Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

Summary

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Abstract

Zrozumienie transportu, dyspersji i osadzania mikroorganizmów w porowatych ośrodkach to złożone zadanie naukowe obejmujące tak różnorodne tematy jak hydrodynamika, ekologia i inżynieria środowiska. Modelowanie transportu bakterii w porowatych środowiskach w różnych skalach przestrzennych ma kluczowe znaczenie dla lepszego przewidywania konsekwencji transportu bakterii, jednak obecne modele często nie są w stanie zwiększyć skali z warunków laboratoryjnych do terenowych. W tym miejscu przedstawiamy narzędzia eksperymentalne do badania transportu bakterii w ośrodkach porowatych w dwóch skalach przestrzennych. Celem tych narzędzi jest uzyskanie makroskopowych obserwabli (takich jak krzywe przełomu czy profile osadzania) bakterii wstrzykniętych do przezroczystych porowatych matryc. W małej skali (10-1000 μm) urządzenia mikroprzepływowe są łączone z optyczną wideomikroskopią i przetwarzaniem obrazu w celu uzyskania przełomowych krzywych i jednoczesnego śledzenia poszczególnych komórek bakteryjnych w skali porów. Na większą skalę cytometria przepływowa jest łączona z samodzielnie wykonanym zrobotyzowanym dozownikiem w celu uzyskania krzywych przełomowych. Ilustrujemy przydatność tych narzędzi, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób bakterie są transportowane w złożonych porowatych ośrodkach, takich jak strefa hiporeiczna strumieni. Ponieważ narzędzia te zapewniają jednoczesne pomiary w różnych skalach, torują drogę dla modeli opartych na mechanizmach, co ma kluczowe znaczenie dla skalowania. Zastosowanie tych narzędzi może nie tylko przyczynić się do rozwoju nowatorskich zastosowań bioremediacji, ale także rzucić nowe światło na strategie ekologiczne mikroorganizmów kolonizujących porowate podłoża.

Introduction

Badania mające na celu zrozumienie transportu mikroorganizmów przez porowate media były głównie napędzane obawami o zanieczyszczenie¹, przenoszenie chorób² i bioremediacja³. W związku z tym bakterie były w większości traktowane jako cząstki w modelach transportowych⁴, a procesy takie jak filtracja, odcedzanie, grawitacyjne osiadanie lub remobilizacja z biofilmów zostały zidentyfikowane jako czynniki powodujące zatrzymywanie lub transport drobnoustrojów⁵. Jednak badanie transportu bakterii przez porowate krajobrazy może również dostarczyć nam informacji na temat strategii ekologicznych leżących u podstaw ich sukcesu w tych złożonych środowiskach. Wymaga to jednak nowatorskich eksperymentów i modeli matematycznych działających na poziomie pojedynczej komórki, populacji lub społeczności drobnoustrojów.

Naturalne porowate środowiska, takie jak te znajdujące się w strefie hiporeicznej strumieni i rzek, są gęsto skolonizowane przez różne społeczności mikrobów tworzących biofilm⁶. Biofilmy tworzą struktury, które modyfikują przepływ, a tym samym transport i dyspersję bakterii w fazie ciekłej^7,8. Transport bakterii w skali porów zależy od ograniczonej dostępności przestrzeni w porowatej matrycy, a dyspersja związana z ruchliwością może być skutecznym sposobem na zwiększenie indywidualnej sprawności poprzez zmniejszenie konkurencji o zasoby na mniej zaludnionych obszarach. Z drugiej strony, ruchliwe bakterie mogą również docierać do bardziej izolowanych obszarów porowatej matrycy, a rozszerzona eksploracja takich obszarów może zapewnić możliwości ekologiczne dla ruchliwych populacji¹⁰. W większych skalach przestrzennych wzrost biofilmu zmienia ścieżki przepływu, prowadząc również do (częściowego) zatkania porów, a tym samym do powstania jeszcze bardziej skanalizowanych i niejednorodnych warunków przepływu¹¹. Ma to wpływ na zaopatrzenie w składniki odżywcze i zdolność ich dyspersji, częstotliwość i odległość. Na przykład przepływ preferencyjny może generować tak zwane "szybkie ścieżki", a ruchliwe bakterie mogą osiągać nawet większe prędkości niż przepływ lokalny wzdłuż tych ścieżek¹². Jest to skuteczny sposób na zwiększenie eksploracji nowych siedlisk.

