Method Article

Wydajny system ekspresji plazmidu sterowany transkrypcją do badania stabilności transkryptów mRNA w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych

DOI:

10.3791/60654

⸱

March 6th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 3Département de médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy narzędzie, które może być użyte do badania potranskrypcyjnej modulacji transkryptu w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą indukowalnego systemu ekspresji sprzężonego z techniką elektroporacji pipetowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie regulacji potranskrypcyjnej jest fundamentalne dla zrozumienia modulacji danego informacyjnego RNA (mRNA) i jej wpływu na homeostazę i metabolizm komórek. Rzeczywiście, fluktuacje w ekspresji transkryptu mogą modyfikować wydajność translacji i ostatecznie aktywność komórkową transkryptu. Opracowano kilka podejść eksperymentalnych w celu zbadania okresu półtrwania mRNA, chociaż niektóre z tych metod mają ograniczenia, które uniemożliwiają prawidłowe badanie modulacji potranskrypcyjnej. System indukcji promotora może wyrażać interesujący nas gen pod kontrolą syntetycznego promotora regulowanego tetracykliną. Metoda ta pozwala na oszacowanie okresu półtrwania danego mRNA w dowolnych warunkach eksperymentalnych bez naruszania homeostazy komórki. Jedną z głównych wad tej metody jest konieczność transfekcji komórek, co ogranicza zastosowanie tej techniki w izolowanych komórkach pierwotnych, które są wysoce odporne na konwencjonalne techniki transfekcji. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej były szeroko wykorzystywane do badania biologii komórkowej i molekularnej nabłonka pęcherzyków płucnych. Unikalne cechy i fenotyp pierwotnych komórek pęcherzyków płucnych sprawiają, że niezbędne jest badanie potranskrypcyjnych modulacji genów będących przedmiotem zainteresowania w tych komórkach. Dlatego naszym celem było opracowanie nowego narzędzia do badania potranskrypcyjnych modulacji mRNA będących przedmiotem zainteresowania w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej. Zaprojektowaliśmy szybki i wydajny protokół transfekcji przejściowej, aby wprowadzić kontrolowany transkrypcji system ekspresji plazmidu do pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych. Ta strategia klonowania, wykorzystująca epitop wirusa do znakowania konstruktu, pozwala na łatwe odróżnienie ekspresji konstruktu od endogennych mRNA. Stosując zmodyfikowaną metodę cyklu kwantyfikacji ΔΔ (Cq), ekspresję transkryptu można następnie określić ilościowo w różnych odstępach czasu w celu zmierzenia jego półtrwania. Nasze dane pokazują skuteczność tego nowatorskiego podejścia w badaniu regulacji potranskrypcyjnej w różnych stanach patofizjologicznych w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano kilka technik określania okresu półtrwania mRNA. Technika rozpadu impulsowego, która wykorzystuje znakowane mRNA, pozwala na jednoczesną ocenę dużej puli mRNA przy minimalnych zakłóceniach komórkowych. Jednak podejście to nie pozwala na bezpośrednie oszacowanie okresu półtrwania pojedynczego transkryptu genu i nie może być zaimplementowane do badania potranskrypcyjnej modulacji mRNA po stymulacji czynnikami wzrostu, ROS, alarminami lub stanem zapalnym1.

Stosowanie inhibitorów transkrypcji, takich jak aktynomycyna D i α-amanityna, jest stosunkowo prostą metodą pomiaru kinetyki degradacji mRNA w czasie. Jedną z głównych zalet tego podejścia w porównaniu z poprzednimi technikami (tj. pościg impulsowy) jest możliwość bezpośredniego oszacowania okresu półtrwania danego transkryptu i porównania, jak różne terapie mogą wpływać na kinetykę jego degradacji. Jednak znaczący szkodliwy wpływ inhibitorów transkrypcji na fizjologię komórki stanowi główną wadę tego podejścia2. Rzeczywiście, hamowanie transkryptomu całej komórki za pomocą tych leków ma negatywny efekt uboczny w postaci zakłócenia syntezy kluczowych elementów zaangażowanych w stabilność mRNA, takich jak mikroRNA (miRNA), a także ekspresji i syntezy białek wiążących RNA, które są ważne dla degradacji i stabilności mRNA. Poważne zaburzenia transkrypcji genów przez te leki mogą zatem sztucznie modyfikować krzywe degradacji transkryptów.

