Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny 38 za pomocą sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blottingu w badaniu klinicznym.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest chorobą zwyrodnieniową mięśni, która powoduje postępującą utratę masy mięśniowej, prowadząc do przedwczesnej śmierci. Mutacje często powodują zniekształconą ramkę odczytu i przedwczesne kodony stop, co skutkuje prawie całkowitym brakiem białka dystrofiny. Ramkę odczytu można skorygować za pomocą oligonukleotydów antysensownych (AON), które indukują przeskakiwanie eksonów. Wykazano, że morpholino AON viltolarsen (nazwa kodowa: NS-065/NCNP-01) indukuje przeskakiwanie eksonu 53, przywracając ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52. Niedawno podaliśmy NS-065 / NCNP-01 dożylnie pacjentom z DMD w eksploracyjnym badaniu NS-065 / NCNP-01 zainicjowanym przez badacza, pierwszym na ludziach. W tym artykule przedstawiono molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny przy użyciu sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blotting w badaniu klinicznym. Charakterystyka ekspresji dystrofiny miała zasadnicze znaczenie w badaniu dla wykazania skuteczności, ponieważ nie przeprowadzono żadnych funkcjonalnych testów wyników.

Wprowadzenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest chorobą zwyrodnieniową mięśni, powodującą postępującą utratę masy mięśniowej, niewydolność oddechową i kardiomiopatię, która prowadzi do przedwczesnej śmierci¹. Choroba jest spowodowana brakiem dużego strukturalnego białka mięśniowego dystrofiny². Mutacje w genie DMD na chromosomie X są recesywne, a choroba dotyka 1 na 3500-5000 nowonarodzonych mężczyzn^3,4,5. Mutacje są często dużymi delecjami w obszarze hotspotu między eksonami 44 i 55, które prowadzą do zniekształconej ramki odczytu i przedwczesnych kodonów stop, powodując rozpad za pośrednictwem nonsensu i prawie całkowity brak białka dystrofiny^6,7,8. Ramkę odczytu można skorygować za pomocą oligonukleotydów antysensownych (AON), które indukują przeskakiwanie eksonów i przywracają ramkę odczytu, częściowo przywracając ekspresję dystrofiny i opóźniając postęp choroby^9,10,11. Morfolino AON eteplirsen, który został niedawno zatwierdzony przez Federalną Agencję Leków (FDA), indukuje pomijanie eksonu 51 i może przywrócić ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52^12,13. Jednak pomijanie eksonu 53 przywraca ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52 i może potencjalnie leczyć około 10% pacjentów z DMD¹⁴. Wykazano, że lek morpholino AON NS-065/NCNP-01 indukuje przeskakiwanie eksonu 53 w komórkach ludzkich, a ostatnio podaliśmy NS-065/NCNP-01 pacjentom z DMD w otwartym badaniu klinicznym fazy 1 ze zwiększaniem dawki (zwanym dalej "badaniem") (zarejestrowanym jako UMIN: 000010964 i ClinicalTrials.gov: NCT02081625)¹⁴. Badanie wykazało zależny od dawki wzrost pomijania eksonu 53 w oparciu o RT-PCR i poziomy białka dystrofiny w oparciu o western blotting, a także nie zaobserwowano żadnych poważnych zdarzeń niepożądanych ani rezygnacji z leczenia¹⁴.

We wszystkich badaniach klinicznych analiza wyników ma ogromne znaczenie. W przypadku badań klinicznych nad DMD nadal trwa debata na temat najlepszej metody wykazania korzyści z leczenia. Testy kliniczne, takie jak test 6-minutowego marszu, mają pewne wady. Molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny można przeprowadzić przy użyciu kilku metod, takich jak RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting i immunohistochemia. Jednak zakres przywrócenia ekspresji białek, który jest wymagany do uzyskania korzyści klinicznych, pozostaje niejasny. W tym artykule szczegółowo opisujemy metody RT-PCR i western blot stosowane do określania odpowiednio pomijania eksonów i poziomów białka w badaniu fazy 1 leku z pominięciem AON NS-065/NCNP-01¹⁴.

Protokół

Procedura operacyjna dla badania zainicjowanego przez badacza została zatwierdzona przez komisję etyczną NCNP (ID zatwierdzenia: A2013-019).

1. Przygotowanie próbek mięśni

UWAGA: Mięśnie dwugłowe ramienia lub mięśnie czworogłowe są często wybierane jako miejsca biopsji. Jednak w badaniu klinicznym wykorzystano piszczel przedni.

