Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60697

⸱

3 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Laboratory of Plant Molecular Sciences, College of Life Sciences, Shanghai Normal University, 2College of Agriculture, Yangtze University, 3Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guizhou Institute of Tobacco Science

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Streszczenie

Wyciszanie RNA jest ewolucyjnie zachowanym, specyficznym dla sekwencji mechanizmem regulacji genów u eukariontów. Kilka patogenów roślinnych wyewoluowało białka zdolne do hamowania szlaku wyciszania RNA rośliny żywicielskiej. W przeciwieństwie do białek efektorowych wirusa, tylko kilka wydzielanych białek efektorowych wykazało zdolność do tłumienia wyciszania RNA w patogenach bakteryjnych, lęgniowców i grzybów, a funkcje molekularne większości efektorów pozostają w dużej mierze nieznane. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nieco zmodyfikowaną wersję testu współinfiltracji, która może służyć jako ogólna metoda obserwacji wyciszania RNA i charakteryzowania białek efektorowych wydzielanych przez patogeny roślinne. Kluczowymi etapami tego podejścia są wybór zdrowych i w pełni rozwiniętych liści, dostosowanie kultury bakterii do odpowiedniej gęstości optycznej (OD) przy 600 nm oraz obserwacja fluorescencji białka zielonej fluorescencji (GFP) w optymalnym czasie na naciekanych liściach, aby uniknąć pominięcia efektorów o słabej aktywności supresyjnej. Ten ulepszony protokół przyczyni się do szybkich, dokładnych i rozległych badań przesiewowych supresorów wyciszających RNA i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do badania funkcji molekularnych tych białek.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad przyspieszenie sekwencjonowania genomu mikroorganizmów wywołujących choroby roślin doprowadziło do coraz większej luki w wiedzy między informacjami o sekwencji a biologicznymi funkcjami kodowanych białek1. Wśród cząsteczek ujawnionych w ramach projektów sekwencjonowania znajdują się cząsteczki efektorowe, które tłumią wrodzoną odporność i ułatwiają kolonizację gospodarza; Czynniki te są wydzielane przez destrukcyjne patogeny roślin, w tym bakterie, nicienie i drobnoustroje nitkowate. Aby zareagować na te zagrożenia, rośliny żywicielskie wyewoluowały nowe receptory, które rozpoznają te efektory, umożliwiając przywrócenie odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym efektory podlegają różnym naciskom selekcyjnym, co prowadzi do zróżnicowania repertuaru efektorów wśród linii patogenów2. W ostatnich latach wykazano, że domniemane efektory patogenów roślinnych zaburzają wrodzoną odporność roślin poprzez hamowanie procesów komórkowych gospodarza, co przynosi korzyści drobnoustrojom na różne sposoby, w tym rozregulowanie szlaków sygnałowych, transkrypcję, transport wewnątrzkomórkowy, stabilność cytoszkieletu, transport pęcherzyków i wyciszanie RNA3,4,5. Jednak zdecydowana większość efektorów patogenów, zwłaszcza tych pochodzących z patogenów nitkowatych, pozostała enigmatyczna.

Wyciszanie RNA to maszyneria inaktywacji genów za pośrednictwem homologii, która jest zachowana wśród eukariontów. Proces ten jest wywoływany przez długi dwuniciowy RNA (dsRNA) i celuje w homologiczny jednoniciowy RNA (ssRNA) w sposób specyficzny dla sekwencji i manipuluje szerokim zakresem procesów biologicznych, w tym obroną przeciwwirusową6. Aby przezwyciężyć wrodzone odpowiedzi immunologiczne gospodarza, niektóre wirusy ewoluowały, aby zrównoważyć wyciszanie RNA, w tym zdolność do replikacji wewnątrz przedziałów wewnątrzkomórkowych lub ucieczki przed zreorganizowanym sygnałem wyciszającym. Niemniej jednak najbardziej ogólną strategią, za pomocą której wirusy chronią swoje genomy przed zależną od wyciszenia RNA utratą funkcji genu, jest kodowanie specyficznych białek, które hamują wyciszanie RNA7,8. Ustalono kilka mechanistycznie różnych podejść do badań przesiewowych i charakterystyki wirusowych supresorów wyciszania RNA (VSR), w tym jednoczesną infiltrację kultur Agrobacterium tumefaciens, rośliny transgeniczne wykazujące ekspresję przypuszczalnych supresorów, szczepienie i hodowlę komórkową9,10,11,12,13.