System indukcji promotora reprezentuje trzecie podejście do pomiaru okresu półtrwania określonego mRNA. Metoda ta mierzy degradację określonego mRNA w podobny sposób, jak metody wykorzystujące inhibitory transkrypcji. Często stosowane są dwa rodzaje systemów indukcyjnych: indukowany surowicą promotor c-fos < sup class="xref">3 oraz system indukowany Tet-Off4. W przypadku systemu c-fos nie jest konieczne stosowanie inhibitorów transkrypcji, które mogą być toksyczne dla komórki. Metoda ta wymaga jednak synchronizacji cyklu komórkowego, co uniemożliwia ocenę rzeczywistej stabilności transkryptu podczas interphase5. W przeciwieństwie do tego, system Tet-Off pozwala na silną ekspresję genu zainteresowania (GOI) pod kontrolą syntetycznego promotora regulowanego tetracykliną. System ten wymaga obecności dwóch elementów, które muszą zostać kotransfekowane do komórki, aby działały. Pierwszy plazmid (pTet-Off) wykazuje ekspresję białka regulatorowego tTA-Adv, hybrydowego syntetycznego czynnika transkrypcyjnego składającego się z represora prokariotycznego TetR (z Escherichia coli) połączonego z trzema domenami transaktywacji transkrypcji z białka wirusowego HSV VP16. Rząd Indii klonuje się do plazmidu pTRE-Tight pod kontrolą syntetycznego promotora (PTight), składającego się z minimalnej sekwencji promotora wirusa cytomegalii (CMV) połączonej z siedmioma powtórzeniami sekwencji operatora tetO. Transkrypcja genu za PTight zależy od interakcji TetR z tetO. W obecności tetracykliny lub jej pochodnej, doksycykliny, represor TetR traci swoje powinowactwo do operatora tetO, co prowadzi do zaprzestania transkrypcji4. Charakterystyka systemu Tet-Off sprawia, że jest on idealnym modelem do badania specyficznej ekspresji mRNA w komórkach eukariotycznych przy jednoczesnym unikaniu potencjalnych efektów plejotropowych, które są wtórne do braku prokariotycznych sekwencji regulatorowych w komórce eukariotycznej6. Zazwyczaj podwójnie stabilne linie komórkowe Tet-Off (HEK 293, HeLa i PC12) są używane z tym systemem do integracji kopii regulatora i plazmidów odpowiedzi w celu wygodnego dostępu do kontrolowanej ekspresji genów7,8,9.

Kilka modeli komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli zostało wykorzystanych do badania biologii komórkowej i molekularnej nabłonka pęcherzyków płucnych. Przez lata naukowcy intensywnie wykorzystywali ludzkie lub gryzonie pierwotne komórki10,11, a także unieśmiertelnione linie komórkowe, takie jak ludzkie komórki A549 lub szczurze RLE-6TN12,13. Chociaż są one na ogół mniej proliferacyjne i trudniejsze do hodowli i transfekcji, komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej pozostają złotym standardem w badaniu funkcji i dysfunkcji nabłonka pęcherzyków płucnych w stanach fizjologicznych i patologicznych. Rzeczywiście, unieśmiertelnione linie komórkowe, takie jak komórki A549, nie wykazują złożonych cech i fenotypów komórek pierwotnych, podczas gdy komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej podsumowują główne właściwości nabłonka pęcherzyków płucnych, w szczególności zdolność do tworzenia spolaryzowanej i szczelnej bariery14,15. Niestety, komórki te są bardzo odporne na konwencjonalne techniki transfekcji, takie jak te wykorzystujące liposomy, co sprawia, że użycie systemu indukowanego przez promotor, takiego jak Tet-Off, jest bardzo trudne.