1. Biopsja mięśni od pacjentów
   1. Zaznacz miejsce nacięcia przed przygotowaniem skóry.
   2. Przygotuj gazę zwilżoną solą fizjologiczną do próbki biopsji. Dobrze ściśnij gazę.
   3. Wstrzyknąć znieczulenie miejscowe w skórę i tkankę podskórną, ale nie w mięśnie. Upewnij się, że znieczulenie jest głębokie dzięki braku bólu skórnego.
      UWAGA: Znieczulenie ogólne jest zwykle stosowane u dzieci i młodzieży w wieku poniżej 15 lat.
   4. Wykonaj nacięcie od skóry do tkanki podskórnej. Użyj małych retraktorów, aby otworzyć nacięcie i oddzielić podskórną tkankę tłuszczową.
      UWAGA: Na tym etapie część skóry może zostać wycięta w celu hodowli fibroblastów.
   5. Wykonaj kolejne małe nacięcie w powięzi i przetnij powięź dalej. Zaciśnij krawędzie za pomocą kleszczy do komarów, aby odsłonić mięsień.
   6. Użyj szwu, aby podciągnąć wybraną część mięśnia. Zrób mały tunel za pomocą nożyczek do tęczówki i włóż do niego kleszcze do komarów.
   7. Oddziel wiązkę mięśni za pomocą kleszczy i odetnij oba końce części docelowej.
      UWAGA: Próbki z biopsji mięśni powinny być mniej więcej wielkości ołówka dla dorosłych pacjentów (długość 1,0-1,5 cm, średnica 0,8-1,0 cm). U dzieci i młodzieży próbka powinna mieć około 1 cm długości i 5 mm średnicy.
   8. Owinąć próbkę w gazę zwilżoną solą fizjologiczną i natychmiast przetransportować świeży mięsień w temperaturze pokojowej (RT) do obiektu, w którym próbkę można przygotować do dalszej analizy.
      UWAGA: Próbki należy transportować w temperaturze 4 °C, jeśli czas transportu przekracza 1 godzinę.

2. Przygotowanie próbki mięśniowej

1. Wymieszaj równe objętości gumy tragakantowej i wody, aż guma stanie się miękka i lepka. Załadować mieszaninę do strzykawek o pojemności 25 ml. Strzykawki można przechowywać w lodówce.
2. Umieść około 0,5 do 1 cm gumy tragakantowej na krążkach korkowych. Oznacz dyski po przeciwnej stronie.
3. Umieść pojemnik z izopentanem w ciekłym azocie, aż część płynu zamarznie.
4. Umieść próbkę w gumie tragakantowej. Oś podłużna każdego mięśnia powinna być prostopadła do korka. Umieść gumę wokół dolnej części każdego mięśnia, aby pomóc w prawidłowym umieszczeniu.
5. Za pomocą pęsety umieść próbkę mięśnia/korka w zimnym izopentanie przygotowanym w kroku 2.3 do zamrożenia. Przesuwaj próbkę w sposób ciągły przez 1 minutę lub do całkowitego zamrożenia i tymczasowo umieść na suchym lodzie.
6. Umieścić próbkę w szklanych fiolkach i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Sekcja mięśniowa

1. Ustawić kriostat do cięcia na sekcje w temperaturze roboczej -25 °C.
2. Zamontuj blok korka/mięśni i przycinaj, aż uzyskasz płaskie sekcje.
3. Użyj przekroju o grubości 10 μm do RT-PCR i western blot. Użyj grubości 6-8 μm i 10-12 μm odpowiednio do immunohistochemii lub barwienia hematoksyliną i eozyną. Umieść pokrojone kawałki w probówkach o pojemności 2,0 ml i przechowuj w temperaturze -80 °C do RT-PCR i western blot.

4. Ekstrakcja RNA i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

1. Ekstrahować około 10 plasterków o grubości 10 μm z zamrożonego mięśnia za pomocą kriostatu. Zebrać oczyszczony całkowity RNA za pomocą zestawu do oczyszczania całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
3. Połączyć odczynniki wymagane do reakcji RT-PCR w probówkach do PCR zgodnie z tabelą 1. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z sekwencjami starterów.
   UWAGA: Starter do przodu wynosił 44F dla pacjenta NS-03 i 46F dla pacjenta NS-07. Odwrócony starter to 54/55R jako domyślny. Jeśli widoczne były produkty niespecyficzne, jako alternatywę stosowano 54R.
4. Umieść probówki PCR zawierające mieszaninę w termocyklerze. Uruchom termocykler zgodnie z tabelą 3.
5. Produkt PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

5. Elektroforeza mikroprocesorowa i obliczanie pomijania eksonów

UWAGA: System elektroforezy mikroprocesorowej (MCE) jest często wybierany do analizy efektywności pomijania eksonów. W niniejszym protokole opisano kroki niezbędne do analizy efektywności pomijania eksonów przy użyciu systemu MCE producenta A, a także producenta B, zwanego dalej systemem A i B. Podczas badania klinicznego analizowano skuteczność przeskakiwania eksonów w układzie A. Jednak system A nie jest już dostępny w sprzedaży i zalecamy system B do analizy skuteczności pomijania eksonów. Dołączyliśmy protokoły dla obu systemów (patrz sekcja 5.1 dla systemu A i 5.2 dla systemu B). Informacje dotyczące systemu A i B znajdują się w Tabeli materiałów. Co więcej, ten krok można również wykonać z normalną elektroforezą w żelu agarozowym, ale czułość znacznie się zmniejsza

.