Do badania transportu ruchliwych i nieruchliwych bakterii (i cząstek) w porowatych ośrodkach dostępne są różne narzędzia. Modele numeryczne mają duże możliwości predykcyjne, które są ważne dla aplikacji, jednak często są ograniczone przez nieodłączne założenia⁴. Eksperymenty na skalę laboratoryjną^{13, 14} w połączeniu z modelowaniem krzywej przełomu (BTC) dostarczyły ważnych informacji na temat znaczenia właściwości powierzchni komórek bakteryjnych dla skuteczności przyklejania¹⁵. Zazwyczaj BTC (tj. szeregi czasowe stężenia cząstek w ustalonym miejscu) uzyskuje się poprzez uwalnianie o stałej szybkości i pomiar liczby komórek na wylocie z urządzenia eksperymentalnego. W tym kontekście, BTC odzwierciedlają dynamikę adwekcji-dyspersji bakterii w porowatej matrycy i mogą być rozszerzone o termin zlewu uwzględniający przywiązanie. Jednak samo modelowanie BTC nie rozwiązuje kwestii roli organizacji przestrzennej porowatego podłoża lub biofilmu w procesach transportowych. Udowodniono, że inne makroskopowe obserwable, takie jak profile dyspersyjności lub osadzania, dostarczają ważnych informacji na temat rozkładu przestrzennego, zatrzymanych cząstek lub rosnących społeczności. Mikrofluidyka to technologia, która umożliwia badanie transportu w ośrodkach porowatych za pomocą badania mikroskopowego^9,12,16, a z wyjątkiem najnowszej klasy work10, systemy eksperymentalne są zazwyczaj ograniczone do jednej skali rozdzielczości długości, czyli skali porów lub całej skali urządzenia fluidycznego.

Tutaj przedstawiamy zestaw połączonych metod do badania transportu ruchliwych i nieruchliwych bakterii w porowatych krajobrazach w różnych skalach. Obserwacje transportu bakterii w skali porów łączymy z informacjami w większej skali, za pomocą analizy BTC. Urządzenia mikroprzepływowe zbudowane z miękkiej litografii z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS) są biokompatybilne, odporne na szereg substancji chemicznych, umożliwiają powielanie przy niskich kosztach i zapewniają doskonałą przezroczystość optyczną, a także niską autofluorescencję krytyczną dla obserwacji mikroskopowej. Mikrofluidyka oparta na PDMS była wcześniej wykorzystywana do badania transportu drobnoustrojów w prostych kanałach¹⁷ lub w bardziej złożonych geometriach¹². Jednak zazwyczaj eksperymenty mikrofluidyczne koncentrują się na horyzontach krótkoterminowych, a mikroskopowa obserwacja żywych komórek w epi-fluorescencji jest zwykle ograniczona do szczepów modyfikowanych genetycznie (np. szczepów znakowanych GFP). Prezentujemy tutaj narzędzia do badania transportu bakterii za pomocą urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS w połączeniu z mikroskopią oraz większych urządzeń wytwarzanych z poli(metakrylanu metylu) (PMMA, znanego również jako pleksi) w połączeniu z cytometrią przepływową. PDMS i PMMA różnią się przepuszczalnością gazów i właściwościami powierzchniowymi, zapewniając tym samym uzupełniające się możliwości badania transportu bakterii. Podczas gdy urządzenie mikroprzepływowe zapewnia bardziej kontrolowane środowisko, większe urządzenie pozwala na eksperymentowanie przez dłuższy czas lub przy użyciu naturalnych społeczności bakteryjnych. Zliczanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości czasowej w dedykowanym obszarze służy do uzyskania BTC w urządzeniu mikroprzepływowym opartym na PDMS. Aby uzyskać liczbę komórek do modelowania BTC z urządzenia opartego na PMMA, wprowadzamy samodzielnie skonstruowany automatyczny dozownik cieczy w połączeniu z cytometrią przepływową. W tej konfiguracji komórki przechodzą przez urządzenie fluidyczne i są kolejno dozowane do 96-dołkowych płytek. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona przez minimalną objętość, którą można dokładnie dozować, a tym samym natężenie przepływu medium przez urządzenie fluidyczne. Utrwalacz w studzienkach zapobiega wzrostowi i ułatwia barwienie DNA w celu wyliczenia metodą cytometrii przepływowej. Aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas eksperymentów transportowych, używamy minimalnej pożywki (zwanej buforem ruchliwości).

