4. Przypisz pojedynczą ikonę z menu, aby reprezentować dane bazowe, klikając wybraną ikonę, a następnie klikając kartę Finalizuj.
    5. Po przekazaniu plików adnotacji zidentyfikuj kolumnę, w której wyświetlana jest liczba genów z adnotacjami na ścieżkę. To jest ostatnia kolumna po prawej.
    6. Użyj filtru ścieżek w lewym górnym rogu okna głównego, aby wyświetlić ścieżki zawierające interesujące geny.
    7. Zidentyfikuj szlaki, które mają więcej opisanych genów, niż można by się spodziewać przypadkowo. Użyj funkcji znajdującej się na karcie Wzbogacanie.
    8. Wybierz bazę danych, aby wyświetlić potencjalnie uboczne geny z adnotacji ustawień wstępnych, zaznaczając odpowiednią ikonę po lewej stronie okna głównego (np. DGIdb, PharmGKB).
    9. Wybierz ścieżkę do wizualizacji, klikając jej nazwę wyświetlaną na stronie Pathway Viewer.
      UWAGA: Ikony reprezentujące każdy zestaw adnotacji są wyświetlane obok powiązanego genu. Kliknij na interesujący Cię gen, aby otworzyć odpowiednią stronę internetową GeneCards.
    10. Wybierz szlaki, które wykazały oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania (tj. zmienione w danym guzie) i "trafienia" dla potencjalnych leków do dalszej analizy.
  2. Skorzystaj z bazy danych zawierającej leki zatwierdzone do stosowania klinicznego (https://clinicaltrials.gov/), aby porównać zidentyfikowane cele.
  3. Nadaj priorytet docelowym zmianom do dalszych testów w modelach PDX, przeprowadzając przegląd literatury (np. PubMed) w celu potwierdzenia znaczenia dla biologii określonego typu nowotworu.

3. Walidacja rearanżacji genomu za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera

  1. Projektuj startery przy użyciu odczytów sekwencjonowania uzyskanych z danych MPseq.
    1. Wybierz łącznik zainteresowania do walidacji (tj. potencjalny cel terapeutyczny) na podstawie analiz MPseq.
    2. Zaprojektuj podkłady kierunkowo tak, aby amplikon zawierał złącze. Zaprojektuj 2 startery po każdej stronie skrzyżowania, w sumie 4, aby zwiększyć szanse na wzmocnienie skrzyżowania.
      UWAGA: Nazwij startery zgodnie z przypadkiem i lokalizacją chromosomu.
    3. Użyj standardowych parametrów PCR do projektu startera i wybranego oprogramowania. Wybierz temperaturę topnienia (60-62 °C) i zawartość GC (40-60%). Upewnij się, że sekwencja startera nie tworzy dimerów startera, palindromów ani pętli spinek do włosów.
    4. Potwierdź, że sekwencja startera nie jest homologiczna z innymi obszarami ludzkiego genomu, sprawdzając ją za pomocą BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start).
  2. Uruchom PCR, aby wzmocnić interesujące połączenie.
    1. Rozcieńczyć podkłady wodą do 10 mM i połączyć 10 ml każdego startera tak, aby każdy starter do przodu był sparowany z każdym starterem odwrotnym w mieszankę starterów.
      UWAGA: Sekwencje starterów dla wybranego przykładu przedstawiono w Tabeli 1.
    2. Oznacz probówki paskowe o pojemności 0,2 ml jako: C1, T1, C2, T2, C3, T3, C4 i T4, gdzie C = kontroluj ludzkie genomowe DNA (komercyjne), T = DNA nowotworu, wyizolowane z guza pacjenta lub PDX, a liczba wskazuje mieszankę starterów.
    3. Dodaj 1 ml każdej mieszanki starterów do oznaczonych tubek.
    4. Przygotuj mieszankę główną Taq, łącząc odczynniki wymienione w tabeli 2, pozostawiając enzym w zamrażarce do czasu, aż będzie potrzebny, dodając go do mieszanki na samym końcu.