Posttranskrypcyjna modulacja mRNA jest jedną z najskuteczniejszych metod szybkiego modulowania ekspresji genu transkryptu16. Region mRNA 3' bez translacji (3' UTR) odgrywa ważną rolę w tym mechanizmie. Wykazano, że w przeciwieństwie do 5' UTR, istnieje wykładnicza korelacja między długością 3' UTR a złożonością komórkową i morfologiczną organizmu. Ta korelacja sugeruje, że 3' UTR, podobnie jak regiony kodujące mRNA, został poddany naturalnej selekcji, aby umożliwić coraz bardziej złożoną modulację potranskrypcyjną w trakcie ewolucji17. 3' UTR zawiera kilka miejsc wiązania białek i miRNA, które wpływają na stabilność i translację transkryptu.

W obecnej pracy opracowaliśmy narzędzie do badania roli wysoce konserwatywnych domen w 3' UTR GOI do kontroli stabilności transkryptu. Skupiliśmy się na nabłonkowym kanale sodowym, podjednostce alfa (αENaC), która odgrywa kluczową rolę w fizjologii nabłonka pęcherzyków płucnych18. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej zostały z powodzeniem przejściowo transfekowane dwoma składnikami systemu Tet-Off, co pozwala na badanie roli 3' UTR w stabilności mRNA za pomocą systemu, który minimalnie wpływa na fizjologię i metabolizm komórki w porównaniu ze stosowaniem inhibitorów transkrypcji z innymi protokołami. Opracowano strategię klonowania w celu odróżnienia ekspresji GOI od ekspresji genu endogennego przy użyciu epitopu o ekspresji nieendogennej (V5). Plazmidy odpowiedzi i regulatorowe zostały następnie przeniesione do komórek nabłonka pęcherzyków płucnych za pomocą techniki elektroporacji pipetowej. Następnie mierzono ekspresję transkryptu poprzez inkubację komórek z doksycykliną w różnych odstępach czasu. Okres półtrwania transkryptu oceniano za pomocą RT-qPCR zmodyfikowaną metodą Cq przy użyciu transfekowanego produktu mRNA tTA-Ad do normalizacji. Dzięki naszemu protokołowi oferujemy wygodny sposób badania potranskrypcyjnej modulacji transkryptu w różnych warunkach i bardziej szczegółowego definiowania udziału regionów nieulegających translacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnej Centrum Badawczego Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).

