Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60701

⸱

25 listopada 2020

 ,  ,  , 
1Stream Biofilm and Ecosystem Research Laboratory, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2Institute of Earth Sciences, University of Lausanne, CH-1015

W tym artykule

Podsumowanie

Krzywe przełomu (BTC) są skutecznymi narzędziami do badania transportu bakterii w porowatych mediach. Tutaj przedstawiamy narzędzia oparte na urządzeniach fluidycznych w połączeniu z mikroskopią i zliczaniem metodą cytometrii przepływowej w celu uzyskania BTC.

Streszczenie

Zrozumienie transportu, dyspersji i osadzania mikroorganizmów w porowatych ośrodkach to złożone zadanie naukowe obejmujące tak różnorodne tematy jak hydrodynamika, ekologia i inżynieria środowiska. Modelowanie transportu bakterii w porowatych środowiskach w różnych skalach przestrzennych ma kluczowe znaczenie dla lepszego przewidywania konsekwencji transportu bakterii, jednak obecne modele często nie są w stanie zwiększyć skali z warunków laboratoryjnych do terenowych. W tym miejscu przedstawiamy narzędzia eksperymentalne do badania transportu bakterii w ośrodkach porowatych w dwóch skalach przestrzennych. Celem tych narzędzi jest uzyskanie makroskopowych obserwabli (takich jak krzywe przełomu czy profile osadzania) bakterii wstrzykniętych do przezroczystych porowatych matryc. W małej skali (10-1000 μm) urządzenia mikroprzepływowe są łączone z optyczną wideomikroskopią i przetwarzaniem obrazu w celu uzyskania przełomowych krzywych i jednoczesnego śledzenia poszczególnych komórek bakteryjnych w skali porów. Na większą skalę cytometria przepływowa jest łączona z samodzielnie wykonanym zrobotyzowanym dozownikiem w celu uzyskania krzywych przełomowych. Ilustrujemy przydatność tych narzędzi, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób bakterie są transportowane w złożonych porowatych ośrodkach, takich jak strefa hiporeiczna strumieni. Ponieważ narzędzia te zapewniają jednoczesne pomiary w różnych skalach, torują drogę dla modeli opartych na mechanizmach, co ma kluczowe znaczenie dla skalowania. Zastosowanie tych narzędzi może nie tylko przyczynić się do rozwoju nowatorskich zastosowań bioremediacji, ale także rzucić nowe światło na strategie ekologiczne mikroorganizmów kolonizujących porowate podłoża.

Wprowadzenie

Badania mające na celu zrozumienie transportu mikroorganizmów przez porowate media były głównie napędzane obawami o zanieczyszczenie1, przenoszenie chorób2 i bioremediacja3. W związku z tym bakterie były w większości traktowane jako cząstki w modelach transportowych4, a procesy takie jak filtracja, odcedzanie, grawitacyjne osiadanie lub remobilizacja z biofilmów zostały zidentyfikowane jako czynniki powodujące zatrzymywanie lub transport drobnoustrojów5. Jednak badanie transportu bakterii przez porowate krajobrazy może również dostarczyć nam informacji na temat strategii ekologicznych leżących u podstaw ich sukcesu w tych złożonych środowiskach. Wymaga to jednak nowatorskich eksperymentów i modeli matematycznych działających na poziomie pojedynczej komórki, populacji lub społeczności drobnoustrojów.