    5. Wykonaj 2 mieszanki główne, po jednej dla każdego matrycowego DNA, kontroluj ludzkie DNA i DNA guza. Dodaj 24 ml każdej głównej mieszanki Taq do odpowiedniej probówki paskowej. Całkowita objętość reakcyjna wynosi 25 ml. Wiruj bardzo krótko, a następnie odkręć rurkę paskową w dół.
    6. Uruchom PCR w termocyklerze. Należy użyć parametrów przedstawionych w tabeli 3. Dostosować temperaturę wyżarzania tak, aby była o co najmniej 1 °C niższa niż temperatura topnienia podkładów.
    7. Gotowy produkt PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C (długotrwale) lub w lodówce w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) do czasu, gdy będzie potrzebny.
    8. Wykonaj elektroforezę przy 1-5 V/cm, aby uwidocznić produkt PCR przy użyciu 1,5% żelu agarozowego. Pozostawić 2 ml porcji produktu do użycia do sekwencjonowania Sangera.
  3. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera, aby potwierdzić skrzyżowanie i zidentyfikować dokładny punkt przerwania38.
    1. Należy użyć produktu PCR, jeśli PCR wygenerował pojedynczy produkt (prążek). Alternatywnie, wytnij opaskę z żelu, oczyść i prześlij do sekwencjonowania Sangera wraz ze starterem używanym do amplifikacji.
      UWAGA: Nowotwory, dla których przeprowadzono analizy genomowe, są wykorzystywane do implantacji u myszy.

4. Przeszczepienie i utrzymanie guza

  1. Przygotuj preparaty do wszczepienia guzów do mysich modeli PDX. Wybrać do wszczepienia guzy, dla których zostaną lub zostały przeprowadzone analizy genomowe.
    1. Upewnij się, że w momencie rozpoczęcia opracowywania dowolnych modeli PDX istnieje infrastruktura pomocnicza, w tym dedykowane laboratoria i pomieszczenia dla zwierząt, wykwalifikowany personel techniczny i szczegółowe standardowe procedury operacyjne.
    2. Zapewnij szybki transport i przetwarzanie próbek, ponieważ szybkość ma kluczowe znaczenie dla żywotności komórek i pomyślnego wszczepienia.
    3. Używaj sterylnego środowiska, aby zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne i grzybicze podczas przetwarzania i wszczepiania próbek.
    4. Z próbkami ludzkimi należy obchodzić się ostrożnie, zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą materiałów potencjalnie niebezpiecznych biologicznie, ponieważ mogą one zawierać patogeny przenoszone przez krew.
    5. Przygotuj tkankę (o wielkości 0,5-0,7cm3) do wszczepienia, umieszczając próbkę chirurgiczną w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki do hodowli tkankowych.
      UWAGA: Tkanka nowotworowa może być świeża lub odzyskana z wcześniej kriokonserwowanego materiału5.
    6. Potwierdź zawartość guza w próbce, konsultując się z patologiem.
    7. Umieść tkankę nowotworową w naczyniu zawierającym 10-15 ml zimnego PBS lub pożywki do hodowli tkankowej, takiej jak RPMI 1640 lub DMEM zawierające antybiotyki (1% penicyliny i streptomycyny).
    8. Zidentyfikuj i wyizoluj żywy materiał nowotworowy z sąsiedniej normalnej i martwiczej tkanki z pomocą patologa. Użyj sterylnych kleszczy i skalpela, aby usunąć materiał martwiczy wskazany przez patologa.
      UWAGA: Guz może być wszczepiony dootrzewnowo lub podskórnie myszom. Wykonaj krok 4.2, aby wykonać implantację dootrzewnową lub przejdź do kroku 4.3, aby wykonać przeszczep podskórny. W tym badaniu terapie celowane wybrane na podstawie analiz genomowych przetestowano w serii modeli PDX dla surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości z implantacją dootrzewnową.