1. Projektowanie i generowanie plazmidu odpowiedzi wyrażającego gen zainteresowania (GOI)

  1. Użyj indukowalnego wektora tetracykliny, takiego jak pTRE-Tight.
  2. Przeanalizuj sekwencję rządu Indii i miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora, aby zidentyfikować miejsca ograniczeń w MCS, które nie są obecne wewnętrznie w GOI.
  3. Wyizoluj pierwotne komórki nabłonka pęcherzyków płucnych z płuc samca szczura Sprague-Dawley, jak opisano wcześniej19,20.
  4. Oczyść całkowite RNA z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych przez ekstrakcję RNA przy użyciu standardowej metody, takiej jak ekstrakcja fenolem/chloroformem lub użycie kolumn wirujących RNA na bazie krzemionki.
  5. Odwrotna transkrypcja mRNA na komplementarne DNA (cDNA) przy użyciu oligo (dT) i odwrotnej transkryptazy o wysokiej wierności.
  6. Użyj polimerazy Taq o wysokiej wierności i standardowych technik nakładania się PCR, aby oskrzydlić rząd Indii dwoma wybranymi miejscami rozpoznawania enzymów restrykcyjnych przy użyciu zaprojektowanych starterów.
    1. Niech starter do przodu zawiera miejsce wiązania rybosomów w konsensusie Kozaka21, aby poprawić poziomy ekspresji w celu badania ekspresji białek równolegle ze stabilnością mRNA. Należy dołączyć sekwencję kodującą epitop V5 przed GOI w celu odróżnienia ekspresji transfekowanego II od ekspresji endogennej (tabela 1).
    2. Niech starter odwrotny zawiera sygnał poliadenylacji po kodonie stop.
  7. Mutanty mogą być generowane przez sekwencyjną delecję w celu zbadania wpływu różnych regionów 3' UTR na stabilność mRNA GOI przy użyciu odwrotnych starterów kodujących miejsce poliadenylacji, które stopniowo usuwa koniec 3' GOI 3' UTR (Figura 6). Alternatywnie, mutageneza ukierunkowana na PCR może być wykorzystana do ukierunkowania na określony region zainteresowania w klasie 3' UTR22.
  8. Trawić indukowalny wektor i wkładkę z wcześniej wybranymi enzymami restrykcyjnymi w odpowiedniej temperaturze inkubacji przez 1 godzinę, a następnie poddawać działaniu fosfatazy podczas reakcji wektora przez 30 minut, aby uniknąć samoligacji.
  9. Oddzielić strawiony wektor i segmenty insertu za pomocą elektroforezy w 1-1,5% żelu agarozowym (stężenie zależne od wielkości wkładki).
  10. Za pomocą ostrza i światła UV zbierz fragmenty DNA zawierające pożądaną wstawkę i wektor do ligacji.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  11. Oczyścić zebrane segmenty z żelu agarozowego za pomocą zestawu do oczyszczania PCR na bazie krzemionki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometrii przy 260 nm.
  12. Zliguj GOI i indukowalny wektor za pomocą ligazy DNA T4 za pomocą stosunku wektora do wstawki 1: 3, aby zwiększyć prawdopodobieństwo ligacji. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 godziny.
  13. Przekształć reakcję ligacji w kompetentną E. coli (DH5α).
    1. Dodaj 1-10 ng wektora i genu do probówki zawierającej 100 μl kompetentnych komórek. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut, a następnie komory poddane szokowi cieplnemu w temperaturze 42 °C przez 45 s. Umieść probówkę na lodzie na 2 minuty i dodaj 900 μl podłoża RT LB. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
    2. Rozprowadzić 100 μl reakcji na płytce agarowej LB z odpowiednim antybiotykiem (np. 100 μg/ml ampicyliny dla wektora pTRE-Tight) w celu wyselekcjonowania przekształconych bakterii. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    3. Wybrać poszczególne kolonie za pomocą pętli inokulacyjnej lub końcówki o pojemności 20 μl i inkubować przez noc w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej odpowiedni antybiotyk w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Przekształcone bakterie mogą być przechowywane w zapasach glicerolu w temperaturze -80 °C w stosunku 400:600 pożywki LB do glicerolu.
  14. Ekstrahować plazmidowe DNA za pomocą kolumn plazmidowych na bazie krzemionki i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometrii przy 260 nm. Potwierdzić wprowadzenie rządu Indii za pomocą analizy ograniczeń i jego orientację oraz brak mutacji potencjalnie wprowadzonych podczas RT-PCR przez sekwencjonowanie.

2. Transfekcja plazmidu odpowiedzi wyrażającego interesujący nas gen (GOI) do pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych

