Artykuł metodologiczny

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

DOI:

10.3791/60680

⸱

18 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty i mikroglej to najliczniejsze komórki glejowe. Odpowiadają za wsparcie fizjologiczne i utrzymanie homeostazy w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Coraz więcej dowodów na ich udział w zwalczaniu chorób zakaźnych uzasadnia rosnące zainteresowanie udoskonaleniem metodologii izolacji pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu oceny ich odpowiedzi na infekcje wpływające na OUN. Biorąc pod uwagę wpływ zakażenia Trypanosoma cruzi (T. cruzi) i Toxoplasma gondii (T. gondii) na OUN, przedstawiamy tutaj metodę ekstrakcji, utrzymania, dysocjacji i zakażenia mysich astrocytów i komórek mikrogleju pasożytami pierwotniaków. Wyekstrahowane komórki z kory noworodków są utrzymywane in vitro przez 14 dni z okresową wymianą pożywki różnicowej. Astrocyty i mikroglej uzyskuje się z tego samego protokołu ekstrakcji przez dysocjację mechaniczną. Po fenotypowaniu za pomocą cytometrii przepływowej komórki są zakażone pasożytniczymi pierwotniakami. Szybkość infekcji określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w różnych punktach czasowych, umożliwiając w ten sposób ocenę zróżnicowanej zdolności komórek glejowych do kontrolowania inwazji i replikacji pierwotniaków. Techniki te reprezentują proste, tanie i skuteczne metody badania odpowiedzi astrocytów i mikrogleju na infekcje, otwierając pole do dalszej analizy neuroimmunologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OUN składa się głównie z neuronów i komórek glejowych1,2,3. Mikroglej i astrocyty są najliczniejszymi komórkami glejowymi w OUN. Mikroglej, makrofag rezydentny, jest immunokompetentną i fagocytarną komórką glejową w klasie CNS3,4, podczas gdy astrocyty są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy i pełnią funkcje wspomagające5.

Pomimo tego, że komórki glejowe są klasycznie znane jako odpowiedzialne za wsparcie i ochronę neuronów6,7, pojawiające się funkcje tych komórek zostały opisane w najnowszej literaturze, w tym ich reakcje na infekcje8,9,10,11. W związku z tym istnieje nacisk na opracowanie metod izolowania tych komórek glejowych, aby zrozumieć ich indywidualne funkcje.

Istnieją alternatywne modele do badania komórek glejowych zamiast pierwotnych hodowli, takie jak unieśmiertelnione linie komórkowe i modele in vivo. Jednak unieśmiertelnione komórki są bardziej podatne na dryfowanie genetyczne i zmiany morfologiczne, podczas gdy badania in vivo narzucają ograniczone warunki manipulacji. I odwrotnie, hodowle pierwotne są łatwe w obsłudze, lepiej przypominają komórki in vivo, a także pozwalają nam kontrolować czynniki eksperymentalne12,13. W tym miejscu opisujemy wytyczne dotyczące ekstrakcji, utrzymywania i dysocjacji mysich astrocytów i pierwotnych komórek mikrogleju w tym samym protokole. Ponadto podajemy również przykłady, jak pracować z zakażeniem pierwotniakami w tych kulturach.

Komórki OUN pobrane od noworodków myszy (do 3 dni) były hodowane przez 14 dni na pożywkach różnicowych, które pozwalają na preferencyjny wzrost astrocytów i komórek mikrogleju. Ponieważ mikroglej spoczywa nad przyłączonymi astrocytami, populacje komórek zostały mechanicznie zdysocjowane w inkubatorze orbitalnym. Następnie zebraliśmy cały supernatant zawierający mikroglej i dodaliśmy trypsynę, aby odłączyć astrocyty. Wyizolowane komórki glejowe oceniono fenotypowo za pomocą cytometrii przepływowej i posiano zgodnie z pożądanym eksperymentem.