  2. Przygotuj tkankę do implantacji dootrzewnowej (IP), mieląc tkankę sterylnymi kleszczami i skalpelem na lodzie, aby uzyskać kawałki o wielkości około 1-1,5mm3 i mieszając z zimną pożywką hodowlaną. Wstrzyknąć 0,3–0,5 ml zawiesiny nowotworowej za pomocą igły o rozmiarze 16-17.
    UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonywane są przy użyciu technik aseptycznych. Sterylne rękawiczki, sterylne narzędzia, materiały eksploatacyjne i wszczepione materiały zostały użyte w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa infekcji.
    1. Wymieszaj kawałki 1:1 z lodowatą pożywką hodowlaną i wstrzyknij 100 ml dootrzewnowo co najmniej trzem samicom myszy SCID.
  3. Przeciąć tkankę nowotworową do podskórnego wszczepienia za pomocą sterylnych kleszczy, skalpela lub nożyczek chirurgicznych na małe fragmenty o wymiarach około 2 x 2 x 2 mm i przenieść rozdrobnione tkanki na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego na lodzie.
    1. Dodaj zimną matrycę błony podstawnej do naczynia z rozdrobnioną tkanką (około 200 ml na 10 kawałków tkanki), dobrze wymieszaj i pozwól fragmentom tkanki zanurzyć się w zimnej matrycy błony podstawnej przez 10 minut.
    2. Znieczulij 5 samic myszy NOD/SCID, aby przygotować je do wszczepienia.
    3. Każdej myszy wstrzyknąć dootrzewnowo kombinację ketaminy (150 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
    4. Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając końcówkę ogona atraumatycznymi kleszczami.
    5. Wyjmij delikatną, w pełni znieczuloną mysz z komory i umieść na myszy stożek nosowy, który ma wejście z waporyzatora i wyjście z systemu oczyszczania gazów odlotowych.
    6. Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przygotuj obszar, w którym zostanie wykonany zabieg. Do wykonania zabiegu należy zastosować technikę aseptyczną.
    7. Upewnij się, że powierzchnia, na której ma się odbyć operacja, jest nieporowata, uszczelniona i zdezynfekowana przed zabiegiem.
    8. Rozpocznij operację od sterylnych (sterylizacją w autoklawie, gazie lub chemii) narzędzi.
    9. Używaj rękawiczek do obsługi narzędzi i utrzymuj sterylność końcówek narzędzi przez cały czas trwania zabiegu, zanurzając je w etanolu między etapami operacji.
  4. Wysterylizuj miejsce operowane, stosując 3 naprzemienne peelingi z jodu i alkoholu. Użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby wykonać pionowe nacięcie skóry o średnicy 5-10 mm na obu bokach myszy.
    1. Delikatnie włóż proste kleszcze w przestrzeń podskórną, aby stworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby fragment guza mógł zostać umieszczony pod poduszką tłuszczową.
    2. Użyj sterylnych prostych kleszczy, aby wprowadzić fragmenty guza do wcześniej przygotowanej kieszonki u każdej z 5 myszy.
      UWAGA: Umieść 3-4 kawałki tkanki nowotworowej w jednej kieszeni
      3. .
    3. Zamknij nacięcia skóry za pomocą kleju tkankowego.
    4. Wstrzyknąć dootrzewnowo każdej myszy 100 ml rytuksymabu po implantacji w celu zahamowania proliferacji limfocytów.
  5. Umieść mysz w klatce pod lampą grzewczą na około 20 minut, aż do znieczulenia. Monitoruj parametry życiowe myszy i zapewnij jej wystarczające nawodnienie.
  6. Przywróć mysz do towarzystwa innych myszy po tym, jak wyzdrowiała ze znieczulenia i zaczęła jeść i pić. Zapewnienie opieki pooperacyjnej i monitorowania zgodnie z wytycznymi instytucji. Sprawdzaj, czy nie ma oznak bólu i niepokoju codziennie przez 3 kolejne dni po zabiegu.
    UWAGA: Kryteria bólu lub niepokoju obejmują martwicę lub owrzodzenie, utratę wagi/ocenę kondycji ciała, objawy behawioralne, takie jak poziom aktywności, funkcje motoryczne i postawa.
