Artykuł metodologiczny

Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy

DOI:

10.3791/60652

⸱

21 grudnia 2019

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę badania przesiewowego czynników przeciwwirusowych zapalenia wątroby typu B, które hamują interakcję HBx-DDB1 za pomocą systemu testów z podziałem lucyferazy. System ten pozwala na łatwe wykrywanie oddziaływań białko-białko i nadaje się do identyfikacji inhibitorów takich interakcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe środki terapeutyczne na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV). Chociaż obecnie dostępne analogi nukleo(t)ide silnie hamują replikację wirusa, nie mają bezpośredniego wpływu na ekspresję białek wirusowych transkrybowanych z wirusowego kowalencyjnie zamkniętego kolistego DNA (cccDNA). Ponieważ wysokie miano antygenu wirusa może odgrywać rolę w tej przewlekłej i związanej z HBV kancerogenezie, celem leczenia HBV jest wyeliminowanie białek wirusowych. Białko regulatorowe X (HBx) HBV wiąże się z białkiem białka 1 wiążącego uszkodzenie DNA gospodarza (DDB1) w celu degradacji strukturalnego utrzymania chromosomów 5/6 (Smc5/6), co powoduje aktywację transkrypcji wirusa z cccDNA. Tutaj, korzystając z systemu testów komplementacji podzielonej lucyferazy, przedstawiamy kompleksowy system badań przesiewowych związków w celu identyfikacji inhibitorów interakcji HBx-DDB1. Nasz protokół umożliwia łatwe wykrywanie dynamiki interakcji w czasie rzeczywistym w żywych komórkach. Technika ta może stać się kluczowym testem do odkrycia nowych środków terapeutycznych w leczeniu zakażenia HBV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, z rocznymi szacunkami 240 milionów ludzi przewlekle zakażonych HBV i 90 000 zgonów z powodu powikłań infekcji, w tym marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC)1. Chociaż obecne leki przeciw HBV, analogi nukleozydów, wystarczająco hamują odwrotną transkrypcję wirusa, rzadko osiągają eliminację białek wirusowych, co jest długoterminowym celem klinicznym. Ich słaby wpływ na eliminację białek wirusowych wynika z braku bezpośredniego wpływu na transkrypcję wirusa z episomalnych wirusowych indeksów kowalencyjnie zamkniętych kolistych DNA (cccDNA) w jądrze hepatocytów2.

Transkrypcja HBV jest aktywowana przez białko regulatorowe HBV X (HBx)3. Ostatnie badania wykazały, że HBx degraduje strukturalne utrzymanie chromosomów 5/6 (Smc5/6), czynnika ograniczającego gospodarza, który blokuje transkrypcję HBV z cccDNA, poprzez przejęcie kompleksu ligazy ubikwityny DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Dlatego uważa się, że kluczowym krokiem w promowaniu transkrypcji wirusa z cccDNA jest interakcja HBx-DDB1. Związki zdolne do hamowania wiązania między HBx i DDB1 mogą blokować transkrypcję wirusa, a nitazoksanid został zidentyfikowany jako inhibitor interakcji HBx-DDB1 za pomocą systemu przesiewowego opracowanego w naszym laboratorium7.

Tutaj prezentujemy nasz wygodny system przesiewowy używany do identyfikacji inhibitorów interakcji HBx-DDB1, który wykorzystuje podzielony test komplementarny lucyferazy7,8. Rozdzielone podjednostki lucyferazy są połączone z HBx i DDB1, a interakcja HBx-DDB1 zbliża podjednostki do siebie, tworząc funkcjonalny enzym, który generuje jasny sygnał luminescencyjny. Ponieważ interakcja między podjednostkami jest odwracalna, system ten może wykrywać szybko dysocjujące białka HBx-DDB1 (ryc. 1). Korzystając z tego systemu, można łatwo przeprowadzić badania przesiewowe dużej biblioteki związków, co może skutkować odkryciem nowych związków zdolnych do skutecznego hamowania interakcji HBx-DDB1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schematyczne przedstawienie testu rozszczepionej lucyferazy jest pokazane w Rysunek 1A, a proces testu jest opisany w Rysunek 1B. Dynamika interakcji może być mierzona w czasie rzeczywistym bez lizy komórek.