  1. Wyizolować komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II z płuc szczura.
  2. Zasiać komórki o gęstości 1 x 10 6 komórek/cm2 na 100 mm szalki Petriego z kompletną minimalną pożywką niezbędną (kompletny MEM). Complete MEM to MEM uzupełniony 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycyny, Septra (3 μg/ml trimetoprimu i 17 μg/ml sulfametoksazolu), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) i 2 mM L-glutaminy. Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  3. Następnego dnia umieścić 500 μl kompletnego MEM bez antybiotyku w każdym dołku nowej 12-dołkowej płytki i ogrzać płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Na tym etapie ważne jest, aby stosować płodową surowicę bydlęcą wolną od zanieczyszczających tetracyklin lub o poziomie zbyt niskim, aby zakłócać indukowalność.
  4. Przygotować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające plazmid z indukowalnym GOI (plazmidem GOI) i wektorem regulatorowym (np. pTet-Off), dodając 1 μg plazmidu GOI i 1 μg wektora regulatorowego na studzienkę w temperaturze pokojowej. W przypadku eksperymentów koekspresyjnych z białkami wiążącymi RNA (RBP) do mieszanki DNA dodaje się 1 μg wektora konstytutywnego (np. pcDNA3) wyrażającego RPB będący przedmiotem zainteresowania (Figura 7).
  5. Odessać pożywkę i delikatnie przepłukać komórki PBS (bez wapnia i magnezu) podgrzanym w temperaturze 37 °C.
  6. Dodać 5 ml 0,05% trypsyny podgrzanej w temperaturze 37 °C i inkubować komórki, aż komórki zostaną odłączone (2-4 min). Zneutralizuj trypsynę, dodając 10 ml kompletnego MEM bez antybiotyku.
  7. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml, przemyć szalkę Petriego 4 ml pożywki, aby zebrać jak najwięcej pozostałych komórek, a następnie odwirować zawiesinę komórek przy 300 x g przez 5 minut.
  8. Delikatnie odessać i wyrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Policz i oblicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  9. Odwirować komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do resuspensji o stężeniu 4 x 107 komórek/ml. Dodać komórki z probówki o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 2.4 w stężeniu 400 000 komórek na studzienkę i delikatnie je wymieszać, pipetując w górę i w dół.
  10. Umieścić probówkę w urządzeniu do elektroporacji i napełnić ją 3,5 ml buforu elektrolitycznego.
  11. Włóż pozłacaną końcówkę elektrody do pipety, całkowicie dociskając tłok. Delikatnie wymieszać zawartość probówki o pojemności 1,5 ml i ostrożnie odessać komórki pipetą. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do końcówki, ponieważ spowoduje to wyładowanie łukowe podczas elektroporacji i doprowadzi do zmniejszenia wydajności transfekcji.
  12. Włóż pipetę do stacji elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie.
  13. Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, odpowiadający napięciu impulsu 1 450 V i 2 impulsom o szerokości 20 ms, a następnie naciśnij Start na ekranie dotykowym.
  14. Natychmiast po transfekcji wyjąć pipetę i przenieść komórki do studzienki uprzednio wypełnionej kompletnym MEM bez antybiotyku, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.
  15. Powtórzyć kroki 2.11-2.14 dla pozostałych próbek.
  16. Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze. Po 2 dniach zastąp pożywkę kompletnym MEM z antybiotykami.
  17. Potwierdź powodzenie transfekcji, obserwując ekspresję eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym lub za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu wektora kontrolnego (Rysunek 1).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i wymaga dodatkowego etapu transfekcji przy użyciu innego plazmidu eksprymującego eGFP, takiego jak pcDNA3-EGFP.

3. Indukcja zahamowania transkrypcji przez rząd Indii

UWAGA: Komórki mogą być wstępnie potraktowane pożądanymi zabiegami przed indukcją doksycykliny, aby ocenić ich wpływ na stabilność mRNA (Rysunek 5).

