Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje, jak izolować tętniczki i naczynia włosowate hipokampa od mózgu myszy oraz jak zwiększać w nich ciśnienie do miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badań molekularnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Od subtelnych zmian w zachowaniu do późnego stadium demencji, naczyniowe upośledzenie funkcji poznawczych zazwyczaj rozwija się po niedokrwieniu mózgu. Udar mózgu i zatrzymanie akcji serca są niezwykle dymorficznymi chorobami płciowymi i oba wywołują niedokrwienie mózgu. Jednak postęp w zrozumieniu naczyniowych zaburzeń poznawczych, a następnie opracowanie metod leczenia specyficznych dla płci, został częściowo ograniczony przez wyzwania związane z badaniem mikrokrążenia mózgowego na podstawie modeli mysich w badaniach funkcjonalnych. W tym miejscu przedstawiamy podejście do badania sygnalizacji między naczyniami włosowatymi a tętniczkami w preparacie ex vivo tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa (HiCaPA) z mózgu myszy. Opisujemy, jak izolować, kaniulować i zwiększać ciśnienie w mikrokrążeniu, aby zmierzyć średnicę tętniczki w odpowiedzi na stymulację naczyń włosowatych. Pokazujemy, które odpowiednie kontrole funkcjonalne można zastosować do walidacji integralności preparatu HiCaPA i wyświetlania typowych wyników, w tym badania potasu jako czynnika sprzęgającego nerwowo-naczyniowe oraz wpływu niedawno scharakteryzowanego inhibitora rodziny kanałów potasowych Kir2 do wewnętrznej rektyfikacji, ML133. Ponadto porównujemy odpowiedzi w preparatach uzyskanych od samców i samic myszy. Chociaż dane te odzwierciedlają badania funkcjonalne, nasze podejście może być również stosowane w badaniach biologii molekularnej, immunochemii i elektrofizjologii.
Wprowadzenie
Krążenie pialne na powierzchni mózgu było przedmiotem wielu badań, częściowo ze względu na jego eksperymentalną dostępność. Jednak topologia układu naczyniowego mózgu tworzy odrębne regiony. W przeciwieństwie do solidnej sieci pial bogatej w zespolenia o znacznej zdolności do przekierowywania przepływu krwi, tętniczki miąższowe śródmózgowe (PA) wykazują ograniczoną podaż poboczną, a każda z nich perfunduje dyskretną objętość tkanki nerwowej1,2. Powoduje to efekt wąskiego gardła w przepływie krwi, który w połączeniu z unikalnymi cechami fizjologicznymi3,4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kolorado, Kampusu Medycznego Anschutz i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.
1. Rozwiązania
- Do rozbioru należy użyć soli fizjologicznej buforowanej MOPS, a próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed ich użyciem. Nie gazować roztworu. Przygotować buforowaną sól fizjologiczną MOPS o następującym składzie: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glukozy, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM piro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Śródbłonkowe kanały potasowe o małym przewodnictwie (SK) i średnim przewodnictwie (IK) Ca2+wrażliwy na K+ kanały wywierają wpływ rozszerzający na średnicę tętnic płucnych. Aplikacja kąpielowa 1 µM NS309, syntetyczny agonista kanałów IK i SK, wywołał niemal maksymalne rozszerzenie (Rycina 2A,B). Jednakże komórki śródbłonka naczyń włosowatych nie posiadają kanałów IK i SK i nie uległy hiperpolaryzacji w odpowiedzi na NS309.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Preparat HiCaPA (tętniczka kapilarno-miąższowa hipokampa) opisany w niniejszym manuskrypcie jest rozszerzeniem naszej dobrze uznanej procedury izolacji, zwiększania ciśnienia i badania tętniczek miąższowych29. Niedawno informowaliśmy, że kanały Kir2.1 w komórkach śródbłonka naczyń włosowatych mózgu wyczuwają wzrost [K+] o związany z aktywacją neuronalną i generują rosnący sygnał hiperpolaryzacyjny, który rozszerza tętniczkiw górę 20. Ujawnienie tej wcz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Julesowi Morinowi za wnikliwe komentarze na temat rękopisu. Badania te zostały sfinansowane z nagród organizacji non-profit CADASIL Together We Have Hope, Center for Women's Health and Research oraz NHLBI R01HL136636 (FD).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 i mikro; m Filtry strzykawkowe | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Warner Instruments | TC-324B | ||
| Średnica zewnętrzna szkła borokrzemianowego: 1,2 mm, średnica wewnętrzna: 0,68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dwuwodny | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Luneta preparcyjna | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — kompletna pompa z napędem i głowicą pompy MS/CA 4-12 | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Drobne nożyczki - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Wbudowany podgrzewacz wody | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex & handel; Kleszcze do tkanek | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Bezwodny | mikromanipulator Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Narishige | MN-153 | ||
| ML 133 chlorowodorek | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Wewnątrzkomórkowe systemy dozowania mikroiniekcji, 2-kanałowe | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Regulator ciśnienia z pompą perystaltyczną | Oprzyrządowanie Living Systems | PS-200 | |
| Pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super drobne kleszcze | Nożyczki chirurgiczne Fine Science Tools | 11252-20 | |
| - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Pionowy ściągacz do mikropipet | Narishige | PP-83 |
Bibliografia
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