1. Elektroforeza mikroprocesorowa z wykorzystaniem systemu A
   UWAGA: System A ma dwa rodzaje chipów. Tutaj opisujemy kroki związane z chipem DNA.
   1. Zrównoważ odczynniki zestawu (bufor do barwienia, bufor ładujący, drabinka i bufor żelowy) do RT, wiru i wirowania.
   2. Aby przygotować bufor żelowo-barwiący (GS), dodaj 12,5 μl buforu barwiącego do 250 μl buforu żelowego i wiruj przez 10 s. Przenieś roztwór do wirowej probówki filtracyjnej i odwiruj przy 2 400 x g przez 15 minut. Wyrzuć filtr.
      UWAGA: Przefiltrowany GS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
   3. Jeśli próbki są silnie stężone, rozcieńczyć do około 50 ng/μl buforem TE lub wodą wolną od DNaz.
      UWAGA: Jeśli próbki mają stężenie soli ≥ 200 mM KCl (lub NaCl) i/lub 15 mM MgCl₂, należy wymienić bufor.
   4. Dodać 12 μl roztworu GS do dołka gruntującego żel (podświetlonego i oznaczonego GS) chipa DNA i umieścić chip w stacji zasysającej.
      UWAGA: Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, podczas dozowania włóż końcówkę pipety pionowo i do dna studzienki. Dozuj powoli do pierwszego oporu pipety i nie wypuszczaj powietrza na końcu etapu pipetowania.
   5. Wybierz tryb C3 i naciśnij przycisk Start. Po zakończeniu zalewania usuń chip.
   6. Sprawdź wzrokowo mikrokanaliki pod kątem uwięzionych pęcherzyków powietrza lub niepełnego zalewania.
   7. Załaduj przygotowane próbki i drabinę na chip, jak poniżej.
      1. Odpipetować 9 μl roztworu GS do pozostałych 3 studzienek GS.
      2. Odpipetować 5 μl buforu ładującego do studzienki L i do każdej studzienki na próbkę (1-11).
      3. Odpipetować 1 μl drabiny do studzienki L.
      4. Pobrać pipetą 1 μl próbki DNA do każdej z 11 studzienek na próbki.
      5. Odpipetować 1 μl wody wolnej od TE lub DNaz do nieużywanych studzienek. Skrócona instrukcja obsługi zestawu przedstawia rysunek układu chipów.
         UWAGA: Sprawdź wszystkie studzienki pod kątem pęcherzyków powietrza, trzymając chip nad jasnym tłem. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione na dnie studzienki za pomocą czystej końcówki pipety lub wyjmując i ponownie ładując roztwór.
   8. Umieść chip w stacji wirowej i naciśnij Mix. Stacja wirowa zatrzymuje się automatycznie po 1 minutach.
   9. Uruchom chip w stacji elektroforezy w ciągu 5 minut od załadowania.
   10. Wybierz pozycję Nowy przebieg na pasku narzędzi oprogramowania. Na ekranie New Run (Nowy przebieg) wybierz pozycję DNA (DNA) i DNA 1K (DNA 1K) z listy rozwijanej Test (Test rozwijany).
   11. Wybierz folder projektu do uruchomienia z listy rozwijanej Projekt lub utwórz nowy folder projektu, wprowadzając nazwę w polu Projekt.
   12. Wprowadź nazwę uruchomienia w polu Prefiks uruchomienia i kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie.
   13. Przyrząd emituje sygnał dźwiękowy po zakończeniu analizy i otwiera się okno wskazujące koniec przebiegu. Wybierz przycisk OK i usuń chip z platformy chipów.
   14. Wybierz punkt menu Plik | Eksportuj dane, aby wyeksportować dane. Wybierz żądane opcje w oknie dialogowym Eksportuj.
   15. Aby wyczyścić elektrody, napełnij chip czyszczący 800 μl wody dejonizowanej i umieść go na platformie chipowej, zamknij pokrywę i pozostaw ją zamkniętą na 1 minutę. Po 1 minutach otwórz pokrywę, wyjmij chip czyszczący i pozostaw elektrody do wyschnięcia na 1 minutę.
2. Elektroforeza mikroprocesorowa z użyciem systemu B
   1. Otwórz oprogramowanie operacyjne i wprowadź przykładowe informacje. Po wprowadzeniu informacji oprogramowanie automatycznie oblicza ilość roztworów rozdzielających i znaczników.
   2. Przygotuj niezbędną ilość bufora separacyjnego obliczoną przez oprogramowanie. Najpierw przygotuj 100x roztwór barwienia żelu z kwasem nukleinowym, rozcieńczając 10 000x roztwór odpowiednią ilością buforu TE. Roztwór 100x może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
   3. Wymieszaj odpowiednią ilość 100x barwnika żelowego kwasu nukleinowego z buforem separacyjnym w specjalnej probówce dostarczonej przez firmę, aby przygotować 1x roztwór. Wiruj roztwór.
   4. Przygotuj wymaganą ilość roztworu markera w probówce.
   5. Uruchom program mycia sondy.
   6. Po zakończeniu uruchom program mycia mikroczipów.
   7. Jednocześnie pipetować próbki do wielopłytki PCR (96-dołkowej, przezroczystej) i rozcieńczyć 4 razy wodą dejonizowaną. Minimalna objętość, jaką może obsłużyć maszyna, to 6 μl, a maksymalna to 30 μl. Sugerujemy całkowitą objętość 10 μL (2,5 μL próbki i 7,5 μL wody/buforu TE).
   8. Przykryj płytki samoprzylepnymi arkuszami folii uszczelniającej PCR i odwiruj próbki.
   9. Ustaw płytkę, roztwór znacznika i 1x bufor separujący w maszynie zgodnie z umieszczeniem pokazanym przez maszynę. Naciśnij przycisk Start.
   10. Po zakończeniu przebiegu wyeksportuj dane wynikowe jako plik .csv z oprogramowania i oblicz efektywność pomijania eksonów przy użyciu stężenia molowego w następujący sposób:
       Efektywność pomijania eksonów (%) = (Pominięte pasmo / (Pominięte pasmo + Niepominięte pasmo) X 100