Dostarczyliśmy również przykłady, jak zainfekować te izolowane mikroglej i astrocyty pasożytami pierwotniaków. T. gondii jest wysoce neurotropowym pierwotniakiem odpowiedzialnym za toksoplazmozę14, podczas gdy T. cruzi jest odpowiedzialny za chorobę Chagasa, która może prowadzić do rozwoju zaburzeń neurologicznych w klasie CNS15,16. Ponadto donoszono również, że zakażenie T. gondii17,18 lub T. cruzi19,20,21 były przypuszczalną przyczyną zgonu pacjentów z obniżoną odpornością. Dlatego wyjaśnienie immunologicznej roli komórek glejowych z OUN w zwalczaniu zakażeń pierwotniakami ma ogromne znaczenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z brazylijskim prawem krajowym (11.794/2008) i zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Federalnego w São Paulo (UNIFESP).

1. Ekstrakcja, utrzymanie i dysocjacja komórek glejowych

UWAGA: Liczba myszy użytych do ekstrakcji komórek glejowych zależy od ilości komórek potrzebnych do przeprowadzenia pożądanych eksperymentów. W tym protokole uzyskano łącznie 2,7 x 107 astrocytów i 4 x 106 mikrogleju od sześciu nowonarodzonych myszy C57BL / 6. Wszystkie zabiegi zostały wykonane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego II klasy.