Ponieważ protokoły przygotowania urządzeń płynowych w różnych skalach są łatwo dostępne, tylko pokrótce przedstawiamy techniki produkcji takich urządzeń i skupiamy się raczej na procedurach eksperymentalnych do rejestrowania BTC. Podobnie istnieją różne procedury oznaczania liczby drobnoustrojów metodą cytometrii przepływowej, a użytkownicy potrzebują wiedzy specjalistycznej, aby zinterpretować wyniki uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej. Informujemy o nowatorskim zastosowaniu urządzeń mikroprzepływowych w połączeniu z obrazowaniem mikroskopowym do rejestrowania BTC komórek znakowanych fluorescencyjnie. W skali porów lokalne prędkości i trajektorie uzyskuje się za pomocą przetwarzania obrazu. Ponadto demonstrujemy zastosowanie urządzenia fluidycznego na bazie PMMA w połączeniu ze zliczaniem cytometrycznym przepływowym do obserwacji transportu bakteryjnego ruchliwych i nieruchliwych komórek w porowatych środowiskach skolonizowanych przez natywny biofilm strumieniowy.

Protocol

1. Warunki hodowli bakterii

1. Pracując pod okapem z przepływem laminarnym, użyj 100 μl glicerolu Pseudomonas putida KT2440 znakowanego GFP (1 × 10^{7 mL-1}, przechowywanego w temperaturze -80 °C) do zaszczepienia 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB). Inkubować w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez noc.
2. Następnego dnia ponownie zamieszać 100 μl kultury przez noc w pożywce o pojemności 5 ml LB i inkubować w tych samych warunkach przez 5 godzin (faza wykładnicza). Pobrać próbkę podwielokrotności o pojemności 1 ml do probówki o pojemności 2 ml, pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej (~15 min) i odwirować (2300 x g przez 5 minut).
3. Usunąć supernatant i dodać 1 ml buforu ruchliwości do osadu. Krótko zawirować, aby homogenizować próbkę. Rozcieńczyć do osiągnięcia pożądanego stężenia komórek, np. 5 x 10^{5 mL-1}.
4. W przypadku eksperymentów z udziałem zbiorowisk naturalnych, takich jak te pochodzące ze strumieni, należy przygotować nieselektywne podłoże uprawowe. Na przykład użyj sterylnie przefiltrowanej i autoklawizowanej wody strumieniowej lub sztucznego strumienia wodnego wzbogaconego złożonym źródłem węgla (pożywka LB).

2. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego z polidimetylosiloksanu (PDMS)