Każdy z tych testów ma zalety i wady, a także identyfikuje VSR na swój własny, odrębny sposób. Jedno z najczęstszych podejść opiera się na jednoczesnej infiltracji poszczególnych kultur A. tmuefaciens zawierających potencjalne białko wirusa i gen reporterowy (zwykle białko zielonej fluorescencji [GFP]) na roślinach Nicotiana benthamiana 16c konstytutywnie wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S. W przypadku braku aktywnego supresora wyciszającego wirusa, GFP jest identyfikowany przez komórki gospodarza jako egzogenny i jest wyciszany w ciągu 3 dni po infiltracji (dpi). W przeciwieństwie do tego, jeśli białko wirusowe ma aktywność supresyjną, poziom ekspresji GFP pozostaje stały powyżej 3−9 dpi9. Ten test współinfiltracji jest prosty i szybki; Nie jest jednak ani bardzo stabilny, ani wrażliwy. Niemniej jednak test zidentyfikował liczne VSR z różnymi sekwencjami i strukturami białkowymi w wielu wirusach RNA7,8.

Ostatnio scharakteryzowano kilka białek efektorowych, które mogą hamować aktywność wyciszania komórkowego RNA, z bakteryjnych, lęgniowców i grzybowych patogenów roślin14,15,16. Odkrycia te sugerują, że supresja wyciszania RNA jest powszechną strategią ułatwiającą infekcję, która jest wykorzystywana przez patogeny w większości królestw. Teoretycznie wiele, jeśli nie wszystkie, efektory mogą kodować supresory wyciszające RNA (RSS); Do tej pory zidentyfikowano jednak tylko kilka z nich, głównie ze względu na brak wiarygodnej i ogólnej strategii badań przesiewowych. Co więcej, supresory wyciszania RNA nie zostały zbadane w zdecydowanej większości patogenów roślin17.

W tym raporcie przedstawiamy zoptymalizowany i ogólny protokół identyfikacji efektorów patogenów roślinnych, które mogą tłumić miejscowe i ogólnoustrojowe wyciszanie RNA za pomocą testu agroinfiltracji. Głównym celem tego badania było podkreślenie kluczowych aspektów protokołu i szczegółowe opisanie kroków, zapewniając w ten sposób test przesiewowy, który jest odpowiedni dla prawie wszystkich efektorów patogenów roślinnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie etapy procedury powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (RT).

UWAGA: Umieść wszystkie podłoża zawierające chorobotwórcze mikroby, jak również rośliny i tkanki roślinne użyte w teście, do odpowiednich pojemników na odpady i autoklawu przed wyrzuceniem.