  1. Dzień 1
    1. Przygotuj czysty zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) i HBSS + 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotować uzupełnioną pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM penicylina + 0,09 mM Streptomycyna + 12,5 mM HEPES + 30 mM wodorowęglan sodu, pH 7,2) i przefiltrować filtrem 0,22 μm (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Wszystkie pożywki hodowlane powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C, ale konieczne jest ich wstępne podgrzanie w temperaturze 37 °C przez 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
    3. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (nożyczki, szpatułkę i pęsetę) w autoklawie i użyj 70% etanolu podczas zabiegu.
    4. Umieść nowonarodzone (do 3 dni) myszy w szczelnej komorze zawierającej bawełnę nasączoną izofluranem na 5 minut w celu głębokiego znieczulenia.
    5. Spryskaj szczeniaka myszy 70% etanolem i odetnij zwierzę nożyczkami.
    6. Wykonaj cięcie strzałkowe (od tyłu do przodu) nożyczkami wzdłuż czaszki, aby ją otworzyć i odsłonić mózg. Oddziel czaszkę od mózgu za pomocą pęsety. Usuń mózg za pomocą mikroszpatułki, aby zachować integralność mózgu.
    7. Umieść mózg na suchej szalce Petriego (o średnicy 6 cm). Usuń opuszkę węchową i móżdżek za pomocą mikroszpatułki. Przenieś korę na inną szalkę Petriego (6 cm średnicy) zawierającą HBSS + 10% FBS (2 ml/szalkę Petriego).
    8. Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki sterylnymi nożyczkami i za pomocą mikropipety p1000 przenieś każdą tkankę mózgową za pomocą HBSS + 10% FBS do różnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Upewnij się, że ostateczna objętość wynosi 2 ml/probówkę. Jeśli nie, w komplecie z HBSS + 10% FBS.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Jeśli tak, stożkowe rurki z tkanką OUN należy umieścić na lodzie do 1 godziny.
    9. Przemyć przeciętą tkankę mózgową 3 ml HBSS + 10% FBS (na probówkę) i po dekantacji. Ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok 3 razy.
      UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie zanieczyszczeń i odzyskanie pobranej tkanki.
    10. Przeciąć tkankę mózgową 3 ml czystego HBSS (na probówkę) i po dekantacji ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok 3 razy.
      UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie pozostałej surowicy z poprzednich prań, ponieważ w następnym kroku komórki zostaną wytrypsynizowane.
    11. Dodać 3 ml trypsyny do probówki i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie potrząsając probówkami co 5 minut. Unikaj pęcherzyków, odwracając lub gwałtownie mieszając probówki.
      UWAGA: Ten etap ma na celu strawienie pobranej tkanki.
    12. Aby dezaktywować trypsynę, przemyj tkankę 3 ml na probówkę HBSS + 10% FBS i po dekantacji tkanki ostrożnie usuń supernatant. Powtórz ten krok 3 razy.
    13. Przemyć tkankę 3 ml na probówkę czystego HBSS i ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.
    14. Dodać 7 ml do probówki czystego HBSS i homogenizować tkankę przez kolejne przejścia w pipetach: najpierw za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, następnie pipety o pojemności 5 ml, a na końcu za pomocą mikropipety p1000.
    15. Po homogenizacji probówki wirować o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    16. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 4 ml HBSS + 10% FBS na probówkę.
    17. Przenieść komórki do wstępnie poddanej obróbce kolby T-75 w celu uzyskania optymalnej adhezji kultur komórkowych (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Przetwarzaj tkankę z każdego zwierzęcia na kolbę.
    18. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut w celu zachowania zaleceń lekarskich.
    19. Dodać 10 ml uzupełnionego DMEM/F12 na kolbę i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Ostateczna objętość wynosi 14 ml na kolbę.
  2. Dzień 3
    1. Usunąć 7 ml pożywki hodowlanej z kolby T-75 i dodać 7 ml świeżo uzupełnionego DMEM/F12.
      UWAGA: Kolby będą zawierały dużo zanieczyszczeń komórkowych i będą miały mętny wygląd.
  3. Dzień 5
    1. Usunąć całą pożywkę z kolby T-75 i dodać 14 ml świeżego suplementu DMEM/F12.
      UWAGA: Pożywka jest zastępowana z kolb w celu usunięcia zanieczyszczeń i nieprzylegających komórek.
    2. Po każdych 48 godzinach usunąć 6 ml supernatantu i dodać 7 ml świeżo uzupełnionej pożywki DMEM/F12 do 14 dnia hodowli.
  4. Dzień 14
    1. Po usunięciu 6 ml supernatantu i dodaniu 7 ml świeżo uzupełnionej pożywki DMEM/F12, szczelnie zamknąć kolby T-75.
