Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Podsumowanie

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Streszczenie

Zanieczyszczenie enzymów metalami wypłukanymi z kolumn IMAC (immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali) stanowi poważny problem dla enzymologów, ponieważ wiele popularnych kationów dwu- i trójwartościowych stosowanych w żywicach IMAC ma działanie hamujące na enzymy. Jednak zakres wymywania metali i wpływ różnych odczynników eluujących i redukujących są słabo poznane w dużej mierze ze względu na brak prostych i praktycznych protokołów kwantyfikacji metali przejściowych, które wykorzystują sprzęt zwykle dostępny w laboratoriach biochemicznych. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół umożliwiający szybkie ilościowe określenie ilości zanieczyszczeń metalami w próbkach przygotowanych przy użyciu IMAC jako etapu oczyszczania. W metodzie wykorzystuje się błękit hydroksynaftolowy (HNB) jako wskaźnik kolorymetryczny zawartości kationów metali w roztworze próbki oraz spektroskopię UV-Vis jako sposób do ilościowego określenia ilości obecnego metalu w zakresie nanomolowym na podstawie zmiany widma HNB przy 647 nm. Podczas gdy zawartość metalu w roztworze była historycznie określana za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej lub technik plazmy sprzężonej indukcyjnie, metody te wymagają specjalistycznego sprzętu i szkolenia wykraczającego poza zakres typowego laboratorium biochemicznego. Proponowana tutaj metoda zapewnia biochemikom prosty i szybki sposób określania zawartości metalu w próbkach przy użyciu istniejącego sprzętu i wiedzy bez poświęcania dokładności.

Wprowadzenie

Od momentu powstania przez Poratha i współpracowników¹, chromatografia powinowactwa do metali immobilizowanych (IMAC) stała się metodą szybkiego rozdzielania białek na podstawie ich zdolności do wiązania się z jonami metali przejściowych, takich jak Zn²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ i Co²⁺. Najczęściej odbywa się to za pomocą zmodyfikowanych znaczników polihistydynowych i jest obecnie jedną z najczęstszych technik oczyszczania chromatograficznego do izolacji białek rekombinowanych². IMAC znalazł również zastosowania poza oczyszczaniem białek rekombinowanych jako sposób izolowania chinolonów, tetracyklin, aminoglikozydów, makrolidów i β-laktamów do analizy próbek żywności³ oraz jako krok w identyfikacji markerów białkowych krwi w raku wątroby i trzustki^4,5. Nic dziwnego, że IMAC stał się również metodą z wyboru do izolacji wielu natywnych enzymów bioenergetycznych^6,7,8,9,10. Jednak pomyślne wdrożenie tych metod oczyszczania do badań nad enzymatycznie aktywnymi białkami bioenergetycznymi jest uzależnione od obecności znikomych poziomów kationów metali wypłukiwanych z matrycy kolumny do eluatu. Kationy metali dwuwartościowych powszechnie stosowane w IMAC mają znane patologiczne znaczenie biologiczne, nawet w niskich stężeniach^11,12. Fizjologiczne działanie tych metali jest najbardziej widoczne w systemach bioenergetycznych, gdzie mogą okazać się śmiertelne jako inhibitory oddychania komórkowego lub fotosyntezy^13,14,15. Podobne problemy są nieuniknione w przypadku większości klas białek, w których resztkowe metale zanieczyszczające mogą zakłócać funkcje biologiczne białka lub charakterystykę za pomocą technik biochemicznych i biofizycznych.

Podczas gdy poziomy zanieczyszczenia metalami w warunkach utleniania i stosowania imidazolu jako eluantu są zazwyczaj niskie¹⁶, izolacje białek wykonywane w obecności środków redukujących cysteinę (DTT, β-merkaptoetanol, itp.) lub silniejszych chelatorów, takich jak histydyna^17,18 lub kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) powodują znacznie wyższe poziomy zanieczyszczenia metalami^19,20. Podobnie, ponieważ jony metali w żywicach IMAC są często koordynowane przez grupy karboksylowe, elucja białek przeprowadzana w warunkach kwaśnych może również mieć znacznie wyższy poziom zanieczyszczenia metalami. Zawartość metalu w roztworach można ocenić za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej (AAS) i spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) do granicy wykrywalności w zakresie ppb-ppt^21,22,23,24. Niestety, AAS i ICP-MS nie są realistycznymi metodami wykrywania w tradycyjnym laboratorium biochemicznym, ponieważ metody te wymagałyby dostępu do specjalistycznego sprzętu i szkolenia.