6. Sekwencjonowanie komplementarnego DNA (cDNA)

1. Preparat w żelu agarozowym
   1. Odmierz 1,5 g proszku agarozy i wymieszaj proszek ze 100 ml 1x buforu TAE w kolbie do kuchenki mikrofalowej (w wyniku czego uzyskuje się 1,5% żelu agarozowego).
   2. Mikrofalówkę przez 1-3 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Nie przegotuj roztworu, ponieważ część buforu wyparuje i zmieni ostateczną zawartość procentową agarozy w żelu.
   3. Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury około 50 °C.
   4. Dodać 10 μl 10 000x fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego do roztworu agarozy.
   5. Wlej agarozę do tacki na żel z założonym grzebieniem. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 20-30 minut, aż całkowicie zastygnie.
2. Sekwencjonowanie
   1. Wymieszać 5 μl produktu RT-PCR (z kroku 4.4) i 1 μl 6-krotnego buforu ładującego. Załaduj je do studzienek 1,5% żelu agarozowego.
   2. Uruchom żel pod napięciem 135 V przez 5 minut i 120 V przez 20 minut.
   3. Wizualizacja pasm za pomocą transiluminatora zgodnie z protokołem producenta.
   4. Usuń interesujące Cię pasma z żelu i użyj zestawu do czyszczenia żelu i PCR, aby odzyskać produkty RT-PCR.
   5. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Oczyszczone pasmo może zostać wysłane do sekwencjonowania w firmie lub zakładzie sekwencjonowania, jeśli w firmie nie jest dostępny żaden sprzęt do sekwencjonowania Sanger.
   6. Przygotować wymagane odczynniki do zestawu do sekwencjonowania cyklu i odpipetować do wielopłytkowej płytki PCR zgodnie z tabelą 4. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z sekwencjami starterów.
   7. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną.
   8. Wirować płytkę przez 2 do 3 s. Krótko odwirować w wirówce z odchylanym wiadrem, tak aby zawartość osiadła na dnie studzienek (5 do 10 s) w temperaturze 1,000 x g.
      UWAGA: W studzienkach mogą występować pęcherzyki powietrza, ale nie wpływają one negatywnie na reakcję.
   9. Umieścić mieszaninę w termocyklerze i uruchomić zgodnie z tabelą 5.
   10. Oczyść reakcje sekwencjonowania za pomocą płytek zgodnie z instrukcjami producenta.
   11. Użyj analizatora DNA, aby określić sekwencje zgodnie z protokołem producenta.
   12. Porównaj uzyskaną sekwencję z sekwencją oczekiwaną przez pacjenta.

