Artykuł metodologiczny

Analiza populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych

DOI:

10.3791/60658

⸱

23 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana jest wygodna, szybka i opłacalna metoda pomiaru proporcji komórek populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rakowe komórki macierzyste (CSC) są ważną przyczyną wzrostu guza, przerzutów i nawrotów. Izolacja i identyfikacja CSC mają ogromne znaczenie dla badań nad nowotworami. Obecnie stosuje się kilka technik identyfikacji i oczyszczania CSC z tkanek nowotworowych i linii komórek nowotworowych. Separacja i analiza komórek populacji bocznej (SP) to dwie z powszechnie stosowanych metod. Metody te opierają się na zdolności CSC do szybkiego wydalania barwników fluorescencyjnych, takich jak Hoechst 33342. Wypływ barwnika jest związany z transporterami kasety wiążącej ATP (ABC) i może być hamowany przez inhibitory transportera ABC. Opisano metody barwienia hodowanych komórek nowotworowych za pomocą Hoechst 33342 i analizy proporcji ich komórek SP za pomocą cytometrii przepływowej. Ten test jest wygodny, szybki i opłacalny. Dane uzyskane w tym teście mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia wpływu genów lub innych sygnałów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych na właściwości macierzyste komórek nowotworowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rakowe komórki macierzyste (CSC) to podzbiory komórek o zdolności do samoodnawiania się i wielokrotnym potencjale różnicowania, które odgrywają istotną rolę we wzroście guza, przerzutach i nawrotach1,2. Obecnie stwierdzono, że CSC występują w różnych nowotworach złośliwych, w tym w raku płuc, mózgu, trzustki, prostaty, piersi i wątroby3,4,5,6,7,8,9. Identyfikacja CSCs w tych nowotworach opiera się głównie na obecności powierzchniowych białek markerowych, takich jak wysoka i/lub niska ekspresja CD44, CD24, CD133 i Sca-19,10, ale do tej pory nie zgłoszono unikalnego markera, który może odróżnić CSC od innych niż CSC. Obecnie stosuje się kilka technik do identyfikacji i oczyszczania CSC w tkance nowotworowej lub liniach komórek nowotworowych. Techniki te zostały opracowane w oparciu o specyficzne właściwości CSC. Wśród nich testy i sortowanie komórek populacji bocznej (SP) to dwie z powszechnie stosowanych metod.

Komórki SP zostały pierwotnie odkryte przez Goodell et al.11, kiedy scharakteryzowali krwiotwórcze komórki macierzyste w komórkach szpiku kostnego myszy. Kiedy komórki szpiku kostnego myszy zostały oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym Hoechst 33342, niewielka grupa słabo wybarwionych komórek Hoechst 33342 pojawiła się na dwuwymiarowym wykresie kropkowym testu cytometrii przepływowej. Hoechst 33342 jest barwnikiem wiążącym DNA i ma co najmniej dwa tryby wiązania, które prowadzą do różnych charakterystyk widmowych. Oglądając emisję fluorescencji na dwóch długościach fal w tym samym czasie, można ujawnić wiele populacji12. W ich teście Hoechst 33342 był wzbudzany przy 350 nm, a fluorescencję mierzono przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego (BP) 450/20 nm i filtra krawędziowego długoprzepustowego 675 nm (EFLP)11. W porównaniu z całą populacją komórek szpiku kostnego, ta grupa komórek została wzbogacona o hematopoetyczne komórki macierzyste zwane komórkami SP cells11. Komórki SP są zdolne do szybkiego wydalania Hoechst 33342. Wypływ tego barwnika jest związany z transporterami kasety wiążącej ATP (ABC) 13, które mogą być hamowane przez niektóre czynniki, takie jak Fumitremorgin C14, Verapamil i Reserpine15,16. Następnie wykryto różne proporcje komórek SP w różnych tkankach, narządach, tkankach nowotworowych i liniach komórek nowotworowych17,18,19. Te komórki SP mają wiele cech komórek macierzystych17,19.

