Artykuł metodologiczny

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

DOI:

10.3791/60693

⸱

10 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Boyer Center for Molecular Medicine, Yale University School of Medicine, 2Microbial Sciences Institute, Yale University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System wydzielania Dot/Icm Legionella pneumophila to złożona nanomaszyna systemu wydzielania typu IV (T4SS), która lokalizuje się na biegunie bakteryjnym i pośredniczy w dostarczaniu białek i substratów DNA do komórek docelowych, co zazwyczaj wymaga bezpośredniego kontaktu między komórkami. Niedawno rozwiązaliśmy strukturę aparatu Dot/Icm za pomocą tomografii krioelektronowej (cryo-ET) i wykazaliśmy, że tworzy on kanał obejmujący otoczkę komórkową, który łączy się z kompleksem cytoplazmatycznym. Zastosowanie dwóch uzupełniających się podejść, które zachowują natywną strukturę próbki, mikroskopii fluorescencyjnej w żywych komórkach i cryo-ET, umożliwia wizualizację białek in situ oraz asymilację stechiometrii i czasu produkcji każdego komponentu maszyny w stosunku do innych podjednostek Dot/Icm. Aby zbadać wymagania dotyczące pozycjonowania biegunowego i scharakteryzować dynamiczne cechy związane z biogenezą maszyny T4SS, połączyliśmy gen kodujący superfolder białka zielonej fluorescencji z genami ATPazy Dot / Icm w ich natywnych pozycjach na chromosomie. Poniższa metoda integruje ilościową mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek i krio-ET w celu ilościowego określenia polarnej lokalizacji, dynamiki i struktury tych białek w nienaruszonych komórkach bakteryjnych. Zastosowanie tych podejść do badania Legionella pneumophila T4SS jest przydatne do scharakteryzowania funkcji systemu Dot / Icm i może być dostosowane do badania szerokiej gamy patogenów bakteryjnych, które wykorzystują T4SS lub inne typy kompleksów wydzielania bakteryjnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Legionella pneumophila (L. pneumophila), czynnik etiologiczny choroby legionistów, zamieszkuje zbiorniki słodkowodne, gdzie bakterie rozmnażają się, infekując i replikując się w wodnych swobodnie pływających pierwotniakach. L. pneumophila powoduje ogniska choroby u ludzi, gdy dochodzi do wdychania bakterii w aerozolu ze źródeł wody pitnej. W zakażonych komórkach subwersja szlaków gospodarza pozwala L. pneumophila opóźnić endocytarne dojrzewanie wakuoli, w której się znajduje, i promować biogenezę przedziału komórkowego, który wspiera replikację bakterii. Proces ten jest napędzany przez wyspecjalizowany bakteryjny system wydzielania IVB typu (T4BSS) znany jako Dot/Icm i jego repertuar ponad 300 białek "efektorowych", które są translokowane do cytozolu gospodarza podczas infekcji, aby ułatwić manipulację funkcjami komórkowymi1,2,3,4,5. Mutanty pozbawione funkcjonalnego aparatu Dot/Icm nie dostarczają efektorów do cytozolu gospodarza, są wadliwe w replikacji wewnątrzkomórkowej i są awirulentne w zwierzęcych modelach choroby6,7.

Wiele gatunków bakterii rozwinęło niezwykle skomplikowane i dynamiczne wieloskładnikowe maszyny, które są niezbędne do procesów infekcji. Inne T4BSS, takie jak system Dot/ICM, są również niezbędne do wewnątrzkomórkowej replikacji patogenów bakteryjnych, takich jak Coxiella burnetii i Rickettsiella grylli. Chociaż T4BSS są ewolucyjnie spokrewnione z prototypowymi systemami typu IVA, które pośredniczą w transferze DNA i mogą dostarczać ograniczony repertuar białek efektorowych, system Dot/Icm ma prawie dwa razy więcej komponentów maszynowych i dostarcza szeroką gamę efektorów. Przypuszczalnie to zwiększenie liczby komponentów umożliwiło aparatowi Dot/Icm łatwe dostosowanie i integrację nowych efektorów8,9.