7. Western blotting

1. Przygotowanie próbki
   1. Przygotować bufor próbki SDS (4% SDS, 4 M mocznik, 10% 2-merkaptoetanol, 10% glicerol, 70 mM Tris-HCl pH 6,4, 0,001% błękitu bromofenolowego i inhibitor proteazy).
   2. Umieść około 100 wycinków mięśni o wielkości 10 μm pobranych z kriosekcji w 150 μl buforu SDS.
   3. Krótko homogenizuj próbki białek na lodzie przez 30 sekund za pomocą poręcznego mikrohomogenizatora.
   4. Odwirować przy 16 500 x g przez 15 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Kontynuować analizę lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. SDS-PAGE do pomiaru stężenia białka
   UWAGA: Do określenia stężenia białka użyto fluorescencyjnego barwnika żelowego.
   1. Określić normalną masę zdrowej próbki kontrolnej i stężenie za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Przygotować próbki do elektroforezy żelowej. Odpipetować 10 μg białka całkowitego osoby zdrowej z grupy kontrolnej i 5 μl próbek pobranych od pacjenta, 5 μl 4 porcji buforu próbki, 2 μl 10 ml środka redukującego próbkę. Po ich wymieszaniu dodać wodę dejonizowaną do końcowej objętości 20 μl w każdej próbce.
   3. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
   4. Przygotuj 2,000 ml 1x bufor do biegania SDS, używając 50 ml 40x buforu do biegania SDS. Rozcieńczyć 1 950 ml wody dejonizowanej.
      UWAGA: W tym momencie wystarczy 1,000 ml buforu do biegania. Pozostałe 1 000 ml buforu jest używane w kroku 7.3.1.
   5. Dokładnie wymieszaj i odłóż na bok 800 ml buforu do pracy 1x SDS do użycia w dolnej (zewnętrznej) komorze buforowej pudełka na żel.
   6. Bezpośrednio przed elektroforezą dodać 500 μl buforu przeciwutleniającego do 200 ml 1x buforu do pracy SDS do użycia w górnej (wewnętrznej) komorze buforowej pudełka żelowego.
   7. Przygotuj się do elektroforezy żelowej, zakładając żel 3-8% Tris-acetate zgodnie z protokołem producenta. Załadować 20 μl każdej próbki na żel.
   8. Wykonać elektroforezę przy napięciu 150 V przez 75 minut.
   9. Po elektroforezie umieść żel bezpośrednio w czystej tacce zawierającej 50 ml fluorescencyjnego roztworu barwnika żelowego.
   10. Przykryj tackę, umieść na shakerze i mieszaj, nie rozpryskując płynu ani nie uszkadzając żelu przez 90 minut.
   11. Przenieś żel do wody przed obrazowaniem w systemie fluorescencyjnym przy oświetleniu 312 nm z filtrem emisyjnym bromku etydyny w celu wykrycia fluorescencji.
   12. Zmierzyć stężenia próbek pobranych od pacjenta w oparciu o krzywą analityczną skonstruowaną przy użyciu normalnego lizatu kontrolnego o znanym stężeniu.
3. SDS-PAGE do western blotting
   1. Przygotuj pojemnik na żel zgodnie z krokami 7.2.4-7.2.6.
   2. Na podstawie pomiaru stężenia uzyskanego w kroku 7.2.11 załadować 100 μg na pas zdrowego lizatu kontrolnego i 300 μg na pas próbki pacjenta. Elektroforeza przy użyciu tych samych ustawień, co w kroku 7.2.7.
4. Przenoszenie białek
   1. Przygotuj bufor transferu. Namocz membranę PVDF przez 20 s w metanolu. Przenieś go do bufora Blot B do czasu użycia.
   2. Namocz bardzo grubą bibułę w buforze bibułowym A, B i C na co najmniej 30 minut na bufor.
   3. Po elektroforezie namocz żel w buforze bibułkowym B na 5 minut.
   4. Umieść bibuły, membranę PVDF i żel na półsuchej maszynie transferowej zgodnie z rysunkiem w Rysunek 1. Za pomocą wałka rozwałkuj pęcherzyki powietrza między żelem a membraną.
   5. Transfer przy membranie 2 mA/^cm2 przez 1 godzinę przy RT.
      UWAGA: Po przeniesieniu zaleca się wykonanie barwienia białkami całkowitymi, podobnego do barwienia Pucseau, aby potwierdzić pomyślne przeniesienie białek o dużej masie cząsteczkowej.
5. Blokowanie i barwienie przeciwciał
   1. Przepłukać membranę dwukrotnie PBST (1x PBS z 0,1% Tween 20).
   2. Umieść membranę w 1% środku blokującym i delikatnie kołysz przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować.
   3. Inkubować błonę z przeciwciałem anty-dystrofinowym w roztworze blokującym (1:125) i przeciwciałem antyspektrynowym (1:25 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Przemyć membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBST w temperaturze pokojowej.
   5. Inkubować błonę z sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) drugorzędowym przeciwciałem przeciwko myszy/królikowi w PBST (1:100) przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Ponownie umyć membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBST w temperaturze pokojowej.
6. wykrywanie
   1. Zmieszaj roztwory detekcyjne A i B w stosunku 1:1. Końcowa wymagana objętość odczynnika detekcyjnego to 0,1 ml/^cm2 membrany.
   2. Usuń nadmiar PBST z umytej membrany i umieść go białkiem do góry na arkuszu folii lub innych odpowiednich czystych powierzchniach. Dodać zmieszany odczynnik detekcyjny na membranę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Usuń nadmiar odczynnika do wykrywania, delikatnie trzymając membranę w kleszczach i dotykając krawędzią tkanki.
   4. Umieść białko blot stroną do góry na tacy na próbki. Używaj systemu fluorescencyjnego zgodnie z dokumentacją użytkownika. Ustaw maszynę w następujący sposób. Typ ekspozycji: Przyrost, Czas interwału: 10 s, Czułość/rozdzielczość: wysoka.
      UWAGA: Mierzone obszary zostały oznaczone niebieskim prostokątem (Rysunek 4a-b): BG: tło; D: dystrofina 427 kDa, SL: spektryna beta długa izoforma (274 kDa); SS: krótka izoforma (253 kDa). Stosunek sygnału dystrofiny/spektryny obliczono jako (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. Stosunek normalnej kontroli został ustalony na 100%.