  1. Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C w sposób bezpieczny przed światłem. Doksycyklina, pochodna tetracykliny, jest stosowana zamiast tetracykliny, ponieważ ma dłuższy okres półtrwania (2x) niż tetracyklina. Co więcej, niższe stężenie doksycykliny jest wymagane do całkowitej inaktywacji tet operon23.
    UWAGA: Doksycyklina może wpływać na ekspresję mRNA endogennego GOI. Aby to zweryfikować, należy zbadać wpływ 24-godzinnego leczenia doksycykliną na komórki pęcherzyków płucnych, aby potwierdzić brak jakichkolwiek zmian w ekspresji GOI (Ryc. 2).
  2. Przygotować świeży roztwór doksycykliny o stężeniu 1 μg/ml w pełnym MEM 72 godziny po transfekcji i ogrzać go do temperatury 37 °C.
  3. Zastąp pożywkę 1 ml kompletnego MEM zawierającego 1 μg/ml doksycykliny na studzienkę, aby zahamować transkrypcję GOI.
  4. Inkubować wiele dołków w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez różne okresy czasu od 15 minut do 6 godzin, aby ocenić okres półtrwania mRNA rządu Indii.
  5. Pod koniec zabiegu umyj komórki lodowatym PBS i poddaj je lizie za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji fenolowo-chloroformowego RNA, dodając 500 μl buforu na studzienkę i wstrząsając płytką w celu homogenizacji komórek.
  6. Wyizolować RNA zgodnie z protokołem producenta. Oznaczyć wydajność i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii przy 230, 260 i 280 nm. Próbki RNA o proporcjach 260:230 i 260:280 wynoszących odpowiednio 1,8 i 2,0 są uważane za czyste.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Określanie stabilności mRNA GOI

