Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Podsumowanie

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Streszczenie

Ludzka bariera krew-mózg (BBB) charakteryzuje się bardzo niską przepuszczalnością dla biomolekuł w celu ochrony i regulacji metabolizmu mózgu. Bariera krew-mózg składa się głównie z komórek śródbłonka osadzonych w błonach podstawnych bogatych w kolagen IV i fibronektynę. Kilka patologii wynika z dysfunkcji bariery krew-mózg, a następnie przenikania drobnoustrojów, powodując choroby, takie jak zapalenie opon mózgowych. W celu zbadania wpływu wielu parametrów, w tym różnych leków i środków znieczulających, na przepuszczalność bariery krew-mózg, stworzyliśmy nowatorski model hodowli komórek ludzkich naśladujący barierę krew-mózg z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu. Komórki śródbłonka są hodowane na jednostkach filtracyjnych pokrytych kolagenem i fibronektyną aż do zbiegu, a następnie mogą być leczone różnymi interesującymi związkami. Aby zademonstrować przenikanie mikrobiologiczne, górna komora z wierzchołkową powierzchnią komórek śródbłonka jest zaszczepiana bakteriami. Po okresie inkubacji próbki z dolnej komory posiewa się na płytkach agarowych i liczy otrzymane kolonie, przy czym liczba kolonii koreluje z przepuszczalnością BBB. Endogenne czynniki komórkowe mogą być analizowane w tym układzie eksperymentalnym w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów komórkowych komórek śródbłonka przyczyniających się do BBB. Ponadto platforma ta pozwala na wykonanie badania przesiewowego pod kątem związków, które mogą wpływać na przepuszczalność komórek śródbłonka. Wreszcie, przenikanie bakterii może być badane i łączone z różnymi patologiami, takimi jak zapalenie opon mózgowych. Być może uda się rozszerzyć model i przeanalizować szlaki bakterii przez barierę krew-mózg. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół opisanej metody w celu zbadania przepuszczalności bariery krew-mózg.

Wprowadzenie

Ludzki BBB to unikalna granica tkanki mózgowej, oddzielająca mózg od krwi. Ściśle reguluje przechodzenie większych i hydrofilowych cząsteczek, blokuje dyfuzję parakomórkową i utrzymuje homeostazę mózgu. Chroni również mózg przed wahaniami osocza, toksynami, drobnoustrojami i kieruje komórkami zapalnymi w ramach odporności ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Od czasu jego odkrycia sto lat temu¹, przeprowadzono wiele badań mających na celu zrozumienie struktury i funkcji BBB. Złożone interakcje komórek, białek i sygnałów z mózgu i krwi wymagają dalszych badań i modeli.

Ludzki BBB składa się z trzech typów komórek: komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC), perycytów i astrocytów^2,3. BMEC różnią się od większości komórek śródbłonka w organizmie tym, że posiadają dużą liczbę połączeń ścisłych i połączeń adherens⁴, niską aktywność pinocytotyczną^2,5 oraz ciągłą błonę podstawną^6,7 w celu zablokowania dyfuzji przykomórkowej. Małe cząsteczki lipofilowe mogą dyfundować i przechodzić przez BBB zgodnie z gradientem stężeń; Większe i hydrofilowe cząsteczki dostają się lub opuszczają mózg tylko przez spolaryzowane, wyrażone selektywne systemy transportowe⁸. Regulacja ta skutkuje wysoką transśródbłonkową rezystancją elektryczną (TEER) wynoszącą 1,500-2,000 Ω·^cm2, która jest odwrotnie skorelowana z przepuszczalnością^9,10. Chociaż BMEC tworzą szczelną barierę, mogą reagować na sygnały lokalne i peryferyjne^11,12. Istnieje ścisła interakcja między BMEC a astrocytami¹³; Stopy końcowe astrocytów tworzą warstwę wokół naczyń i indukują powstawanie ścisłych połączeń13^,14. Biorą udział w dojrzewaniu BBB z różnymi czynnikami, w tym przekształcającym czynnikiem wzrostu-β (TGF-β)^15,16. Ponadto perycyty odgrywają kluczową rolę w regulacji angiogenezy¹⁷ i zapobieganiu apoptozie śródbłonka w różnicowaniu komórkowym¹⁸ (Figura 1). Są one osadzone w membranie podstawnej i zapewniają stabilność strukturalną ściany naczynia ¹⁹.

