Method Article

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

DOI:

10.3791/60647

⸱

January 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie mRNA pojedynczych komórek poczyniło znaczne postępy w ciągu ostatnich kilku lat i stało się ważnym narzędziem w dziedzinie biologii rozwojowej. Został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji rzadkich populacji komórek, odkrywania nowych genów markerowych oraz dekodowania przestrzennych i czasowych informacji rozwojowych. W ciągu ostatnich dwóch, trzech lat rozwinęła się również metoda jednokomórkowa od mikroprzepływowej technologii Fluidigm C1 do rozwiązań kropelkowych. Tutaj użyliśmy serca jako przykładu, aby zademonstrować, jak profilować komórki tkanki embrionalnej myszy za pomocą metody scRNA-Seq opartej na kropelkach. Ponadto zintegrowaliśmy dwie strategie z przepływem pracy, aby profilować wiele próbek w jednym eksperymencie. Korzystając z jednej ze zintegrowanych metod, jednocześnie sprofilowaliśmy ponad 9 000 komórek z ośmiu próbek serca. Metody te będą cenne dla dziedziny biologii rozwoju, zapewniając opłacalny sposób jednoczesnego profilowania pojedynczych komórek z różnych środowisk genetycznych, etapów rozwojowych lub lokalizacji anatomicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profil transkrypcyjny każdej pojedynczej komórki różni się między populacjami komórek podczas rozwoju embrionalnego. Chociaż jednocząsteczkowa hybrydyzacja in situ może być wykorzystana do wizualizacji ekspresji niewielkiej liczby genów1, sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq) zapewnia bezstronne podejście do zilustrowania wzorców ekspresji genów w całym genomie w pojedynczych komórkach. Po pierwszej publikacji w 2009 roku2, scRNA-Seq został zastosowany do badania wielu tkanek na różnych etapach rozwoju w ostatnich latach3,4,5. Ponadto, w związku z tym, że atlas komórek ludzkich rozpoczął niedawno swoje projekty ukierunkowane na rozwój, oczekuje się, że w najbliższej przyszłości zostanie wygenerowanych więcej danych dotyczących pojedynczych komórek z ludzkich tkanek embrionalnych.

Serce, jako pierwszy organ, który się rozwija, odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym. Serce składa się z wielu typów komórek, a rozwój każdego typu komórek jest ściśle regulowany czasowo i przestrzennie. W ciągu ostatnich kilku lat scharakteryzowano pochodzenie i linię komórkową komórek serca we wczesnych stadiach rozwoju6, które stanowią niezwykle użyteczne narzędzie nawigacyjne do zrozumienia patogenezy wrodzonych wad serca, a także do opracowania bardziej zaawansowanych technologicznie metod stymulowania regeneracji kardiomiocytów7.

W ostatnich latach scRNA-Seq przeszedł gwałtowny rozwój8,9,10. Dzięki nowo opracowanym metodom, projektowanie i analiza eksperymentów z pojedynczymi komórkami stały się bardziej osiągalne11,12,13,14. Przedstawiona tutaj metoda jest komercyjną procedurą opartą na roztworach kropelkowych (patrz Tabela materiałów)15,16. Metoda ta polega na wychwytywaniu komórek i zestawów unikalnie oznaczonych kodami kreskowymi kulek w kropelce emulsji olejowo-wodnej pod kontrolą systemu sterownika mikroprzepływowego. Szybkość ładowania komórek do kropelek jest bardzo niska, tak że większość emulsji kropelkowych zawiera tylko jedną komórkę17. Pomysłowa konstrukcja procedury polega na rozdzieleniu pojedynczych komórek na emulsje kropelkowe zachodzące jednocześnie z kodowaniem kreskowym, co umożliwia równoległą analizę pojedynczych komórek za pomocą RNA-Seq na niejednorodnej populacji.

Włączenie strategii multipleksowania jest jednym z ważnych dodatków do tradycyjnego przepływu pracy z pojedynczymi komórkami13,14. Ten dodatek jest bardzo przydatny w odrzucaniu dubletów komórkowych, zmniejszaniu kosztów eksperymentów i eliminowaniu efektów wsadowych18,19. Strategia kodów kreskowych opartych na lipidach i strategia kodów kreskowych opartych na przeciwciałach (patrz tabela materiałów) to dwie najczęściej stosowane metody multipleksowania. Określone kody kreskowe są używane do oznaczania każdej próbki w obu metodach, a oznaczone próbki są następnie mieszane w celu wychwycenia pojedynczych komórek, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Następnie zbiorcze dane sekwencjonowania można rozdzielić, analizując sekwencje kodów kreskowych (Rysunek 1)19. Istnieją jednak znaczne różnice między tymi dwiema metodami. Strategia kodowania kreskowego oparta na lipidach opiera się na oligonukleotydach modyfikowanych lipidami, które nie stwierdzono, aby miały jakiekolwiek preferencje dotyczące typu komórki. Podczas gdy strategia kodowania kreskowego oparta na przeciwciałach może wykryć tylko komórki wyrażające białka antygenu19,20. Ponadto barwienie lipidów zajmuje około 10 minut, ale barwienie przeciwciał trwa 40 minut (ryc. 1). Co więcej, oligonukleotydy modyfikowane lipidami są tańsze niż oligonukleotydy sprzężone z przeciwciałami, ale nie są dostępne na rynku w momencie pisania tego artykułu. Wreszcie, strategia oparta na lipidach może multipleksować 96 próbek w jednym eksperymencie, ale strategia oparta na przeciwciałach może obecnie multipleksować tylko 12 próbek.

