Artykuł metodologiczny

Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60672

⸱

7 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry, 2Clinical Research Support Office, Translational Medical Center, National Center of Neurology and Psychiatry, 3Department of Child Neurology, National Center Hospital, National Center of Neurology and Psychiatry

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny 38 za pomocą sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blottingu w badaniu klinicznym.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest chorobą zwyrodnieniową mięśni, która powoduje postępującą utratę masy mięśniowej, prowadząc do przedwczesnej śmierci. Mutacje często powodują zniekształconą ramkę odczytu i przedwczesne kodony stop, co skutkuje prawie całkowitym brakiem białka dystrofiny. Ramkę odczytu można skorygować za pomocą oligonukleotydów antysensownych (AON), które indukują przeskakiwanie eksonów. Wykazano, że morpholino AON viltolarsen (nazwa kodowa: NS-065/NCNP-01) indukuje przeskakiwanie eksonu 53, przywracając ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52. Niedawno podaliśmy NS-065 / NCNP-01 dożylnie pacjentom z DMD w eksploracyjnym badaniu NS-065 / NCNP-01 zainicjowanym przez badacza, pierwszym na ludziach. W tym artykule przedstawiono molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny przy użyciu sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blotting w badaniu klinicznym. Charakterystyka ekspresji dystrofiny miała zasadnicze znaczenie w badaniu dla wykazania skuteczności, ponieważ nie przeprowadzono żadnych funkcjonalnych testów wyników.

Wprowadzenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest chorobą zwyrodnieniową mięśni, powodującą postępującą utratę masy mięśniowej, niewydolność oddechową i kardiomiopatię, która prowadzi do przedwczesnej śmierci1. Choroba jest spowodowana brakiem dużego strukturalnego białka mięśniowego dystrofiny2. Mutacje w genie DMD na chromosomie X są recesywne, a choroba dotyka 1 na 3500-5000 nowonarodzonych mężczyzn3,4,5. Mutacje są często dużymi delecjami w obszarze hotspotu między eksonami 44 i 55, które prowadzą do zniekształconej ramki odczytu i przedwczesnych kodonów stop, powodując rozpad za pośrednictwem nonsensu i prawie całkowity brak białka dystrofiny6,7,8. Ramkę odczytu można skorygować za pomocą oligonukleotydów antysensownych (AON), które indukują przeskakiwanie eksonów i przywracają ramkę odczytu, częściowo przywracając ekspresję dystrofiny i opóźniając postęp choroby9,10,11. Morfolino AON eteplirsen, który został niedawno zatwierdzony przez Federalną Agencję Leków (FDA), indukuje pomijanie eksonu 51 i może przywrócić ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 5212,13. Jednak pomijanie eksonu 53 przywraca ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52 i może potencjalnie leczyć około 10% pacjentów z DMD14. Wykazano, że lek morpholino AON NS-065/NCNP-01 indukuje przeskakiwanie eksonu 53 w komórkach ludzkich, a ostatnio podaliśmy NS-065/NCNP-01 pacjentom z DMD w otwartym badaniu klinicznym fazy 1 ze zwiększaniem dawki (zwanym dalej "badaniem") (zarejestrowanym jako UMIN: 000010964 i ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Badanie wykazało zależny od dawki wzrost pomijania eksonu 53 w oparciu o RT-PCR i poziomy białka dystrofiny w oparciu o western blotting, a także nie zaobserwowano żadnych poważnych zdarzeń niepożądanych ani rezygnacji z leczenia14.

We wszystkich badaniach klinicznych analiza wyników ma ogromne znaczenie. W przypadku badań klinicznych nad DMD nadal trwa debata na temat najlepszej metody wykazania korzyści z leczenia. Testy kliniczne, takie jak test 6-minutowego marszu, mają pewne wady. Molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny można przeprowadzić przy użyciu kilku metod, takich jak RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting i immunohistochemia. Jednak zakres przywrócenia ekspresji białek, który jest wymagany do uzyskania korzyści klinicznych, pozostaje niejasny. W tym artykule szczegółowo opisujemy metody RT-PCR i western blot stosowane do określania odpowiednio pomijania eksonów i poziomów białka w badaniu fazy 1 leku z pominięciem AON NS-065/NCNP-0114.

Protokół

Procedura operacyjna dla badania zainicjowanego przez badacza została zatwierdzona przez komisję etyczną NCNP (ID zatwierdzenia: A2013-019).

1. Przygotowanie próbek mięśni

UWAGA: Mięśnie dwugłowe ramienia lub mięśnie czworogłowe są często wybierane jako miejsca biopsji. Jednak w badaniu klinicznym wykorzystano piszczel przedni.