Rycina 1: Schematyczna struktura bariery krew-mózg. Unikalna struktura ludzkiej bariery krew-mózg składa się z trzech różnych typów komórek. Światło mikronaczynia jest otoczone komórkami śródbłonka, które są wzbogacone w ścisłe połączenia i nie są fenestrowane. Są osadzone w błonie podstawnej, podobnie jak perycyty. Komórki te są ważne dla stabilności strukturalnej ściany naczynia i odgrywają rolę w rozwoju bariery krew-mózg obok astrocytów. Ich końcowe stopy tworzą ścisłą warstwę wokół naczynia i wspierają budowanie szczelnych połączeń. Wszystkie składniki bariery krew-mózg są ważne dla funkcjonalności fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wiele różnych patologii jest związanych z zapadnięciem się BBB (np. encefalopatia septyczna). Pacjenci dotknięci chorobą mają zwiększony poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym²⁰, a miąższ mózgu u dotkniętych gryzoni wykazuje zwiększony wychwyt wyraźnego koloidalnego tlenku żelaza i aminokwasów^21,22. Wyniki te wskazują na zwiększoną przepuszczalność bariery krew-mózg, która występuje wraz ze zwiększoną pinocytozą w BMECs²¹ i endothelial activation²³. Inną związaną patologią związaną ze zmienioną barierą krew-mózg jest zapalenie opon mózgowych, nagły wypadek medyczny i złożony stan zapalny, któremu towarzyszy obrzęk mózgu, który może prowadzić do śmierci komórek neuronalnych. Przypuszcza się, że głównym miejscem wejścia krążących bakterii są mikronaczynia²⁴; jednak bariera krew-mózg zapobiega przedostawaniu się bakterii. Przepuszczalność bariery krew-mózg nie zawsze jest związana ze wzrostem eksperymentalnego hematogennego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych²⁵, a mechanizmy mogą być wieloczynnikowe. Zbieżność sepsy z majaczeniem pooperacyjnym (POD)²⁶ i związek z infekcjami przedoperacyjnymi^27,28 wskazuje na potrzebę modelu BBB, który umożliwia bezpośrednie narażenie na bakterie, aby lepiej zrozumieć patogenezę bakterii.

Istnieje wiele luk w zrozumieniu i ilościowym określeniu przenikania mikroorganizmów przez barierę krew-mózg. W związku z tym opracowaliśmy model, który pozwala na wygodne testowanie różnych czynników i warunków z bezpośrednią korelacją między przenikaniem bakterii a wpływami na przepuszczalność bariery krew-mózg. Wcześniejsze prace koncentrowały się na przepuszczalności parakomórkowej i obejmowały pomiar TEER oraz strumień znacznikowy. Ponadto transport makrocząsteczek analizowano za pomocą sprzężonych cząsteczek lub przeciwciał, przy czym opracowano różne modele wykorzystujące tylko komórki śródbłonka lub kombinacje z astrocytami i perycytami. Ze względu na trudności w regularnym pozyskiwaniu tkanek ludzkich stosuje się wiele modeli zwierzęcych. Komórki śródbłonka mózgu pochodzenia bydlęcego i wieprzowego tworzą zwarte monowarstwy o wysokim współczynniku TEER, które tworzą dobrze ukształtowaną polaryzację wierzchołkowo-podstawną i nadają się do badań transportu małych cząsteczek przez barierę krew-mózg. Białka różnią się sekwencją od swoich ludzkich homologów^29,30, co utrudnia badanie przeciwciał terapeutycznych. Z tego powodu preferowane mogą być modele hodowli mysich lub ludzkich. Mysz lub szczury jako źródła próbek mają tę zaletę, że są pozyskiwane z dobrze scharakteryzowanych gatunków, ale dają niewiele komórek do celów badawczych. Można to obejść za pomocą nieśmiertelnych linii komórkowych śródbłonka mózgu myszy (END) bEND.3, bEND.5 lub cEND^31,32,33.