Ostatnio użyliśmy tomografii krioelektronowej (cryo-ET) do rozwiązania struktury aparatu Dot/Icm in situ i pokazaliśmy, że tworzy on kanał obejmujący otoczkę komórki, który łączy się z kompleksem cytoplazmatycznym. Dalsza analiza wykazała, że cytozolowa ATPaza DotB wiąże się z układem Dot/Icm na biegunie komórkowym L. pneumophila poprzez interakcje z cytozolową ATPazą DotO. Odkryliśmy, że DotB wykazuje ruch cytozolowy w większości komórek bakteryjnych, co wskazuje, że ta ATPaza jest obecna w dynamicznej populacji cytozolowej, ale wiąże się również z polarnymi kompleksami Dot / ICM. Ponadto DotO tworzy heksameryczny zespół dimerów DotO związanych z kompleksem błony wewnętrznej, a heksamer DotB łączy się z podstawą tego kompleksu cytoplazmatycznego. Złożenie kompleksu energetycznego DotB-DotO tworzy kanał cytoplazmatyczny, który kieruje translokacją substratów przez T4SS ( Rysunek 1) < klasa sup = "xref">10.

Pomimo tych ostatnich osiągnięć, niewiele wiadomo o tym, jak funkcjonuje system Dot/Icm i jak każde białko łączy się, tworząc aktywne urządzenie8. Odkrycie obwodów regulacyjnych Dot/Icm T4SS ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji gospodarz-patogen. Dlatego omawiamy, jak używać mikroskopii żywych komórek i cryo-ET do wykrywania i charakteryzowania istotnych elementów systemu L. pneumophila Dot/ICM, które są oznaczone superfolderem GFP (sfGFP). Za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej polarna lokalizacja DotB zostanie zdefiniowana na tle typu dzikiego lub po usunięciu układu typu IV. Mikroskopia poklatkowa zostanie wykorzystana do ilościowego określenia różnic w lokalizacji i dynamice między cytozolowymi ATPazami Dot/ICM.

Połączone zastosowanie dwóch uzupełniających się podejść, takich jak obrazowanie na żywo i cryo-ET, daje przewagę w porównaniu z innymi systemami in vitro. Obie metody są wykonywane w nienaruszonych komórkach i zachowują naturalne środowisko T4BSS, minimalizując w ten sposób zakłócenie natywnej struktury podczas przygotowywania próbki. Ponieważ nadekspresja białek może upośledzać stechiometrię aparatu wydzielniczego, fuzje sfGFP są zwracane poprzez wymianę alleli do chromosomu Legionella, tak że każda fuzja jest kodowana w pojedynczej kopii, a ekspresja jest napędzana przez endogenny promotor. Wizualizacja fuzji kodowanych chromosomalnie umożliwia ilościowe określenie dokładnego poziomu ekspresji białka w określonym punkcie czasowym. Cryo-ET ma również wiele zalet w określaniu struktury systemów sekrecjonalnych. Najbardziej zauważalną zaletą jest to, że próbki cryo-ET składają się z zamrożonych nienaruszonych komórek, które zachowują natywne kompleksy w kontekście architektury komórek bakteryjnych. W związku z tym cryo-ET może być lepszy niż biochemiczne metody oczyszczania, które ekstrahują kompleksy błonowe i mogą usuwać białka obwodowe z aparatu rdzeniowego lub modyfikować ogólną strukturę. Ponadto znakowanie interesującego białka za pomocą dużego białka, takiego jak sfGFP, dodaje masę, która jest wykrywalna przez cryo-ET i może pomóc w mapowaniu różnych podkompleksów aparatu Dot / Icm na strukturę uzyskaną przez cryo-ET.

To podejście jest potężnym narzędziem do odkrywania informacji strukturalnych o wielocząsteczkowych kompleksach, które gromadzą się w błonie komórkowej bakterii. Interpretacja struktur wyjaśnionych za pomocą tych technik pomoże w zrozumieniu, w jaki sposób działają komponenty T4BSS, dlaczego tak wiele komponentów jest wymaganych do działania, w jaki sposób komponenty oddziałują na siebie w obrębie większego kompleksu i jakie funkcje pełnią te podzespoły.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury związane z hodowlą, manipulacją i obrazowaniem L. pneumophila powinny być wykonywane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 zgodnie z lokalnymi wytycznymi.