Zalecana liczba komórek do multipleksowania w pojedynczym eksperymencie powinna być mniejsza niż 2,5 x 104, w przeciwnym razie doprowadzi to do wysokiego procentu dubletów komórkowych i potencjalnego zanieczyszczenia mRNA w otoczeniu. Dzięki strategiom multipleksowania koszt wychwytywania pojedynczych komórek, generowania cDNA i przygotowania biblioteki dla wielu próbek zostanie zredukowany do kosztu jednej próbki, ale koszt sekwencjonowania pozostanie taki sam.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura dotycząca zwierząt jest zgodna z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu (IACUC).

1. Sekcja embrionalnego serca myszy i przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki

UWAGA: Ten krok może zająć kilka godzin, w zależności od liczby zarodków do sekcji.

  1. Aby uzyskać serca embrionalne E18,5, należy poddać eutanazji ciężarną mysz CD1 poprzez podanie CO2 . Użyj maszynki do golenia, aby usunąć niechciane owłosienie w okolicy brzucha i zdezynfekuj skórę 70% etanolem.
  2. Przeciąć skórę brzucha za pomocą wysterylizowanych nożyczek i ostrożnie wypreparować zarodki i szybko umieścić je w zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.
  3. Ostrożnie wyizoluj serca z każdego pojedynczego zarodka w 10-centymetrowym naczyniu wypełnionym zimnym PBS pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy i nożyczek.
    UWAGA: Utrzymuj cztery komory w stanie nienaruszonym, preparując płuco z sercem razem i NIE chwytaj/ciągnij bezpośrednio serca za pomocą narzędzi chirurgicznych.
  4. Przenieś ~10 serc do nowego 10 cm naczynia wypełnionego zimnym PBS i mikropreparuj serca do lewego przedsionka, prawego przedsionka, lewej komory i prawej komory.
    UWAGA: Zakłada się, że z każdej próbki otrzyma się więcej niż 1 x 106 komórek. Zalecamy rozpoczęcie od co najmniej 1 x 105 komórek na próbkę.
  5. Przenieś każdą z 4 tkanek komory do probówki o pojemności 1,5 ml i posiekaj je na kawałki za pomocą nożyczek. Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w celu zebrania tkanek.
  6. Po zassaniu supernatantu dodać 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA do każdej probówki i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut. Delikatnie pipetować w górę i w dół 7-8 razy za pomocą pipety P1000.
  7. Jeśli stadium zarodkowe jest starsze niż E11,5, dodać 1 ml mieszaniny kolagenazy A/B 10 mg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-20 minut. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aż większość komórek zostanie rozdzielona.
  8. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 8 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), aby rozcieńczyć enzymy. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut. Zawieś komórki w 1 ml PBS i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 40 μm.
  9. Pobrać 15 μl objętości z każdej próbki i wymieszać z taką samą ilością 0,04% błękitu trypanowego. Załaduj to do komory zliczania komórek i policz komórki w liczniku komórek.
    UWAGA: Aby uzyskać wysokiej jakości wyniki, zaleca się, aby żywotność komórek była wyższa niż 95%.

2. Multipleksowanie pojedynczych komórek

UWAGA: Ten krok trwa co najmniej 40 minut, co różni się w zależności od liczby przetworzonych próbek. Do etapów wstępnego amplifikacji wymagany jest czysty obszar stołu potraktowany roztworem do dekontaminacji RNazy (kroki 2.11 do 3.11), a do etapów po amplifikacji wymagany jest oddzielny obszar czystej ławki (kroki po 3.11).