Ten manuskrypt opisuje znakowanie i barwienie hodowanych komórek nowotworowych metodą Hoechst 33342 oraz analizę komórek SP za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto wykazano optymalizację stężenia Hoechst 33342 i właściwy dobór blokerów dla określonej linii komórek nowotworowych przy użyciu tego podejścia. Na koniec wykazano wpływ sygnałów promocji lub hamowania pnia na proporcję SP w komórkach nowotworowych. Przykłady eksperymentalne pokazują, że analiza SP może być wykorzystana do zbadania wpływu różnych sygnałów, takich jak ekspresja genów, małe inhibitory, aktywatory, cytokiny i chemokiny, na łodygę guza. W porównaniu z innymi metodami izolacji i oczyszczania CSC, takimi jak sortowanie populacji CD44+/CD24-, analiza dehydrogenazy aldehydowej (ALDH) i testy tworzenia sfery nowotworowej, metoda ta jest łatwiejsza do manipulacji i opłacalna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Trawienie i neutralizacja komórek
    1. Nasiać komórki nowotworowe (takie jak komórki MDA-MB-231) na płytce 6-dołkowej i hodować je w inkubatorze o temperaturze 37 °C zasilanym 5% CO2 .
    2. Zbieraj komórki, gdy ich gęstość osiągnie około 90%. Dokładnie odessać pożywkę hodowlaną i umyć komórki 2x 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
      UWAGA: Aby zbadać wpływ inhibitorów szlaku sygnałowego (np. inhibitora FRA1) lub aktywatorów (np. Aktywatora STAT3) na cechy macierzyste komórek nowotworowych, komórki nowotworowe wysiewa się na płytce 6-dołkowej i wstępnie traktuje inhibitorami lub aktywatorami przez określony czas przed zbiorem.
    3. Dodać 500 μl 0,25% trypsyny-EDTA do każdego dołka na płytce 6-dołkowej, umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1-3 minuty (min) i delikatnie postukać w płytkę, aby odłączyć komórki.
      UWAGA: Przedłużone trawienie wpłynie na profil SP ze względu na zmiany w żywotności komórek.
    4. Dodaj 3 ml PBS uzupełnionego 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do każdego dołka na 6-dołkowej płytce, aby zakończyć trawienie i delikatnie pipetować komórki w górę iw dół 3-5 razy, aby rozproszyć grudki komórek.
    5. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórkowej do jednego dołka nowej płytki 6-dołkowej i zbadać ją pod mikroskopem. Jeśli zaobserwuje się grudki komórek, przepuść zawiesinę komórek przez sitko do komórek 70 μM.
      UWAGA: Jest to krok opcjonalny.
    6. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki o masie 200 x g przez 5 minut, aby uzyskać osady. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 3 ml PBS uzupełnionym 2% FBS. Pipetuj komórki w górę i w dół 3–5 razy, aby dokładnie wymieszać.
  2. Liczba komórek
    1. Dodać 50 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 50 μl roztworu błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl mieszaniny, aby policzyć liczbę żywych komórek przy użyciu standardowej metody, takiej jak hemocytometr.
    2. Rozcieńczyć komórki w PBS uzupełnionym 2% FBS do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml. Dodać 1 ml zawiesiny komórek do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu i przygotować dwie probówki z próbką.

2. Barwienie komórek za pomocą Hoechst 33342

  1. Dodać Hoechst 33342 do jednej probówki, aby osiągnąć odpowiednie stężenie końcowe.
    UWAGA: Na przykład odpowiednie stężenie Hoechst 33342 wynosi 3 μg/ml dla komórek MDA-MB-231.
  2. Dodać bloker (np. Fumitremorginę C, werapamil lub rezerpinę) do innej probówki do odpowiedniego stężenia końcowego i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed dodaniem tego samego stężenia Hoechst 33342, jak opisano w kroku 2.1.
    UWAGA: W przypadku komórek MDA-MB-231 odpowiednim blokerem jest Rezerpina (40 μM). Rezerpina jest stosowana jako kontrola blokująca w celu sprawdzenia braku komórek w bramkowanym obszarze SP.
  3. Przygotować kilka probówek zawierających komórki i dodać Hoechst 33342 do różnych gradientów stężeń. Po teście cytometrii przepływowej należy wybrać odpowiednie stężenie zgodnie z profilem i proporcją SP.
    UWAGA: Jest to opcjonalny krok stosowany w celu określenia prawidłowego stężenia Hoechst 33342.
  4. Przygotować kilka probówek zawierających komórki, dodać bloker do różnych gradientów stężeń, inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie dodać Hoechst 33342 do odpowiedniego stężenia. Po teście cytometrii przepływowej należy wybrać odpowiednie stężenie w zależności od braku komórek w bramkowanym obszarze SP.
    UWAGA: Jest to opcjonalny krok stosowany w celu określenia właściwego stężenia blokera.
  5. Umieścić probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i inkubować je przez 60 minut, wstrząsając probówkami co 10 minut.
    UWAGA: Dokładne wytrząsanie probówek jest ważne dla barwienia, ponieważ zapewnia pełny kontakt między komórkami a barwnikiem w celu uzyskania lepszych wyników barwienia.
  6. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 200 x g, 4 °C przez 5 minut i ostrożnie zasysać supernatant, ponieważ komórki tworzą bardzo luźne i niestabilne osady.
  7. Ponownie zawieś komórki każdej probówki w 1 ml lodowatego PBS uzupełnionego 2% FBS i pipetuj komórki w górę iw dół 3-5 razy, aby dokładnie wymieszać. Dodać 1 μl 1 mg/ml jodku propydyny (PI) do zawiesiny każdej probówki, aby zidentyfikować martwe komórki.
    UWAGA: Wszystkie procedury na tym etapie powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C, aby zahamować wypływ Hoechst 33342 z komórek nowotworowych. Rurki należy chronić przed bezpośrednim działaniem światła.