1. Wprowadzenie sfGFP do chromosomu L. pneumophila przy użyciu strategii wymiany alleli i podwójnej selekcji (Rysunek 2, Rysunek 3)

  1. Sklonuj do wektora zastępczego genu pSR47S11 następującą sekwencję: 1000 pz przed miejscem zainteresowania, następnie sekwencja sfGFP, a następnie 1000 pz za miejscem zainteresowania (Rysunek 2). Sekwencję sfGFP należy umieścić w ramce do końca N lub C-końca za pomocą łącznika zawierającego od czterech do ośmiu aminokwasów. Przekształć otrzymany wektor w E. coli DH5αλpir. Później smuga L. pneumophila (biorca) dla pojedynczych kolonii na ekstrakcie z węgla drzewnego i ekstraktu drożdżowego (CYE) agar12 zawierającym 100 μg/ml streptomycyny i rosnącym przez 5 dni w temperaturze 37 °C (Rysunek 3).
  2. Smuga L. pneumophila na CYE-agar-streptomycyna i rośnie przez 2 dni w temperaturze 37 °C (ciężka plama)10. Smuga E. coli DH5α transformowana plazmidem pomocniczym pRK600 (pomocnikiem) 13 na agarze LB zawierającym 25 μg / ml chloramfenikolu. Umieść E. coli DH5αλpir (dawca) na agarze LB zawierającym 50 μg/ml kanamycyny.
  3. Przeprowadzić krycie trójrodzicielskie: inkubować kolonię pomocnika, kolonię dawcy i biorcy, nakładając plastry trzech szczepów na płytkę agarową CYE bez selekcji i inkubując przez 4–8 godzin w temperaturze 37 °C. Jako kontrole ujemne inkubować mieszaninę szczepów pomocnik + biorca i mieszankę szczepów dawca + biorca przez te same okresy czasu.
  4. Ponownie zawiesić reakcje kojarzenia w 500 μL ddH2O. Płytka 20 μL i 50 μL reakcji na agarze CYE zawierającym 100 μg/ml streptomycyny i 10 μg/ml kanamycyny i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Smugować cztery z powstałych klonów na agarze CYE zawierającym 100 μg/ml streptomycyny i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 37 °C.
  5. Umieść 16 klonów na agarze CYE zawierającym 5% sacharozy i 100 μg/ml streptomycyny i hoduj przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Następnie umieść 32 klony na agarze CYE zawierającym 100 μg/ml streptomycyny i na agarze CYE zawierającym 100 μg/ml streptomycyny i 10 μg/ml kanamycyny i rosnąć przez 5 dni w temperaturze 37 °C.

2. Izolacja klonów, które zintegrowały sfGFP z chromosomem L. pneumophila

  1. Klony, które były wrażliwe na kanamycynę, umieszczają na płytkach CYE-agar-streptomycyna i potwierdzają wprowadzenie sfGFP do chromosomu za pomocą PCR kolonii. Użyj starterów, które są komplementarne do genu sfGFP i do interesującego regionu chromosomowego, aby wzmocnić złącze insercyjne.
    1. Wymieszać 0,5 μl każdego z 10 μM roztworów starterów i jednej kolonii do końcowej objętości 12,5 μl i poddać denaturacji przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Schłodzić na lodzie przez 10 minut, dodać 12,5 μl 2x roztworu mieszanki głównej PCR i przeprowadzić analizę PCR.
  2. Hodować ciężkie plamy izolowanych kolonii na płytkach CYE-agar-streptomycyna przez 2 dni w temperaturze 37 °C. Zbadać poziomy ekspresji i stabilność fuzji sfGFP poprzez immunoblotting przeciwciałem anty-GFP.