Wyniki

Aby użyć RT-PCR do wykrywania przeskakiwania eksonów, startery po obu stronach eksonu, które zostaną pominięte, zostały zaprojektowane i ocenione tak, aby dawały tylko określone pasma (zobacz Rysunek 2 dla schematycznego schematu pomijania eksonów i pozycji startera). Podkłady powinny wytwarzać produkty, które można łatwo odróżnić po rozmiarze w systemie MCE lub normalnej elektroforezie w żelu agarozowym, jeśli MCE nie jest dostępne. Rysunek 3a pokazuje obrazy reakcji RT-PCR w żelu systemu MCE A oraz wyniki sekwencjonowania pominiętego pasma od pacjentów NS-03 i NS-07 przed i po leczeniu NS-065/NCNP-01 w badaniu fazy 1 z eskalacją dawki. NS-03 i NS-07 zawierają delecje, które obejmują odpowiednio eksony 45-52 i 48-52. NS-03 otrzymywał 5 mg/kg, a NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 co tydzień przez 12 tygodni. Zgodnie z oczekiwaniami przed leczeniem, obaj pacjenci nie wykazywali przeskakiwania, a jedynie można było uwidocznić niepominięte pasmo. Po 12 tygodniach leczenia dla NS-07 uwidoczniono wyraźne pominięte dolne pasmo. Jednak nadal trudno było wykryć jakikolwiek pominięty produkt u pacjenta NS-03. Wyniki sekwencjonowania wykazały konkatenację eksonów 47 i 54 dla NS-07, a także eksonów 44 i 54 dla NS-03. Zgodnie z sekwencją, mogą one teoretycznie wytworzyć funkcjonalną, ale skróconą izoformę dystrofiny. Aby obliczyć procent przeskakiwania pokazany w Rysunek 3b, stężenie molowe dla pominiętego pasma zostało podzielone przez pominięte i niepominięte pasmo. W przypadku pacjenta NS-07 odsetek ten wynosił 72%, a w przypadku NS-03 3,4%. Dane Western blot (w trzech egzemplarzach) od pacjentów NS-03, NS-07 i zdrowej grupy kontrolnej są pokazane w Rysunek 4a. Spodziewano się, że przed leczeniem nie wykryto pasma dystrofiny. Po leczeniu wykryto prążek od pacjenta NS-07 o mniejszej masie cząsteczkowej w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną (dystrofina typu dzikiego ma masę cząsteczkową 427 kDa, a dystrofina NS-07 ma masę cząsteczkową 389 kDa). Ze względu na delecję i przeskakiwanie eksonów, izoforma dystrofiny od pacjenta NS-07 nie miała kilku eksonów i spodziewano się, że będzie miała niższą masę cząsteczkową. Pacjent NS-03 nie wykazywał wykrywalnych poziomów dystrofiny po leczeniu. W Rysunek 4b, pokazana jest ilość dystrofiny w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną dla pacjenta NS-07. Miejsce, w którym zmierzono natężenie sygnału w celu obliczenia odbudowy dystrofiny, jest oznaczone niebieskimi kwadratami. Stosunek spektryny dystrofiny wykorzystano do obliczenia ilości dystrofiny w porównaniu z grupą kontrolną osoby zdrowej. W tym celu sygnał z dystrofiny minus tło został podzielony przez sumę dwóch izoform spektryny (długiej i krótkiej) minus tło (patrz krok 8.6.5). Współczynnik dla zdrowej kontroli został ustawiony na 100%. Ilość dystrofiny w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną u pacjenta NS-07 po leczeniu wynosiła 9,1%. Jednak nie można było obliczyć procentu dla pacjenta NS-03 ze względu na słabe pasmo dystrofiny, które jest podobne do tych uzyskanych dla wcześniejszych próbek leczenia dla obu pacjentów.

Rysunek 1: Schemat ideowy stosu transferowego do analizy western blot. Na dole pokazano montaż stosu transferowego western blot z bibułą nasączoną buforem bibułowym A na dole, a następnie bibułą nasączoną buforem bibułowym B, membraną PVDF, żelem 3-8% tris-octanowym, a na górze 2 bibułkami nasączonymi buforem bibułowym C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Schematyczny rysunek pomijania eksonu 53 u pacjenta z delecją eksonu 45-52 w genie DMD. Na przykład pacjent NS-03 w badaniu klinicznym ze zwiększaniem dawki miał tę delecję. Jeśli ekson 53 zostanie zachowany, mRNA będzie poza ramką, ponieważ połączenie ekson-ekson między eksonem 44 i 53 zakłóca ramkę odczytu, powodując kodon stop w eksonie 53. Ramka odczytu jest przywracana, gdy ekson 53 jest pomijany i wytwarzana jest krótsza izoforma dystrofiny. Aby wykryć pomijanie eksonu 53 za pomocą RT-PCR, stosuje się startery w eksonie 44 i 54, aby można było łatwo wykryć produkt PCR między pominiętym i niepominiętym mRNA. FWD: starter do przodu, REV: starter odwrotny, PMO: oligomer morfolinooligomeru fosforodiamidanu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Skuteczność pomijania u pacjentów z NS-03 i NS-07 z próbek biopsji mięśnia piszczelowego przedniego. a) Obraz żelu wygenerowany przez system elektroforezy A próbek RT-PCR próbek nieleczonych i leczonych próbek od pacjentów NS-03 i NS-07. Górny panel pokazuje NS-03, a dolny NS-07 w trzech egzemplarzach. Dla NS-03 niepominięte pasmo wynosi 422 pz, a pominięte pasmo wynosi 212 pz. Dla NS-07 pasma wynoszą odpowiednio 836 pz i 624 pz. Analiza sekwencji wykazała konkatenację eksonu 44 i eksonu 54 dla NS-03 oraz eksonu 47 do eksonu 54 dla NS-07. b) Skuteczność pomijania przed i po leczeniu jest pokazana dla pacjentów NS-03 i NS-07, obliczona na podstawie stężenia molowego dwóch prążków dostarczonych przez system A jako pominięte pasmo/(pominięte pasmo + niepominięte pasmo) x 100. Skuteczność przeskakiwania dla NS-03 była bardzo niska po zabiegu; dla NS-07 sprawność przeskakiwania wynosiła ponad 70%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Kwantyfikacja białek izoform dystrofiny przed i po terapii z pominięciem eksonów. a) Kwantyfikacja białek izoform dystrofiny przed i po terapii z pominięciem eksonów. Biopsja mięśnia Western blot z kości piszczelowej przedniej od pacjentów NS-03 i NS-07 przed i po leczeniu oraz od zdrowej grupy kontrolnej w trzech egzemplarzach. Dystrofinę można zaobserwować w stężeniu 427 kDa dla zdrowej grupy kontrolnej i w stężeniu 389 kDa dla NS-07 po leczeniu. U żadnego pacjenta przed leczeniem nie wykryto dystrofiny, ani też nie można było wykryć jej po leczeniu u pacjenta NS-03. Obszar w czarnej ramce pokazano na rysunku 4b. Po lewej stronie każdej plamy pokazany jest znacznik. b) Ilość dystrofiny przywróconej po leczeniu u pacjenta NS-07. Odbudowa dystrofiny została obliczona na podstawie intensywności pasm dla dystrofiny, tła oraz długiej i krótkiej izoformy spektryny zgodnie ze wzorem: (dystrofina - tło)/(spektryna L - tło) + (spektryna S - tło), gdzie stosunek dla zdrowej kontroli jest ustawiony na 100%. Intensywność każdego pasma została zmierzona wewnątrz niebieskich pól pokazanych na rysunku. Odbudowa dystrofiny dla NS-07 wynosiła 9,1% po leczeniu. Sygnał dystrofiny był zbyt słaby, aby można go było zmierzyć w próbkach niepoddanych działaniu środka. Rozmiary znaczników są podane w kilodaltonach. Dys: dystrofina, BG: tło, SL: długa izoforma spektryny, SS: krótka izoforma spektryny, My: miozyna typu 1. Rozmiary znaczników są podane w kilodaltonach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