  1. Biopsja mięśni od pacjentów
    1. Zaznacz miejsce nacięcia przed przygotowaniem skóry.
    2. Przygotuj gazę zwilżoną solą fizjologiczną do próbki biopsji. Dobrze ściśnij gazę.
    3. Wstrzyknąć znieczulenie miejscowe w skórę i tkankę podskórną, ale nie w mięśnie. Upewnij się, że znieczulenie jest głębokie dzięki braku bólu skórnego.
      UWAGA: Znieczulenie ogólne jest zwykle stosowane u dzieci i młodzieży w wieku poniżej 15 lat.
    4. Wykonaj nacięcie od skóry do tkanki podskórnej. Użyj małych retraktorów, aby otworzyć nacięcie i oddzielić podskórną tkankę tłuszczową.
      UWAGA: Na tym etapie część skóry może zostać wycięta w celu hodowli fibroblastów.
    5. Wykonaj kolejne małe nacięcie w powięzi i przetnij powięź dalej. Zaciśnij krawędzie za pomocą kleszczy do komarów, aby odsłonić mięsień.
    6. Użyj szwu, aby podciągnąć wybraną część mięśnia. Zrób mały tunel za pomocą nożyczek do tęczówki i włóż do niego kleszcze do komarów.
    7. Oddziel wiązkę mięśni za pomocą kleszczy i odetnij oba końce części docelowej.
      UWAGA: Próbki z biopsji mięśni powinny być mniej więcej wielkości ołówka dla dorosłych pacjentów (długość 1,0-1,5 cm, średnica 0,8-1,0 cm). U dzieci i młodzieży próbka powinna mieć około 1 cm długości i 5 mm średnicy.
    8. Owinąć próbkę w gazę zwilżoną solą fizjologiczną i natychmiast przetransportować świeży mięsień w temperaturze pokojowej (RT) do obiektu, w którym próbkę można przygotować do dalszej analizy.
      UWAGA: Próbki należy transportować w temperaturze 4 °C, jeśli czas transportu przekracza 1 godzinę.

2. Przygotowanie próbki mięśniowej

  1. Wymieszaj równe objętości gumy tragakantowej i wody, aż guma stanie się miękka i lepka. Załadować mieszaninę do strzykawek o pojemności 25 ml. Strzykawki można przechowywać w lodówce.
  2. Umieść około 0,5 do 1 cm gumy tragakantowej na krążkach korkowych. Oznacz dyski po przeciwnej stronie.
  3. Umieść pojemnik z izopentanem w ciekłym azocie, aż część płynu zamarznie.
  4. Umieść próbkę w gumie tragakantowej. Oś podłużna każdego mięśnia powinna być prostopadła do korka. Umieść gumę wokół dolnej części każdego mięśnia, aby pomóc w prawidłowym umieszczeniu.
  5. Za pomocą pęsety umieść próbkę mięśnia/korka w zimnym izopentanie przygotowanym w kroku 2.3 do zamrożenia. Przesuwaj próbkę w sposób ciągły przez 1 minutę lub do całkowitego zamrożenia i tymczasowo umieść na suchym lodzie.
  6. Umieścić próbkę w szklanych fiolkach i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Sekcja mięśniowa

  1. Ustawić kriostat do cięcia na sekcje w temperaturze roboczej -25 °C.
  2. Zamontuj blok korka/mięśni i przycinaj, aż uzyskasz płaskie sekcje.
  3. Użyj przekroju o grubości 10 μm do RT-PCR i western blot. Użyj grubości 6-8 μm i 10-12 μm odpowiednio do immunohistochemii lub barwienia hematoksyliną i eozyną. Umieść pokrojone kawałki w probówkach o pojemności 2,0 ml i przechowuj w temperaturze -80 °C do RT-PCR i western blot.

4. Ekstrakcja RNA i reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

  1. Ekstrahować około 10 plasterków o grubości 10 μm z zamrożonego mięśnia za pomocą kriostatu. Zebrać oczyszczony całkowity RNA za pomocą zestawu do oczyszczania całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
  3. Połączyć odczynniki wymagane do reakcji RT-PCR w probówkach do PCR zgodnie z tabelą 1. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z sekwencjami starterów.
    UWAGA: Starter do przodu wynosił 44F dla pacjenta NS-03 i 46F dla pacjenta NS-07. Odwrócony starter to 54/55R jako domyślny. Jeśli widoczne były produkty niespecyficzne, jako alternatywę stosowano 54R.
  4. Umieść probówki PCR zawierające mieszaninę w termocyklerze. Uruchom termocykler zgodnie z tabelą 3.
  5. Produkt PCR należy przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

5. Elektroforeza mikroprocesorowa i obliczanie pomijania eksonów

UWAGA: System elektroforezy mikroprocesorowej (MCE) jest często wybierany do analizy efektywności pomijania eksonów. W niniejszym protokole opisano kroki niezbędne do analizy efektywności pomijania eksonów przy użyciu systemu MCE producenta A, a także producenta B, zwanego dalej systemem A i B. Podczas badania klinicznego analizowano skuteczność przeskakiwania eksonów w układzie A. Jednak system A nie jest już dostępny w sprzedaży i zalecamy system B do analizy skuteczności pomijania eksonów. Dołączyliśmy protokoły dla obu systemów (patrz sekcja 5.1 dla systemu A i 5.2 dla systemu B). Informacje dotyczące systemu A i B znajdują się w Tabeli materiałów. Co więcej, ten krok można również wykonać z normalną elektroforezą w żelu agarozowym, ale czułość znacznie się zmniejsza