1. Przygotowanie konstruktów plazmidowych zawierających domniemane efektory

  1. Wybierz przypuszczalnie wydzielane efektory, które ulegają silnej ekspresji podczas infekcji, jak określono za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-Seq), a następnie za pomocą ilościowej techniki Real Time PCR (qRT-PCR).
  2. Określ miejsce rozszczepienia peptydu sygnałowego każdego efektora za pomocą narzędzia programowego, takiego jak SignalP18.
  3. Zaprojektuj startery i wykonaj PCR w celu amplifikacji genu kodującego interesujący efektor przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym, aby sprawdzić produkt PCR, a następnie sklonuj amplikon do wektora wejściowego bramki pQBV3 za pomocą zestawu do klonowania bez ligacji (tabela materiałów), a następnie do docelowego wektora ekspresji pEG100 przy użyciu reakcji rekombinacji LR19.
  4. Przekształć 3−5 μl mieszaniny reakcyjnej LR w 100 μl kompetentnych komórek E. coli (np. TOP10, DH5α), rozprowadzić przekształcone komórki bakteryjne na podłożu agarowym Luria-Bertani (LB) uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16−20 h.
    UWAGA: Transformanty dodatnie można zidentyfikować za pomocą PCR20 i dalej analizować za pomocą miniprepu plazmidu i sekwencjonowania.
  5. Wprowadzić 50−100 ng rekombinowanych plazmidów przenoszących białko efektorowe do 100 μl chemicznie kompetentnych komórek A. tumefaciens (np. GV3101 lub C58C1), delikatnie wymieszać, a następnie zamrozić w ciekłym azocie na 1 min. Rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 min.
  6. Dodać 500 μl bulionu LB i inkubować w temperaturze 30 °C przez 4-6 godzin z delikatnym wstrząsaniem, a następnie przenieść i rozprowadzić wszystkie komórki agrobakterii na podłożu agarowym LB uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
    UWAGA: Dodatnie klony można zweryfikować za pomocą PCR kolonii.
  7. Użyj pojedynczej przekształconej kolonii do eksperymentów agroinfiltracji, chyba że zalecono inaczej.
    UWAGA: W niniejszym badaniu żaden z badanych genów efektorowych nie zawierał przewidywanych intronów; każdy z genów został bezpośrednio amplifikowany z genomowego DNA izolatu Phytophthora sojae. Wektor wyrażenia roślinnego Gateway bez żadnego znacznika jest zalecany, ale nie jest to konieczne.

2. Przygotowanie roślin N. benthamiana 16c

  1. Przygotować mieszanki gleby doniczkowej składające się (objętościowo) z 50% mchu torfowego, 30% perlitu i 20% wermikulitu i pozostawić w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut.
  2. Namocz autoklawizowane mieszanki glebowe w roztworze nawozu roślinnego (1 g/l) i zapakuj je do mniejszych doniczek (80 mm x 80 mm x 75 mm) przechowywanych na większej tacy (540 mm x 285 mm x 60 mm).
  3. Wysiewaj jedno lub dwa nasiona N. benthamiana 16c na powierzchnię gleby w każdej doniczce. Przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować.
  4. Umieść tacę w jasnych komorach wzrostowych o kontrolowanej temperaturze i temperaturze 23−25 °C, wilgotności względnej 50−60% i fotoperiodze długiego dnia (14 h światła/10 h ciemności, z oświetleniem przy 130−150 μE·m-2 s-1).
  5. Zdejmij plastikową kopułę po wykiełkowaniu nasion (3-4 dni) i pozwól sadzonkom rosnąć w tych samych warunkach, które są używane na etapie kiełkowania.
  6. Dodawaj odpowiednią ilość wody, utrzymując glebę wilgotną, ale nie moczącą, co 2-3 dni; dodawaj nawóz co 10 dni, aby przyspieszyć dalszy wzrost. Utrzymuj rośliny N. benthamiana 16c w normalnych warunkach, dopóki nie będą gotowe do użycia; Na tym etapie roślina powinna mieć co najmniej pięć w pełni rozwiniętych prawdziwych liści i nie mieć widocznych pąków pachowych ani kwiatowych, a liście powinny mieć zdrowy zielony wygląd).
  7. Do testów wyciszania ustrojowego RNA należy użyć 3-4 tygodniowych liści N. benthamiana 16c do miejscowych testów wyciszania RNA, a młodych roślin N. benthamiana 16c (10−14 dni) do ogólnoustrojowych testów wyciszania RNA.
    UWAGA: Warunki wzrostu roślin i obiekty różnią się w zależności od laboratorium; Wybierz zdrowe, dobrze rozwinięte i w pełni rozwinięte liście do infiltracji.