Pierwotne hodowane komórki z tkanek ludzkich są trudne do zdobycia i regularnego przetwarzania. Dlatego większość ludzkich modeli komórkowych wykorzystywanych w badaniach nad ludzką barierą krew-mózg to unieśmiertelnione linie komórkowe śródbłonka. Opublikowana linia komórkowa to ludzka linia komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu hCMEC/D3, która dobrze nadaje się do badania wchłaniania leków i jest łatwa w obsłudze. Komórki budują monowarstwę i wyrażają charakterystyczne białka ścisłego połączenia klasy BBB³⁴, podczas gdy poziom ekspresji klaudyny-5 jest niższy niż w nienaruszonych mikronaczyniach ³⁵ i wiele specyficznych transporterów zostało wykrytych na poziomie transkryptu³⁶, a także w badaniach proteomicznych³⁴. Stosunkowo niski TEER w zakresie 30-50 Ω·^cm2 nadal stanowi wyzwanie³⁷. Innym źródłem komórek śródbłonka mózgu są ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC)³⁸ oraz ludzkie komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej krążących linii progenitorowych śródbłonka i krwiotwórczych^39,40. Oba protokoły różnicowania skutkują ścisłymi monowarstwami komórek i wysokimi wartościami TEER (np. 1 450 Ω·^cm2 w kokulturach)³⁸. Te modele komórek macierzystych wymagają szczególnej troski o hodowlę, a jednocześnie dają możliwość zbadania wpływu hormonów regulujących⁴¹ lub chorób o podłożu genetycznym⁴² na rozwój BBB.

W tym badaniu stworzyliśmy nieśmiertelnie transfekowaną linię komórek mikronaczyniowego śródbłonka ludzkiego mózgu, THBMEC⁴³, aby naśladować barierę krew-mózg i badać przenikanie bakterii. Komórki są wysiewane na filtrze i hodowane do 100% zbiegu w tym modelu hodowli komórkowej. Bakterie są zaszczepiane w górnej części komory hodowli komórkowej. Używamy Escherichia coli (E. coli) w naszym badaniu próbnym ze względu na wysoką częstość występowania zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych E. coli⁴⁴. Wykazano, że najniższa przepuszczalność monowarstwy komórkowej występuje między 13 a 15 dniem po wysiewie⁴⁵. Dlatego po tym czasie przeprowadza się obróbkę monowarstwy THBMEC, a następnie bakterie są inokulowane w pożywce na wierzchołkowej powierzchni monowarstwy. Po czasie inkubacji bakterie, które były w stanie przekroczyć barierę, są oznaczane ilościowo za pomocą pożywki galwacyjnej z bakteriami na płytkach agarowych i liczenia kolonii. Zwiększona liczba kolonii koreluje z wyższym przenikaniem bakterii przez barierę krew-mózg. TEER wynosi około 70 Ω·^{cm2 46}. Nie jest jednak konieczne mierzenie TEER w opisanej metodzie. Chociaż jest to dobrze znana wartość przepuszczalności bariery krew-mózg, wydaje się, że nie ma ona wpływu na przenikanie bakterii przez barierę krew-mózg. Nieleczone komórki służą jako kontrola szczelności w naszym modelu. W poprzednich pracach wykazano, że komórki są w stanie reagować na cytokiny prozapalne i wyrażać typowe białka połączeń ścisłych⁴⁷. Pozwala to na badania przesiewowe związków i walidację większego zestawu substratów transportowych i receptorów.

Protokół

1. Przygotowanie buforu i odczynników

1. Przygotować 10 x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (10 x PBS) przez dodanie 80 g chlorku sodu (NaCl), 2 g chlorku potasu (KCl), 14,4 g diwodnego fosforanu disodu (Na₂HPO₄ · 2H₂O) i 2 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) w szklanej kolbie o pojemności 1 l w 1 l podwójnie destylowanego_H2O. Autoklawować 10 x PBS roztworu i rozcieńczyć 100 ml tego roztworu w 900 ml podwójnie destylowana woda, aby uzyskać 1x PBS.
   1. Użyj autoklawu do sterylizacji roztworów. Włożyć szklaną kolbę do kosza, zamknąć pokrywkę i sterylizować przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 98,9 kPa.
      UWAGA: Ten protokół jest zawsze używany do autoklawowania roztworów w dalszych krokach.
2. Przygotuj 10 μg/ml kolagenu dożylnie i 10 μg/ml roztworu fibronektyny, rozcieńczając 0,5 mg/ml roztworu fibronektyny i 0,3 mg/ml roztworu kolagenu dożylnego z 1x PBS do 100 mg/μL podwielokrotności w mikroprobówkach 1,5 ml. Następnie zmieszać 100 μl obu podwielokrotności z 1 800 μl 1x PBS w mikroprobówkach o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować pożywkę DMEM/F-12, dodając do pożywki 4% płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM L-glutaminy oraz 100 mg/l penicyliny/streptomycyny i przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Przygotować 1x roztwór trypsyny-EDTA, rozcieńczając 5 ml 10x stężonego roztworu trypsyny-EDTA z 45 ml 1x PBS w probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Przygotować 500 ml pożywki LB, ważąc 10 g bazy bulionowej LB w szklanej kolbie o pojemności 500 ml. Dodaj 500 ml wysterylizowanej wody i przelej ją w autoklawie.
6. Przygotować agar LB, ważąc 10 g bazy bulionowej LB i 7,5 g agaru-agaru w szklanej kolbie o pojemności 500 ml. Przed sterylizacją w autoklawie dodać 500 ml wysterylizowanej wody i nie zamykać pokrywy kolby. Autoklaw i pozostaw roztwór do ostygnięcia, aż będzie ciepły w dotyku.
7. Przygotować pożywkę wolną od antybiotyków, dodając 4% płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM L-glutaminy, ale bez penicyliny/streptomycyny do pożywki DMEM/F-12 i przechowywać w temperaturze 4 °C, jak w kroku 1.3.