  1. Potraktuj 1 μg całkowitego RNA DNA bez RNAzyZyZy I (stopień amplifikacji), aby usunąć wszelkie ślady plazmidowego DNA, które mogłyby zakłócać późniejszą amplifikację DNA.
    1. W probówce PCR o pojemności 0,2 ml połącz 1 μg całkowitego RNA, 1 μl 10x buforu reakcyjnego DNazy I, 1 μl DNAzy I (1 U/μL) i wodę wolną od RNAzy, aby uzyskać całkowitą objętość 10 μL.
    2. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    3. Dezaktywować DNAzę I, dodając 1 μl 25 mM EDTA do 10 μl mieszaniny reakcyjnej i inkubując reakcję w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  2. Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA zubożonego w DNA do cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do syntezy cDNA z mieszanką oligo(dT) i losowych starterów heksamerowych w celu poprawy wydajności odwrotnej transkrypcji.
    1. Na krótko dodać 4 μl 5x mieszaniny reakcyjnej, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 4 μl wody wolnej od RNAzy do 11 μl całkowitej mieszaniny RNA zubożonej w DNA, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 20 μL. Dobrze wymieszaj reakcję, pipetując ją w górę iw dół.
    2. Inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 25 °C, następnie 20 minut w temperaturze 46 °C, a następnie dezaktywować reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 1 minutę. Każda reakcja da 50 ng/μL produktu cDNA.
    3. Rozcieńczyć reakcję cDNA do stężenia 5 ng/μl, dodając 180 μl wody klasy biologii molekularnej do mieszaniny reakcyjnej o objętości 20 μl. Przechowywać produkty cDNA w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do wykonywania ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR).
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Projektowanie starterów qPCR do przodu i do tyłu specyficznych dla rządu Indii.
    1. Ze względu na endogenną ekspresję GOI w komórkach, startery muszą być zaprojektowane tak, aby amplifikować amplikon 100-150 pz epitopu V5 sprzężonego z GOI (Tabela 1).
    2. Wewnętrzne referencyjne startery genów muszą być również używane jako kontrole normalizacji. Zwykle geny porządkowe, takie jak geny beta-aktyny i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1, są używane jako geny odniesienia. Nie można ich jednak używać z tym systemem indukcyjnym ze względu na zmienność wydajności transfekcji. Zamiast tego ekspresja transkryptu tTA-Ad jest oceniana w celu normalizacji, ponieważ jego ekspresja jest konstytutywna w komórkach ze względu na aktywność promotora wirusa cytomegalii. Każda zmiana jego ekspresji mierzona za pomocą qPCR będzie reprezentatywna dla skuteczności transfekcji (startery: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' i reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; amplikon 129 pz) i pozwoli na normalizację ekspresji transfekowanych klonów (Rysunek 3).
  4. Przygotować każdą reakcję qPCR w trzech egzemplarzach, używając głównej mieszanki barwników SYBR Green.
    1. Rozcieńczyć mieszaninę cDNA o stężeniu 5 ng/μl do stężenia 1,25 ng/μl za pomocą wody klasy biologii molekularnej.
    2. Połącz 5 μl SYBR Green dye master mix (2x), 0,1 μl wody klasy biologii molekularnej, 0,45 μl 7,5 μM startera do przodu, 0,45 μl 7,5 μM startera odwrotnego i 4 μl 1,25 ng/μL cDNA, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 μL. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół na 96-dołkowej płytce PCR. Użyj optycznej folii samoprzylepnej, aby upewnić się, że pokrywa płyty jest szczelna i zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu.
    3. Odwirować na krótko mieszaninę reakcyjną przez odwirowanie i umieścić płytkę w termocyklerze qPCR.
  5. Amplifikować znakowane V5 amplikony GOI i tTA-Ad przy użyciu następujących warunków qPCR: 95 °C przez 10 minut jako etap denaturacji, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 10 s, 58 °C przez 15 s i 72 °C przez 20 s. Po przeprowadzeniu cykli amplifikacji należy wygenerować krzywą topnienia o wysokiej rozdzielczości w celu oceny określonych temperatur topnienia pożądanych amplikonów i zapewnienia braku pików amplikonu szumu.
    1. Uwzględnij kontrole ujemne dla qRT-PCR, wykonując qPCR z RNA jako matrycą bez odwrotnej transkryptazy, aby służyć jako kontrola potencjalnego zanieczyszczenia plazmidowego DNA i qPCR bez dodatku cDNA do mieszaniny qPCR, aby zapewnić brak dimerów starterów lub zanieczyszczeń.
    2. Optymalne stężenie cDNA, wydajność startera i stężenie muszą być zoptymalizowane zgodnie z rządem Indii za pomocą testu krzywej standardowej. W tym celu należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie przy użyciu cDNA z komórek niepoddanych działaniu substancji (hodowanych bez doksycykliny). Krzywa standardowa jest generowana przez wykreślenie wartości Cq w stosunku do logarytmu czynnika rozcieńczenia cDNA, a wydajność amplifikacji (E) oblicza się zgodnie z nachyleniem krzywej wzorcowej przy użyciu następującego wzoru:
      E = 10-1/nachylenie
      UWAGA: Wydajność amplifikacji powinna wynosić około 0,9 do 1,05. W przeciwnym razie podkłady muszą zostać przeprojektowane.
  6. Przeanalizuj dane qPCR przy użyciu metody porównawczej Cq, normalizując wartości ekspresji GOI do ekspresji tTA-Ad w celu uzyskania względnych poziomów ekspresji GOI i podania jego ekspresji jako procentu ekspresji mRNA GOI w komórkach tego samego zwierzęcia w punkcie początkowym (t = 0) (Rysunek 4).
  7. Okres półtrwania określa się na podstawie stałej szybkości (K) krzywej degradacji mRNA GOI za pomocą następującego równania:
    t1/2 = ln 2/K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został z powodzeniem wykorzystany do wygenerowania systemu ekspresji plazmidu kontrolowanego transkrypcyjnie Tet-Off, aby ocenić znaczenie różnych części αENaC 3' UTR w modulacji stabilności transkryptu w pierwotnych komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych.

Pierwszym krokiem w implementacji tego systemu było stworzenie szybkiej, łatwej i efektywnej techniki transfekcji komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niski współczynnik transfekcji komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w hodowli pierwotnej był poważnym ograniczeniem dla stosowania systemu Tet-Off do oceny stabilności mRNA w tych komórkach. Ograniczenie to zostało jednak przezwyciężone przez elektroporację pipet, co pozwoliło na uzyskanie 25–30% skuteczności transfekcji (ilustracje 1 i 3)26.