  7. Rutynowo sprawdzaj myszy pod kątem powstawania guza co dwa tygodnie, aż guzy osiągną rozmiar 0,5 cm średnicy, mierzony suwmiarką.
  8. Oceń wynik zdrowia każdej myszy na podstawie wyglądu, zachowania i kondycji ciała39. Użyj wyników ≤6 jako kryteriów dla konających myszy, które mają zostać uśmiercone przez wdychanie dwutlenku węgla.

5. Testowanie odpowiedzi na genomicznie zidentyfikowane cele w modelach PDX

  1. Rozpocznij wybrane leczenie celowane, gdy guzy są wyczuwalne palpacyjnie i osiągną 0,5cm3, mierzone za pomocą badania ultrasonograficznego.
    1. Przed wykonaniem badania ultrasonograficznego jamy brzusznej należy usunąć sierść z brzucha myszy i nałożyć sterylny smar w postaci galaretki.
    2. Użyj aparatu ultrasonograficznego z głowicą, aby uzyskać obrazy z guzem umieszczonym w przekroju poprzecznym. Wykonaj 3 pomiary na sesję dla każdego zwierzęcia i uśrednij wartość, aby uzyskać dokładniejszą ocenę wielkości guza.
    3. Przeanalizuj obrazy za pomocą dostępnego oprogramowania40.
  2. Chemioterapię składającą się z mieszaniny karboplatyny w dawce 51 mg/kg mc. i paklitakselu w dawce 15 mg/kg mc. podawanie dootrzewnowe (IP) raz w tygodniu przez łączny czas leczenia wynoszący 4-6 tygodni. Upewnij się, że całkowita objętość do wstrzyknięcia nie przekracza 0,2 ml.
  3. Przygotuj roztwór podstawowy MK-220641 w 30% cyklodekstrynie (np. Captisol) i dostarczaj przez zgłębnik doustny w dawce 120 mg/kg dziennie przez 4 kolejne tygodnie.
  4. Przygotuj mysz do gajnika ustnego, przytrzymując ją, ściskając skórę grzbietu i przypinając ją z powrotem, tak aby głowa i kończyny myszy były unieruchomione.
    1. Włóż sondę zgłębnika do tylnej części gardła myszy, aż sonda dotrze do przełyku. Upewnij się, że sonda nie jest włożona zbyt głęboko, ponieważ płuca myszy mogą się przebić, powodując śmierć.
  5. Przygotuj roztwór podstawowy MK-866942 w etanolu w dawce 25 mg/ml. Rozcieńczyć go w podłożu zawierającym 5,2% Tween 80, 5,2% PEG400 w sterylnej wodzie do wstrzykiwań IP w dawce 10 mg/kg mc. przez 5 dni co drugi tydzień, przy łącznym czasie trwania leczenia wynoszącym 4 tygodnie.
    UWAGA: Objętość wstrzyknięta myszom powinna wynosić 50-120 ml, w zależności od masy ciała zwierzęcia.
  6. Użyj 7-8 myszy na grupę badaną, aby mieć wystarczającą moc statystyczną do wykrycia różnic43,44.
  7. Codziennie oceniaj masę ciała i ogólny stan myszy w terapii. Wstrzymaj się z przyjmowaniem leków, jeśli waga zwierzęcia spadnie o 20% lub więcej w stosunku do jego początkowej wagi.
  8. Oceniaj wielkość guza co tydzień za pomocą skanowania ultrasonograficznego. Upewnij się, że osoba monitorująca wzrost guza jest ślepa na leczenie, aby zapewnić bezstronną ocenę odpowiedzi.