1. Zaprojektuj żądaną geometrię porowatą za pomocą oprogramowania do rysowania wspomaganego komputerowo (CAD) ¹⁸, która składa się z macierzy okręgów (czyli nieprzepuszczalnej przeszkody dla przepływu), opisanej rozmiarem promienia i współrzędnymi środka.
   UWAGA: Przykład porowatej geometrii z losowymi rozmiarami ziarna i porów znajduje się w Rysunek 1A. Kanał obserwacyjny bez przeszkód w pobliżu wylotu ułatwia pozyskiwanie BTC.
2. Na podstawie wybranej geometrii przygotuj formę, korzystając ze standardowej SU-8-photolithography¹⁸.
   UWAGA: Alternatywnie formy można również zamówić w dedykowanym zakładzie mikrofabrykacji. Aby uzyskać niejednorodny przepływ płynu w płaszczyźnie poziomej, ważne jest zaprojektowanie grubości komory mikroprzepływowej tego samego rzędu wielkości, co średnia wielkość gardzieli porów. Należy jednak upewnić się, że wymiary urządzenia mikroprzepływowego są odpowiednie do obserwacji pod mikroskopem (np. praca na szkiełkach mikroskopowych).
3. Przygotować 50 g PDMS, dodając 10% środka sieciującego (dimetylo, metylowodorosiloksan) do 90% wagowo elastomeru, używając strzykawki bez igły. Pracuj w czystych warunkach i w miarę możliwości unikaj kurzu. Wymieszaj oba odczynniki w czystym jednorazowym pojemniku i zastosuj próżnię (100 mbar) przez 30 minut, aby usunąć rozpuszczone powietrze i pęcherzyki z lepkiego PDMS.
4. Umieść formę na szalce Petriego (100 mm średnicy, 15 mm wysokości). Wlej PDMS na formę na żądaną wysokość (np. 2-5 mm). Przykryj szalkę Petriego i trzymaj ją w temperaturze 60 °C przez 4 godziny (przez noc w przypadku grubszych warstw) do utwardzenia.
   UWAGA: Do celów wizualizacji światło powinno być w stanie przejść przez PDMS, dlatego pożądana jest cienka warstwa od 2 mm do 5 mm. Grubsze warstwy (>5 mm) zmniejszają przezroczystość urządzenia, a cieńsze ulegają odkształceniom podczas aplikacji.
5. Wyjmij formę z piekarnika i pozwól urządzeniu mikroprzepływowemu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po schłodzeniu ostrożnie usuń żądaną porcję PDMS za pomocą skalpela.
   UWAGA: Silne naciski na formę powodują pęknięcia formy. Nie dotykaj PDMS gołymi rękami, ponieważ odciski palców wpłyną na przezroczystość optyczną.
6. Tymczasowo uszczelnij dolną część kanału PDMS (w którym wygrawerowano żądaną geometrię) taśmą. Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 0,5 mm przebij kanał mikroprzepływowy, aby utworzyć wlot i wylot pasujący do rurki o średnicy 0,5 mm (średnica wewnętrzna).
   UWAGA: Miękka natura PDMS zapewni szczelność po włożeniu rurki. Kanały wlotowe i wylotowe nie mogą być wykonane po uszczelnieniu PDMS do szyby.
7. Uszczelnij kanał mikroprzepływowy za pomocą wiązania plazmą tlenową za pomocą generatora wysokiej częstotliwości (spajacz plazmowy, tabela materiałów). W tym celu wyczyść szkiełko krzemianowe (25 mm x 75 mm) etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Usuń taśmę z kanału PDMS i umieść kanał porowatą stroną do góry. Szkiełko krzemianowe i powierzchnie PDMS należy traktować plazmą przez około 45 s w temperaturze pokojowej.
8. Umieść kanał PDMS na szkiełku krzemianowym i podgrzewaj w temperaturze 100 °C przez 30 minut na płycie grzejnej.
9. Wyjmij urządzenie mikroprzepływowe z płyty grzejnej i ostudź je do temperatury pokojowej. Podłącz wlot kanału PDMS do wężyka. Zastosuj podciśnienie przez 30 minut, aby usunąć powietrze z PDMS, które jest prawie nieprzepuszczalne dla płynów, ale przepuszczalne dla gazu.
10. Przygotować 100 ml buforu do pomiaru ruchliwości (10 mM fosforanu potasu, 0,1 mM EDTA, uzupełnionego 1% w/v glukozy, pH 7,0) i wstrzyknąć 1 ml do urządzenia mikroprzepływowego za pomocą pompy strzykawkowej pracującej przy 10 μL ^min-1,
    UWAGA: Ponieważ PDMS jest niedostatecznie nasycony gazem (ze względu na poprzedni etap próżni), pęcherzyki znikną w ciągu ~30 minut.