Poprzednia praca Brittain^25,26 badała użycie błękitu hydroksynaftolowego (HNB) jako sposobu identyfikacji obecności metali przejściowych w roztworze. Było jednak kilka wewnętrznych sprzeczności w data²⁰ i te prace nie oferowały odpowiedniego protokołu. Badania przeprowadzone przez Temel et al.²⁷ oraz Ferreira et al.²⁸ rozszerzyły prace Brittaina z HNB jako potencjalnym wskaźnikiem metalu. Jednak Temel opracował protokół, który wykorzystuje AAS do analizy próbek, używając HNB tylko jako czynnika chelatującego. W badaniu Ferreiry wykorzystano zmianę widm absorbancji HNB przy 563 nm, regionie widm HNB wolnego barwnika, który w dużym stopniu pokrywa się z widmami kompleksów HNB-metal przy pH 5,7, co sprawia, że czułość testu jest dość niska, a także skutkuje stosunkowo słabym powinowactwem do wiązania metali²⁰. Aby rozwiązać problemy w naszym własnym laboratorium z wymywaniem Ni²⁺ z IMAC, rozszerzyliśmy pracę wykonaną przez Brittain^25,26 i Ferreria²⁸, aby opracować łatwy test zdolny do wykrywania poziomów nanomolowych kilku metali przejściowych. Wykazaliśmy, że HNB wiąże nikiel i inne typowe dla IMAC metale o powinowactwie wiązania sub-nanomolowego i tworzy kompleks 1:1 w szerokim zakresie wartości pH²⁰. Przedstawiony tutaj test opiera się na tych wynikach i wykorzystuje zmiany absorbancji w widmie HNB przy 647 nm do ilościowego oznaczania metalu. Test można przeprowadzić w fizjologicznym zakresie pH przy użyciu typowych i oprzyrządowania znajdującego się w typowym laboratorium biochemicznym, wykorzystując kolorymetryczne wykrywanie i kwantyfikację kompleksów metal-barwnik oraz związaną z tym zmianę absorbancji wolnego barwnika, gdy wiąże się on z metalem.

Protokół

1. Przygotowanie komponentów testu

1. Wyznaczyć frakcje chromatograficzne do analizy, wykorzystując absorbancję optyczną przy 280 nm lub alternatywne metody oznaczania ilości białka w celu zidentyfikowania frakcji wzbogaconych w białko.
   UWAGA: W niniejszej pracy wykorzystano spektrofotometr UV-Vis z detektorem macierzy diodowej. W celu zwiększenia przepustowości można zastosować czytnik płytek zdolny do pomiaru absorbancji UV-Vis.
2. Przygotowanie niezbędnych komponentów do analizy
   1. Przygotować lub pozyskać bufor 10-100 mM („bufor do próbek”) o pH w zakresie od 7 do 12.
      UWAGA: Do analizy odpowiednie są powszechnie stosowane bufory biochemiczne, takie jak Tris, HEPES, MOPS oraz fosforanowy o pH neutralnym lub zasadowym. Można stosować tricynę i histydynę, jednak wymagają one krzywych kalibracyjnych, ponieważ obie substancje w znacznym stopniu chelatują jony metali. Przykład kalibracji dla histydyny przedstawiono w źródle²⁰.
   2. Przygotować 12% w/v (20-krotnie stężony) roztwór dyspersji błękitu hydroksynaftolowego (HNB) w buforze do próbek, używając 120 mg odczynnika HNB na każdy mililitr przygotowanego roztworu stokowego.
      OSTROŻNIE: Kontakt HNB z oczami może spowodować poważne uszkodzenia i podrażnienia. Podczas pracy z HNB należy stosować ochronę oczu, a po zakończeniu czynności dokładnie umyć ręce.
      UWAGA: HNB jest sprzedawany przez głównych dostawców odczynników naukowych jako dyspersja na KCl. W związku z tym rzeczywiste stężenie w roztworze będzie różnić się w zależności od producenta, partii oraz miejsca pobrania dyspersji HNB z butelki. Idealnie po 20-krotnym rozcieńczeniu roztworu stokowego należy uzyskać absorbancję w zakresie 0,5-0,8 przy 647 nm.