  1. Procedura kodowania kreskowego na podstawie lipidów (procedura fakultatywna 1)
    1. W oparciu o stężenie komórek, utrzymuj mniej niż 5 x 105 komórek na próbkę. Upewnij się, że zawiesina komórek jest wolna od zanieczyszczeń i agregatów komórkowych.
    2. Przygotować roztwór podstawowy 2 μM kotwicy/kodu kreskowego i roztwór podstawowy współkotwicy 2 μM dla każdej próbki (Tabela 1).
      UWAGA: Kotwica i współkotwica zostały uprzejmie podarowane przez laboratorium dr Zev J. Gartner. Aby zsyntetyzować te zmodyfikowane lipidami oligonukleotydy, sekwencje DNA sprzężono z kwasem tłuszczowym na stałym podłożu i oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC)18,19.
    3. Umyj komórki dwukrotnie PBS i zbieraj komórki w ilości 300 x g przez 5 minut. Zawieś komórki w 180 μl PBS.
    4. Dodaj 20 μl roztworu podstawowego z kotwicą/kodem kreskowym i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
    5. Dodać 20 μl roztworu podstawowego współkotwiącego i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, a następnie inkubować na lodzie przez kolejne 5 minut.
    6. Dodać 1 ml zimnego PBS z 1% BSA i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć jeszcze co najmniej 2 razy lodowatym 1% BSA w PBS.
    7. Połącz wszystkie próbki razem i przefiltruj przez sitka o wielkości 40 μm. Policz komórki i trzymaj zawiesinę komórek na lodzie do wykorzystania w sekcji 3.
  2. Procedura kodowania kreskowego na podstawie przeciwciał (procedura fakultatywna 2)
    1. Odwirować 1 x 106-2 x 106 komórek dla każdej próbki (od kroku 1.8) przy 300 x g przez 5 minut i zawiesić je w 100 μl buforu barwiącego (Tabela 1) w 1,5 ml probówek o niskim poziomie wiązania.
    2. Dodać 10 μl odczynnika blokującego Fc i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować przeciwciała (patrz tabela materiałów) przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C.
    4. Dodaj 1 μg każdego oligo-sprzężonego przeciwciała do 50 μl buforu do barwienia komórek, aby uzyskać roztwór do barwienia przeciwciał20. Dodać jeden roztwór barwiący przeciwciała do każdej probówki z próbką. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Umyć komórki 3 razy 1 ml PBS, wirować przez 5 minut w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Zebrać wszystkie próbki w żądanych proporcjach w 1 ml buforu barwiącego, wirować przez 5 minut w temperaturze 350 x g w temperaturze 4 °C.
    7. Zawiesić komórki w PBS w odpowiednim stężeniu (do 1 500 komórek/μl) i przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 40 μm. Natychmiast przejdź do następnego kroku.

3. Wytwarzanie kropelek i odwrotna transkrypcja mRNA

UWAGA: Ten krok zajmuje około 90 minut dla jednej reakcji multipleksowanej.

  1. Równowagi kulek żelowych (patrz Tabela materiałów) do temperatury pokojowej przez 30 minut. Wyjmij odczynniki z zestawu kulek żelowych w emulsji (GEMs) (patrz Tabela materiałów) i przechowuj je we wskazanej temperaturze.
  2. Zamontuj chip B w uchwycie na wióry (patrz tabela materiałów).
  3. Dozować 75 μl 50% roztworu glicerolu do nieużywanych studzienek w rzędzie 1; 40 μl w rzędzie 2 i 280 μl w rzędzie 3. Nie dodawaj glicerolu do żadnych studzienek regeneracyjnych w górnym rzędzie chipa.
  4. Przygotować mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie z tabelą 1. Dodaj odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej i wody wolnej od nukleaz do mieszanki głównej zgodnie z tabelą kalkulatora objętości zawiesiny komórek17 i delikatnie pipetuj mieszankę. Dozować 75 μl mieszaniny komórek do dolnej środkowej części dołka na próbkę w rzędzie 1 bez wprowadzania pęcherzyków.
  5. Wiruj kulki żelowe przez 30 sekund za pomocą adaptera wirowego i powoli dozuj 40 μl kulek żelowych do dolnej środkowej części kulki żelowej w rzędzie 2 bez wprowadzania pęcherzyków.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby odczekać 30 sekund między dodaniem komórek i kulek żelowych, aby uniknąć awarii zwilżania.
  6. W przypadku dołka naftowego do rozdzielania w rzędzie 3 należy dozować 280 μl oleju rozdzielającego przez ścianę boczną studzienki.
    UWAGA: Załadowanie mniej niż 270 μl oleju do rozdzielania doprowadzi do nieprawidłowego wytwarzania GEMs.
  7. Przymocuj uszczelkę do chipa, nie dociskaj uszczelki i trzymaj ją poziomo, aby uniknąć zamoczenia uszczelki.
  8. Załaduj zmontowany chip z uszczelką do kontrolera chromu i uruchom program B z pojedynczą komórką chromu (patrz tabela materiałów), natychmiast przejdź do następnego kroku po zakończeniu programu.
  9. Wyjmij wiór i wyrzuć uszczelkę. Odchyl pokrywę z powrotem, aby odsłonić studzienki pod kątem 45°, sprawdź poziom płynu, aby upewnić się, że nie ma zatorów.
  10. Powoli zassać 100 μl GEM z najniższych punktów studzienki regeneracyjnej i sprawdzić jednorodność GEM. Dozuj GEM do nowej probówki do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na lodzie tak, aby końcówki pipet przyłożyły się do bocznej ścianki probówki.
    UWAGA: W przypadku zaobserwowania nadmiaru warstwy wodnej zaleca się ponowne przygotowanie próbek. Co ważne, należy zrobić zdjęcie mieszaniny, gdy GEM-y są jeszcze w końcówkach pipet. Na tym zdjęciu można stwierdzić, czy występuje awaria zwilżania, częściowo zemulgowane GEM i zatkanie odczynnika. Zdjęcie może być również wykorzystane jako dowód w celu uzyskania zwrotu kosztów od firmy produkującej odczynniki wraz z zamiennikami odczynników i chipami.
  11. Umieść probówkę w termocyklerze i wykonaj procedurę odwrotnej transkrypcji (Tabela 2).
    UWAGA: Zatrzymaj się tutaj lub przejdź do następnego kroku. Produkt PCR może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia.