    2. Umieść je w podłogowej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min i 37 °C na noc, aby mechanicznie oddzielić mikroglej od astrocytów.
  5. Dzień 15
    1. Wyjmij kolby z wytrząsarki i energicznie umyj je ich własnym podłożem, aby zoptymalizować dysocjację komórek i zebrać maksymalną liczbę mikrogleju. Następnie zebrać supernatant (zawierający mikroglej) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Następnie dodać 4 ml trypsyny do każdej kolby i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia astrocytów.
    3. Dodać 5 ml na kolbę uzupełnionego DMEM/F12, aby dezaktywować trypsynę. Umyć kolby ich własnym podłożem i przenieść ich zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    4. Odwirować wszystkie probówki zawierające zdysocjowany mikroglej i astrocyty w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad mikrogleju w 1 ml, a astrocyty w 10 ml uzupełnionego DMEM/F12.
    6. Przejdź do zliczania komórek w komorze Neubauera lub automatycznym liczniku komórek. Pokryć komórki uzupełnionym DMEM/F12 o pożądanej gęstości na odpowiedniej płytce do hodowli komórek z płaskim dnem (wstępnie poddanej obróbce w celu optymalnego przyłączenia komórek; patrz Tabela materiałów). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić im przyłączenie.
      UWAGA: Zarezerwuj 1,5 x 106 każdej populacji komórek, aby potwierdzić ich czystość za pomocą cytometrii przepływowej.
    7. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej, aby zweryfikować czystość populacji komórek.
      UWAGA: Bierzemy pod uwagę mikroglej CD11b+/CD45+/GFAP- i astrocyty CD11b-/CD45-/GFAP+. Barwienie Iba1 i TMEM119 może być brane pod uwagę w celu pełnego scharakteryzowania mikrogleju22.
    8. Dodaj FMO (Fluorescence Minus One)23 i niebarwioną próbkę dla każdej populacji komórek (astrocytów i mikrogleju) jako kontrole testu cytometrii przepływowej.
    9. Dla każdej populacji komórek należy zarezerwować 5 x 105 komórek dla każdej barwionej i niebarwionej próbki. W przypadku FMO zarezerwuj dwie inne probówki mikrogleju zawierające 2,5 x 105 komórek każda, a także zarezerwuj kolejną probówkę z 5 x 105 astrocytów.
      UWAGA: Ponieważ liczba mikrogleju może być czynnikiem ograniczającym, możliwe jest użycie mniejszej liczby komórek do kontroli niebarwionych i FMO.
    10. Odwirować wszystkie mikroprobówki o stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 500 μl/mikroprobówkę buforu FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7,2).
    11. Odwirować wszystkie mikroprobówki o sile 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl/mikroprobówkę anty-CD16/CD32 (klon 93) (1:50) rozcieńczoną w buforze FACS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Dodać 500 μl/mikroprobówkę buforu FACS do wszystkich mikroprobówek i odwirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić probówki do barwienia astrocytów i mikrogleju, a także probówkę FMO astrocytów z mieszanką 50 μl / mikroprobówkę markerów powierzchniowych: anty-CD45 (PE, klon 30-F11) i anty-CD11b (eFluor 450, klon M1/70) (oba rozcieńczone w stosunku 1: 100 w buforze FACS).
    13. W przypadku komórek niebarwionych należy ponownie zawiesić z tą samą objętością bufora FACS. W przypadku FMO mikrogleju inkubuj każdą probówkę mikrogleju z anty-CD45 lub anty-CD11b. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności.
    14. Dodać 500 μl buforu FACS na mikroprobówkę. Wirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad ze 100 μl/mikroprobówkę buforu utrwalającego (patrz tabela materiałów) przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    15. Dodać 500 μl/mikroprobówkę buforu permeabilacyjnego 1x (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut w ciemności.
    16. Odwirować wszystkie mikroprobówki o sile 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić astrocyty i probówki do barwienia mikrogleju, a także probówki FMO mikrogleju z 50 μl / mikroprobówkę wewnątrzkomórkowego przeciwciała anty-GFAP (APC, klon GA5) w rozcieńczeniu 1:100 w 1x buforze permeabilizacji. W przypadku komórek niebarwionych i FMO astrocytów należy ponownie zawiesić komórki z tą samą objętością buforu FACS. Wszystkie próbki inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
    17. Umyj wszystkie probówki, dodając 500 μl/mikroprobówkę 1x buforu permeabilizacyjnego. Odwirować wszystkie mikroprobówki o sile 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić każdą mikroprobówkę w 200 μl buforu FACS. Pobrać 1 x 105 zdarzeń/próbkę na cytometrze przepływowym.
    18. Do analizy komórki muszą być najpierw bramkowane na CD11b x CD45, a następnie na histogramie GFAP.
      UWAGA: Kontrolki niebarwione i FMO są przydatne do określania bramek.