2. Wzrost komórek naśladujących barierę krew-mózg

1. Aby zmontować płytkę 12-dołkową, umieść wkładki do hodowli komórkowych w dołkach (Rysunek 2A).
   1. Rozpakuj płytkę i każdą wkładkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego i tam wykonaj dalsze kroki. Użyj wysterylizowanych kleszczy, aby chwycić wkładkę za jej szeroką podstawę, aby ją przesunąć.
2. Pokryj porowatą błonę każdej wkładki 90 μl 10 μg/ml kolagenu IV i 10 μg/ml mieszaniny fibronektyny. Inkubować 12-dołkową płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek 2B).
3. Umyć wkładki dwukrotnie, pipetując 1 ml 1x PBS do każdej wkładki i odessać roztwór za pomocą pompy próżniowej do hodowli komórkowych.
4. Wyrównać membrany, pipetując 0,5 ml wstępnie podgrzanego podłoża DMEM/F-12 w górnej komorze i 1,5 ml w dolnej komorze. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% atmosferą CO₂ (Rysunek 2C).
5. Wysiewaj 2 x 10⁵ ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego do każdej górnej komory i inkubuj 12-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych (Rysunek 2D).
   1. Odessać pożywkę z kolby do hodowli komórkowych za pomocą pompy próżniowej do hodowli komórkowych i przemyć monowarstwę, pipetując 10 ml 1x PBS, a następnie odsysając roztwór za pomocą pompy próżniowej.
   2. Przykryj komórki całkowicie 1x stężoną trypsyną-EDTA, pipetując 5 ml roztworu do kolby do hodowli komórkowej. Inkubować kolbę przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Jeśli komórki nie są zdysocjowane, mocno postukaj kolbą o dłoń, aby usunąć komórki.
   3. Pobrać 5 ml pipetą jako podwielokrotność z zawiesiny komórek w probówce o pojemności 15 ml i dodać 5 ml pożywki zawierającej FCS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
   4. Odwirować zawiesinę przez 3 minuty przy 210 x g, usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki za pomocą pipety.
   5. Użyj licznika komórek, mieszając 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% niebieskiego barwnika trypanowego w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl mieszaniny do szkiełka komory liczącej, włożyć do licznika kuwet i rozpocząć liczenie.
      1. Skoncentruj licznik na komórkach tak, aby ich krawędź była ciemnoniebieska, a środkowa biała. Następnie uruchom odpowiedni program do zliczania komórek.
   6. Aby obliczyć objętość każdej wkładki, podziel otrzymane 2 x 10⁵ komórek na wkładkę przez obliczone stężenie zawiesiny komórek.

3. Kultywacja modelu bariery krew-mózg

1. Inkubować 12-dołkową płytkę przez 14 dni w temperaturze 37 °C.
2. Zmieniaj 0,5 ml pożywki na górną komorę i 1,5 ml pożywki na dolną co 2-3 dni. Ogrzać pożywkę przed włożeniem jej do kolby komórkowej. Zasysać za pomocą pompy próżniowej (Rysunek 2E).
   UWAGA: Pracuj ostrożnie, aby nie dotykać membrany.
3. Sprawdź stan komórek, obrazując je pod mikroskopem i określ zbieg. Upewnij się, że zbieg wynosi 100% po 14 dniach.