2. Przygotowanie i pomiar próbek

1. Przygotowanie spektrofotometru do gromadzenia danych
   1. Włączyć i rozgrzać spektrofotometr UV-Vis. Ustawić spektrofotometr na pomiar danych przy 647 nm.
      UWAGA: Jeśli spektrofotometr na to pozwala, dodatkowo gromadzić dane przy 850 nm lub innej długości fali, przy której nie występują znaczące zmiany związane ze spektrami barwnika i kompleksu barwnik-metal, w celu przeprowadzenia korekcji linii bazowej.
   2. Wyzerować spektrofotometr (pomiar blank), używając Buforu Próbkowego (Sample Buffer).
      UWAGA: Można stosować kuwety kwarcowe lub jednorazowe plastikowe. W analizie ilościowej preferowane są kuwety kwarcowe, ponieważ zapewniają one wyższą dokładność i precyzję niż kuwety plastikowe. Jednak kuwety plastikowe blokują światło UV, które może być obecne w wiązkach pomiarowych niektórych spektrofotometrów z matrycą dioidową. Narażenie HNB na intensywne światło UV powoduje wyraźną degradację barwnika i niepożądany powolny spadek absorbancji, który może zostać pomylony z powolnym wiązaniem metalu (np. patrz Rysunek 1 w Informacjach Uzupełniających do Referencji 20).
2. Przygotowanie i pomiar absorbancji kontroli
   1. Przygotować roztwór kontrolny zawierający 50 μL stoku HNB na mililitr całkowitej objętości analizy. Aby zapewnić dobre wymieszanie wszystkich próbek, najpierw pipetować małe objętości, następnie dodać Bufor Próbkowy, a potem wymieszać poprzez pipetowanie. Rozcieńczony roztwór HNB należy przygotować na świeżo, jednak stoki HNB można przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem przez wiele tygodni bez znaczącej degradacji.
   2. Inkubować kontrolę przez minimum 3 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może być konieczny dla próbek o pH zasadowym lub w obecności fosforanów ze względu na tworzenie słabo rozpuszczalnych kompleksów metali, co skutkuje wolniejszym osiągnięciem stanu równowagi.
   3. Zmierzyć i zapisać absorbancję przy 647 nm dla próbki kontrolnej.
3. Przygotowanie i pomiar absorbancji próbek
   1. Przygotować próbki do analizy, mieszając 50 μL stoku HNB z 950 µL odpowiednio rozcieńczonych frakcji białkowych w Buforze Próbkowym.
      UWAGA: Ponieważ poziomy zanieczyszczeń metalami raportowane w literaturze różnią się ponad tysiąckrotnie w zależności od warunków elucji^16,20, może być konieczne przetestowanie kilku rozcieńczeń analizowanych frakcji białkowych w Buforze Próbkowym (patrz krok 1.2.1 powyżej), aby uzyskać zmiany absorbancji mieszczące się w zakresie dynamicznym analizy.
      OSTRZEŻENIE: Nikiel i inne metale stosowane w IMAC są znanymi substancjami drażniącymi skórę, podejrzewanymi o działanie rakotwórcze oraz mogą uszkadzać nerki i krew po długotrwałej ekspozycji. Podczas pracy z próbkami białek przygotowanymi metodą IMAC należy stosować rękawice i ochronę oczu.
   2. Inkubować próbkę przez minimum 3 min w temperaturze pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 647 nm.
      UWAGA: Etapem ograniczającym czas trwania analizy jest inkubacja. Dane do niniejszej pracy zostały zebrane przy użyciu jednej kuwety kwarcowej, którą starannie myto między każdą próbką. Nawet uwzględniając czas mycia i przygotowania stoku HNB, gromadzenie danych dla 14 próbek i kontroli zajęło około półtorej godziny, w związku z czym protokół można łatwo zrealizować bez konieczności przerywania pracy.
   3. Powtórzyć kroki 2.3.1 i 2.3.2 dla każdej frakcji przeznaczonej do pomiaru.
      UWAGA: Jeśli do wielu próbek używane będą różne kuwety, próbki należy przygotować w sposób zapewniający porównywalny czas inkubacji i ekspozycję na światło otoczenia.

3. Oznaczanie ilości metali

1. Wyznaczanie stężenia metalu w każdej próbce
   1. Oblicz różnicę absorbancji każdej próbki przy 647 nm względem kontroli HNB.
   2. Wyznacz stężenie metalu (w µM), korzystając z poniższego wzoru:
      
      
      
      gdzie DF to czynnik rozcieńczenia frakcji analizowanej, ΔAbs₆₄₇ to zmiana absorbancji przy 647 nm, 3,65x10^-2 reprezentuje współczynnik ekstynkcji HNB (ε=36,5 mM^-1·cm^-1 patrz Odnośnik²⁰ w celu uzyskania szczegółowych informacji), a l to droga optyczna kuwety w cm.

Wyniki

Widmo wolnego HNB przy obojętnym pH (linia czarna) oraz reprezentatywne widma frakcji analizowanych pod kątem Ni²⁺ z izolacji MSP1E3D1²⁹ przedstawiono na Ryc. 2. Prawidłowo przeprowadzona seria analiz powinna wykazać spadek absorbancji przy 647 nm w porównaniu z kontrolą HNB, co odpowiada tworzeniu się kompleksów HNB w obecności metalu przejściowego. Błędny wynik analizy objawiałby się wzrostem absorbancji przy 647 nm. Z kolei spadek absorbancji przy 647 nm...

Dyskusja

Detekcja kolorymetryczna metali za pomocą HNB zapewnia prosty sposób ilościowego określenia stopnia zanieczyszczenia białek jonami metali przejściowych z żywic IMAC. Jak ustaliliśmy w odnośniku 20, Ni²⁺ wiąże się z HNB za pomocą stechiometrii 1:1, a stała dysocjacji dla kompleksu Ni-HNB zmienia się wraz z pH. Jednak kompleks K_d znajduje się w zakresie sub-nM dla wszystkich zalecanych (7-12) wartości pH. W praktyce oznacza to, że wszystkie Ni²⁺ w dowolnych badanych frakcjach będą wiązać si...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2xYT bulion	Fisher Scientific	BP9743-500	pożywka do wzrostu E.coli
HEPES, wolny kwas	BioBasic	HB0264	alternatywny bufor
Żywica HisPur Ni-NTA	Thermo Scientific	88222
Hydroksynaftol niebieska sól disoidum	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazol	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazol	BioBasic	IB0277
MOPS, wolny kwas	BioBasic	MB0360	alternatywny bufor
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-500
Fosforan sodu	Fisher Scientific	S369-500	alternatywny bufor
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500