Pomiar stabilności transkryptu ma fundamentalne znaczenie dla zrozum...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Francis Migneault był wspierany przez stypendium zapewnione przez Quebec Respiratory Health Network i program szkoleniowy Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR), stypendium z FRSQ i stypendium z Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Praca ta była wspierana przez Katedrę Badań Klinicznych Gosselin-Lamarre oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem [YBMOP-79544].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Actinomycin DSigma-AldrichA9415
AmpicylinaSigma-AldrichA1593
Hemacytometr jasnoliniowySigma-Aldrich Z359629
Chloroform - Klasa biologii molekularnejSigma-AldrichC2432
ClaINew England BiolabsR0197S
CykloheksymidMikroskop odwrócony Sigma-AldrichC7698
DM IL LED z kontrastem fazowym
I, stopień wzmocnieniaInvitrogen18068015
hyklan doksycyklinySigma-AldrichD9891-1G
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (D-PBS), bez wapnia i magnezuBioprodukty żubrów311-425-CL
Etanol - klasa biologii molekularnejFisher ScientificBP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShakerEppendorf1220G76
GlicerolSigma-AldrichG5516
HEPES pH 7,3Sigma-AldrichH3784
Heracell 240iThermoFisher Scientific51026420
iScriptBio-Rad Laboratories1708890
Isopropanol - Klasa biologii molekularnejSigma-AldrichI9516
LB Rosół (Lennox)Sigma-AldrichL3022
LB Rosół z agarem (Lennox)Sigma-AldrichL2897
L-glutaminaSigma-AldrichG7513
Lipopolisacharydy z Pseudomonas aeruginosa10Sigma-AldrichL9143
MEM, proszekGibco61100103
MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepnaApplied Biosystems4360954
Szafy bezpieczeństwa biologicznego MSC-Advantage Class IIThermoFisher Scientific51025413
System elektroforezy Mupid-exUTakara BioAD140
NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000
System transfekcji neonowej 10 µ L Zestawstartowy InvitrogenMPK1025
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000S
NheINew England BiolabsR0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically kompetentnyE. coliInvitrogenC854003
wektor pcDNA3ThermoFisher ScientificV790-20
plazmid pcDNA3-EGFPAddgene13031
PlatynowaTaqDNA Polimeraza High FidelityInvitrogen11304011
pTet-Off Zaawansowany wektorTakara Bio631070
pTRE-Tight wektorTakara Bio 631059
Oczyszczone komórki nabłonka pęcherzyków płucnych
IIQIAGEN20021
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
Oprogramowanie systemu PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 6 i 7 Flex AppliedBiosystemsn.a.QuantStudio
6 Flex System do PCR w czasie rzeczywistym, 96-dołkowy FastApplied Biosystems4485697
Rekombinowane białko TNF-alfaR& Amp; D Systems510-RT-010
SeptraSigma-AldrichA2487
Fosfataza alkaliczna krewetek (rSAP)New England BiolabsM0371S
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
SsoAdvanced Uniwersalny SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725270
SuperScript IV Odwrotna transkryptazaInvitrogen18090010
T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificEL0011
Tet System Approved FBSTakara Bio631367
TobramycinSigma-AldrichT4014
TRIzolOdczynnik Invitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300054
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
Woda, biologia molekularna KlasaBioprodukty żubra809-115-EL
Leica-DNase Zestaw do syntezy cDNA Zestaw do ekstrakcji żelem N.A.N.A.QIAEX szczura

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  2. Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
  3. Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
  6. Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
  7. Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
  8. Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
  9. Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
  10. Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
  11. Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).
  12. Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
  13. Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
  14. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).
  15. Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
  16. Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
  17. Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
  18. Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
  19. Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
  20. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  21. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
  22. Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
  23. Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
  24. Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
  25. Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
  26. Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
  27. Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
  28. Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).
  29. Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
  30. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  31. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcriptionally Controlled PlasmidmRNA Half Life AnalysisPrimary Alveolar Epithelial CellsTransient Transfection ProtocolV5 Epitope TaggingDoxycycline Inducible SystemElectroporation TechniqueqPCR Quantification MethodRNA Stability AssessmentThree Prime UTR Deletion

Related Articles