4. Przygotowanie bakterii

1. Dzień przed pomiarem umieść kolonię szczepu E. coli GM2163 w pożywce LB. Inkubować probówkę hodowlaną przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z prędkością 180 obr./min w wytrząsarce do inkubacji (Rysunek 2F).
   1. Hodować szczep E. coli na płytce agarowej LB w temperaturze 4 °C. Weź jedną kolonię ze wysterylizowanym kilofem i umieść go w przygotowanej probówce hodowlanej z 3 ml pożywki LB.
   2. Przygotuj płytkę agarową LB dla każdej wkładki ciepłym roztworem agaru LB i napełnij szalki Petriego do połowy ich całkowitej objętości. Pozwól im się zestalić i przechowywać je w temperaturze 4 °C.

5. Leczenie komórek

1. W 14 dniu po wysiewie potraktuj komórki związkami lub zmierz przezśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), jeśli jest to planowane (Rysunek 2G).
   UWAGA: Zawsze miej kilka nieleczonych komórek jako kontrolę.
   1. Aby potraktować komórki interesującym ich związkiem, rozcieńczyć go do końcowego stężenia w pożywce DMEM/F-12. Dodaj 0,5 ml tej mieszaniny do górnej komory i 1,5 ml do dolnej komory. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez żądany czas.
2. Następnie należy wymienić całą pożywkę na pożywkę wolną od antybiotyków, zasysając pompą próżniową i pipetując (Rysunek 2H).

6. Pomiar przepuszczalności

1. Aby uzyskać stałe stężenie bakterii, zmierz gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nm. Rozcieńczyć nocny roztwór bakterii pożywką LB w probówce sokoła o pojemności 50 ml do OD₆₀₀ 0,5 ± 0,05. Praca na lodzie.
   1. Wlej 1 ml pożywki LB do kuwety. Uruchom fotometr i włóż kuwetę do środka, oznaczoną stroną do przodu. Naciśnij dolny przycisk "Blank", aby następnie zmierzyć wartość ślepej próby.
   2. Zmierz gęstość roztworu bakteryjnego, napełniając go do kuwety, wkładając i dociskając dolną próbkę. Powtórzyć pomiar podczas rozcieńczania, aż do uzyskania końcowego stężenia.
2. Pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w której bakterie mogą być przenoszone za pomocą przygotowanej płytki 12-dołkowej i roztworu bakteryjnego o średnicy zewnętrznej₆₀₀ = 0,5. Dodaj 450 μl roztworu bakteryjnego tylko do każdej górnej komory zawierającej 0,5 ml pożywki (Rysunek 2I).
3. Inkubować 12-dołkową płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
   UWAGA: Protokół nakazuje pauzę w tym miejscu.
4. Pobrać próbkę 50 μl pożywki za pomocą pipety z każdej dolnej komory, wyjmując wkładkę za pomocą kleszczyków (Rysunek 2J). Uważaj, aby nie rozlać pożywki z górnych komór do dolnych.
5. Umieść każdą próbkę na osobnej płytce agarowej (Rysunek 2K). Upuść próbkę na płytkę i rozprowadź roztwór za pomocą rozsiewacza komórek.
6. Inkubować płytki agarowe przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
7. Policz kolonie na każdej płytce (Rysunek 2L).

7. Analizowanie danych

1. Zapisz dane w tabeli i oblicz średnią i odchylenie standardowe obserwowanych kolonii komórek poddanych działaniu środka i nieleczonych.
2. Wyświetla średnią jako bezwzględną liczbę kolonii.
   1. Aby znormalizować wyniki, oblicz względną liczbę kolonii, dzieląc wszystkie wyniki przez wartość kontrolną.