3. Obrazowanie żywych komórek L. pneumophila za pomocą fluorescencyjnie oznaczonych komponentów Dot/ICM

  1. Przygotowanie płatków agarozowych
    1. Przygotuj około 30 ml 1% niskotopliwego roztworu agarozy w wodzie. Kuchenka mikrofalowa w szklanej kolbie przez około 90 s, od czasu do czasu wirując, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
    2. Umieść dwa szkiełka podstawowe o wymiarach 22 x 22 x 0,15 mm3 na krawędzi szkiełka o wymiarach 25 x 75 x 1,1 mm3, jeden na drugim. Ułóż dwa kolejne szklane szkiełka podstawowe o wymiarach 22 x 22 x 0,15 mm na drugiej krawędzi.
    3. Odpipetować około 1 ml stopionej agarozy do środkowego szkiełka pośredniego między dwoma górnymi szkiełkami, a następnie umieścić kolejne szkiełko o wymiarach 25 x 75 x 1,1 mm3 na wierzchu stopionej agarozy. Staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza. Schłodzić szkiełka w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    4. Za pomocą skalpela lub żyletki delikatnie pokrój podkładkę na małe kwadraty o wymiarach ~5 x 5 mm2. Przymocuj dwustronną ramkę samoprzylepną 17 x 28 x 0,25 mm3 na szkiełku podstawowym o wymiarach 25 x 75 x 1,1 mm3 i umieść kilka padów na szkiełku.
  2. Akwizycja obrazu
    UWAGA: Poniższe kroki opisano dla mikroskopu, który jest pod kontrolą SlideBook 6.0 i wyposażony w oświetlacze półprzewodnikowe, monochromatyczną kamerę CCD i obiektyw o powiększeniu 100x (apertura numeryczna 1,4). W razie potrzeby należy użyć alternatywnych urządzeń mikroskopowych z odpowiednimi konfiguracjami sprzętowymi i programowymi, które można dostosować zgodnie z ustawieniami protokołu.
    1. Rozpuścić ciężki plaster L. pneumophila w 1 ml ddH2O, odwirować i odpipetować 2–3 μl rozcieńczenia na podkładki. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 x 24 x 0,15 mm3 na ramkę samoprzylepną.
    2. W oknie przechwytywania ustaw ND na 180. Dostosuj binningowanie do 2×2 i użyj kanału 488 nm, aby naświetlić próbkę w zakresie 500–1,000 ms. Zweryfikuj specyficzność sygnału fluorescencji, obrazując nieoznakowaną L. pneumophila o tych samych parametrach (Rysunek 4).

4. Kwantyfikacja lokalizacji biegunowej i dynamiki składników Dot/Icm

UWAGA: Poniższe kroki są przeznaczone dla obrazów o rozdzielczości 0,129 μm na piksel, które zostały uzyskane przy użyciu binningu 2 x 2.

  1. Kwantyfikacja polarności białek fuzyjnych sfGFP (Rysunek 5)
    1. Dostosuj kontrast obrazu, aby bakterie były wyraźnie widoczne. Użyj narzędzia Region, aby umieścić prostokąt o wymiarach 0,25 x 1,3μm2, zaczynając od bieguna i rozciągając się do cytoplazmy. Prostokąt musi dokładnie znajdować się w granicach bakterii.
    2. Zaznacz co najmniej 200 bakterii i użyj przycisku Region to Mask, aby utworzyć maski dla obszarów zainteresowania. W obszarze Statystyka maski i Zakres maski wybierz pozycję Obiekt. Następnie w obszarze Cechy i intensywność zaznacz Średnia intensywność i wariancja.