4. Amplifikacja cDNA

UWAGA: Ten krok zajmuje około 150 minut.

  1. Czyszczenie po odwrotnej transkrypcji pojedynczej komórki
    1. Wyjmij odczynniki do amplifikacji cDNA z zestawu GEMs (patrz tabela materiałów) i przechowuj je we wskazanej temperaturze.
    2. Dodać 125 μl środka odzysku do próbki w temperaturze pokojowej, aby uzyskać mieszaninę dwufazową. Nie należy obserwować nieprzezroczystej cieczy i unikać pipetowania lub wirowania mieszaniny.
    3. Po odczekaniu 60 s powoli usuń 125 μl środka odzysku z dna probówki.
    4. Dokładnie wiruj kulki magnetyczne (patrz Tabela Materiałów) przez 30 sekund i natychmiast użyj ich do przygotowania mieszanki do czyszczenia kulek (Tabela 1). Odczynniki należy dodawać sekwencyjnie, zgodnie z listą.
    5. Zmieszać mieszaninę czyszczącą kulki i dodać 200 μl do próbki. Odpipetować mieszaninę 10 razy, a następnie inkubować ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać odczynniki sekwencyjnie, jak podano w Tabeli 1, aby przygotować roztwór elucyjny i wymyć cDNA w następujący sposób.
      1. Umieścić próbki na magnesie (pozycja wysoka) (patrz tabela materiałów), aż roztwór się klaruje, a następnie usunąć supernatant.
      2. Dodaj 200 μl 80% etanolu do granulatu. Odczekaj 30 sekund, a następnie usuń etanol.
      3. Powtórz krok 4.1.6.2 przez kolejne 2 razy. Odwirować na krótko i umieścić na magnesie (dolna pozycja). Ostrożnie usuń pozostały etanol i susz na powietrzu przez mniej niż 2 minuty
        UWAGA: NIE przekraczaj czasu suszenia powietrzem dłużej niż 2 minuty, w przeciwnym razie skuteczność elucji spadnie.
      4. Usuń próbkę z magnesu. Dodać 35,5 μl roztworu elucyjnego i odpipetować do 15-krotnego mieszania. Inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej.
      5. Umieść próbkę na magnesie (wysoka pozycja), aż roztwór się oczyści. Przenieść 35 μl próbki do nowego paska probówki.
        UWAGA: Ta procedura oczyszczania jest również stosowana w krokach 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 i 6.2.6. Zwróć uwagę na stężenie kulek magnetycznych i objętość buforu EB / ultraczystej wody używanej do elucji próbek na każdym etapie.
    7. Określ ilościowo wielkość, stężenie i integralność eluowanego cDNA za pomocą automatycznego przyrządu do elektroforezy21 (patrz Tabela materiałów) (Rysunek 2).
  2. Amplifikacja cDNA
    1. Amplifikacja cDNA przy użyciu strategii kodów kreskowych opartych na lipidach (opcjonalna procedura 1)
      1. Przygotować mieszaninę reakcyjną amplifikacji (tabela 1) na lodzie.
      2. Dodać mieszaninę z reakcji amplifikacji do 35 μl próbek cDNA (z kroku 4.1.6.7). Odpipetować mieszaninę i krótko odwirować. Mieszaninę należy inkubować w termocyklerze zgodnie z procedurą amplifikacji cDNA (Tabela 2).
      3. Po dokładnym zwirowaniu dodaj 120 μl wybranego odczynnika i 100 μl ultraczystej wody do 100 μl próbki, aby uzyskać 0,6x stężenie wybranego odczynnika (patrz tabela materiałów). Odpipetować mieszaninę 15 razy.
      4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić próbkę na magnesie, aż roztwory staną się klarowne.
        UWAGA: Endogenne cDNA we frakcji kulek i multipleksujące cDNA z kodem kreskowym znajduje się w supernatancie.
      5. Przenieś supernatant do probówki o niskim poziomie wiązania o pojemności 1,5 ml w celu multipleksowania konstrukcji biblioteki cDNA z kodami kreskowymi w kroku 6.1.
      6. Oczyścić endogenne cDNA, postępując zgodnie z krokami opisanymi w ppkt 4.1.6 i wymyć je za pomocą 40 μl buforu EB.
      7. Uruchom 1 μl oczyszczonej próbki cDNA na automatycznym przyrządzie do elektroforezy (patrz Tabela materiałów) w celu analizy/ilościowego określenia cDNA.
      8. Porcja 10 μl cDNA do nowej probówki PCR w celu budowy biblioteki endogennej.
        UWAGA: Zatrzymaj się tutaj lub przejdź do następnego kroku. Pozostała próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez okres do 4 tygodni, aby w razie potrzeby wygenerować dodatkowe biblioteki.
    2. Amplifikacja cDNA w strategii kodów kreskowych opartych na przeciwciałach (opcjonalna procedura 2)
      1. Dodać 2 pmol dodatkowego startera HTO i ADT oraz 15 μl starterów cDNA do 50 μl mieszaniny reakcji amplifikacji (Tabela 1) i przeprowadzić amplifikację cDNA za pomocą procedury amplifikacji cDNA (Tabela 2).
      2. Użyj 0,6x odczynnika selekcyjnego, aby oddzielić endogenne cDNA (frakcja kulek) i multipleksowanie kodu kreskowego cDNA (w supernatancie). Pamiętaj, aby zapisać supernatant w celu wykonania konstrukcji biblioteki kodów kreskowych w kroku 6.2.
      3. Oczyścić i wymyć endogenny transkrypt cDNA, postępując zgodnie z krokami opisanymi w ppkt 4.1.6, przeprowadzić kontrolę jakości (QC) bibliotek i podsycić 10 μl do nowej probówki PCR w celu budowy biblioteki endogennej.