.
  1. Elektroforeza mikroprocesorowa z wykorzystaniem systemu A
    UWAGA: System A ma dwa rodzaje chipów. Tutaj opisujemy kroki związane z chipem DNA.
    1. Zrównoważ odczynniki zestawu (bufor do barwienia, bufor ładujący, drabinka i bufor żelowy) do RT, wiru i wirowania.
    2. Aby przygotować bufor żelowo-barwiący (GS), dodaj 12,5 μl buforu barwiącego do 250 μl buforu żelowego i wiruj przez 10 s. Przenieś roztwór do wirowej probówki filtracyjnej i odwiruj przy 2 400 x g przez 15 minut. Wyrzuć filtr.
      UWAGA: Przefiltrowany GS można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    3. Jeśli próbki są silnie stężone, rozcieńczyć do około 50 ng/μl buforem TE lub wodą wolną od DNaz.
      UWAGA: Jeśli próbki mają stężenie soli ≥ 200 mM KCl (lub NaCl) i/lub 15 mM MgCl2, należy wymienić bufor.
    4. Dodać 12 μl roztworu GS do dołka gruntującego żel (podświetlonego i oznaczonego GS) chipa DNA i umieścić chip w stacji zasysającej.
      UWAGA: Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, podczas dozowania włóż końcówkę pipety pionowo i do dna studzienki. Dozuj powoli do pierwszego oporu pipety i nie wypuszczaj powietrza na końcu etapu pipetowania.
    5. Wybierz tryb C3 i naciśnij przycisk Start. Po zakończeniu zalewania usuń chip.
    6. Sprawdź wzrokowo mikrokanaliki pod kątem uwięzionych pęcherzyków powietrza lub niepełnego zalewania.
    7. Załaduj przygotowane próbki i drabinę na chip, jak poniżej.
      1. Odpipetować 9 μl roztworu GS do pozostałych 3 studzienek GS.
      2. Odpipetować 5 μl buforu ładującego do studzienki L i do każdej studzienki na próbkę (1-11).
      3. Odpipetować 1 μl drabiny do studzienki L.
      4. Pobrać pipetą 1 μl próbki DNA do każdej z 11 studzienek na próbki.
      5. Odpipetować 1 μl wody wolnej od TE lub DNaz do nieużywanych studzienek. Skrócona instrukcja obsługi zestawu przedstawia rysunek układu chipów.
        UWAGA: Sprawdź wszystkie studzienki pod kątem pęcherzyków powietrza, trzymając chip nad jasnym tłem. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione na dnie studzienki za pomocą czystej końcówki pipety lub wyjmując i ponownie ładując roztwór.
    8. Umieść chip w stacji wirowej i naciśnij Mix. Stacja wirowa zatrzymuje się automatycznie po 1 minutach.
    9. Uruchom chip w stacji elektroforezy w ciągu 5 minut od załadowania.
    10. Wybierz pozycję Nowy przebieg na pasku narzędzi oprogramowania. Na ekranie New Run (Nowy przebieg) wybierz pozycję DNA (DNA) i DNA 1K (DNA 1K) z listy rozwijanej Test (Test rozwijany).
    11. Wybierz folder projektu do uruchomienia z listy rozwijanej Projekt lub utwórz nowy folder projektu, wprowadzając nazwę w polu Projekt.
    12. Wprowadź nazwę uruchomienia w polu Prefiks uruchomienia i kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie.
    13. Przyrząd emituje sygnał dźwiękowy po zakończeniu analizy i otwiera się okno wskazujące koniec przebiegu. Wybierz przycisk OK i usuń chip z platformy chipów.
    14. Wybierz punkt menu Plik | Eksportuj dane, aby wyeksportować dane. Wybierz żądane opcje w oknie dialogowym Eksportuj.
    15. Aby wyczyścić elektrody, napełnij chip czyszczący 800 μl wody dejonizowanej i umieść go na platformie chipowej, zamknij pokrywę i pozostaw ją zamkniętą na 1 minutę. Po 1 minutach otwórz pokrywę, wyjmij chip czyszczący i pozostaw elektrody do wyschnięcia na 1 minutę.
  2. Elektroforeza mikroprocesorowa z użyciem systemu B
    1. Otwórz oprogramowanie operacyjne i wprowadź przykładowe informacje. Po wprowadzeniu informacji oprogramowanie automatycznie oblicza ilość roztworów rozdzielających i znaczników.
    2. Przygotuj niezbędną ilość bufora separacyjnego obliczoną przez oprogramowanie. Najpierw przygotuj 100x roztwór barwienia żelu z kwasem nukleinowym, rozcieńczając 10 000x roztwór odpowiednią ilością buforu TE. Roztwór 100x może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
    3. Wymieszaj odpowiednią ilość 100x barwnika żelowego kwasu nukleinowego z buforem separacyjnym w specjalnej probówce dostarczonej przez firmę, aby przygotować 1x roztwór. Wiruj roztwór.
    4. Przygotuj wymaganą ilość roztworu markera w probówce.
    5. Uruchom program mycia sondy.
    6. Po zakończeniu uruchom program mycia mikroczipów.
    7. Jednocześnie pipetować próbki do wielopłytki PCR (96-dołkowej, przezroczystej) i rozcieńczyć 4 razy wodą dejonizowaną. Minimalna objętość, jaką może obsłużyć maszyna, to 6 μl, a maksymalna to 30 μl. Sugerujemy całkowitą objętość 10 μL (2,5 μL próbki i 7,5 μL wody/buforu TE).
    8. Przykryj płytki samoprzylepnymi arkuszami folii uszczelniającej PCR i odwiruj próbki.
    9. Ustaw płytkę, roztwór znacznika i 1x bufor separujący w maszynie zgodnie z umieszczeniem pokazanym przez maszynę. Naciśnij przycisk Start.
    10. Po zakończeniu przebiegu wyeksportuj dane wynikowe jako plik .csv z oprogramowania i oblicz efektywność pomijania eksonów przy użyciu stężenia molowego w następujący sposób:
      Efektywność pomijania eksonów (%) = (Pominięte pasmo / (Pominięte pasmo + Niepominięte pasmo) X 100