Rysunek 2: Szczegółowa prezentacja poszczególnych kroków w protokole. (A) Umieść wkładki ze wysterylizowanymi kleszkami na płytce 12-dołkowej. (B) Pokryj każdą wkładkę 90 μl mieszaniny fibronektyny i kolagenu IV i inkubuj przez 24 godziny. (C) Zrównoważ błony wstępnie podgrzanym podłożem przez 30 minut. (D) Wysiew: 2 x 10,⁵ komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu na wkładkę. (E) Uprawiaj talerz przez odpowiednią ilość czasu. (F) Na dzień przed pomiarem umieścić kolonię E. coli w probówce hodowlanej LB i inkubować przez 24 godziny. (G) Potraktuj komórki lub zmierz TEER. (H) Wymienić kompletną pożywkę na pożywkę wolną od antybiotyków. (I) Dodać 450 μl roztworu bakteryjnego (OD₆₀₀ = 0,5) do każdej górnej komory i inkubować przez 6 godzin. (J) Pobrać 50 μl pożywki z każdej dolnej komory, usuwając wkładkę za pomocą kleszczy. (K) Umieścić próbkę na płytkach agarowych i inkubować przez 24 godziny. (L) Policzyć kolonie i przeanalizować dane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, komórki zostały zasiane i zbudowano model BBB. W 14 dniu po wysiewie komórki potraktowano glioksalem jako reaktywnym aldehydem. Celem eksperymentu było zbadanie korelacji między wiekiem a cukrzycą w POD²⁷ oraz wysokiej częstości występowania zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u pacjentów w podeszłym wieku⁴⁸. Podwyższony poziom zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE) zarówno w wieku, jak i cukrzycy⁴⁹ wymagają dalszych badań nad wpływem glikacji na patogenezę przechodzenia drobnoustrojów przez barierę krew-mózg. Glikacja to nieenzymatyczna reakcja wolnych grup aminowych w białkach z grupami karbonylowymi węglowodanów redukujących lub innych związków karbonylowych. Glukoza jest dobrze znana jako donor grup karbonylowych; Znane są jednak bardziej reaktywne. Po zbudowaniu niestabilnej zasady Schiffa, przegrupowują się do bardziej stabilnych i reaktywnych związków dikarbonylowych, takich jak glioksal. AGEs, produkty końcowe, mogą powodować wiązania krzyżowe między białkami⁵⁰. Mogą uszkadzać struktury komórkowe i zmieniać funkcje komórkowe poprzez interakcję z receptorem AGE (RAGE)⁵¹.

Komórki były traktowane roztworem glioksalu (GO) o stężeniu 0,05 i 0,15 mM przez 1 godzinę, a komórki nieleczone służyły jako kontrola. Glikację wykryto za pomocą immunoblottingu i detekcji za pomocą przeciwciała anty-AGE (Ryc. 3). Uzyskane kolonie bakteryjne zostały policzone i przedstawione jako bezwzględna liczba kolonii (Rysunek 4A) lub względna liczba kolonii znormalizowanych do kontroli (Rysunek 4B). Pożywka pobrana ze studzienek z nietraktowanymi komórkami tworzyła bardzo niewiele kolonii. Wynik ten wykazał, że nieleczone komórki były w stanie zbudować barierę i mogły służyć jako kontrola. Próbki poddane działaniu glioksalu wykazywały zwiększoną liczbę kolonii, co prowadzi do wniosku, że istnieje wpływ glioksalu na THBMEC i gęstość bariery komórkowej, ponieważ liczba kolonii wykazała istotną różnicę między komórkami nieleczonymi i leczonymi. Zwiększone przenikanie bariery bakteryjnej przez barierę po leczeniu glioksalem może wyjaśniać, dlaczego cukrzyca jest skorelowana z chorobami z rozpadem bariery krew-mózg.

Rycina 3: Wykrywanie glikacji białek za pomocą immunoblottingu. THBMEC traktowano GO w różnych stężeniach przez 1 godzinę. Białko całkowite wyizolowano i rozdzielono za pomocą SDS-PAGE. Glikację białek wykryto za pomocą immunoblottingu przy użyciu przeciwciała anty-AGE (CML-26). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W innym otoczeniu glikacja białek THBMEC była indukowana przez glukozę. Wysterylizowaną glukozę dodano do pożywki DMEM/F-12 w celu zwiększenia stężenia glukozy z normalnej pożywki glukozowej (NG) o 17,5 mM do pożywki o wysokiej zawartości glukozy (HG) o 42,5 mM. THBMEC hodowano w dwóch różnych kolbach do hodowli komórkowych: jednej w pożywce o normalnej glukozie (NG), a drugiej w pożywce o wysokiej zawartości glukozy (HG). Te dwa różne podłoża zostały również wykorzystane do wzrostu BBB na filtrach w płytkach 12-dołkowych. Komórki hodowane w pożywce NG służyły jako kontrola. Uzyskane kolonie są reprezentowane jako bezwzględna liczba kolonii (Rysunek 4C) lub względna liczba kolonii znormalizowana do kontroli (Rysunek 4D). Wyniki wskazują na brak znaczącego wpływu na przenikanie bakterii przez ludzką barierę krew-mózg, co prowadzi do wniosku, że wpływ NG w porównaniu z HG nie był wystarczająco poważny, aby wpłynąć na integralność BBB. Różne scenariusze zostały zaprojektowane tak, aby udowodnić model i integralność komórek naśladujących barierę krew-mózg.