3. Analiza metodą cytometrii przepływowej

UWAGA: Instrukcje dotyczące korzystania z oprogramowania cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów) są opisane w tej sekcji oraz na rysunkach uzupełniających 1–10.

  1. W oprogramowaniu cytometru przepływowego kliknij przycisk FOLDER. Kliknij przycisk Experiment (Eksperyment), a następnie kliknij opcję New Experiment (Nowy eksperyment) (rysunek uzupełniający 1A,B).
  2. Kliknij przycisk OK. "Experiment_001" pojawi się w FOLDERZE (Rysunek uzupełniający 2A,B).
  3. Kliknij przycisk Experiment_001, aby zmienić nazwę folderu na określoną nazwę (np. "20191118-SP"). Kliknij Enter. Nowa nazwa ("20191118-SP") pojawi się w FOLDERZE (Rysunek uzupełniający 3A,B).
  4. Kliknij przycisk Nowy próbka, aby dodać próbkę do nowego folderu eksperymentu ("20191118-SP"). Kliknij przycisk Nowa probówka, aby dodać probówkę do próbki. Kliknij przycisk Grot strzałki (Rysunek uzupełniający 4A-C).
  5. Kliknij przycisk Parametry i ustaw parametry cytometru przepływowego (rysunek uzupełniający 5).
    1. Użyj krótkoprzepustowego zwierciadła dichroicznego 610 nm (DMSP), aby oddzielić długości fal emisji. Użyj filtra BP 450/20 nm do zebrania niebieskiej fluorescencji i EFLP 675 nm do zebrania czerwonej fluorescencji.
      UWAGA: Hoechst 33342 jest wzbudzany laserem UV przy 355 nm, a PI jest wzbudzany przy 488 nm.
  6. Uruchom próbki komórek na cytometrze przepływowym.
    UWAGA: Komórki SP można sortować przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w sterylnych warunkach. Do dalszych eksperymentów należy pobrać łącznie 100 000–500 000 komórek.
    1. Uruchomić komórki wybarwione Hoechst 33342 na cytometrze przepływowym.
      1. Umieścić probówki zawierające komórki barwione Hoechst 33342 na cytometrze.
      2. Kliknij przycisk Wykres punktowy, aby wyświetlić wykres punktowy, a następnie kliknij oś X i ustaw ją na "FSC-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "PI-A". Wyświetla wykres punktowy obszaru impulsu rozproszenia do przodu (FSC-A, oś X ustawiona na tryb liniowy) w funkcji fluorescencji PI (oś Y ustawiona na skalę logarytmiczną). Dostosuj napięcia, aby pokazać żywe komórki po prawej stronie i nieożywione komórki, które są jasno zabarwione PI, w lewym górnym rogu. Następnie ustal bramkę wielokątną, aby wykluczyć martwe komórki i szczątki komórek (Rysunek 1A), klikając przycisk Bramka wielokątna, aby zabramkować podzbiór P1, znany również jako podzbiór FSC-A, PI-A (Rysunek uzupełniający 6A,B).
      3. Kliknij przycisk Wykres punktowy, aby wyświetlić wykres punktowy, kliknij oś X i ustaw ją na "FSC-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "FSC-W". Wyświetla wykres punktowy FSC-A (oś X) w funkcji szerokości impulsu rozpraszania do przodu (FSC-W, oś Y). Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy, kliknij przycisk P1 pod przyciskiem Pokaż populacje. Kliknij przycisk Bramka prostokątna, aby utworzyć bramkę prostokątną do bramki dla podzbioru P2 (znanego również jako podzbiór FSC-A, FSC-W). Spowoduje to wykluczenie komórek o dużych objętościach (Rysunek uzupełniający 7A-C i Rysunek 1A).