6. Sekwencjonowanie komplementarnego DNA (cDNA)

  1. Preparat w żelu agarozowym
    1. Odmierz 1,5 g proszku agarozy i wymieszaj proszek ze 100 ml 1x buforu TAE w kolbie do kuchenki mikrofalowej (w wyniku czego uzyskuje się 1,5% żelu agarozowego).
    2. Mikrofalówkę przez 1-3 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Nie przegotuj roztworu, ponieważ część buforu wyparuje i zmieni ostateczną zawartość procentową agarozy w żelu.
    3. Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury około 50 °C.
    4. Dodać 10 μl 10 000x fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego do roztworu agarozy.
    5. Wlej agarozę do tacki na żel z założonym grzebieniem. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 20-30 minut, aż całkowicie zastygnie.
  2. Sekwencjonowanie
    1. Wymieszać 5 μl produktu RT-PCR (z kroku 4.4) i 1 μl 6-krotnego buforu ładującego. Załaduj je do studzienek 1,5% żelu agarozowego.
    2. Uruchom żel pod napięciem 135 V przez 5 minut i 120 V przez 20 minut.
    3. Wizualizacja pasm za pomocą transiluminatora zgodnie z protokołem producenta.
    4. Usuń interesujące Cię pasma z żelu i użyj zestawu do czyszczenia żelu i PCR, aby odzyskać produkty RT-PCR.
    5. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Oczyszczone pasmo może zostać wysłane do sekwencjonowania w firmie lub zakładzie sekwencjonowania, jeśli w firmie nie jest dostępny żaden sprzęt do sekwencjonowania Sanger.
    6. Przygotować wymagane odczynniki do zestawu do sekwencjonowania cyklu i odpipetować do wielopłytkowej płytki PCR zgodnie z tabelą 4. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z sekwencjami starterów.
    7. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią samoprzylepną.
    8. Wirować płytkę przez 2 do 3 s. Krótko odwirować w wirówce z odchylanym wiadrem, tak aby zawartość osiadła na dnie studzienek (5 do 10 s) w temperaturze 1,000 x g.
      UWAGA: W studzienkach mogą występować pęcherzyki powietrza, ale nie wpływają one negatywnie na reakcję.
    9. Umieścić mieszaninę w termocyklerze i uruchomić zgodnie z tabelą 5.
    10. Oczyść reakcje sekwencjonowania za pomocą płytek zgodnie z instrukcjami producenta.
    11. Użyj analizatora DNA, aby określić sekwencje zgodnie z protokołem producenta.
    12. Porównaj uzyskaną sekwencję z sekwencją oczekiwaną przez pacjenta.

7. Western blotting

  1. Przygotowanie próbki
    1. Przygotować bufor próbki SDS (4% SDS, 4 M mocznik, 10% 2-merkaptoetanol, 10% glicerol, 70 mM Tris-HCl pH 6,4, 0,001% błękitu bromofenolowego i inhibitor proteazy).
    2. Umieść około 100 wycinków mięśni o wielkości 10 μm pobranych z kriosekcji w 150 μl buforu SDS.
    3. Krótko homogenizuj próbki białek na lodzie przez 30 sekund za pomocą poręcznego mikrohomogenizatora.
    4. Odwirować przy 16 500 x g przez 15 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki. Kontynuować analizę lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. SDS-PAGE do pomiaru stężenia białka
    UWAGA: Do określenia stężenia białka użyto fluorescencyjnego barwnika żelowego.
    1. Określić normalną masę zdrowej próbki kontrolnej i stężenie za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przygotować próbki do elektroforezy żelowej. Odpipetować 10 μg białka całkowitego osoby zdrowej z grupy kontrolnej i 5 μl próbek pobranych od pacjenta, 5 μl 4 porcji buforu próbki, 2 μl 10 ml środka redukującego próbkę. Po ich wymieszaniu dodać wodę dejonizowaną do końcowej objętości 20 μl w każdej próbce.
    3. Podgrzewać próbki w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    4. Przygotuj 2,000 ml 1x bufor do biegania SDS, używając 50 ml 40x buforu do biegania SDS. Rozcieńczyć 1 950 ml wody dejonizowanej.
      UWAGA: W tym momencie wystarczy 1,000 ml buforu do biegania. Pozostałe 1 000 ml buforu jest używane w kroku 7.3.1.
    5. Dokładnie wymieszaj i odłóż na bok 800 ml buforu do pracy 1x SDS do użycia w dolnej (zewnętrznej) komorze buforowej pudełka na żel.
    6. Bezpośrednio przed elektroforezą dodać 500 μl buforu przeciwutleniającego do 200 ml 1x buforu do pracy SDS do użycia w górnej (wewnętrznej) komorze buforowej pudełka żelowego.
    7. Przygotuj się do elektroforezy żelowej, zakładając żel 3-8% Tris-acetate zgodnie z protokołem producenta. Załadować 20 μl każdej próbki na żel.
    8. Wykonać elektroforezę przy napięciu 150 V przez 75 minut.
    9. Po elektroforezie umieść żel bezpośrednio w czystej tacce zawierającej 50 ml fluorescencyjnego roztworu barwnika żelowego.
    10. Przykryj tackę, umieść na shakerze i mieszaj, nie rozpryskując płynu ani nie uszkadzając żelu przez 90 minut.
    11. Przenieś żel do wody przed obrazowaniem w systemie fluorescencyjnym przy oświetleniu 312 nm z filtrem emisyjnym bromku etydyny w celu wykrycia fluorescencji.
    12. Zmierzyć stężenia próbek pobranych od pacjenta w oparciu o krzywą analityczną skonstruowaną przy użyciu normalnego lizatu kontrolnego o znanym stężeniu.
  3. SDS-PAGE do western blotting
    1. Przygotuj pojemnik na żel zgodnie z krokami 7.2.4-7.2.6.
    2. Na podstawie pomiaru stężenia uzyskanego w kroku 7.2.11 załadować 100 μg na pas zdrowego lizatu kontrolnego i 300 μg na pas próbki pacjenta. Elektroforeza przy użyciu tych samych ustawień, co w kroku 7.2.7.
  4. Przenoszenie białek
    1. Przygotuj bufor transferu. Namocz membranę PVDF przez 20 s w metanolu. Przenieś go do bufora Blot B do czasu użycia.
    2. Namocz bardzo grubą bibułę w buforze bibułowym A, B i C na co najmniej 30 minut na bufor.
    3. Po elektroforezie namocz żel w buforze bibułkowym B na 5 minut.
    4. Umieść bibuły, membranę PVDF i żel na półsuchej maszynie transferowej zgodnie z rysunkiem w Rysunek 1. Za pomocą wałka rozwałkuj pęcherzyki powietrza między żelem a membraną.
    5. Transfer przy membranie 2 mA/cm2 przez 1 godzinę przy RT.
      UWAGA: Po przeniesieniu zaleca się wykonanie barwienia białkami całkowitymi, podobnego do barwienia Pucseau, aby potwierdzić pomyślne przeniesienie białek o dużej masie cząsteczkowej.
  5. Blokowanie i barwienie przeciwciał
    1. Przepłukać membranę dwukrotnie PBST (1x PBS z 0,1% Tween 20).
    2. Umieść membranę w 1% środku blokującym i delikatnie kołysz przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować.
    3. Inkubować błonę z przeciwciałem anty-dystrofinowym w roztworze blokującym (1:125) i przeciwciałem antyspektrynowym (1:25 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Przemyć membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBST w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować błonę z sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) drugorzędowym przeciwciałem przeciwko myszy/królikowi w PBST (1:100) przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Ponownie umyć membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBST w temperaturze pokojowej.
  6. wykrywanie
    1. Zmieszaj roztwory detekcyjne A i B w stosunku 1:1. Końcowa wymagana objętość odczynnika detekcyjnego to 0,1 ml/cm2 membrany.
    2. Usuń nadmiar PBST z umytej membrany i umieść go białkiem do góry na arkuszu folii lub innych odpowiednich czystych powierzchniach. Dodać zmieszany odczynnik detekcyjny na membranę i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń nadmiar odczynnika do wykrywania, delikatnie trzymając membranę w kleszczach i dotykając krawędzią tkanki.
    4. Umieść białko blot stroną do góry na tacy na próbki. Używaj systemu fluorescencyjnego zgodnie z dokumentacją użytkownika. Ustaw maszynę w następujący sposób. Typ ekspozycji: Przyrost, Czas interwału: 10 s, Czułość/rozdzielczość: wysoka.
      UWAGA: Mierzone obszary zostały oznaczone niebieskim prostokątem (Rysunek 4a-b): BG: tło; D: dystrofina 427 kDa, SL: spektryna beta długa izoforma (274 kDa); SS: krótka izoforma (253 kDa). Stosunek sygnału dystrofiny/spektryny obliczono jako (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. Stosunek normalnej kontroli został ustalony na 100%.