1. Przygotowanie komórek

  1. Utrzymuj hodowane komórki HEK293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1x penicyliną/streptomycyną w temperaturze 37 °C w 20%O2 i 5% CO2 .
  2. Wysiewać 5 x 106 komórek do naczynia o średnicy 100 mm z 10 ml DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Przejściowo transfekować 1 μg HBx i DDB1 z rozszczepionymi lucyferazy do komórek zgodnie z następującą metodą.
    UWAGA: Ilość transfekowanego plazmidowego DNA może zależeć od użytego regenta transfekcji. Należy wcześniej określić optymalną pozycję rozszczepionej lucyferazy połączonej z białkiem docelowym. W tym przypadku HBx połączony z LgBit na C-końcu HBx (HBx-LgBit) i DDB1 połączony z SmBit na N-końcu DDB1 (SmBit-DDB1) zapewniły najlepsze wyniki (tj. Najjaśniejsze sygnały lucyferazy). Proces ten został już wcześniej szczegółowo opisany7.
    1. Rozcieńczyć 1 μg plazmidu DNA wykazującego ekspresję HBx-LgBit i 1 μg plazmidu DNA wykazującego ekspresję SmBit-DDB1 (tabela materiałów) w buforze kondensacyjnym DNA (tabela materiałów) do całkowitej objętości 300 μl.
    2. Dodać 16 μl roztworu wzmacniacza (tabela materiałów) i mieszać przez wirowanie przez 1 s.
    3. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    4. Dodać 60 μl odczynnika do transfekcji (tabela materiałów) do próbki i mieszać przez wirowanie przez 10 s.
    5. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 8 minut.
    6. Podczas inkubacji należy odessać pożywkę hodowlaną z naczynia (przygotowanego w kroku 1.2) i przemyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usunąć PBS przez aspirację i dodać 7 ml DMEM.
    7. Dodać 3 ml DMEM do probówki zawierającej kompleksy transfekcji. Wymieszać pipetując i dodać kompleksy transfekcji na komórkę w naczyniu o średnicy 10 cm.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 przez 10 godzin.
  5. Ponownie zasiać komórki na białej 96-dołkowej płytce przy 5 x 104 komórki/basenik w 50 μl pożywki/basenik zgodnie z następującą metodą.
    1. Usunąć zużytą pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć komórki 5 ml PBS.
    2. Usunąć PBS przez aspirację, dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek.
    3. Dodać 4 ml DMEM i rozproszyć pożywkę, kilkakrotnie pipetując powierzchnię warstwy komórkowej. Przenieść zawiesinę komórek do probówki.
    4. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.
    6. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    7. Rozcieńczyć osad komórkowy buforowaną pożywką do hodowli komórkowych (tabela materiałów) uzupełnioną 10% FBS do gęstości wysiewu 1,0 x 106 komórek/ml.
    8. Odpipetować 50 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2 przez 10 godzin.