3. Przygotowanie urządzenia fluidycznego z poli(metakrylanu metylu)

1. Zaprojektuj żądaną geometrię za pomocą oprogramowania CAD. W razie potrzeby upewnij się, że wymiary są odpowiednie do obserwacji pod mikroskopem (np. wymiary standardowej płytki 96-dołkowej w połączeniu z odpowiednim uchwytem). Urządzenie fluidyczne składa się z podstawy (127 × 127 × 12 mm) i pokrywy (127 × 127 × 12 mm) z PMMA.
   UWAGA: Zalecana jest wiedza specjalistyczna z oprogramowaniem CAD. Przykładowy rysunek techniczny znajduje się w Rysunek 1A.
2. Aby wytworzyć przedział porów, za pomocą precyzyjnego mikrofrezowania (WF31SA, Mikron), należy usunąć 0,5 mm z dolnej warstwy PMMA i wyfrezować rowek (1,1 × 1,1 mm) na gumowy O-ring. Wywierć 12 otworów gwintowanych (M5). Będzie to służyć jako podstawa urządzenia fluidycznego.
   UWAGA: Wymiary urządzenia fluidycznego należy dostosować tak, aby pasowało do stolika mikroskopu i odległości ogniskowej. Rysunek techniczny znajduje się na rysunku S1.
3. Wywierć dwa gwintowane otwory (typ 1/4-28UNF) do wlotu i wylotu w górnej części urządzenia fluidycznego oraz 12 otworów (5.5 mm) na. Będzie to służyć jako pokrywa urządzenia fluidycznego.
   UWAGA: Wskazana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mikromielenia; Autorzy korzystają ze wsparcia specjalistycznego warsztatu.
4. W celu wyczyszczenia i wysterylizowania urządzenia fluidycznego przed i po każdym użyciu, należy namoczyć podstawę i pokrywę urządzenia fluidycznego w HCl 7% i spłukać trzykrotnie wodą dejonizowaną.
5. Przykręć ze sobą podstawę i pokrywę za pomocą 12 gwintowanych otworów.

4. Konfiguracja automatycznego dozownika

UWAGA: Dostępne na rynku dozowniki płynów są kosztowne i często nie oferują elastyczności w bezpośrednim dozowaniu z odpływu urządzenia do płynów. Dlatego zaleca się montaż taniego i elastycznego zrobotyzowanego systemu dozującego z robota plotera XY (tabela materiałów).

1. Aby dozować odpływ z urządzenia fluidycznego do 96-dołkowych płytek, należy zamontować zrobotyzowany dozownik na płytce PMMA i wnękach młyna o wymiarach 85,8 x 128 mm i głębokości 1 mm, aby pomieścić kilka płytek 96-dołkowych.
2. Przymocuj rurkę odpływową urządzenia fluidycznego do ramienia robota dozownika.
3. Aby obsługiwać zrobotyzowany dozownik, pobierz bCNC z github: https://github.com/vlachoudis/bCNC i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zainstalować program.
4. Pobierz dispenser.py z materiałów pomocniczych tego artykułu.
   UWAGA: Ten kod Pythona zawiera wtyczkę do bCNC dla prostego układu dozownika robota.
5. Podłącz zrobotyzowany dozownik do komputera z uruchomionym bCNC i zidentyfikuj właściwy port COM.
6. W bCNC kliknij przycisk home, aby przywrócić automatyczny dozownik do pozycji wyjściowej.
   UWAGA: Bazowanie przywraca zrobotyzowany dozownik do znanej pozycji (x=0, y=0), a tym samym poprawia dokładność dozownika.
7. Przed eksperymentem należy przygotować wystarczającą liczbę 96 płytek dołkowych, przy czym studzienki zawierają odpowiednią ilość utrwalacza (np. końcowe stężenie 3,7% formaldehydu).
   UWAGA: Na przykład, przy natężeniu przepływu 0,2 ml ^min-1, 100 μl jest dozowane do każdej studzienki co 30 s. Dlatego dodaj 10 μl 37% formaldehydu do każdej studzienki, aby osiągnąć końcowe stężenie formaldehydu między 2 a 4%. Użycie ośmiu płytek 96-dołkowych pozwoli na prowadzenie eksperymentu przez ponad 6 godzin z łączną liczbą 768 punktów danych. Ponadto należy pamiętać, że komórki znakowane GFP mogą stracić sygnał fluorescencyjny po utrwaleniu za pomocą formaldehydu.