      4. Kliknij przycisk Wykres punktowy, aby wyświetlić wykres punktowy, kliknij oś X i ustaw ją na "SSC-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "SSC-W". Wyświetla wykres punktowy obszaru impulsu rozproszenia bocznego (SSC-A, oś X) w funkcji szerokości impulsu rozproszenia bocznego (SSC-W, oś Y). Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, a następnie kliknij przycisk P2 w obszarze Pokaż populacje. Następnie kliknij przycisk Bramka prostokątna, aby utworzyć bramkę prostokątną do bramki podzbioru P3 (znanego również jako podzbiór SSC-A, SSC-W). W ten sposób uzyska się populację komórek o jednolitej ziarnistości (rysunek uzupełniający 8A-C i rysunek 1A).
      5. Kliknij przycisk Wykres punktowy, aby wyświetlić wykres punktowy, kliknij oś X i ustaw ją na "Hoechst Red-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "Hoechst Blue-A". Wyświetl wykres punktowy Hoechst Red-A (oś X) i Hoechst Blue-A (oś Y). Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres punktowy, kliknij przycisk P3 pod przyciskiem Pokaż populacje. Kliknij przycisk Bramka wielokątna, aby utworzyć bramkę wielokątną w celu bramkowania podzbioru P4 (znanego również jako podzbiór Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, kliknij przycisk Pokaż hierarchię populacji, aby wyświetlić hierarchię populacji.
        UWAGA: Wykres punktowy pokaże trzy różne populacje: 1) populację fazy G0-G1 w pobliżu środka wykresu; 2) populacja fazy S-G2/M w pobliżu prawego górnego rogu; 3) SP. SP jest następnie bramkowany do dalszej analizy (rysunek uzupełniający 9A-D i Rysunek 1A). Jeśli wykres punktowy Hoechst Red-A w porównaniu z Hoechst Blue-A nie pokazuje profilu SP podobnego do pokazanego na Rysunek 1A, napięcia należy regulować, aż pojawi się podobny profil. W międzyczasie odpowiednio dostosuj wszystkie powyższe bramy.
      6. Po określeniu regionu bramki komórek SP kliknij przycisk Uzyskaj dane, aby zebrać 20 000–100 000 zdarzeń z każdej próbki w celu przeanalizowania procentu komórek SP (rysunek uzupełniający 10).
    2. Uruchom komórki barwione Hoechst 33342 potraktowane blokerem na cytometrze przepływowym.
      1. Umieść probówki zawierające bloker na cytometrze i uruchom komórki przy użyciu tych samych napięć i bramek, aby dalej sprawdzić, czy napięcia i bramki są odpowiednio dobrane.
        UWAGA: W porównaniu z samym barwieniem Hoechst 33342, tylko bardzo mała część komórek, jeśli w ogóle, powinna pojawić się w bramkowanym obszarze SP (Rysunek 1B).
      2. Zbierz od 20 000 do 100 000 zdarzeń z każdej próbki, aby przeanalizować procent komórek SP.