Rysunek 4: Bezwzględna i względna liczba zliczonych kolonii bakteryjnych w modelu BBB z THBMECs. THBMEC traktowano 0,15 mM GO przez 1 godzinę, nieleczone komórki służyły jako kontrola. Do każdej górnej komory dodano łącznie 450 μl zawiesiny E. coli (OD₆₀₀ = 0,5). Pożywkę z dolnych komór posiewano na płytkach agarowych po 6 godzinach. (A) Wykres przedstawia średnią +/- SEM zliczonych kolonii. (B) Wykres przedstawia zliczone kolonie znormalizowane do komórek nietraktowanych jako kontrola +/- SEM (n = 4). W (C) i (D) THBMEC były uprawiane w pożywce NG i HG. Do każdej górnej komory dodano łącznie 450 μl zawiesiny E. coli (OD₆₀₀ = 0,5). Pożywkę z dolnej komory posiewano na płytkach agarowych po 6 godzinach. (C) Wykres przedstawia średnią +/- SEM zliczonych kolonii. (D) Wykres przedstawia zliczone kolonie znormalizowane do komórek nietraktowanych jako kontrola +/- SEM (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ograniczony wgląd w patogenezę przemieszczania się drobnoustrojów ogranicza dalszy rozwój terapii POD lub zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Śmiertelność i zachorowalność z powodu tych chorób wymagają lepszego leczenia pacjentów, badań nad mechanizmami leżącymi u ich podstaw oraz solidnej platformy do badań przesiewowych związków. Zdarzenia wieloczynnikowe można badać za pomocą ludzkich BMEC. Kilka zgłoszonych pomyślnie procedur izolacji BMEC z wielu gatunków wykazało utratę cech charakterystycznych sygnatury molekularnej komórek^52,53. Opisane THBMEC w tej procedurze były transfekowane w bardzo wczesnych pasażach, gdzie wykazywały specyficzne cechy komórek śródbłonka mózgu i zachowywały je⁴³. Jest to ważne, ponieważ do tej pory nie odkryto wszystkich etapów w dotkniętych szlakach, a model ten wydaje się naśladować konwencjonalne BMEC. Prezentowany przez nas model wykazuje bezpośrednie wpływy na BMEC i przenikanie drobnoustrojów przez barierę krew-mózg.

Obsługa ogniw THBMEC jest prosta, a wymagane wyposażenie techniczne znajduje się w większości laboratoriów nauk przyrodniczych. Nasz model pozwala na natychmiastowe rozpoczęcie procedur dochodzeniowych po tym, jak THBMEC zbudują szczelną monowarstwę. Zakres zastosowań może być szeroki ze względu na możliwe kombinacje nowych testów z konwencjonalnymi testami, takimi jak pomiar TEER lub znakowanie za pomocą znaczników⁵⁴. Możliwe jest również dodanie astrocytów lub perycytów w celu stworzenia modelu współ- lub potrójnej hodowli. Wpływ leków na przenikanie drobnoustrojów można również przetestować w naszym modelu, traktując THBMEC związkami przed zaszczepieniem górnej komory bakteriami. W rzeczywistości istnieje możliwość zakupu wkładów z filtrami do płytek 96-dołkowych, co pozwala na automatyzację zabiegu. Może to ułatwić wdrożenie wysokoprzepustowych systemów badań przesiewowych leków w celu przyspieszenia odkrywania leków przeciwko wspomnianym chorobom i zmniejszenia skutków ubocznych dla bariery krew-mózg podczas opracowywania leków.