5. Analizuj transport bakterii za pomocą urządzeń mikroprzepływowych PDMS

1. Umieścić urządzenie mikroprzepływowe PDMS uprzednio nasycone buforem ruchliwości na stoliku mikroskopu. Użyj taśmy do zamocowania rurki, aby zminimalizować zakłócenia przepływu podczas ruchu sceny.
2. Przesuń stolik mikroskopu do kanału obserwacyjnego w pobliżu wylotu. Korzystając z mikroskopii jasnego pola lub kontrastu fazowego, skup się na środku kanału obserwacyjnego i dostosuj powiększenie, aby uwidocznić poszczególne komórki bakteryjne.
3. Przełącz ustawienia ścieżki światła na mikroskopię fluorescencyjną i dostosuj czas ekspozycji kamery tak, aby rozdzielić pojedyncze komórki bakteryjne (np. 100 ms) lub tak, aby sygnały fluorescencyjne komórek były co najmniej 3 razy silniejsze niż szum tła.
4. Następnie włożyć rurkę wlotową do probówki o pojemności 2 ml zawierającej zawiesinę bakteryjną. Odwrócić kierunek pompy i rozpocząć pobieranie zawiesiny przy natężeniu przepływu 1 μl ^min-1.
5. Skanuj przekrój poprzeczny całego kanału obserwacyjnego, rejestrując złożony obraz co 2 minuty, przez cały czas trwania eksperymentu.

6. Podstawowe przetwarzanie obrazu

UWAGA: Celem tych podstawowych procedur przetwarzania obrazów jest zliczenie liczby bakterii w zarejestrowanych obrazach. Optymalne procedury przetwarzania zależą od specyfikacji technicznych mikroskopu i kamery, a także od właściwości fluorescencyjnych szczepu bakteryjnego użytego w eksperymencie i dlatego muszą zostać dostosowane.

1. Najpierw eksportuj obrazy w formacie .tiff.
2. Importuj obrazy do żądanej platformy programowej (np. MATLAB, ImageJ, R lub Python).
3. Usuń szum aparatu, który jest losową zmianą intensywności pikseli na obrazach, i skoryguj aberrację optyczną. Można to zrobić, stosując filtr Gaussa do każdego zdjęcia: rozmiar filtra zależy od jakości matrycy aparatu (np. CCD lub CMOS). Aberrację optyczną można usunąć, normalizując każdy obraz za pomocą obrazu referencyjnego zebranego pod nieobecność próbki o tej samej konfiguracji optycznej.
4. Przytnij obrazy do obszaru zainteresowania.
5. Zidentyfikuj wartość progową (intensywność pikseli), tak aby wartości powyżej progu obejmowały komórki bakteryjne.
   UWAGA: W przypadku, gdy obrazy są nierównomiernie oświetlone (z powodu aberracji optycznej lub szumów), przydatne może być zastosowanie progu adaptacyjnego, który wybiera wartość progową na podstawie lokalnych średnich intensywności.
6. Od każdego obrazu odejmij próg zdefiniowany powyżej.
7. Binarnie wynikowy obraz w taki sposób, aby komórki bakteryjne przyjmowały wartość 1, podczas gdy tło przyjmuje wartość 0.
8. Usuń skupiska o powierzchni mniejszej niż najmniejszy rozmiar komórki bakteryjnej.
9. Zsumuj binaryzowany obraz, aby uzyskać łączną liczbę pikseli pozostałych klastrów. Podziel liczbę pikseli przez średni rozmiar (w pikselach) komórki bakteryjnej: pozwala to oszacować całkowitą liczbę komórek.
10. Znając głębię widzenia i obszar badania, przekształć liczby w stężenie (cząstki ^mL-1).
11. Zasadnicze znaczenie ma określenie stężenia wstrzykniętej zawiesiny bakterii. W tym celu należy wstrzyknąć strzykawką 1 ml zawiesiny kultur bakterii do kanału obserwacyjnego czystego urządzenia mikroprzepływowego. Zapisz obraz i oblicz stężenie bakterii dopływających (C₀) zgodnie z powyższym opisem (6.1 do 6.10).
12. Analizuj BTC, normalizując stężenie bakterii w ściekach (C) ze stężeniem bakterii wpływających (C₀) i wykreśl C/C₀ w funkcji czasu.