Naturalne porowate środowiska, takie jak te znajdujące się w strefie hiporeicznej strumieni i rzek, są gęsto skolonizowane przez różne społeczności mikrobów tworzących biofilm6. Biofilmy tworzą struktury, które modyfikują przepływ, a tym samym transport i dyspersję bakterii w fazie ciekłej7,8. Transport bakterii w skali porów zależy od ograniczonej dostępności przestrzeni w porowatej matrycy, a dyspersja związana z ruchliwością może być skutecznym sposobem na zwiększenie indywidualnej sprawności poprzez zmniejszenie konkurencji o zasoby na mniej zaludnionych obszarach. Z drugiej strony, ruchliwe bakterie mogą również docierać do bardziej izolowanych obszarów porowatej matrycy, a rozszerzona eksploracja takich obszarów może zapewnić możliwości ekologiczne dla ruchliwych populacji10. W większych skalach przestrzennych wzrost biofilmu zmienia ścieżki przepływu, prowadząc również do (częściowego) zatkania porów, a tym samym do powstania jeszcze bardziej skanalizowanych i niejednorodnych warunków przepływu11. Ma to wpływ na zaopatrzenie w składniki odżywcze i zdolność ich dyspersji, częstotliwość i odległość. Na przykład przepływ preferencyjny może generować tak zwane "szybkie ścieżki", a ruchliwe bakterie mogą osiągać nawet większe prędkości niż przepływ lokalny wzdłuż tych ścieżek12. Jest to skuteczny sposób na zwiększenie eksploracji nowych siedlisk.

Do badania transportu ruchliwych i nieruchliwych bakterii (i cząstek) w porowatych ośrodkach dostępne są różne narzędzia. Modele numeryczne mają duże możliwości predykcyjne, które są ważne dla aplikacji, jednak często są ograniczone przez nieodłączne założenia4. Eksperymenty na skalę laboratoryjną13, 14 w połączeniu z modelowaniem krzywej przełomu (BTC) dostarczyły ważnych informacji na temat znaczenia właściwości powierzchni komórek bakteryjnych dla skuteczności przyklejania15. Zazwyczaj BTC (tj. szeregi czasowe stężenia cząstek w ustalonym miejscu) uzyskuje się poprzez uwalnianie o stałej szybkości i pomiar liczby komórek na wylocie z urządzenia eksperymentalnego. W tym kontekście, BTC odzwierciedlają dynamikę adwekcji-dyspersji bakterii w porowatej matrycy i mogą być rozszerzone o termin zlewu uwzględniający przywiązanie. Jednak samo modelowanie BTC nie rozwiązuje kwestii roli organizacji przestrzennej porowatego podłoża lub biofilmu w procesach transportowych. Udowodniono, że inne makroskopowe obserwable, takie jak profile dyspersyjności lub osadzania, dostarczają ważnych informacji na temat rozkładu przestrzennego, zatrzymanych cząstek lub rosnących społeczności. Mikrofluidyka to technologia, która umożliwia badanie transportu w ośrodkach porowatych za pomocą badania mikroskopowego9,12,16, a z wyjątkiem najnowszej klasy work10, systemy eksperymentalne są zazwyczaj ograniczone do jednej skali rozdzielczości długości, czyli skali porów lub całej skali urządzenia fluidycznego.