Wyniki

W celu wykrycia pomijania eksonów za pomocą RT-PCR zaprojektowano i oceniono primery znajdujące się po obu stronach eksonu, który ma zostać pominięty, tak aby uzyskiwały one wyłącznie specyficzne prążki (schemat pomijania eksonów i położenia primerów przedstawiono na Ryc. 2). Primery powinny generować produkty, które można łatwo rozróżnić pod względem wielkości w systemie MCE lub za pomocą standardowej elektroforezy w żelu agarozowym, jeśli MCE jest niedostępne. Na Ryc. 3a przedstawiono obrazy żeli z systemu MCE dla reakcji RT-PCR oraz wyniki sekwencjonowania prążka pominiętego u pacjentów NS-03 i NS-07 przed i po leczeniu preparatem NS-065/NCNP-01 w fazie 1 badania z eskalacją dawki. Pacjenci NS-03 i NS-07 posiadają delecje obejmujące odpowiednio eksony 45-52 oraz 48-52. Pacjent NS-03 otrzymywał 5 mg/kg, a pacjent NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 raz w tygodniu przez 12 tygodni. Zgodnie z przewidywaniami, przed leczeniem u obu pacjentów nie stwierdzono pomijania, a widoczny był jedynie prążek niepominięty. Po 12 tygodniach leczenia u pacjenta NS-07 zaobserwowano wyraźny, niższy prążek pominięty. Jednak w przypadku pacjenta NS-03 nadal trudno było wykryć jakikolwiek produkt pominięty. Wyniki sekwencjonowania wykazały konkatenację eksonów 47 i 54 dla NS-07 oraz eksonów 44 i 54 dla NS-03. Zgodnie z sekwencją, mogłoby to teoretycznie prowadzić do powstania funkcjonalnej, ale skróconej izoformy dystrofiny. Aby obliczyć procent pomijania przedstawiony na Ryc. 3b, stężenie molowe prążka pominiętego podzielono przez sumę stężeń prążka pominiętego i niepominiętego. Dla pacjenta NS-07 odsetek po leczeniu wyniósł 72%, a dla NS-03 3,4%. Dane z analizy Western blot (wykonanej w trzech powtórzeniach) dla pacjentów NS-03, NS-07 oraz zdrowej kontroli przedstawiono na Ryc. 4a. Zgodnie z oczekiwaniami, przed leczeniem nie wykryto prążka dystrofiny. Po leczeniu u pacjenta NS-07 wykryto prążek o niższej masie cząsteczkowej w porównaniu do zdrowej kontroli (dystrofina typu dzikiego ma masę cząsteczkową 427 kDa, natomiast dystrofina u pacjenta NS-07 ma masę cząsteczkową 389 kDa). Ze względu na delecję i pomijanie eksonów, izoforma dystrofiny u pacjenta NS-07 była pozbawiona kilku eksonów, co skutkowało spodziewaną niższą masą cząsteczkową. U pacjenta NS-03 po leczeniu nie stwierdzono wykrywalnych poziomów dystrofiny. Na Ryc. 4b przedstawiono ilość dystrofiny u pacjenta NS-07 w porównaniu do zdrowej kontroli. Miejsca, w których mierzono intensywność sygnału w celu obliczenia stopnia przywrócenia dystrofiny, zaznaczono niebieskimi kwadratami. Do obliczenia ilości dystrofiny w stosunku do zdrowej kontroli wykorzystano stosunek dystrofiny do spektryny. W tym celu sygnał z dystrofiny pomniejszony o tło podzielono przez sumę dwóch izoform spektryny (długiej i krótkiej) pomniejszoną o tło (patrz krok 8.6.5). Stosunek dla zdrowej kontroli ustalono na 100%. Ilość dystrofiny u pacjenta NS-07 po leczeniu w porównaniu do zdrowej kontroli wyniosła 9,1%. Jednak w przypadku pacjenta NS-03 nie można było obliczyć wartości procentowej ze względu na słaby prążek dystrofiny, podobny do tych uzyskanych w próbkach sprzed leczenia dla obu pacjentów.