2. Zakażenie i ocena wskaźników infekcji

  1. Zakażenie komórek glejowych T. gondii
    1. Płytka 3 x 104 mikroglej lub astrocyty z uzupełnionym DMEM/F12 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny na wstępnie poddanej 96-dołkowej płaskiej płytce (patrz Tabela materiałów).
    2. Zakażon każdą populację komórek tachyzoitami ze szczepu T. gondii RH wykazującego ekspresję białka żółtej fluorescencji (YFP) przy wielokrotności infekcji (MOI) 1:1 (pasożyt: komórka) rozcieńczonej w 200 μl / studzienkę uzupełnionego RPMI (3% FBS + 0,16 mM penicylina + 0,18 mM Streptomycyna + 12,5 mM HEPES + 30 mM wodorowęglan sodu, pH 7,2) (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.
    3. Następnie odrzucić supernatant i utrwalić komórki, dodając 100 μl/basenik 1% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    4. Zastąp PFA 100 μl/studzienkę PBS o pH 7,2.
    5. Ostrożnie usunąć supernatant i jądra komórek barwiących, pipetując 50 μl/studzienkę DAPI (5 mg/ml) rozcieńczonego w PBS pH 7,2 (1:1,000) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Zastąp roztwór barwiący DAPI 100 μl/studzienkę PBS (pH 7,2) i przeanalizuj go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  2. Zakażenie komórek glejowych T. cruzi
    1. Płytka 3 x 104 mikroglej lub astrocyty z uzupełnionym DMEM/F12 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny na wstępnie poddanej 96-dołkowej płaskiej płytce (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Dla każdego punktu infekcji użyj innej płytki.
    2. Zakażone komórki glejowe trypomastigotami ze szczepu T. cruzi Y przy MOI 5:1 (pasożyty:komórka) rozcieńczone w 200 μl / studzienka uzupełnionego RPMI i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny
      UWAGA: Ten krok jest ważny dla inwazji pasożyta na komórki.
    3. Usuń cały supernatant i umyj studzienki, dodając 200 μl / studzienkę uzupełnionego RPMI w celu usunięcia wszystkich pasożytów zewnątrzkomórkowych. Usunąć supernatant i dodać 200 μl/studzienkę świeżo uzupełnionego RPMI.
      UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie wszystkich pasożytów, które nie zaatakowały przylegających komórek.
    4. Inkubuj zakażone komórki przez 2 godziny, 48 godzin i 96 godzin, aby ocenić replikację T. cruzi w komórkach glejowych11.
    5. Po każdym punkcie czasowym usunąć supernatant i utrwalić komórki za pomocą 100 μl/basenik metanolu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zastąpić metanol 100 μl/basenik PBS (pH 7,2).
    6. Po utrwaleniu przygotuj komórki do testu immunofluorescencyjnego w następujący sposób.
      1. Aby uniknąć autofluorescencji, należy potraktować komórki 100 μl/basenik 50 mM NH4Cl rozcieńczonego w PBS (pH 8,0) przez 15 minut. Umyj komórki, dodając 100 μl / studzienkę PBS i natychmiast usuń (powtórz ten krok 3 razy).
      2. Następnie przepłucz komórki, dodając 100 μl/basenik 0,5% Tritona rozcieńczonego w PBS przez 15 minut. Umyj komórki, dodając 100 μL/studzienkę PBS i natychmiast go usuń (powtórz ten krok 3 razy).
      3. Następnie inkubować kulturę komórkową ze 100 μl/basenik roztworu blokującego (5% mleka beztłuszczowego + 2% BSA rozcieńczonego w PBS [pH 7,2]) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj komórki, dodając 100 μl/studzienkę PBS i natychmiast je usuń (powtórz ten krok 3 razy).