3. Przygotowanie kultury Agrobacterium do infiltracji

  1. Wybrać dodatnią kolonię z płytki LB i zaszczepić komórki w szklanej probówce zawierającej 5 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny. Hodować komórki w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez 24−48 godzin.
  2. Przenieść 100 μl kultury do 5 ml pożywki LB uzupełnionej tymi samymi antybiotykami, 10 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES; pH 5,6) i 20 μM acetosyringonu (AS). Hodować bakterie w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 16−20 godzin.
  3. Odwirować komórki przy 4 000 x g przez 10 min. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 10 mM buforu MgCl2
    4. .
  4. Powtórz krok 3.3, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyków.
  5. Określić gęstość kultury Agrobacterium, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm (OD600). Dostosuj do OD600 1,5−2,0 z buforem 10 mM MgCl2.
  6. Dodać 10 mM MES (pH 5,6) i 150 μM AS do końcowych kultur zawiesinowych i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny bez wstrząsania.
    UWAGA: Nie pozostawiaj końcowych kultur zawiesiny na noc.

4. Współinfiltracja pozostawia N. benthamiana

  1. Zmieszać równe objętości kultury Agrobacterium zawierającej 35S-GFP z kulturą Agrobacterium zawierającą 35S- supresor wirusa mozaiki ogórka 2b (CMV2b), przypuszczalny efektor lub pusty wektor (EV).
  2. Ostrożnie i powoli infiltrować zmieszane zawiesiny agrobacterium na bokach abaksjalnych liści N. benthamiana 16c za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej.
  3. Usunąć pozostałą zawiesinę bakteryjną z liści za pomocą wycieraczek do tkanek miękkich i okrążyć brzegi naciekanych plam pisakiem.
  4. Pozostaw naciekane rośliny w komorze wzrostowej w tych samych warunkach wzrostu.
    UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa i zdrowia podczas infiltracji należy nosić okulary ochronne i maskę. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, rękawice powinny być wymieniane lub sterylizowane etanolem między infiltracjami. Zwykle do infiltracji potrzeba co najmniej 1 ml zawiesiny agrobacterium na liść. Do wyciszenia ogólnoustrojowego do infiltracji potrzebne będą co najmniej dwa liście.

5. Analiza obrazowa GFP

  1. Wizualnie wykryj fluorescencję GFP w nowo wyrosłych liściach całych roślin 2 tygodnie po infiltracji (w celu wyciszenia ogólnoustrojowego RNA) lub naciekanych plamach liści 3−4 dpi za pomocą długofalowej lampy ultrafioletowej (UV) bez zbierania liści.
  2. Sfotografuj zebrane rośliny i/lub oderwane liście za pomocą aparatu cyfrowego wyposażonego zarówno w filtry UV, jak i żółte.
    UWAGA: W celu przeprowadzenia testów miejscowego tłumienia wyciszania należy zbadać infiltrowane plamy liści N. benthamiana 16c, natomiast w przypadku ogólnoustrojowej aktywności tłumiącej należy zbadać nowo wyrosłe liście. Aktywność supresji wyciszania RNA może się różnić w zależności od indywidualnych efektorów. Dlatego obserwuj plamy lub liście przez kilka dni, zaczynając od 3 dpi. Użyj CMV2b i EV jako odpowiednio kontroli dodatniej i ujemnej.