5. Przygotowanie biblioteki transkrypcji endogenicznych

UWAGA: Ten krok zajmuje około 120 minut.

  1. Odczynniki konstrukcyjne biblioteki ekspresji genów z zestawu bibliotecznego (patrz Tabela materiałów) należy przechowywać odpowiednio we wskazanej temperaturze.
  2. Przygotować mieszaninę do rozdrobnienia (tabela 1) na lodzie, odpipetować do wymieszania i krótko odwirować.
  3. Dodać 25 μl buforu EB do 10 μl oczyszczonej próbki cDNA (z kroku 4.2.1.8 lub 4.2.2.3), a następnie dodać nowo przygotowaną mieszaninę fragmentacji 15 μl do próbki, odpipetować mieszaninę 15 razy na lodzie i krótko odwirować.
  4. Przenieść próbkę do wstępnie schłodzonego termocyklera i zainicjować program PCR w celu rozdrobnienia, naprawy końcowej i ogonowania A (tabela 2).
  5. Odczynnik Select Node (Odczynnik do zawieszania) kulek magnetycznych i kolejno za pomocą odczynników Select 0,6x i 0,8x umożliwia wybór rozmiaru dwustronnego zgodnie z instrukcją obsługi17,22. Użyj 50 μl buforu EB do elucji DNA.
  6. Przygotować mieszaninę do podwiązania za pomocą adaptera (Tabela 1), następnie dokładnie pipetować mieszaninę i krótko odwirować.
  7. Dodać 50 μl mieszaniny do ligacji adaptorowej do 50 μl próbki, ponownie wymieszać pipetą 15 razy i krótko odwirować. Wykonaj podwiązanie adaptera zgodnie z protokołem w termocyklerze (Tabela 2).
  8. Użyj 0,8x odczynnika selekcyjnego, aby oczyścić produkt ligacji i eluować oczyszczoną próbkę za pomocą 30 μl buforu EB (patrz krok 4.1.6).
  9. Przygotować mieszaninę PCR o wskaźniku próbki (tabela 1) i dodać 60 μl do oczyszczonej próbki. Dodać 10 μl wskaźnika próbki do próbki, pipetować w górę i w dół 5 razy i krótko odwirować, inkubować w termocyklerze zgodnie z protokołem indeksu próbki (tabela 2).
    UWAGA: Zatrzymaj się tutaj lub przejdź do następnego kroku. Jeśli używana jest więcej niż jedna studzienka, należy wybrać jeden konkretny indeks próbki (patrz tabela materiałów) dla każdej studzienki. Pamiętaj, aby zapisać identyfikator indeksu używany dla każdej studzienki i upewnić się, że nie nakładają się na siebie w sekwencjonowaniu multipleksowanym.
  10. Kolejno użyj odczynników 0,6x i 0,8x, aby dokonać dwustronnego wyboru rozmiaru, aby uzyskać 35 μl oczyszczonej endogennej biblioteki komórkowej DNA17.
  11. Kontrola jakości endogennej biblioteki komórkowej przed sekwencjonowaniem (Rysunek 2).