4. Analiza danych

UWAGA: Instrukcje dotyczące korzystania z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (patrz Spis materiałów) są opisane w tej sekcji oraz na rysunkach uzupełniających 11–16.

  1. Skopiuj pliki w formacie fcs do komputera, otwórz oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i przeciągnij jeden przykładowy plik do oprogramowania (rysunek uzupełniający 11A,B).
  2. Bramkować komórki i uzyskać procent komórek SP.
    1. Kliknij dwukrotnie ten przykładowy plik, kliknij oś X i ustaw ją na "FSC-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "PI-A". Następnie utwórz bramkę wielokątną i kliknij przycisk OK, aby uzyskać podzbiór FSC-A, PI-A (Rysunek uzupełniający 12A-E).
    2. Kliknij dwukrotnie plik podzbioru FSC-A, PI-A, kliknij oś X i ustaw ją na "FSC-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "FSC-W". Następnie utwórz bramkę prostokątną i kliknij przycisk OK, aby uzyskać podzbiór FSC-A, FSC-W (Rysunek uzupełniający 13A-E).
    3. Kliknij dwukrotnie plik podzbioru FSC-A, FSC-W, kliknij oś X i ustaw ją na "SSC-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "SSC-W". Następnie utwórz bramkę prostokątną i kliknij przycisk OK, aby uzyskać podzbiór SSC-A, SSC-W (Rysunek uzupełniający 14A-E).
    4. Kliknij dwukrotnie plik podzbioru SSC-A, SSC-W, kliknij oś X i ustaw ją na "Hoechst Red-A"; kliknij oś Y i ustaw ją na "Hoechst Blue-A". Następnie utwórz bramkę wielokątną i kliknij przycisk OK, aby uzyskać podzbiór Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A (rysunek uzupełniający 15A-E).
    5. Otwórz Edytor układu, klikając przycisk Otwórz edytor układu. Przeciągnij plik podzbioru SSC-A, SSC-W do Edytora układu, a następnie kliknij przycisk Kliknij, aby zapisać okno układu do pliku, aby zapisać wyniki obrazu (Rysunek uzupełniający 16A-C).
  3. Zapisz obszar roboczy, aby zachować informacje o bramkowaniu podczas zamykania oprogramowania.
  4. Wykonuj analizy testu t za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej, aby porównać różnicę między dwiema grupami. Wartość P < 0,05 została zdefiniowana jako istotna statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cztery eksperymentalne analizy SP zostały przeprowadzone zgodnie z tą metodą. W pierwszym wykryliśmy proporcję komórek SP w MDA-MB-231, który jest potrójnie ujemną linią komórkową ludzkiego raka piersi, w normalnych warunkach. Po zliczeniu komórek Hoechst 33342 dodano do jednej probówki zawierającej 1 x 106 komórek do końcowego stężenia 3 μg/ml. Rezerpinę i Hoechst 33342 dodano do innej probówki do końcowych stężeń odpowiednio 40 μM i 3 μg/ml. PI został dodany do obu probówek. Wykres punktowy FSC-A (oś X) w po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku testu SP należy pamiętać o kilku kluczowych kwestiach. Pierwszym z nich jest wybór odpowiedniego blokera, takiego jak Werapamil lub Rezerpina, dla każdej linii komórkowej, ponieważ lokalizacja "bramy" komórek SP jest określana w zależności od pozycji, w której duża liczba komórek SP znika po dodaniu blokera. W przypadku linii komórkowej MDA-MB-231 dobrze sprawdza się Rezerpina. Jednak w przypadku innych linii komórkowych różne blokery mogą działać lepiej.

Drugim jest stężenie Hoech...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych 81572599, 81773124 i 81972787; Fundacja Nauk Przyrodniczych w mieście Tianjin (Chiny) 19JCYBJC27300; Grant badawczy Szpitala Ludowego w Tianjin i Uniwersytetu Nankai 2016rmnk005; Fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych, Uniwersytetu Nankai 63191153.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCORNING35169,5 cm2 (w przybliżeniu)
ColivelinMCEHY-P1061ASer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Surowica bydlęca płodu (FBS)Przemysł biologiczny (BIOIND)04-001-1ACS
BD BiosciencesBD LSRFortessa
Oprogramowanie cytometru przepływowegoBD BiosciencesFACSDiva
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowejBD BiosciencesFlowJo
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261bisBenzimide H 33342 trichlorowodorek
Polistyren probówka z okrągłym dnemCORNING35205412 x 75 mm, 5 ml
Propidium jodek (PI)Sigma-AldrichP41703,8-diamino-5-[3-(dietylomethyloamonio)propyl]-6-fenylofenantrydyniowy dijodek
RezerpinaSigma-Aldrich83580(3β, 16β, 17&alfa;, 18β, 20&alfa;)-11,17-Dimetoksy-18-[(3,4,5-trimetoksybenzoilo)oksy]ester metylowy kwasu johimban-16-karboksylowego
SKLB816Dostarczone przez dr Shengyong Yang, Uniwersytet
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200072
Chlorowodorek VerapamilSigma-AldrichV46295-[N-(3,4-dimetoksyfenyloetylo)metyloamino] chlorowodorek -2-(3,4-dimetoksyfenylo)-2-izopropylowanonitrylu
Cytometr przepływowy Syczuański

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
  4. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
  5. Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
  6. Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
  7. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
  9. Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16(2015).
  10. Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
  11. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  12. Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18(2005).
  13. Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).
  14. Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
  15. Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
  16. Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
  17. Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
  18. Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
  19. Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
  20. Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
  21. Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
  22. Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
  23. Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
  24. Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
  25. Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23(2013).
  26. Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
  27. Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
  28. Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624(2019).
  29. Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
  30. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
  31. Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
  32. Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188(2016).
  33. Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
  34. Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
  35. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  36. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  37. Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza populacji bocznejkom rki macierzyste nowotworubarwienie Hoechst 33342cytometria przep ywowatransportery ABCizolacja kom rekw a ciwo ci macierzysto cikontrola z blokeremjodek propidyny

Powiązane artykuły