Krytycznym etapem w prezentowanej metodzie jest czas inkubacji po dodaniu bakterii do górnej komory. Ważne jest, aby używać godzin jako osi czasu w protokole, ponieważ czas generowania E. coli wynosi tylko 20 minut^{i 55} minut. W przeciwnym razie użycie różnych punktów czasowych może prowadzić do mylących wyników. Istnieje również możliwe ryzyko zanieczyszczenia między górną a dolną komorą podczas ekspozycji na bakterie, jeśli płytki nie są obchodzone z ostrożnością. Wszelkie zmiany w płytce 12-dołkowej w tym momencie mogą zanieczyścić pożywkę w dolnej komorze.

E. coli jest jedną z dobrze znanych, bardzo częstych przyczyn bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Dalsze badania powinny przetestować różne bakterie, które są również związane z zapaleniem opon mózgowych, takie jak Neisseria meningitidis⁵⁶ lub Streptococcus pneumoniae⁵⁷. Wydaje się, że wykorzystują one różne mechanizmy do przekraczania bariery krew-mózg i muszą być lepiej zrozumiane w leczeniu pacjentów. U pacjentów w podeszłym wieku częstość występowania POD wzrasta^{o 26} , podobnie jak liczba występujących chorób współistniejących. Wiadomo, że zachodzą interakcje między różnymi chorobami, zwłaszcza ogólnoustrojowymi, takimi jak cukrzyca. W naszym modelu możliwe jest symulowanie tych warunków lub traktowanie komórek przed dodaniem bakterii.

Model jest ograniczony przez bezpośredni kontakt THBMEC i bakterii, dlatego konieczne są dalsze badania w celu zbadania potencjalnych mechanizmów kontaktu w celu wykrycia zaangażowanych szlaków i białek. Możliwe jest jednak usunięcie wkładek i pobranie komórek do dalszej analizy. TEER modelu jest niższy w porównaniu z modelami komórek macierzystych 38,39,40. Potwierdziliśmy to, stosując stężenie bakterii, które nie przekroczyło bariery krew-mózg w nieleczonych komórkach po 6 godzinach.

Podsumowując, metoda ta stanowi solidną platformę do analizy przenikania bakterii przez barierę krew-mózg z potencjałem do jej rozszerzenia w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar - Agar	Carl Roth	6494.3	Autoklaw klasy BioScience
	Systec	VX-150
Bakterie E.coli szczep GM2163	Fermentas Life Sciences, Litwa
Fotometr	Eppendorf	6131
Komórki THBMEC	Grupa M. F. Stinsa
Hodowla komórkowa kolby	Greiner Bio-One	658175
Wirówka Uniwersalna 320	Hettrichlab	1401
Kolagen IV	SIGMA Aldrich	C6745	z hodowli komórek
ludzkich Countess Automatyczny licznik komórek ze szkiełkami komory do liczenia komórek i barwieniem Trypan Blue 0,4%	Invitrogen	C10311
Probówki hodowlane	Greiner Bio-One	191180
Kuwety	BRAND	759015
Di wodorofosforan sodu z hydratem	MERCK	1065800500
DMEM/F-12	GIBCO/ Thermo Sc.	11330032	Probówki HEPES
Falcon 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Probówki Falcon 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Płodowa Surowica Bydlęca	GIBCO/ Thermo Sc.	10270	wartość FBS -Brazylia
Fibronektyna	SIGMA Aldrich	F0556	roztwór ludzkie fibroblasty
Heracell 150 CO2 Inkubator Heraeus 50116047
Wytrząsarka do inkubatora I 26 Nowy Brunszwik	Eppendorf	M1324-0000
Pętla inokulacyjna	Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel	641000
LB Baza bulionowa	GIBCO/ Termo Sc.
L-Glutamina	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
Inkubator mikrobiologiczny B 6200	Heraeus	51015192
Szafa Bezpieczeństwa Mikrobiologicznego AURA 2000 M.A.C. Klasa II	BIOAIR	12469
Mikroskop odwrócony	Zeiss	TELAVAL 31
Mikroprobówki 2 ml	Sarstedt	72,695,400
Mikroprobówki 1,5 ml	Sarstedt	72,706,400
Penicylina / Streptomycyna	GIBCO / Thermo Sc.
szalka Petriego	Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel	464-800
Chlorek potasu	Roth	HN02.3
Di-wodorofosforan potasu	Roth	P018.2
Chlorek sodu	Roth	9265.2
ThinCerts + płytki wielodołkowe	Greiner Bio-One	665631	12 dołków, wielkość porów 3,0 &mikro; m
Trypsyna - EDTA	GIBCO/ Thermo Sc.
Pompa próżniowa Laboport	KNF N	86 KT.18