7. Analizuj transport bakterii w skali porów

1. Aby przeanalizować lokalne prędkości i trajektorie bakterii transportowanych przez porowatą matrycę, należy przesunąć stolik mikroskopu do obszaru zainteresowania i ustawić ostrość na środku urządzenia mikroprzepływowego.
2. Ustaw mikroskop na jasne pole lub kontrast fazowy.
   UWAGA: Tylko w przypadku, gdy sygnał fluorescencyjny komórki bakteryjnej nie pozwala na rejestrowanie obrazów w czasie ekspozycji krótszym niż średni czas bakteryjny, w przeciwnym razie należy użyć mikroskopii fluorescencyjnej.
3. Nagrywaj obrazy poklatkowe w czasie ekspozycji, który rejestruje przemieszczenie bakterii (krótsze niż średnie przemieszczenie na liczbę pikseli mniejszą niż rozmiar obiektu) i optymalizuje wykrywanie komórek bakteryjnych (np. ekspozycja 20 ms i obrazy rejestrowane co 50 ms). Rejestruj zdjęcia przez wystarczająco dużo czasu, aby zarejestrować wystarczającą ilość (aby być statystycznie reprezentatywnym) najwolniejszych trajektorii (np. 3 minut).
   UWAGA: Upewnij się, że na dysku komputera jest wystarczająca ilość miejsca.
4. Aby usunąć szum tła, odejmij od każdego obrazu średnią ze wszystkich zarejestrowanych obrazów. Aby to zrobić, utwórz matrycę, której wynikiem jest suma intensywności wszystkich obrazów dla każdego piksela i podziel ją przez liczbę obrazów.
5. Na podstawie przetworzonego obrazu (Im) określ moduł gradientu numerycznego i znormalizuj go o maksymalną wartość (max), zgodnie z poniższą definicją.
   
   
6. Binaryzuj macierz B za pomocą progowania intensywności, patrz kroki 6.7-6.8.
7. Dla każdego punktu czasowego zapisz współrzędne bakterii (x, y w pikselach lub mm) i czas pozyskania obrazu w pliku trzykolumnowym.
8. Na koniec zastosuj skrypt śledzenia cząstek, aby przetworzyć zarejestrowane dane i obliczyć trajektorie bakterii. Na przykład użyj ustalonego protocol¹⁹ i swobodnie dostępnego kodu śledzenia cząstek Matlab: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).

8. Badanie filtracji bakteryjnej za pomocą profili osadzania

1. Aby uzyskać profile osadzania komórek P. putida KT2440 znakowanych GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy zarejestrować złożony obraz całego kanału porowatego przed, czyli tłem i po wstrzyknięciu zawiesiny bakteryjnej przez urządzenie mikroprzepływowe. Należy użyć czasu naświetlania, który pozwala na uzyskanie bakteryjnego sygnału fluorescencyjnego (np. 100 ms), bez wybielania sygnału.
2. Eksportuj obrazy i importuj na żądaną platformę oprogramowania (patrz 6.1-6.2).
3. Usuń tło z obrazów zarejestrowanych po wstrzyknięciu bakterii.
4. Zintegruj całkowity sygnał fluorescencyjny zatrzymanych bakterii wzdłuż poprzecznych odcinków porowatego kanału.
5. Aby obliczyć profil osadzania, należy wykreślić zintegrowany sygnał kwiatescencji w funkcji długości kanału porowatego.