6. Przygotowanie bibliotek cDNA z kodami kreskowymi do multipleksowania próbek

UWAGA: Ten krok zajmuje co najmniej 120 minut.

  1. Generowanie przykładowej biblioteki kodów kreskowych dla strategii multipleksowania na bazie lipidów (opcjonalna procedura 1)
    1. Dodać 520 μl wybranego odczynnika i 360 μl izopropanolu do próbki cDNA z kodem kreskowym z kroku 4.2.1.5, aby uzyskać 3,2-krotne stężenie odczynnika selekcyjnego. Odpipetować mieszaninę 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór się usunie. Następnie odrzucić supernatant.
    3. Użyj 500 μl 80% etanolu, aby dwukrotnie umyć koraliki na magnesie i odczekaj 30 s po każdym praniu.
    4. Krótko odwiruj kulki i umieść na magnesie. Usuń pozostały etanol za pomocą mikropipety P10 i pozostaw kulki na 2 minuty.
    5. Wyjmij probówkę ze stojaka na magnesy i ponownie zawieś kulki w 50 μl buforu EB. Pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    6. Umieść rurkę z powrotem na magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie. Przenieś supernatant (próbkę kodu kreskowego cDNA) do nowej probówki PCR. Uważaj, aby nie przenieść żadnych koralików.
    7. Określ ilościowo stężenie próbki kodu kreskowego cDNA23.
    8. Przygotować mieszaninę biblioteki lipidowych kodów kreskowych (Tabela 1), dodać 3,5 ng oczyszczonego cDNA z kodem kreskowym (z kroku 6.1.6) i wody wolnej od nukleaz do całkowitej objętości 50 μl.
    9. Przechowuj go w termocyklerze zgodnie z biblioteką kodów kreskowych na bazie lipidów PCR (Tabela 2).
    10. Użyj 1,6 x wybranego odczynnika, aby oczyścić produkt PCR i eluować DNA za pomocą 25 μl buforu EB (patrz krok 4.1.6).
    11. Określ ilościowo stężenie biblioteki za pomocą metody analizy DNA o wysokiej czułości24 od początkowego rozcieńczenia 1:5 (Rysunek 2).
  2. Generowanie przykładowej biblioteki kodów kreskowych dla strategii multipleksowania opartej na przeciwciałach (opcjonalna procedura 2)
    1. Dodaj dodatkowe 1,4x objętość reakcyjną wybranego odczynnika do supernatantu zawierającego kody kreskowe próbek uzyskane z kroku 4.2.2.3, aby uzyskać 2-krotny stosunek odczynnika selekcyjnego.
    2. Umyj kulki 80% etanolem, postępując zgodnie z krokami opisanymi w 4.1.6 i wymyj cDNA z kodem kreskowym ultraczystą wodą.
    3. Wykonaj protokół selekcyjny z 2x odczynnikiem Select po raz drugi i eluuj za pomocą ultraczystej wody.
    4. Przygotować mieszaninę biblioteki kodów kreskowych przeciwciał (Tabela 1) i dodać 45 μl oczyszczonego cDNA z kodem kreskowym z ostatniego etapu.
    5. Inkubować w termocyklerze zgodnie z biblioteką kodów kreskowych przeciwciał PCR (Tabela 2)20.
    6. Użyj 1,6x wybranego odczynnika do oczyszczenia produktu PCR i eluuj oczyszczoną próbkę za pomocą 30 μl ultraczystej wody (patrz krok 4.1.6).

7. Sekwencjonowanie biblioteki

UWAGA: Wiele platform sekwencjonowania nowej generacji, takich jak HiSeq 4000 i NovaSeq, może być używanych do sekwencjonowania bibliotek endogenicznych transkryptów i bibliotek kodów kreskowych multipleksowania.

  1. Użyj wybranej platformy sekwencjonowania nowej generacji, aby sekwencjonować endogenne biblioteki transkrypcji i biblioteki kodów kreskowych multipleksowania.
  2. Rozcieńczyć biblioteki zgodnie z zaleceniami eksperta z firmy zajmującej się sekwencjonowaniem lub zakładu sekwencjonowania. Zalecane jest minimum 20 000 odczytów na komórkę dla biblioteki endogenicznych transkrypcji i 3000 odczytów dla bibliotek kodów kreskowych.

8. Analiza danych

UWAGA: Demultipleksuj dane sekwencjonowania za pomocą zasobu w chmurze BaseSpace lub uruchamiając pakiet bcl2fastq na serwerze UNIX.