    3. Wyeksportuj dane i oblicz wyniki polaryzacji każdej bakterii jako stosunek wariancji do średniej intensywności.
    4. W przypadku zastosowań o wysokiej przepustowości należy użyć obiektywu fazowego i odpowiedniej konfiguracji kondensora, aby uzyskać obrazy z kanałami fazowymi i 488 nm. Upewnij się, że wybierasz pola widzenia, w których bakterie są całkowicie oddzielone.
    5. Dostosuj kontrast kanału fazowego obrazu do poziomu, w którym bakterie są wyraźnie widoczne. Otwórz obraz dwukanałowy, uruchom okno Utwórz maskę segmentu i zmień kanał na fazowy.
    6. Dostosuj odpowiedni próg i usuń małe obiekty za pomocą przycisku Zdefiniuj obiekty. W obszarze Popraw maskę wybierz opcję Usuń obiekty krawędzi, a następnie oddziel maski bakterii, które sąsiadują ze sobą.
    7. Oblicz wyniki polaryzacji sygnału w kanale 488 dla każdej komórki, jak opisano wcześniej w krokach 4.1.2–4.1.3.
  2. Kwantyfikacja dynamiki białek fuzyjnych sfGFP (Rysunek 6)
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji 3, aby przygotować próbkę do akwizycji obrazu. Dynamika jest definiowana jako zmiany intensywności w czasie, a poniższe kroki są zaprojektowane dla krótkich okresów obrazowania (tj. kilku minut). Dodaj do wkładki odpowiednie suplementy, jeśli pożądane są dłuższe okresy obrazowania.
    1. W oknie Image Capture (Przechwytywanie obrazu) zaznacz Timelapse, wprowadź czas interwałów w polu interwału i wprowadź 2 w polu # punktów czasu. Uzyskaj dwa kolejne obrazy L. pneumophila wyrażające interesujące nas białko fluorescencyjne.
    2. Dostosuj kontrast obrazu, aż komórki będą wyraźnie widoczne. Postępuj zgodnie z Rysunek 6A i poniższymi opisami, aby umieścić trzy różne maski. Użyj narzędzia Region, aby umieścić kwadrat o wymiarach 0,25 x 0,25 μm pośrodku co najmniej 400 komórek.
    3. Użyj przycisku Region to Mask, aby utworzyć maskę (maskę 1) interesujących kwadratów. Utwórz nową pustą maskę (maskę 2) i użyj narzędzia Piksel lub narzędzia Wielokąt, aby zaznaczyć cały obszar komórek z co najmniej 25 losowych komórek, które zostaną użyte do obliczenia wybielania fluorescencyjnego. Utwórz nową pustą maskę (maskę 3) i użyj dużego narzędzia pędzla, aby zaznaczyć obszary między komórkami, które zostaną użyte do odejmowania tła.
    4. W obszarze Statystyka maski i Zakres maski wybierz opcję Obiekt dla maski 1 i maski 2. Następnie w obszarze Cechy i intensywność wybierz opcję Średnia intensywność i wyeksportuj dane dwóch masek. W przypadku maski 3 wyeksportuj średnią intensywność całej maski.
    5. Oblicz zmianę intensywności fluorescencji dla każdego obiektu w masce 1, korzystając z następujących wzorów:

figure-protocol-1

figure-protocol-2

gdzie maska 1 to kwadrat o wymiarach 0,25 μm × 0,25 μm umieszczony w środku komórki, maska 2 obejmuje całą komórkę, maska 3 to tło między komórkami, t1 to średnia intensywność w pierwszym punkcie czasowym, a t2 to średnia intensywność w drugim punkcie czasowym.

5. Wykrywanie gęstości masy sfGFP za pomocą Cryo-ET

  1. Przygotowanie próbek, zbieranie danych i rekonstrukcja
    1. Wyhoduj ciężką plamę L. pneumophila wyrażającą fluorescencyjnie znakowane białko Dot / Icm na płytkach CYE-agar-streptomycyna przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Ponownie zawiesić komórki w ddH2O do OD600 ~ 0,7. Dodać 5 μl koloidalnych cząstek złota (BSA Tracer, 10 nm) do 20 μl zawiesiny komórek.
    2. Odpipetować 5 μl mieszaniny komórek na świeżo rozżarzoną, dziurawą siatkę węglową (R 2/1 na oczkach Cu 200) i odstawić na 1 minutę. Osuszyć bibułą filtracyjną i zamrozić w ciekłym etanie za pomocą grawitacyjnego aparatu tłokowego, jak opisano wcześniej14,15.
    3. Zobrazuj zamrożone uwodnione próbki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego 300 kV wyposażonego w pistolet do emisji pola, filtr energii, płytkę fazową Volty i urządzenie do bezpośredniej detekcji. Zbieraj serie pochylenia w jednej osi przy powiększeniach 26 000x i 42 000x, co daje rozmiary pikseli na poziomie próbki odpowiednio 5,4 A/piksel lub 3,4 A/piksel.
    4. Użyj pakietu tomograficznego SerialEM, aby zebrać stosy obrazów przy rozmyciu ~0 μm, z zakresem kątów nachylenia od -60° do +60° z krokiem co 3° i dawką akumulacyjną ~60 e-/Å2,16. Wyrównaj frakcjonowane dawką obrazy filmowe w każdym stosie za pomocą MotionCor217. Złóż stosy z korekcją dryfu za pomocą TOMOAUTO14.
    5. Wyrównywanie stosów z korekcją dryfu za pomocą znacznika IMOD alignment18. Rekonstrukcja tomogramów za pomocą metody SIRT19 w celu segmentacji i bezpośredniej analizy obrazu oraz metody WBP20.
  2. Analiza subtomogramowa próbek fuzji sfGFP
    1. Użyj pakietu tomograficznego I3 (0.9.9.3) do analizy subtomogramu14,21,22.
      UWAGA: Wyrównanie przebiega iteracyjnie, przy czym każda iteracja składa się z trzech części, w których generowane są odniesienia i maski klasyfikacyjne, podtomogramy są wyrównywane i klasyfikowane, a średnie klas są wyrównywane do siebie.
    2. Użyj 4 x 4 x 4 podtomogram z pojemnikami do wstępnego wyrównania. Scal cząstki, które należą do średnich klas i wykazują gęstość elektronów odpowiadającą sfGFP. Po posortowaniu cząstek za pomocą fuzji sfGFP, użyj 2 x 2 x 2 subtomogram z bined w celu skoncentrowanego wyrównania obszaru zainteresowania (takiego jak cytoplazmatyczny kompleks ATPazy Dot/Icm) w celu uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homologiczna rekombinacja z podwójnym wyborem w dwóch krokach została użyta do skonstruowania zdefiniowanej insercji sfGFP. W pierwszym etapie przeprowadzono kojarzenie trirodzicielskie, w którym plazmid koniugacyjny pRK600 (plazmid IncP) ze szczepu pomocniczego E. coli MT616 został zmobilizowany do szczepu E. coli dawcy z wektorem samobójczym pSR47S zawierającym gen sfGFP otoczony dwoma regionami homologicznymi, pochodzeniem oriT transferu i genem kontrselekcji Bacillus subtilis sacB....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyjaśnienie funkcji bakteryjnych systemów wydzielania jest kluczem do pełnego zrozumienia interakcji gospodarz-patogen. Systemy wydzielania to złożone maszyny, które mogą wstrzykiwać białka efektorowe do komórek gospodarza, a w niektórych przypadkach sprzyjać tworzeniu się niszy subkomórkowej, która wspiera replikację bakterii. Powyższa metoda dostarcza ważnych nowych narzędzi do badania systemu wydzielania Dot/Icm patogenu bakteryjnego Legionella pneumophila, dostarczając wskazówek dotyczących mechanizmów trans...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.C. i C.R.R. były wspierane przez NIH (R37AI041699 i R21AI130671). D.P., B.H. i J.L byli wspierani przez National Institutes of Health (R01AI087946 i R01GM107629).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cząstki złota koloidalnego 10 nmAurion25486
100x Obiektyw Plan Apo (1.4 NA)Nikon
ACESSigma-AldrichA9758
Węgiel aktywnySigma-AldrichC5510
Agaroze GPG/LMP, niskotopliwyAB00981bioanalityczny
Odwodniony agar BactoBD214010
CoolSNAP EZ 20 MHz cyfrowa kamera monochromatycznaFotometria
Gene, Ramka genowa, 1,7x2,8 cm, 125 &mikro; LFisher ScientificAB-0578
Holey Siatka węglowa R 2/1 Cu 200 meshQuantifoilQ225-CR1
Azotan żelaza(III) bezwodnySigma-Aldrich216828
K2 Kamera szczytowa do cryo-EMGATAN
L-CysteinaSigma-AldrichC7352
Szkiełka osłonowe mikroskopu 22x22 mmFisher Scientific12-542B
Szkiełka podstawowe do mikroskopów 24x50 mmFisher Scientific12-545K
Szkiełka podstawowe 25x75x1 mmGlobe Scientific1380
SlideBook 6.0Inteligentne innowacje
Silnik świetlny Spectra XLumencor
Taq 2X Master MixNew England BioLabsM0270
Titan KriosThermo Fisher Naukowy
ekstrakt drożdżowyBD212750
amerykański w obrazowaniu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
  2. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508(2009).
  3. Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
  4. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  5. Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
  6. Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
  7. Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
  8. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136(2011).
  9. Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
  10. Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
  11. Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
  12. Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
  13. Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
  14. Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608(2016).
  15. Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
  16. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
  17. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
  18. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
  19. Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
  20. Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
  21. Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
  22. Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
  23. Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
  24. Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
  25. Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
  26. Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
  27. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnasystem sekrecji typu IVpolarna lokalizacja bakteryjnafuzja z Superfolder GFPanaliza dynamiki strukturalnejnienaruszone kom rki bakteryjne

Powiązane artykuły