Równowaga statyczna; schemat układu do transferu na membranę PVDF; analiza transferu białek; elektroforeza.
Rycina 1: Schematyczny rysunek układu transferowego do analizy western blot. Przedstawiono montaż układu transferowego western blot: na dole znajduje się papier do transferu nasączony buforem do transferu A, następnie papier do transferu nasączony buforem do transferu B, membrana PVDF, żel Tris-Acetate 3-8%, a na górze dwa papiery do transferu nasączone buforem do transferu C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces pomijania eksonu 53, schemat PCR, konwersja pre-mRNA do mRNA, analiza genetyczna.
Rycina 2: Schemat pomijania eksonu 53 u pacjenta z delecją eksonów 45-52 w genie DMD. Na przykład pacjent NS-03 w badaniu klinicznym z eskalacją dawki posiadał tę delecję. Jeśli ekson 53 zostanie zachowany, mRNA będzie miało przesuniętą ramkę odczytu, ponieważ złącze ekson-ekson między eksonem 44 a 53 zaburza ramkę odczytu, co powoduje powstanie kodonu stop w eksonie 53. Ramka odczytu zostaje przywrócona, gdy ekson 53 zostanie pominięty, co prowadzi do produkcji krótszej izoformy dystrofiny. Aby wykryć pominięcie eksonu 53 za pomocą RT-PCR, stosuje się primery w eksonie 44 i 54, tak aby produkt PCR mRNA z pominiętym i niepominiętym eksonem można było łatwo rozróżnić. FWD: primer forward, REV: primer reverse, PMO: oligomer fosforodiamidatowy morfolino. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki RT-PCR i sekwencja mRNA; wykres przedstawia pominięcie eksonu w próbkach traktowanych i nietraktowanych.
Rycina 3: Efektywność pominięcia dla pacjentów NS-03 i NS-07 w próbkach z biopsji mięśnia piszczelowego przedniego. a) Obraz żelu uzyskany za pomocą systemu elektroforezy A dla próbek RT-PCR z tkanek nietraktowanych i traktowanych pacjentów NS-03 i NS-07. Panel górny przedstawia pacjenta NS-03, a panel dolny pacjenta NS-07 w trzech powtórzeniach. Dla NS-03 prążek bez pominięcia ma wielkość 422 bp, a prążek z pominięciem 212 bp. Dla NS-07 prążki mają odpowiednio 836 bp i 624 bp. Analiza sekwencji wykazała połączenie eksonu 44 z eksonem 54 dla NS-03 oraz eksonu 47 z eksonem 54 dla NS-07. b) Efektywność pominięcia przed i po leczeniu dla pacjentów NS-03 i NS-07, obliczona na podstawie stężenia molowego dwóch prążków podanego przez system A jako prążek z pominięciem/(prążek z pominięciem + prążek bez pominięcia) x 100. Efektywność pominięcia dla NS-03 po leczeniu była bardzo niska; dla NS-07 efektywność pominięcia przekroczyła 70%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy, prążki białkowe, pacjent w porównaniu z kontrolą zdrową, analiza dystrofiny, obraz żelu.
Rycina 4: Ilościowe oznaczenie białka izoform dystrofiny przed i po terapii pomijania eksonów. a) Ilościowe oznaczenie białka izoform dystrofiny przed i po terapii pomijania eksonów. Western blot biopsji mięśnia piszczelowego przedniego od pacjentów NS-03 i NS-07 przed i po leczeniu oraz od zdrowej kontroli w trzech powtórzeniach. Dystrofinę można zaobserwować przy 427 kDa dla zdrowej kontroli i przy 389 kDa dla pacjenta NS-07 po leczeniu. U żadnego z pacjentów przed leczeniem nie wykryto dystrofiny, podobnie jak u pacjenta NS-03 po leczeniu. Obszar w czarnej ramce przedstawiono na Rycynie 4b. Po lewej stronie każdego blotu widoczny jest marker. b) Ilość przywróconej dystrofiny po leczeniu u pacjenta NS-07. Przywrócenie dystrofiny obliczono na podstawie intensywności prążków dla dystrofiny, tła oraz długiej i krótkiej izoformy spektryny według wzoru: (dystrofina - tło)/(spektryna L - tło) + (spektryna S - tło), gdzie stosunek dla zdrowej kontroli ustalono na 100%. Intensywność każdego prążka mierzono wewnątrz niebieskich ramek przedstawionych na rycinie. Przywrócenie dystrofiny dla NS-07 po leczeniu wyniosło 9,1%. Sygnał dystrofiny w próbkach nieleczonych był zbyt słaby, aby go zmierzyć. Wielkości markerów podano w kilodaltonach. Dys: dystrofina, BG: tło, SL: długa izoforma spektryny, SS: krótka izoforma spektryny, My: miozyna typu 1. Wielkości markerów podano w kilodaltonach. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