  1. Endogeniczna analiza danych transkryptomu
    1. Z danymi fastq wygenerowanymi przez oprogramowanie do demultipleksowania, uruchom "mkfastq" w dostępnym na rynku potoku analizy danych (patrz Tabela materiałów), aby dalej demultipleksować każdy kod kreskowy GEMs.
    2. Uruchom polecenie "count", aby wykonać wyrównanie, filtrowanie, zliczanie kodów kreskowych i zliczanie UMI.
    3. Opcjonalnie uruchom polecenie "aggr", aby zagregować wiele torów sekwencjonowania z jednego eksperymentu.
    4. Użyj "przeglądarki komórek" (patrz Spis materiałów), aby wizualizować dane, grupować komórki, identyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji i generować wykresy mapy cieplnej tSNE lub ekspresji genów.
    5. Opcjonalnie użyj dobrze utrzymanej platformy opartej na języku R25 (patrz tabela materiałów), aby znormalizować i skalować dane, zidentyfikować geny o zróżnicowanej ekspresji oraz wygenerować wykresy tSNE/UMAP i mapy cieplne ekspresji genów (Rysunek 3).
  2. Multipleksowanie danych kodów kreskowych
    1. Analiza danych ze strategii kodów kreskowych opartych na lipidach
      1. Użyj dostępnego na rynku potoku analizy danych lub pakietu deMULTIplex R (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq), aby przekonwertować przykładowe pliki kodów kreskowych FASTQ na przykładową macierz liczby kodów kreskowych UMI.
      2. Załaduj macierz zliczania UMI kodów kreskowych wraz z endogennymi danymi transkryptomu na platformę opartą na R (patrz Tabela materiałów) w celu analizy integracji (Rysunek 3).
    2. Analiza danych ze strategii kodów kreskowych opartych na przeciwciałach
      1. Użyj "liczby" z dostępnego na rynku potoku analizy danych, aby zmapować kody kreskowe, podając plik CSV biblioteki i plik CSV z odniesieniem do funkcji hashtagu.
      2. Załaduj wyjściową, ujednoliconą matrycę kodów kreskowych, która zawiera liczbę ekspresji genów wraz z liczbą kodów kreskowych funkcji dla każdego kodu kreskowego komórki, na platformę opartą na języku R w celu dalszej analizy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu użyliśmy embrionalnego serca myszy jako przykładu, aby pokazać, jak przeprowadzano multipleksowane sekwencjonowanie mRNA pojedynczej komórki w celu jednoczesnego przetwarzania różnych próbek z różnych części narządu. Serca myszy E18.5 CD1 wyizolowano i rozbiorowano na lewy przedsionek (LA), prawy przedsionek (RA), lewą komorę (LV) i prawą komorę (RV). Komórki przedsionków i komór zostały następnie niezależnie oznaczone kodami kreskowymi przy użyciu procedury kodowania kresko...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu zademonstrowaliśmy protokół analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek. Udostępniliśmy również dwie opcjonalne metody multipleksowania próbek w przepływie pracy scRNA-Seq. Obie metody okazały się wykonalne w różnych laboratoriach i dostarczyły rozwiązań do przeprowadzenia opłacalnego i wolnego od efektów wsadowych eksperymentu z pojedynczą komórką18,26.