6. Analiza Northern blot poziomów mRNA GFP w infiltrowanych liściach

  1. Izolacja całkowitego RNA z tkanki liścia przy użyciu odczynnika do izolacji RNA (tabela materiałów)
    1. Zebrać tkanki liści z naciekanych plastrów N. benthamiana 16c w temperaturze 4−7 dpi, sproszkować w ciekłym azocie na drobny proszek i przenieść proszek do sterylnej probówki o pojemności 2 ml.
    2. Natychmiast dodać odczynnik do izolacji RNA (1 ml/100 mg tkanki) do probówki z próbką w kapturze, energicznie wstrząsnąć do homogenizacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Dodać chloroform (200 μl/1 ml odczynnika izolującego RNA) do każdej probówki w kapturze, wstrząsać energicznie przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwirować homogenat przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść supernatant do nowej probówki wolnej od RNaz i wyrzucić osad. Dodać 0,7 objętości izopropanolu do supernatantu, delikatnie odwrócić kilka razy i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Wytrącić osad RNA przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Wyrzuć supernatant, umyj osad 70% etanolem i wysusz pellet na powietrzu w kapturze. Rozpuść RNA w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), inkubując w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 10-20 min.
  2. Analiza Northern blot poziomu mRNA GFP w naciekanych liściach
    1. Przygotuj 1,2% żel agarozowy denaturujący formaldehyd w 1x buforze do biegania MOPS.
    2. Zmieszać RNA 1:1 z barwnikiem ładującym RNA i dokonać denaturacji przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 10 minut, natychmiast schłodzić zdenaturowane próbki na lodzie przez 1 minutę.
    3. Załadować próbki do żelu i elektroforezy pod napięciem 100 V przez 50 minut, aż RNA zostanie dobrze oddzielone.
    4. Wypłucz żel w 20x buforze soli fizjologiczno-cytrynianowej (SSC) w celu usunięcia formaldehydu i przenieś żel na membranę nylonową przez transfer kapilarny w 20x buforze SSC przez noc. Namocz membranę w 2x SSC i przymocuj RNA do membrany, wystawiając mokrą membranę na sieciowanie UV.
    5. Dodać odpowiednią ilość buforu do hybrydyzacji (10 ml na 100cm2 membrany; Tabela materiałów) w probówce do hybrydyzacji i mieszać w temperaturze 60 °C w piecu do hybrydyzacji.
    6. Umieścić membranę w probówce hybrydyzacyjnej i inkubować przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Rozcieńczyć sondę DNA znakowaną 5'DIG (stężenie końcowe, 50 ng / ml) w roztworze hybrydyzacyjnym zawierającym wstępnie podgrzany bufor hybrydyzacyjny.
    7. Wyrzuć bufor do hybrydyzacji i natychmiast zastąp go wstępnie podgrzanym roztworem hybrydyzacyjnym zawierającym sondę znakowaną DIG. Inkubować blot za pomocą sondy w temperaturze 60 °C przez noc, delikatnie mieszając.
    8. Po hybrydyzacji przemyć membranę dwukrotnie w o rosnącym stopniu rygorystyczności w temperaturze 60 °C przez 20 minut każdy. Delikatnie przetrzyj membranę, aby usunąć dodatkowy bufor płuczący i dodaj odczynniki zgodnie z sugestią w zestawie do hybrydyzacji i wykrywania chemiluminescencyjnego (tabela materiałów).
    9. Wykrywanie sygnałów hybrydyzowanych w reakcji chemiluminescencyjnej w połączeniu z systemem obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powyżej opisano procedurę krok po kroku ulepszonego testu przesiewowego służącego do oceny aktywności RSS efektorów RxLR P. sojae. Cały eksperyment trwa od 5 do 6 tygodni. Następnie RSS zidentyfikowane w tym teście mogą zostać dalej scharakteryzowane pod kątem funkcji i mechanizmu molekularnego. Jako przykład naszego podejścia wykorzystaliśmy efektor RxLR P. sojae Phytophthora suppressor of RNA silencing 1 (PSR1), który jest wydzielany i dostarczany do komórek gospodarza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyciszanie RNA jest kluczowym mechanizmem obronnym wykorzystywanym przez rośliny do zwalczania patogenów wirusowych, bakteryjnych, lęgniowców i grzybów. Z kolei te drobnoustroje wyewoluowały białka supresorowe wyciszające, aby przeciwdziałać wyciszaniu przeciwwirusowemu, a te RSS zakłócają różne etapy szlaku wyciszania RNA 22,23. Opracowano kilka testów przesiewowych w celu identyfikacji RSS10.