RoztwórObjętość/Reakcja (μl)Stężenie końcowe
Woda wolna od RNaz (dołączona)Zmienna-
5x bufor QIAGEN OneStep RT-PCR5.01x
Mieszanina dNTP (zawierająca 10 mM każdego dNTP)1.0400 μM każdego dNTP
Starter bezpośredni (10 μM)1.50.6 μM
Starter odwrotny (10 μM)1.50.6 μM
Mieszanka enzymów QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix1.0-
inhibitor RNazy (opcjonalnie)Zmienna5–10 j./reakcję
RNA matrycowe50 ng
Suma25

Tabela 1: Odczynniki do RT-PCR. Związki niezbędne do przeprowadzenia jednej reakcji RT-PCR.

StarterSekwencja
44F5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'
48F5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'
54R5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

Tabela 2: Lista starterów. Sekwencje starterów użytych w niniejszym badaniu. F: Forward (przedni), R: Reverse (odwrócony).

1 cyklodwrotna transkrypcja30 min50 °C
1 cyklWstępny etap aktywacji PCR15 min95 °C
35 cykliDenaturacja1 min94 °C
Wyżarzanie1 min60 °C
Rozszerzenie1 min72 °C
1 cyklOstateczne przedłużenie7 min72 °C
Przytrzymać∞4 °C

Tabela 3: Zastosowane warunki PCR. Przedstawiono warunki PCR dla reakcji RT-PCR.

RoztwórObjętość/Reakcja (μl)
woda wolna od RNazZmienna
Gotowa mieszanina reakcyjna BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix3.5
Starter bezpośredni/Starter odwrotny (3.2 μM)2.0
RNA matrycowe20 ng
Suma20

Tabela 4: Odczynniki niezbędne do reakcji sekwencjonowania. W przygotowaniu zestawu należy użyć startera Forward lub Reverse, nie obu jednocześnie.

1 cykl1 min96 °C
25 cykli10 s96 °C
5 s50 °C
4 min60 °C
Podtrzymanie∞4 °C

Tabela 5: Warunki PCR dla sekwencjonowania metodą Sangera.

Dyskusja

Badania kliniczne nad DMD przyniosły zarówno sukcesy, jak i porażki w ciągu ostatnich kilku lat. Zarówno RT-PCR, jak i western blot są powszechnymi technikami oceny skuteczności pomijania generowanej przez związki pomijające egzony podawane pacjentom. Stwierdzono jednak, że RT-PCR przeszacowuje skuteczność pomijania w porównaniu z cyfrowym PCR15. Chociaż wynika to z wielu powodów, jest to spowodowane przede wszystkim bardziej efektywną amplifikacją mniejszych, pominiętych fragmentów podczas cykli PCR. Wydaje się, że RT-PCR zastosowany w tym badaniu klinicznym generował również wyższą skuteczność pomijania w porównaniu z ekspresją białka oszacowaną przez western blotting. Według FDA jest to bardziej wiarygodny sposób ilościowego określenia odbudowy dystrofiny12. W związku z tym należy zachować ostrożność podczas interpretacji wyników pomijania RT-PCR; Próbki można jednak nadal porównywać. Próbki wykazujące wyższą skuteczność pomijania na podstawie wyników RT-PCR często wykazują wyższe poziomy ekspresji białka w analizach western blot.

Ponieważ nie wszyscy pacjenci w badaniach klinicznych z DMD mają ten sam wzorzec delecji, zaprojektowanie starterów i sond, które są odpowiednio specyficzne do przeprowadzenia digital lub qPCR na wszystkich próbkach, może być trudne. W związku z tym RT-PCR jest nadal dobrą alternatywą dla pierwszej oceny skuteczności pomijania. Przed rozpoczęciem badania klinicznego NS-065/NCNP-01 ocena skuteczności pomijania dla każdego pacjenta in vitro była żmudna, ponieważ biopsja mięśni lub skóry była obowiązkowa w celu wytworzenia mioblastów specyficznych dla pacjenta. Jednak niedawno opublikowaliśmy nową technikę generowania specyficznych dla pacjenta komórek pochodzących z moczu (UDC) przekształconych w MYOD1 jako nowego modelu komórek mięśniowych DMD16. W związku z tym do wytworzenia mioblastów wymagany jest tylko mocz pobrany od pacjenta i nie jest konieczna żadna inwazyjna procedura. Uważamy, że ta metoda może być stosowana do badań przesiewowych różnych AON w komórkach specyficznych dla pacjenta. Co więcej, różne startery i sondy mogą być testowane przed rozpoczęciem przez pacjenta jakiegokolwiek badania klinicznego. Może to ułatwić w przyszłości stosowanie qPCR lub digital PCR do pomiaru z pominięciem eksonów w badaniach klinicznych DMD.