Jest kilka kroków, które należy dokładnie wykonać podczas ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Davidowi M. Pattersonowi i Christopherowi S. McGinnisowi z laboratorium Dr. Zev J. Gartnera za uprzejme dostarczenie odczynników do kodów kreskowych na bazie lipidów oraz sugestie dotyczące etapów eksperymentu i analizy danych. Praca ta została założona przez National Institutes of Health (HL13347202).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x Uchwyt na chipy10x Genomics120252 330019
10x Kontroler chromu10x Genomics120223
10x Separator magnetyczny10x Genomics120250 230003
10x Adapter Vortex10x Genomics330002, 120251
10x Klips Vortex10x Genomics120253 230002
4200 System TapeStationAgilentG2991AA
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626Uniwersytet w Pittsburghu Sekwencjonowanie Podstawowy
kod kreskowy OligoZintegrowane technologie DNAJednoniciowy DNA25 nmol
Bufor EBQiagen19086
Myszy CD1Chales RiverStrain Code 022zamówione ciężarne myszy
Wirówka 5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Zestaw pojedynczych komórek, 48 rxns10x Genomics1000073Przechowywać w temperaturze otoczenia
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns10x Genomics1000094Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v310x Genomics1000095Przechowywać w temperaturze -20 & C
Chromium Single Cell 3' V3 Żelowe kulki10x Genomics2000059Przechowywać w temperaturze -80 & C
Kolagenaza ASigma/Millipore10103578001Przechowywać proszek w temperaturze 4 stopni; C, przechowywać w temperaturze -20 &; C po rozpuszczeniu
Kolagenaza BSigma/Millipore11088807001Przechowywać proszek w temperaturze 4 & stopni; C, przechowywać w temperaturze -20 &; C po rozpuszczeniu
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Uniwersytet w Pittsburghu Sekwencjonowanie Sekwencjonowanie Core
DNA LoBind Probówka do mikrowirówek, 1,5 mlEppendorf022431021
DNA LoBind, 2,0 mlEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, stosowany w Beads Cleanup Mix (Tabela 1)
Magnes DynaMag-2Theromo Scientific12321D
Etanol, czysty (200 proof, bezwodny)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP ProbówkaCorning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Probówka wirówkowaCorning Cellgro14-959-49A
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Stany ZjednoczoneFisher Scientific 26140079Store w temperaturze -20 & stopni; C
Pipety wielokanałowe Finnpipette F1, 10-100μ lTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1, 1-10μ lTheromo Scientific4661000N
Filtr siatkowy FlowmiSigmaBAH136800040Porowatość 40 μ m, na końcówki do pipet 1000 μL, opakowanie po 50 sztuk
Gliceryna (glicerol), 50% (v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX (roztwór blokujący receptor Fc)BioLegend422301Dodaj 5 &mikro; l ludzkiego TruStain FcX na milion komórek w 100 i mikro; l objętość barwienia
Izopropanol (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, stosowany w mieszance bibliotek kodów kreskowych znakowanych lipidami (tabela 1)
Lipidowy podkład kodów kreskowych (Multi-seq Primer)Zintegrowane technologie DNAJednoniciowy bufor DNA100 nmol
o niskiej zawartości TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Woda wolna od nukleaz (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
Probówki do PCR 0,2 ml 8 probówekEppendorf951010022
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1X bez wapnia i magnezuCorning Cellgro21-040-CV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 10% albuminą bydlęcą (alternatywa dla produktu Thermo Fisher)Sigma-AldrichSRE0036
Piper 4-pak (0,1– 2,5μ L, 0,5-10μ L, 10– 100μ L, 100– 1,000μ L Pipety o zmiennej objętościFisher Scientific05-403-151
Odczynnik selekcyjny (zestaw odczynników SPRIselect)Beckman CoulterB23318 (60ml)
Przełącznik szablonu Oligo10x Genomics3000228Przechowywać w temperaturze -20 ° C, używany w Master Mix (Tabela 1)
Strategia kodów kreskowych oparta na przeciwciałach jest również znana jako haszowanie
Przeglądarka komórek to Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-lupe-cell-browser
Komercyjnie dostępna linia analityczna w kroku 8.1 to Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ najnowsze/co-jest-strażnikiem-komórki
Strategia kodowania kreskowego oparta na lipidach jest również znana jako MULTI-seq
Dobrze utrzymana platforma R to Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipettip USA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL końcówka do pipety z filtrem o ultra niskiej retencjiUSA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul końcówka do pipety z filtrem o ultra niskiej retencjiUSA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 anty-mysie Hashtag 1 PrzeciwciałoBioLegend1558010,1 - 1,0 i mikro; g przeciwciała w 100 &mikro; l bufora barwiącego na każdy 1 milion komórek
TotalSeq-A0302 anty-mysie Hashtag 2 PrzeciwciałoBioLegend1558030,1 - 1,0 &mikro; g przeciwciała w 100 &mikro; l bufora barwiącego na każdy 1 milion komórek
TotalSeq-A0302 anty-mysie Hashtag 3 PrzeciwciałoBioLegend1558050,1 - 1,0 i mikro; g przeciwciała w 100 &mikro; l bufora barwiącego na każdy 1 milion komórek
Starter TrueSeq RPIZintegrowane technologie DNAJednoniciowe DNA100 nmol, stosowane w mieszance bibliotek kodów kreskowych znakowanych lipidami (Tabela 1)
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Fisher Scientific15250061
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaFisher Scientific25200-056
Uniwersalnezintegrowane technologie DNA I5Jednoniciowy DNA100 nmol
Probówka do mikrowirówek wirówkowa Pipety wielokanałowe komórek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877(2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377(2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476(2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100(2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367(2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175(2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77(2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018).
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. Agilent 4200 TapeStation System. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019).
  22. SPRIselect User Guide. , Beckman Coulter. https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012).
  23. Qubit 4 Fluorometer User Guide. , Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018).
  24. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Agilent. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411(2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide. , 10x Genomics. https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell mRNA SequencingMultiplexed scRNA SeqMouse Embryonic CellsDroplet Based MethodHeart Tissue ProfilingCellular Heterogeneity AnalysisGene Ontology PathwayCell Type AnnotationAnatomical Zone ComparisonBarcoded cDNA Library

Related Articles