    UWAGA: Mniejsze laboratoria mogą zatrudniać 2 różne osoby do prowadzenia leczenia i monitorowania ultrasonograficznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tkanki z wyciętych guzów jajnika pobrano podczas operacji redukcyjnych zgodnie z wytycznymi IRB i wykorzystano do 1) charakterystyki genomicznej oraz 2) przeszczepienia myszom z niedoborem odporności (Rysunek 1). Protokół sekwencjonowania mate-pair36,37 został zastosowany w celu zidentyfikowania zmian strukturalnych w DNA, w tym utrat, przyrostów i amplifikacji. Reprezentatywny wykres genomu ilustrujący krajobraz zmian genomicznych w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy podejście i protokoły, które zastosowaliśmy do przeprowadzenia "badania klinicznego" w modelach PDX, które wykorzystuje charakterystykę molekularną guza uzyskaną przez profilowanie genomowe w celu określenia najlepszego wyboru leków do testów. Wiele platform sekwencjonowania jest obecnie wykorzystywanych do charakterystyki genomowej nowotworów pierwotnych, w tym sekwencjonowania całego genomu, RNAseq i niestandardowych paneli genowych. W przypadku surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości, MPseq do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) dr Lin Yangowi i Faye R. Harris, MS, za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów. Praca ta została wsparta przez Prezent Pana i Pani Neil E. Eckles dla Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3M Vetbond3M, Spółka1469SB
przeciwciało anty-AKTTechnologie sygnalizacji komórkowej, Inc.9272
Przeciwciało anty-GAPDH (G-9)Santa Cruz Biotech. Inc.sc-365062
Technologie sygnalizacji komórkowejprzeciwciała anty-MAPK9926
Przeciwciało anty-fosfo-AKTTechnologie sygnalizacji komórkowej, Inc.9271
Przeciwciało anty-mTORTechnologie sygnalizacji komórkowej, Inc.2972
Przeciwciało anty-fosfo-mTORTechnologie sygnalizacji komórkowej, Inc.2971
Przeciwciało anty-Phospho-S6Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.4858
Przeciwciało anty-RictorTechnologie sygnalizacji komórkowej, Inc.2114
Przeciwciało anty-S6Technologie sygnalizacji komórkowej, Inc.2217
CaptisolChemScene, Inc.cs-0731
KarboplatynaNOVAPLUS, Inc.61703-360-18
DMEMMediatech, Inc.10-013-CV
Easy-A Enzym klonujący Hi-Fi PCRAgilent, Inc.600404-51
SmarCardinal Healthcare82-280
MatrigelCorning, Inc.
McCoy's mediaMediatech, Inc.10-050-CV
MK-2206ApexBio, Inc.A3010
MK-8669ARIAD Pharmaceuticals, Inc.
Nair Kościół Skóry Wrażliwej& Dwight Co.Nair Depilator Shower Power Sensitive
myszy NOD / SCIDCharles River, Inc.skinienie. CB17-Prkdcscid/NCrCrl
PaklitakselNOVAPLUS, Inc.55390-304-05
PEG400Millipore Sigma, Inc.88440-250ML-F
PerjetaGenetech, Co.Pertuzumab
RituximabGenetech, Co.Rituxan
RPMI1640Mediatech, Inc.10-040-CV
Myszy SCIDHarlan Laboratories, Inc.C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
Przetwornik liniowy SLAx 13-6MHzFUJIFILM SonoSite, IncHFL38xp
SonoSite Ultrasonograf serii SFUJIFILM SonoSite, IncSonoSite SII
Tween 80Millipore Sigma, Inc.Zobacz materiał P4780-100ML
, Inc.356234AP23573

Bibliografia

  1. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  2. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
  3. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
  4. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  5. Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
  6. Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
  8. Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
  9. Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
  10. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
  11. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
  12. Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
  13. Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
  15. Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
  16. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
  17. Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
  18. Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
  19. Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
  20. Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172(2016).
  21. Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
  22. Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
  23. Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
  24. 'Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
  25. Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
  26. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
  27. Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
  28. Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  29. Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125(2015).
  30. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  31. Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
  32. Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
  33. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  34. Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
  35. Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
  36. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
  37. Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
  38. Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
  39. Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
  40. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  41. Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
  42. Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
  43. Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
  44. Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14(2018).
  45. Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
  46. Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie nowej generacjianaliza zmian genomicznychmonitorowanie odpowiedzi na lekimyszy z niedoborem odpornościprzeszczepianie tkanki nowotworowejanaliza immunoblottingowaanaliza wzbogacenia szlaków sygnałowych
Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.