Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Streszczenie

Stres oksydacyjny jest ważnym wydarzeniem zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W tym badaniu pokazujemy, jak określić ilościowo stres oksydacyjny, mierząc całkowite reaktywne formy tlenu (ROS) za pomocą barwienia dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) w liniach komórkowych raka jelita grubego jako przykładu. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki, w tym przygotowanie roztworu DCFH-DA, inkubację komórek z roztworem DCFH-DA oraz pomiar znormalizowanej intensywności. Barwienie DCFH-DA to prosty i opłacalny sposób wykrywania ROS w komórkach. Może być używany do pomiaru wytwarzania ROS po obróbce chemicznej lub modyfikacjach genetycznych. Dlatego jest przydatny do określania komórkowego stresu oksydacyjnego na stres środowiskowy, dostarczając wskazówek do badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

Trzy główne reaktywne formy tlenu (ROS) wytwarzane przez metabolizm komórkowy, które mają znaczenie fizjologiczne, to anion ponadtlenkowy, rodnik hydroksylowy i nadtlenek wodoru¹. W niskich stężeniach uczestniczą w fizjologicznych procesach komórkowych, ale w wysokich stężeniach mają niekorzystny wpływ na szlaki sygnalizacji komórkowej¹. Nasz organizm rozwinął systemy antyoksydacyjne, które skutecznie przeciwdziałają nadmiernemu ROS. Jednak stres oksydacyjny może wystąpić, gdy ROS przytłacza zdolność detoksykacyjną naszego organizmu, co przyczynia się do wielu stanów patologicznych, w tym stanów zapalnych, raka i chorób neurodegeneracyjnych^2,3,4. Celem tej metody jest określenie całkowitej komórkowej ROS w komórkach przylegających za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Uzasadnieniem jest to, że utlenianie DCFH-DA do 2'-7'dichlorofluoresceiny (DCF) jest szeroko stosowane do całkowitego wykrywania ROS, w tym rodników hydroksylowych (•OH) i dwutlenku azotu (•NO₂). Mechanistycznie DCFH-DA jest wychwytywany przez komórki, w których esterazy komórkowe odcinają grupy acetylowe, w wyniku czego powstaje DCFH. Utlenianie DCFH przez ROS przekształca cząsteczkę w DCF, który emituje zieloną fluorescencję o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm. W porównaniu z wykrywaniem fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej i innymi alternatywnymi metodami⁵, zaletą tej metody wykorzystującej mikroskop fluorescencyjny i czytnik płytek jest to, że daje ona wyraźnie widoczne obrazy fluorescencyjne i jest łatwa do wykonania, wydajna i opłacalna. Ta metoda jest szeroko stosowana do wykrywania komórkowych ROS w celu badania różnych warunków^6,7,8. Ten protokół służy do wykrywania całkowitych ROS w przylegających komórkach. Stosowanie tej metody do wykrywania ROS w komórkach zawiesinowych może wymagać pewnych modyfikacji.

Protokół

1. Sadzenie komórek

1. Wysiewać 2 x 10⁵ komórek HCT116 raka jelita grubego na basenie na 24-dołkowej płytce i utrzymywać komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Zastąp pożywkę lub bez niej 100 μM siarczanu żelazawego (FS) lub 10 μM doksorubicyny (DOX) zawierającej pożywkę i inkubuj przez 24 godziny.

2. Przygotowanie roztworu DCFH-DA

1. Rozpuścić 4,85 mg DCFH-DA w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego.
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy wstępnie podgrzanym DMEM w roztworze roboczym 10 μM tuż przed dodaniem go do studzienek.
3. Wiruj roztwór roboczy przez 10 sekund.

3. Barwienie DCFH-DA

1. Usuń pożywkę zawierającą lek i przemyj raz DMEM.
2. Dodać 500 μl roztworu roboczego DCFH-DA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. Usuń roztwór roboczy DCFH-DA. Przemyć raz DMEM i 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
4. Dodaj 500 μl 1x PBS do każdej studzienki.

4. Akwizycja obrazowania i pomiar intensywności

1. Wykonaj reprezentatywne obrazy fluorescencyjne dla każdej studzienki przy użyciu kanału białka zielonej fluorescencji (GFP) na mikroskopie fluorescencyjnym.
2. Po wykonaniu zdjęć usuń PBS i dodaj 200 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) do każdej studzienki.
3. Inkubować na lodzie przez 5 minut, a następnie zebrać lizat komórkowy do probówek o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować przy 21,130 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Przenieść 100 μl supernatantu na czarną płytkę 96-dołkową i zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą czytnika fluorescencyjnego na mikropłytkach o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm.
6. Przenieść 1 μl supernatantu na klarowną 96-dołkową płytkę zawierającą 100 μl 1x roztworu do oznaczania białek w celu zmierzenia stężenia białka za pomocą testu Bradforda⁹.
7. Normalizuj intensywność fluorescencji za pomocą stężeń białek.

Wyniki

Komórki raka jelita grubego HCT16 poddano działaniu 10 µM FS lub 10 µM DOX w celu wywołania stresu oksydacyjnego⁷. Jak pokazano na Rysunku 1, zgodnie z oczekiwaniami, fluorescencja zielona uległa gwałtownemu zwiększeniu pod wpływem zarówno FS, jak i DOX. Aby określić ilościowo względną zmianę intensywności, komórki po wykonaniu obrazowania poddano lizie i znormalizowano względem stężeń białek. Ilościowo określona intensywność fluorescencji była znacząco wyższa po zast...

Dyskusja

Opisany tutaj protokół eksperymentalny jest łatwo odtwarzalny w celu pomiaru całkowitego ROM w komórkach. Kluczowe kroki obejmują świeżość roztworu DCFH-DA i unikanie ekspozycji na światło, minimalizację zakłóceń stanu komórek i intensywne mycie PBS tuż przed wykonaniem zdjęć. W celu przygotowania roztworu roboczego DCFH-DA, roztwór podstawowy należy dodać do wstępnie podgrzanego DMEM tuż przed dodaniem do płytki 24-dołkowej. Powodem jest to, że stare rozwiązania, które generują wysoką fluorescencję tła lub ekspozycję na...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Chlorowodorek doksorubicyny	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Siarczan żelaza, siedmiowodny	VWR, Radnor, PA	97061-542
Automatyczny system obrazowania Invitrogen EVOS FL	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	lub dowolny inny mikroskop fluorescencyjny
Test białka Roztwór Bradforda	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
Czytnik mikropłytek SpectraMax M2	Urządzenia molekularne, Radnor, PA	89429-532	lub dowolny inny czytnik mikropłytek fluorescencyjnych