2. Badanie przesiewowe złożone

  1. Podczas inkubacji rozcieńczyć związki przesiewowe (tabela materiałów) i rozpuszczalnik (dimetylosulfotlenek [DMSO]) przy stężeniu 13,5x. Na przykład, jeśli podstawa wynosi 10 mM, a stężenie przesiewowe wynosi 10 μM, dodać 1 μl roztworu podstawowego do 73,1 μl buforowanej pożywki do hodowli komórkowych.
  2. Dodać 12,5 μl podłoża luminescencyjnego (tabela materiałów) do każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jako kontrole ujemne, studzienki na obu końcach płytki (tj. kolumny 1 i 12) nie powinny zawierać podłoża luminescencyjnego.
  3. Zmierz luminescencję linii bazowej za pomocą luminometru (tabela materiałów).
  4. Natychmiast po wstępnym pomiarze dodać 5 μl związków i kontrolować DMSO rozcieńczony w kroku 2.1 do każdej studzienki.
    UWAGA: Końcowe stężenie wyniesie 10 μM.
  5. Mierz wartości luminescencji co 30 minut przez 2 h.
    UWAGA: Płytkę należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej.
  6. Obliczyć efekty hamujące przez porównanie z kontrolnym leczeniem DMSO po normalizacji do sygnałów wyjściowych.
    UWAGA: Przesiewanie każdego związku w duplikatach lub trzech egzemplarzach może zmniejszyć zmienność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki wynikające z użycia tego protokołu są pokazane w Rysunek 2A,B. Stosunek sygnału do tła był większy niż 80, a współczynnik Z'9 (złoty standard jakości dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych) był większy niż 0,5, co wskazuje, że ten system testów był akceptowalny dla badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Przy progu ustalonym na >40% hamowania w porównaniu z grupą kontrolną (tylko D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy wygodną metodę badań przesiewowych przy użyciu testu rozszczepionej lucyferazy w celu znalezienia inhibitorów wiązania HBx-DDB1. Dynamika interakcji może być wykrywana w czasie rzeczywistym w żywych komórkach bez konieczności lizy komórek. Hamowanie interakcji HBx-DDB1 prowadzi do przywrócenia Smc5/6, co skutkuje zahamowaniem transkrypcji wirusa, ekspresji białka i produkcji cccDNA7. Ten nowy mechanizm działania przeciwwirusowego może przezwyciężyć niedoskonałości obecnych terapii HB...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii (#19H03430 i #17K09405 dla M.O., a #19J11829 dla K.S.), przez Grant-in-Aid na Badania Naukowe w Innowacyjnych Obszarach (#18H05024 do M.O.), przez Program Badawczy dotyczący Zapalenia Wątroby od Japońskiej Agencji Badań Medycznych i Rozwoju, AMED (do M.O., #JP19fk021005), w ramach programu Innowacyjnego Rozwoju i Zastosowania Nowych Leków na Wirusowe Zapalenie Wątroby typu B (#JP19fk0310102 do K.K.) od AMED, przez granty z Japońskiej Fundacji Enzymologii Stosowanej i z Fundacji Kobayashi na rzecz Badań nad Rakiem (dla M.O.), przez GSK Japan Research Grant 2018 (dla K.S.) oraz przez grant z Miyakawa Memorial Research Foundation (dla K.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 dołków, PS, F-BOTTOMGreiner-Bio-One GmbH655098
DMEMSigma AldrichD6046
DMSOTocris Bioscience3176
Odczynnik do transfekcji EffecteneQiagen301425Zawiera bufor kondensacyjny DNA, roztwór wzmacniający i odczynnik do transfekcji
FBSNichirei
Luminometr mikropłytkowy GloMax 96PromegaE6521
HBx– Plazmid DNA z ekspresją LgBitNasze laboratoriumDostępne na żądanie
HEK293T komórekKolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-11268
Systemy startowe NanoBiT PPIPromegaN2015Zawiera odczynnik Nano-Glo Live Cell
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021Opisany w manuskrypcie jako "buforowane podłoże do hodowli komórek"
PBSTakaraT900
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP0781
Screen-Well Zatwierdzona przez FDA biblioteka leków V2 wersja 1.0Enzo Life SciencesBML-2841Stosowane tutaj związki były następujące: mequinol, hydrat merkaptopuryny, mesna, mestranol, hemissiarczan metaproterenolu, dwuwinian metaraminolu, metaksam, chlorek metacholiny, metazolamid, metazolamid, hipurynian metenaminy, metokarbamol, metotreksat, metoksalen, bromek metskopolaminy, metsuksymid, metylotaliozyd, aminolewulinian metylu i middot; HCl, maleinian metyloergonowiny, metolazon, metyrapon, meksyletyna i middot; HCl, mikafungina, mikonazol, midodryna i middot; HCl, miglitol, milnacipran i middot; HCl, mirtazapina, mitotan i moexipril i middot; HCl, furoinian mometazonu, mupirocyna, nadolol, nafcylina i middot; Na, naftifine· HCl, naratryptan i middot; HCl, natamycyna, nebiwołol i middot; HCl, nelarabina, nepafenak, newirapina, niacyna, nikotyna, nilotynib, nilutamid, nitazoksanid, nityzynon, nitrofurantoina, nizatydyna, nortryptylina i middot; HCl, olsalazyna i middot; Na, orlistat, oksaprozyna, okstrifilina, chlorek oksybutyniny, oksytetracyklina i middot; HCl, paliperydon, palonosetron i middot; HCl, siarczan paromomycyny, pazopanib i middot; HCl, disód pemetreksedu, pemirolast potasu, penicylamina, penicylina G potasu, izetynian pentamidyny, pentostatyna, perindopryl erbumina, permetryna, perfenazyna, siarczan fenelzyny, fenylefryna, fitonadynon, pimekrolimus, pitawastatyna wapń i podofilox
SmBit– Plazmid DNA z ekspresją DDB1Nasze laboratoriumDostępne na żądanie
Trypsin-EDTASigma AldrichT4049
175012

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
  2. Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
  3. Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).
  4. Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
  5. Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
  6. Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648(2017).
  7. Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
  8. Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  10. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).
  11. Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
  12. Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
  13. de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115(2014).
  14. Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HBx DDB1 InteractionSplit Luciferase AssayCompound ScreeningProtein Protein InteractionHBV Therapeutic AgentsHEK293T Cell TransfectionLuminescence MeasurementZ Prime ScoreNitazoxanide InhibitionReal Time Detection

Powiązane artykuły