Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Podsumowanie

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Streszczenie

Zanieczyszczenie enzymów metalami wypłukanymi z kolumn IMAC (immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali) stanowi poważny problem dla enzymologów, ponieważ wiele popularnych kationów dwu- i trójwartościowych stosowanych w żywicach IMAC ma działanie hamujące na enzymy. Jednak zakres wymywania metali i wpływ różnych odczynników eluujących i redukujących są słabo poznane w dużej mierze ze względu na brak prostych i praktycznych protokołów kwantyfikacji metali przejściowych, które wykorzystują sprzęt zwykle dostępny w laboratoriach biochemicznych. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół umożliwiający szybkie ilościowe określenie ilości zanieczyszczeń metalami w próbkach przygotowanych przy użyciu IMAC jako etapu oczyszczania. W metodzie wykorzystuje się błękit hydroksynaftolowy (HNB) jako wskaźnik kolorymetryczny zawartości kationów metali w roztworze próbki oraz spektroskopię UV-Vis jako sposób do ilościowego określenia ilości obecnego metalu w zakresie nanomolowym na podstawie zmiany widma HNB przy 647 nm. Podczas gdy zawartość metalu w roztworze była historycznie określana za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej lub technik plazmy sprzężonej indukcyjnie, metody te wymagają specjalistycznego sprzętu i szkolenia wykraczającego poza zakres typowego laboratorium biochemicznego. Proponowana tutaj metoda zapewnia biochemikom prosty i szybki sposób określania zawartości metalu w próbkach przy użyciu istniejącego sprzętu i wiedzy bez poświęcania dokładności.

Wprowadzenie

Od momentu powstania przez Poratha i współpracowników¹, chromatografia powinowactwa do metali immobilizowanych (IMAC) stała się metodą szybkiego rozdzielania białek na podstawie ich zdolności do wiązania się z jonami metali przejściowych, takich jak Zn²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ i Co²⁺. Najczęściej odbywa się to za pomocą zmodyfikowanych znaczników polihistydynowych i jest obecnie jedną z najczęstszych technik oczyszczania chromatograficznego do izolacji białek rekombinowanych². IMAC znalazł również zastosowania poza oczyszczaniem białek rekombinowanych jako sposób izolowania chinolonów, te....

Protokół

1. Przygotowanie komponentów testu

1. Wyznaczyć frakcje chromatograficzne do analizy, wykorzystując absorbancję optyczną przy 280 nm lub alternatywne metody oznaczania ilości białka w celu zidentyfikowania frakcji wzbogaconych w białko.
   UWAGA: W niniejszej pracy wykorzystano spektrofotometr UV-Vis z detektorem macierzy diodowej. W celu zwiększenia przepustowości można zastosować czytnik płytek zdolny do pomiaru absorbancji UV-Vis.
2. Przygotowanie niezbędnych komponentów do analizy
   1. Przygotować lub pozyskać bufor 10-100 mM („bufor do próbek”) o pH w zakresie od 7 do 12.
      UWAGA: Do analizy odpowiednie są powszechnie stosowane bufory....

Wyniki

Widmo wolnego HNB przy obojętnym pH (linia czarna) oraz reprezentatywne widma frakcji analizowanych pod kątem Ni²⁺ z izolacji MSP1E3D1²⁹ przedstawiono na Ryc. 2. Prawidłowo przeprowadzona seria analiz powinna wykazać spadek absorbancji przy 647 nm w porównaniu z kontrolą HNB, co odpowiada tworzeniu się kompleksów HNB w obecności metalu przejściowego. Błędny wynik analizy objawiałby się wzrostem absorbancji przy 647 nm. Z kolei spadek absorbancji przy 647 nm.......

Dyskusja

Detekcja kolorymetryczna metali za pomocą HNB zapewnia prosty sposób ilościowego określenia stopnia zanieczyszczenia białek jonami metali przejściowych z żywic IMAC. Jak ustaliliśmy w odnośniku 20, Ni²⁺ wiąże się z HNB za pomocą stechiometrii 1:1, a stała dysocjacji dla kompleksu Ni-HNB zmienia się wraz z pH. Jednak kompleks K_d znajduje się w zakresie sub-nM dla wszystkich zalecanych (7-12) wartości pH. W praktyce oznacza to, że wszystkie Ni²⁺ w dowolnych badanych frakcjach będą wiązać si.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2xYT bulion	Fisher Scientific	BP9743-500	pożywka do wzrostu E.coli
HEPES, wolny kwas	BioBasic	HB0264	alternatywny bufor
Żywica HisPur Ni-NTA	Thermo Scientific	88222
Hydroksynaftol niebieska sól disoidum	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazol	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazol	BioBasic	IB0277
MOPS, wolny kwas	BioBasic	MB0360	alternatywny bufor
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-500
Fosforan sodu	Fisher Scientific	S369-500	alternatywny bufor
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500