9. Analizuj transport bakterii za pomocą urządzeń przepływowych PMMA i cytometrii przepływowej

1. Podłączyć pompę perystaltyczną do wlotu za pomocą rurki o średnicy 50 cm (1 mm średnicy wewnętrznej), a odpływ z automatycznym dozownikiem za pomocą tej samej rurki (50 cm, patrz rozdział 4).
   UWAGA: Użyj pompy do dozowania pożywki hodowlanej i wstrzykiwania komórek bakteryjnych. Użyj złączy Luer-lock i zaworów trójdrogowych, aby przełączać się między zawiesiną pożywki a zawiesiną bakteryjną podczas uwalniania ze stałą szybkością.
2. Pompować podłoże uprawowe w urządzeniu fluidycznym. Zwróć uwagę na dotarcie medium do rurki wylotowej przymocowanej do dozownika automatycznego.
3. Rozpocząć wstrzykiwanie zawiesiny bakteryjnej przez urządzenie fluidyczne PMMA przy natężeniu przepływu 0,2 ml ^min-1,
4. Gdy bakterie dotrą do wlotu urządzenia fluidycznego, włącz automatyczny dozownik.
5. W celu wykonania iniekcji impulsowej należy wstrzyknąć zawiesinę bakteryjną na pewną objętość porów (np. 30), a następnie zmienić iniekcję na podłoże hodowlane do końca eksperymentu.
   UWAGA: objętość porów urządzenia fluidycznego wynosi około 0,2 ml, a zatem przy zamierzonym natężeniu przepływu co minutę wymieniana jest jedna cała objętość porów.
6. Po sporządzeniu płytki 96-dołkowej należy ją przykryć w celu zmniejszenia parowania i przechowywać w temperaturze 4 °C.
7. Analizuj liczebność bakterii za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z ustalonymi protokołami²⁰.
   UWAGA: Na przykład dodaj 25 μl barwienia kwasem nukleinowym o zielonej fluorescencji (tabela materiałów) w temperaturze 0,025 mM (w wodzie ultraczystej) do każdej studzienki. Barwiąc DNA bakterii, umożliwiając w ten sposób ilościowe określenie liczebności bakterii za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki inkubować przez 15 minut w ciemności, a następnie analizować za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 488 nm i detektory o długości fali 515 nm.
8. Przed analizą BTC należy rozważyć rozcieńczenie próbki spowodowane dodaniem utrwalacza i barwienia. Skoryguj liczebność bakterii o współczynnik 1,35, aby uwzględnić utrwalacz i plamy.

Results

Aby zilustrować funkcjonalność prezentowanego przepływu pracy, przeprowadziliśmy eksperymenty z użyciem genetycznie zmodyfikowanej Pseudomonas putida KT2440, gram-ujemnej bakterii ruchliwej, ważnej dla bioremediacji i biotechnologii. Genetycznie zmodyfikowane wersje tego szczepu, które wyrażają produkcję GFP, są dostępne na rynku. Dostępny jest również nieruchliwy szczep P. putida KT2440, który nie ma odpowiednich genów strukturalnych i regulatorowych dla ruchliwości. Uż...

Discussion

W tym miejscu proponujemy dwa sposoby badania transportu drobnoustrojów przez porowate systemy na poziomie pojedynczej komórki i populacji. Chociaż badanie zjawisk transportowych przy użyciu modelowania BTC dostarczyło cennych informacji na temat rozprzestrzeniania się patogenów lub zanieczyszczeń w skali ekosystemu, nadal istnieją trudności z przejściem od eksperymentów laboratoryjnych do warunków terenowych. Opisane tu narzędzia pozwalają naukowcom na eksperymentalne rozdzielenie skali przestrzennej i czasowej w celu l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Cytometr przepływowy NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB bulion	BD
Dozownik płynów, zestaw robota do plotera XY	makeblock
Mikroskop Axio Imager	Mikroskop Zeiss
AxioZoom v16	Szkiełka mikroskopowe
, 75 mm i razy 25 mm	Pompa
Minipuls 3	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Fosforan potasu	Sigma
Pompa strzykawkowa New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Zielone fluorescencyjne sondy molekularne do barwienia kwasami nukleinowymi	Invitrogen
Tygon	Frezarka uniwersalna Ismatec
WF31SA	Mikron