      4. W celu barwienia amastigotów inkubować z 30 μl/basenik niekomercyjnego przeciwciała monoklonalnego (mAb) białka anty-Ssp-4 2C2 (1:200) rozcieńczonego w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      5. Umyj komórki, dodając 100 μl/studzienkę PBS i natychmiast je usuń (powtórz ten krok 3 razy). Inkubować płytkę z 30 μl/basenik drugorzędowego przeciwciała anty-mysiego (1:500) rozcieńczonego w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Niekomercyjne białko mAb 2C2 anty-Ssp-4 było miłym prezentem od prof. dr Renato A. Mortara z Wydziału Mikrobiologii, Immunologii i Parazytologii Uniwersytetu Federalnego w São Paulo.
      6. Ostrożnie usunąć supernatant i jądra barwienia, dodając 50 μl/studzienkę DAPI (5 mg/ml) rozcieńczonego w PBS pH 7,2 (1:1,000) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w ciemności.
      7. Zastąp roztwór barwiący DAPI 100 μl/studzienkę PBS pH 7,2 i przeanalizuj go za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dnia 14 dnia, hodowla komórek glejowych (Rysunek 1A) uległa mechanicznej dysocjacji. Izolowane populacje komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z markerami CD11b, CD45 i GFAP. Mogliśmy zaobserwować czystość na poziomie 89,5% dla populacji astrocytów i 96,6% dla populacji mikrogleju (Rysunek 1B). Po izolacji komórki zostały posiane na płaskiej płytce z 96 dołkami i po 24 godzinach były gotowe do zakażenia T. cru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie badania funkcji izolowanych komórek glejowych w różnych kontekstach biologicznych rośnie w ciągu ostatnich dwóch dekad. Zrozumienie OUN poza neuronami jest wciąż rozwijającą się dziedziną w biologii komórki, zwłaszcza w przypadku infekcji lub stanów zapalnych 8,9,24. Komórki glejowe mają kluczowe znaczenie nie tylko dla fizycznego wsparcia neuronów (jak to było wcześniej znane), ale także w wielu innych sytuacjach fizj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować profesorowi Dr. Renato A. Mortara z Uniwersytetu Federalnego w São Paulo (UNIFESP) za mAb 2C2 anty-Ssp-4. Prace te były wspierane przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, grant 2017/25942-0 dla K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, grant 402100/2016-6 dla K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ( CAPES, kod finansowy 001). M.P.A. otrzymuje stypendium od CNPq, A.L.O.P. otrzymuje stypendium od CAPES, a I.S.F i L.Z.M.F.B. otrzymują stypendium od FAPESP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70% etanoluDinâ mika Quí mika Współczesnaâ neaKot: 2231Sterylizuj
75 cm2 KolbaCorningNr kat.: 430720UTworzywo sztuczne
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner CellstarNr kat.: 655090Hodowla komórkowa
Chlorek amonu (NH4Cl)Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ neaKot: C10337.01.AHUsuń autofluorescencyjne
przeciwciało anty-GFAPAbcamNr kat.: ab49874przeciw immunofluorescencji
0,22 i mu; mm CACorningCat: 430513Filtr pożywki hodowlanej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Aldrich Kot: A7906FACS Przygotowanie buforu
CD11b (FITC)BD PharmigenKat.: 553310Przeciwciało cytometrii przepływowej
CD45 (PE)InvitrogenKat.: 12-0451-83Wirówka z przeciwciałami cytometrii przepływowej
Eppendorf Nrkat.: 5810R
WirówkaEppendorf5415RWirówka
Klasa II Komora bezpieczeństwa biologicznegoPachaneCat: 200Komora bezpieczeństwa biologicznego do procedur sterylnych
CO2 InkubatorThermoScientificModel: 3110Konserwacja komórek pierwotnych
Rurki stożkowe 15 mlCorningKot: 430766Tworzywo sztuczne
Probówki stożkowe 50 mlCorningKat: 352070Tworzywo sztuczne
Automatyczny licznik komórek CountessInvitrogenNr kat.: C10281Licznik komórek