Do przeprowadzenia analizy western blot w tym badaniu klinicznym użyto pojedynczego przeciwciała przeciwko dystrofinie, a jako próbkę referencyjną użyto tylko jednej zdrowej grupy kontrolnej. W związku z tym swoistość przeciwciała nie została odpowiednio zwalidowana. To, wraz z faktem, że przeciwciało rozpoznaje tylko C-końcową domenę dystrofiny, jest ograniczeniem protokołu. W przyszłości wskazane są zdrowsze grupy kontrolne i przeciwciała skierowane przeciwko różnym domenom cząsteczki dystrofiny.

Tutaj podsumowaliśmy protokoły, które zostały użyte w niedawnym badaniu eksploracyjnym zainicjowanym przez badaczy, pierwszym badaniu NS-065 / NCNP-01 na ludziach. NS-065/NCNP-01 ma potencjalnie zastosowanie do 10,1% pacjentów z DMD.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Dr Takashi Saito, Dr Tetsuya Nagata, Panu Satoshi Masuda i Dr Eri Takeshita za naukową dyskusję.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 bp DNA LadderTakara3407ARoztwór markerowy do
roztworu buforowego MultiNA 1mol / l-Tris-HCl (pH 7,6)Nacalai35436-01
2-merkaptoetanolNacalai21418-42
2-metylobutan (izopentan)Sigma-Aldrich15-2220
5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnemFalcon352235
6 i razy; Bufor ładującyTakara9156
Agaroza MEIwai chemiczny50013R
Applied Biosystems 3730 Analizator DNAApplied BiosystemsA41046
BD Matrigel MatrixBD Biosciences356234
BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cykluApplied Biosystems4337455
Albumina surowicy bydlęcej rozwiązanieSigma-AldrichA8412
Błękit bromofenolowyNacalai05808-61
Centri-Sep 96-dołkowe płytkiApplied Biosystems4367819
cOmplete Inhibitor proteazy KoktajlRoche4693116001
DMEM/F-12Gibco11320033
Odczynnik blokujący ECL PrimeGE opieka zdrowotnaRPN418
Odczynnik do wykrywania blottingu ECL Prime MedycznyRPN2232
GE Endo-PorterGeneTools2922498000
Experion Automatyczna stacja elektroforezyBio-Rad7007010System elektroforezy mikroprocesorowej Zestaw
analizy DNA 1K Experion na 10 chipówBio-Rad7007107JA
Experion Stacja zalewaniaBio-Rad7007030
Experion Vortex Station IIBio-Rad7007043
Bibuła filtracyjna o bardzo grubej plamieBio-Rad1703965
EzBlotAttoAE-1460
GelRed Żel z kwasami nukleinowymi BejcaBiotium41003
szklana fiolkaIwaki1880 SV20
GlycerolNacalai17045-65
Histofine Prosta plama MAX PONichirei424151
Serum dla koniGibco16050122
Immobilon-P Membrana transferowaMilliporeIPVH304F0
ITS Płynny suplement mediówSigma-AldrichI3146
MetanolSigma-Aldrich34860
MicroAmp Clear Adhesive FilmApplied Biosystems4306311
MultiNASHIMADZUMCE-202System elektroforezy mikrochipowej B
Wielopłytkowe 96-dołkowe płytki do PCRBio-Radmlp9601
NanoDrop One Spektrofotometr UV-Vis z mikroobjętością Wi-FiThermo ScientificND-ONE-W
NovocastraTM Liofilizowane mysie przeciwciało monoklonalne Dystrofina (C-koniec)Leica biosystemsNCL-DYS2
NovocastraTM Liofilizowane mysie przeciwciało monoklonalne SpectrinLeica biosystemsNCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% tris-acetatowe żele białkoweInvitrogenEA03785BOX
NuPAGE PrzeciwutleniaczInvitrogenNP0005
NuPAGE LDS Próbka BufferInvitrogenNP0007
NuPAGE Środek redukujący próbkiInvitrogenNP0009
NuPAGE Tris-Acetate SDS Bufor do bieganiaInvitrogenLA0041
Wilga Fluorescencyjny barwnik żelowyBio-Rad1610496
PBSGibco10010023
Stabilizowanyroztwór penicyliny-streptomycynySigma-AldrichP4458
Physcotron Poręczny mikrohomogenizatorMICROTECNS-310E3
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23227
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenuSigma-AldrichTR-1003
Roztwór do barwienia jodku propidiumBD Pharmingen556463
QIAGEN OneStep Zestaw RT-PCRQiagen210212
RNeasy Mini zestaw do tkanek włóknistychQiagen74704
SDSNacalai31606-75
Półsucha maszyna transferowaBio Craft41-1293
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasami nukleinowymiInvitrogenS11494MultiNA
TAENacalai35430-61
Guma tragakantowaWako200-02245
Tris-EDTA BuforNippon Gen316-90025dla MultiNA
Trypsyna-EDTA (0,05%)Gibco25300054
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416
MocznikNacalai35907-15
Wizard SV Żel i system czyszczenia PCRPromegaA9281
XCell SureLock Mini-CellInvitrogenEI0001
do do buforu

Bibliografia

  1. Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
  2. Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
  3. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  4. Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
  5. Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
  6. Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
  7. Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
  8. Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
  9. Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
  10. Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
  11. Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
  12. Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
  13. Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
  14. Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
  15. Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467(2016).
  16. Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ekspresji dystrofinysekwencjonowanie metod SangeraRT PCRWestern blotprzygotowanie tkanki mi niowejskrawanie w kriosztacieelektroforeza na mikroczipiebadania kliniczne nad DMD
Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.