rozwiązanie	Objętość/reakcja (μl)	Końcowe stężenie
Woda wolna od RNaz (w zestawie)	zmienna	-
5x bufor QIAGEN OneStep RT-PCR	5.0	1x
dNTP Mix (zawierający 10 mM każdego dNTP)	1,0	400 μM każdego dNTP
Podkład do przodu (10 μM)	1,5	0,6 μM
Podkład odwrotny (10 μM)	1,5	0,6 μM
Mieszanka enzymatyczna QIAGEN OneStep RT-PCR	1,0	-
Inhibitor RNazy (opcjonalnie)	zmienna	5–10 jednostek/reakcję
Matryca RNA	50 ng
łączny	25

Tabela 1: Odczynniki RT-PCR. Związki niezbędne do jednej reakcji RT-PCR.

podkład	kolejność
44F	5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'
art. 48 stopni	5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R	5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'
Zobacz materiał 54R	5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

Tabela 2: Lista podstaw. Sekwencje starterów użytych w tym badaniu. F: Do przodu, R: Do tyłu.

1 cykl	Odwrotna transkrypcja	Czas trwania: 30 min	50 °C
1 cykl	Wstępny etap aktywacji PCR	Czas trwania: 15 min	95 °C
35 cykli	denaturacja	1 min	94 °C
	Wyżarzanie	1 min	60 °C
	rozszerzenie	1 min	72 °C
1 cykl	Końcowe przedłużenie	Czas trwania: 7 min	72 °C
trzymać		∞	4 °C

Tabela 3: Użyto kondycjonowania PCR. Pokazuje warunki PCR dla reakcji RT-PCR.

rozwiązanie	Objętość/reakcja (μl)
Woda wolna od RNaz	zmienna
BigDye Terminator 3.1 Gotowa mieszanka reakcyjna	3,5
Podkład do przodu/podkład wsteczny (3,2 μM)	2.0
Matryca RNA	20 ng
łączny	20

Tabela 4: Odczynniki niezbędne do reakcji sekwencjonowania. W konfiguracji użyj podkładu do przodu lub do tyłu, a nie obu w tym samym czasie.

1 cykl	1 min	96 °C
25 cykli	10 sekund	96 °C
	5 sekund	50 °C
	Czas trwania: 4 min	60 °C
trzymać	∞	4 °C

Tabela 5: Warunki PCR dla sekwencjonowania Sangera.

Dyskusja

Badania kliniczne nad DMD przyniosły zarówno sukcesy, jak i porażki w ciągu ostatnich kilku lat. Zarówno RT-PCR, jak i western blot są powszechnymi technikami oceny skuteczności pomijania generowanej przez związki pomijające egzony podawane pacjentom. Stwierdzono jednak, że RT-PCR przeszacowuje skuteczność pomijania w porównaniu z cyfrowym PCR¹⁵. Chociaż wynika to z wielu powodów, jest to spowodowane przede wszystkim bardziej efektywną amplifikacją mniejszych, pominiętych fragmentów podczas cykli PCR. Wydaje się, że RT-PCR zastosowany w tym badaniu klinicznym generował również wyższą skuteczność pomijania w porównaniu z ekspresją białka oszacowaną przez western blotting. Według FDA jest to bardziej wiarygodny sposób ilościowego określenia odbudowy dystrofiny¹². W związku z tym należy zachować ostrożność podczas interpretacji wyników pomijania RT-PCR; Próbki można jednak nadal porównywać. Próbki wykazujące wyższą skuteczność pomijania na podstawie wyników RT-PCR często wykazują wyższe poziomy ekspresji białka w analizach western blot.