W tym miejscu opi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z "Programu Shuguang" Fundacji Rozwoju Edukacji w Szanghaju i Miejskiej Komisji Edukacji w Szanghaju, Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2018YFD0201500), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31571696 i 31660510), Programu Tysiąca Talentów dla Młodych Profesjonalistów z Chin, oraz Komisja Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (18DZ2260500).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES)Biofroxx1086GR500Bufor
2xTaq Master MixVazyme BiotechP112-AAPCR
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)Amresco0264C507-1KGBufor MOPS
Acetosyringon (AS)Sigma-AldrichD134406-5GIndukcja agaru
AgrobacteriumSigma-AldrichA1296-1KGLB medium
AgaroseBiofroxx1110GR100Elektroforeza
Amersham Hybond -N+GE HealthcareRPN303 BNothern blot
Amersham ImagerGE HealthcareAmersham Imager 600Image
Bacto TryptoneBD Biosciences211705LB
medium Ekstrakcjadrożdży BactoBD Biosciences212750LB średni
aparatfotograficzny NikonD5100Fotografia
ChemiDoc MP System obrazowaniaBio-Rad
Moduł detekcji chemiluminescencyjnej składnik zestawów DafaThermo Fisher Scientific89880Detekcja luminescencji
ChloramfenikolAmresco0230-100GAntybiotyki
Jednoetapowy zestaw do klonowania ClonExpress IIVazyme BiotechC112-01Podwiązanie
DIG Easy HybSigma-Aldrich11603558001Bufor hybrydyzacyjny
Easypure Plasmid Miniprep ZestawTransGen BiotechEM101-02Ekstrakcja plazmidu
EasyPure Zestaw do szybkiej ekstrakcji żeluTransGen BiotechEG101-02Ekstrakcja żelem
Sól disodowa EDTA dwuwodnaAmresco/VWR0105-1KGMOPS
Elektroforeza buforowa ZasilaczLiuYiDYY6DElektroforeza kwasów nukleinowych.
FastDigest EcoRVThermo Fisher ScientificFD0304Żel do trawienia wektorowego
System obrazowaniaTanonTanon3500Obraz
GentamycynaAmresco0304-5GAntybiotyki
Siarczan KanamycynySigma-AldrichK1914Antybiotyki
LR Enzym Klonaza IIInvitrogen11791020reakcja
LRNitroceluloza Błona bibułkowa 0,45umGE Healthcare10600002Northern
NORTH2south zestaw do losowego znakowania biotyny prime DNAThermo Fisher Scientific17075Znakowanie biotyny
PCR TermocykleryBio-RadT100PCR
Mech torfowyPINDSTRUPCiemne złoto + glinaRośliny
Peters Nawóz rozpuszczalny w wodzieICEPeter Profesjonalny nawóz 20-20-20
Phanta Max Super-Fidelity Polimeraza DNAVazyme BiotechP505-d1Enzym
RyfampicynaMP Biomedicals219549005Antybiotyki
Żel RNA Barwnik ładujący (2X)Thermo Fisher ScientificR0641Barwnik ładujący żel RNA
Hydrat octanu soduAmresco/VWR0530-1KGBufor
Chlorek soduAmresco0241-10KGLB średni
Cytrynian trójsodowyAmresco0101-1KGSSC Bufor
Trizol OdczynnikInvitrogen15596018Odczynnik do izolacji RNA
Lampa UVAnalytik JenaUVP B-100APObserwacja
UVP Hybrilinker OvenAnalytik JenaOV2000Północny
MOPS

Bibliografia

  1. Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
  2. Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
  3. Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
  4. Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
  5. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
  6. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
  7. Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
  8. Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
  9. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
  10. Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
  11. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
  12. Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
  13. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  14. Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
  15. Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
  16. Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
  17. Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
  18. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
  19. Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
  20. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
  21. Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
  22. Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
  23. Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
  24. Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Efektory patogen w ro lintest ko infiltracjidetekcja fluorescencji GFPanaliza Northern blotinfiltracja AgrobacteriumNicotiana benthamianaregulacja g sto ci optycznejtest wyciszania systemowegoprzesiew bia ek efektorowych
Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.