DAPIInvitrogenKat.: D1306Antidoby immunofluorescencyjne
Aparat do mikroskopu cyfrowegoNikonNr kat.: DS-RI1Rejestruj obrazy pod mikroskopem
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)GibcoKot: 12800-058Pożywka do hodowli komórkowych
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichKot: E9884FACS Przygotowanie buforu
F12 Mieszanka składników odżywczychKot Gibco: 21700-026Pożywka do hodowli komórkowych
FACS Canto IIBD BiosciencesNiedostępnycytometr przepływowy
Surowica bydlęca płodu (FBS)LGC BiotechnologyKot: 10-bio500-1Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Flow Jo (oprogramowanie)Flow JoWersja: Flow Jo_9.9.4Analiza danych
Intensywne światło fluorescencyjneNikonKat: C-HGFIŹródło fluorescencji
GFAP (APC)InvitrogenKat.: 50-9892-82Przeciwciało cytometrii przepływowej
Koza - anty-mysie IgG (FITC)Kirkeegood& Perry Lab (KPL)Kat.: 172-1806Antydoby immunofluorescencyjne
HBSS - Zbilansowany roztwór soli HankaKotKot: 14175079Pożywka do hodowli komórkowych
HEPESSigma AldrichKot: H4034Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Bufor utrwalający ICInvitrogenNr kat.: 00-8222-49Utrwalanie komórek do cytometrii przepływowej
Mikroskop odwróconyNikonModel: Mikroskop ECLIPSE TS100
IsofluraneCrist&aaacute; liaKot: 21.2665Wziewny środek znieczulający
SyntezatormetanoluKot: 01A1085.01.BJUtrwalenie do immunofluorescencji
MikroszpatułkaABC nierdzewnaNiedostępnyMateriał chirurgiczny
Mikroprobówka 1,5 mlAxygenKot: MCT-150-CTworzywo sztuczne
Przeciwciało monoklonalne (mAb) 2C2 anty-Ssp-4NiekomercyjneNiekomercyjneAntydoby immunofluorescencyjne
Pipeta wielokanałowa (p200)CorningCat: 751630124Odczynniki do pipet
Oprogramowanie NIS ElementsNikonVersion 4.0Pozyskiwanie i analizowanie obrazów
Mleko beztłuszczoweNestléKategoria: 9442405Roztwór blokujący do immunofluorescencji
Inkubator z wytrząsarką orbitalnąThermoScientificModel: 481 Kategoria: 11Dysocjacja mikrogleju od astrocytów
Paraformaldehyd (PFA)Sigma AldrichKot: P6148Utrwalenie do immunofluorescencji
PBSNiekomercyjneNiekomercyjneneutralne buforowanie
Penicylina GSigma AldrichKot: P-7794Pożywka do hodowli komórkowych
Suplement Bufor przepuszczalny (10x)InvitrogenKot: 00-8333-56Przepuszczalność komórek do cytometrii przepływowej
szalka Petriego 60 mm x 15 mm (jednorazowa, sterylna)ProlabNr kat.: 0303-8Miernik pH z tworzywa
sztucznego KasviK39-1014BKalibruj roztwór pH
RPMI 1640 ŚredniGibcoNr kat.: 31800-014Pożywka do hodowli komórkowych
NożyczkiABC nierdzewneNr kat.: LO9-W4Materiał chirurgiczny
Pipeta serologiczna 10 mlCorningNr kat.: 4101Tworzywo sztuczne
Pipeta serologiczna 5 mlCorningNr kat.: 4051Tworzywo sztuczne
Pipeta jednokanałowa (p1000)Gilson PipetmanKot: F123602Odczynniki do pipet
Pojedynczy Pipeta kanałowa (p200)Gilson PipetmanKat: F123601Odczynniki do pipet
Wodorowęglan soduSigma AldrichKot: S6297Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Sól siarczanu streptomycynySigmaAldrich Kot: S9137Suplement pożywki do hodowli komórkowych
Triton X-100Sigma AldrichKot: T9284Przepuszczalność do immunofluorescencji
TrypsynaGibcoKot: 27250-018Pęseta enzymów trawiennych
ABC nierdzewnaKat: L28-P4-172Materiał chirurgiczny
Kąpiel wodnaNovatecnicaModel: 09020095Trawić tkankę w temperaturze 37 & stopni; C z trypsyną
Filtr butelkowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mikroglejucytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnadysocjacja mechanicznahodowla kom rkowatraktowanie trypsynprzemywanie w HBSSmedium DMEM F12

Powiązane artykuły