Ponieważ nie wszyscy pacjenci w badaniach klinicznych z DMD mają ten sam wzorzec delecji, zaprojektowanie starterów i sond, które są odpowiednio specyficzne do przeprowadzenia digital lub qPCR na wszystkich próbkach, może być trudne. W związku z tym RT-PCR jest nadal dobrą alternatywą dla pierwszej oceny skuteczności pomijania. Przed rozpoczęciem badania klinicznego NS-065/NCNP-01 ocena skuteczności pomijania dla każdego pacjenta in vitro była żmudna, ponieważ biopsja mięśni lub skóry była obowiązkowa w celu wytworzenia mioblastów specyficznych dla pacjenta. Jednak niedawno opublikowaliśmy nową technikę generowania specyficznych dla pacjenta komórek pochodzących z moczu (UDC) przekształconych w MYOD1 jako nowego modelu komórek mięśniowych DMD¹⁶. W związku z tym do wytworzenia mioblastów wymagany jest tylko mocz pobrany od pacjenta i nie jest konieczna żadna inwazyjna procedura. Uważamy, że ta metoda może być stosowana do badań przesiewowych różnych AON w komórkach specyficznych dla pacjenta. Co więcej, różne startery i sondy mogą być testowane przed rozpoczęciem przez pacjenta jakiegokolwiek badania klinicznego. Może to ułatwić w przyszłości stosowanie qPCR lub digital PCR do pomiaru z pominięciem eksonów w badaniach klinicznych DMD.

Do przeprowadzenia analizy western blot w tym badaniu klinicznym użyto pojedynczego przeciwciała przeciwko dystrofinie, a jako próbkę referencyjną użyto tylko jednej zdrowej grupy kontrolnej. W związku z tym swoistość przeciwciała nie została odpowiednio zwalidowana. To, wraz z faktem, że przeciwciało rozpoznaje tylko C-końcową domenę dystrofiny, jest ograniczeniem protokołu. W przyszłości wskazane są zdrowsze grupy kontrolne i przeciwciała skierowane przeciwko różnym domenom cząsteczki dystrofiny.

Tutaj podsumowaliśmy protokoły, które zostały użyte w niedawnym badaniu eksploracyjnym zainicjowanym przez badaczy, pierwszym badaniu NS-065 / NCNP-01 na ludziach. NS-065/NCNP-01 ma potencjalnie zastosowanie do 10,1% pacjentów z DMD.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 bp DNA Ladder	Takara	3407A	Roztwór markerowy do
roztworu buforowego MultiNA 1mol / l-Tris-HCl (pH 7,6)	Nacalai	35436-01
2-merkaptoetanol	Nacalai	21418-42
2-metylobutan (izopentan)	Sigma-Aldrich	15-2220
5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem	Falcon	352235
6 i razy; Bufor ładujący	Takara	9156
Agaroza ME	Iwai chemiczny	50013R
Applied Biosystems 3730 Analizator DNA	Applied Biosystems	A41046
BD Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cyklu	Applied Biosystems	4337455
Albumina surowicy bydlęcej rozwiązanie	Sigma-Aldrich	A8412
Błękit bromofenolowy	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96-dołkowe płytki	Applied Biosystems	4367819
cOmplete Inhibitor proteazy Koktajl	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
Odczynnik blokujący ECL Prime	GE opieka zdrowotna	RPN418
Odczynnik do wykrywania blottingu ECL Prime Medyczny		RPN2232
GE Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion Automatyczna stacja elektroforezy	Bio-Rad	7007010	System elektroforezy mikroprocesorowej Zestaw
analizy DNA 1K Experion na 10 chipów	Bio-Rad	7007107JA
Experion Stacja zalewania	Bio-Rad	7007030
Experion Vortex Station II	Bio-Rad	7007043
Bibuła filtracyjna o bardzo grubej plamie	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed Żel z kwasami nukleinowymi Bejca	Biotium	41003
szklana fiolka	Iwaki	1880 SV20
Glycerol	Nacalai	17045-65
Histofine Prosta plama MAX PO	Nichirei	424151
Serum dla koni	Gibco	16050122
Immobilon-P Membrana transferowa	Millipore	IPVH304F0
ITS Płynny suplement mediów	Sigma-Aldrich	I3146
Metanol	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	System elektroforezy mikrochipowej B
Wielopłytkowe 96-dołkowe płytki do PCR	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One Spektrofotometr UV-Vis z mikroobjętością Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM Liofilizowane mysie przeciwciało monoklonalne Dystrofina (C-koniec)	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM Liofilizowane mysie przeciwciało monoklonalne Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% tris-acetatowe żele białkowe	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE Przeciwutleniacz	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS Próbka Buffer	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Środek redukujący próbki	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Tris-Acetate SDS Bufor do biegania	Invitrogen	LA0041
Wilga Fluorescencyjny barwnik żelowy	Bio-Rad	1610496
PBS	Gibco	10010023
Stabilizowany	roztwór penicyliny-streptomycynySigma-Aldrich	P4458
Physcotron Poręczny mikrohomogenizator	MICROTEC	NS-310E3
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Scientific	23227
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenu	Sigma-Aldrich	TR-1003
Roztwór do barwienia jodku propidium	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep Zestaw RT-PCR	Qiagen	210212
RNeasy Mini zestaw do tkanek włóknistych	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
Półsucha maszyna transferowa	Bio Craft	41-1293
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasami nukleinowymi	Invitrogen	S11494	MultiNA
TAE	Nacalai	35430-61
Guma tragakantowa	Wako	200-02245
Tris-EDTA Bufor	Nippon Gen	316-90025	dla MultiNA
Trypsyna-EDTA (0,05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Mocznik	Nacalai	35907-15
Wizard SV Żel i system czyszczenia PCR	Promega	A9281
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001