Tutaj przedstawiamy zestaw połączonych metod do badania transportu ruchliwych i nieruchliwych bakterii w porowatych krajobrazach w różnych skalach. Obserwacje transportu bakterii w skali porów łączymy z informacjami w większej skali, za pomocą analizy BTC. Urządzenia mikroprzepływowe zbudowane z miękkiej litografii z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS) są biokompatybilne, odporne na szereg substancji chemicznych, umożliwiają powielanie przy niskich kosztach i zapewniają doskonałą przezroczystość optyczną, a także niską autofluorescencję krytyczną dla obserwacji mikroskopowej. Mikrofluidyka oparta na PDMS była wcześniej wykorzystywana do badania transportu drobnoustrojów w prostych kanałach17 lub w bardziej złożonych geometriach12. Jednak zazwyczaj eksperymenty mikrofluidyczne koncentrują się na horyzontach krótkoterminowych, a mikroskopowa obserwacja żywych komórek w epi-fluorescencji jest zwykle ograniczona do szczepów modyfikowanych genetycznie (np. szczepów znakowanych GFP). Prezentujemy tutaj narzędzia do badania transportu bakterii za pomocą urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS w połączeniu z mikroskopią oraz większych urządzeń wytwarzanych z poli(metakrylanu metylu) (PMMA, znanego również jako pleksi) w połączeniu z cytometrią przepływową. PDMS i PMMA różnią się przepuszczalnością gazów i właściwościami powierzchniowymi, zapewniając tym samym uzupełniające się możliwości badania transportu bakterii. Podczas gdy urządzenie mikroprzepływowe zapewnia bardziej kontrolowane środowisko, większe urządzenie pozwala na eksperymentowanie przez dłuższy czas lub przy użyciu naturalnych społeczności bakteryjnych. Zliczanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości czasowej w dedykowanym obszarze służy do uzyskania BTC w urządzeniu mikroprzepływowym opartym na PDMS. Aby uzyskać liczbę komórek do modelowania BTC z urządzenia opartego na PMMA, wprowadzamy samodzielnie skonstruowany automatyczny dozownik cieczy w połączeniu z cytometrią przepływową. W tej konfiguracji komórki przechodzą przez urządzenie fluidyczne i są kolejno dozowane do 96-dołkowych płytek. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona przez minimalną objętość, którą można dokładnie dozować, a tym samym natężenie przepływu medium przez urządzenie fluidyczne. Utrwalacz w studzienkach zapobiega wzrostowi i ułatwia barwienie DNA w celu wyliczenia metodą cytometrii przepływowej. Aby zapobiec rozwojowi bakterii podczas eksperymentów transportowych, używamy minimalnej pożywki (zwanej buforem ruchliwości).

Ponieważ protokoły przygotowania urządzeń płynowych w różnych skalach są łatwo dostępne, tylko pokrótce przedstawiamy techniki produkcji takich urządzeń i skupiamy się raczej na procedurach eksperymentalnych do rejestrowania BTC. Podobnie istnieją różne procedury oznaczania liczby drobnoustrojów metodą cytometrii przepływowej, a użytkownicy potrzebują wiedzy specjalistycznej, aby zinterpretować wyniki uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej. Informujemy o nowatorskim zastosowaniu urządzeń mikroprzepływowych w połączeniu z obrazowaniem mikroskopowym do rejestrowania BTC komórek znakowanych fluorescencyjnie. W skali porów lokalne prędkości i trajektorie uzyskuje się za pomocą przetwarzania obrazu. Ponadto demonstrujemy zastosowanie urządzenia fluidycznego na bazie PMMA w połączeniu ze zliczaniem cytometrycznym przepływowym do obserwacji transportu bakteryjnego ruchliwych i nieruchliwych komórek w porowatych środowiskach skolonizowanych przez natywny biofilm strumieniowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Warunki hodowli bakterii

  1. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy użyć 10 μL zapasu w glicerolu Pseudomonas putida KT240 z tagiem GFP (1 × 107 mL-1, przechowywanego w -80 °C) do zaszczepienia 5 mL pożywki Luria-Bertani (LB). Inkubować w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm przez noc.
  2. Następnego dnia 10 μL nocnej kultury resuspender w 5 mL pożywki LB i inkubować w tych samych warunkach przez 5 h (faza wykładnicza). Pobrać 1 mL alikwotu do probówki o pojemności 2 mL, pozwolić mu ostygnąć do temperatury pokojowej (~15 min), a następnie odwirować (230 x g przez 5 min).
  3. Usunąć supernatant i dodać 1 mL buforu do badania motywności do osadu. Krótko wymieszać na vortexie w celu homogenizacji próbki. Rozcieńczyć do uzyskania pożądanej koncentracji komórek, np. 5 x 105 mL-1.
  4. W przypadku eksperymentów z udziałem społeczności naturalnych, np. pochodzących ze strumieni, należy przygotować nieselektywną pożywkę hodowlaną. Można zastosować np. sterylnie filtrowaną i autoklawowaną wodę strumieniową lub sztuczną pożywkę wody strumieniowej wzbogaconą o złożone źródło węgla (pożywka LB).

2. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego z polidimetylosiloksanu (PDMS)

  1. Zaprojektuj pożądaną geometrię porowatą za pomocą oprogramowania do wspomaganego komputerowo projektowania (CAD)18, która składa się z macierzy okręgów (stanowiących nieprzepuszczalne przeszkody dla przepływu), opisanych za pomocą promienia oraz współrzędnych środków.
    UWAGA: Przykład geometrii porowatej z randomizowanymi rozmiarami ziaren i porów przedstawiono na Rysunku 1A. Kanał obserwacyjny bez przeszkód w pobliżu wylotu ułatwia pozyskiwanie krzywych przełamania (BTC).
  2. Na podstawie wybranej geometrii przygotuj formę, stosując standardową fotolitografię SU-818.
    UWAGA: Alternatywnie formy można zamówić w wyspecjalizowanej pracowni mikrofabrykacji. Aby uzyskać niejednorodny przepływ płynu w płaszczyźnie poziomej, ważne jest zaprojektowanie grubości komory mikroprzepływowej o tej samej rzędowości co średnia wielkość gardła porów. Należy jednak upewnić się, że wymiary urządzenia mikroprzepływowego są odpowiednie do obserwacji pod mikroskopem (np. praca na szkiełkach przedmiotowych).
  3. Przygotuj 50 g PDMS, dodając 10% czynnika sieciującego (kopolimer dimetylu i wodorometylosiloksanu) do 90% elastomeru (procenty masowe), używając strzykawki bez igły. Pracuj w warunkach czystych i maksymalnie unikaj zapylenia. Wymieszaj oba odczynniki w czystym jednorazowym pojemniku i zastosuj próżnię (10 mbar) przez 30 min, aby usunąć rozpuszczone powietrze i pęcherzyki z lepkiego PDMS.
  4. Umieść formę w szalce Petriego (średnica 10 mm, wysokość 15 mm). Wlej PDMS na formę do pożądanej wysokości (np. 2-5 mm). Przykryj szalkę Petriego i utrzymaj w temperaturze 60 °C przez 4 h (lub przez noc w przypadku grubszych warstw), aby utwardzić materiał.
    UWAGA: W celu wizualizacji światło powinno być w stanie przenikać przez PDMS, dlatego pożądana jest cienka warstwa od 2 mm do 5 mm. Grubsze warstwy (>5 mm) zmniejszają przezroczystość urządzenia, a cieńsze są podatne na deformacje podczas aplikacji.
  5. Wyjmij formę z piekarnika i pozwól urządzeniu mikroprzepływowemu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu ostrożnie wytnij pożądaną część PDMS skalpelem.
    UWAGA: Zbyt silny nacisk na formę powoduje jej pękanie. Nie dotykaj PDMS gołymi rękami, ponieważ odciski palców wpłyną na przezroczystość optyczną.
  6. Tymczasowo zabezpiecz dno kanału PDMS (w którym wygrawerowano pożądaną geometrię) taśmą. Za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 0,5 mm przebij kanał mikroprzepływowy, aby stworzyć wlot i wylot pasujące do drenów o średnicy wewnętrznej 0,5 mm.
    UWAGA: Miękka natura PDMS zapewni szczelność po włożeniu drenów. Kanałów wlotowych i wylotowych nie można wykonać po uszczelnieniu PDMS do szkła.
  7. Uszczelnij kanał mikroprzepływowy poprzez wiązanie plazmą tlenową, używając generatora wysokiej częstotliwości (bonder plazmowy, Tabela Materiałów). W tym celu oczyść szkiełko z krzemionkowego szkła (25 mm x 75 mm) etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Usuń taśmę z kanału PDMS i ułóż kanał stroną porowatą do góry. Poddaj powierzchnie szkiełka krzemionkowego i PDMS działaniu plazmy przez około 45 s w temperaturze pokojowej.
  8. Połóż kanał PDMS na szkiełku krzemionkowym i podgrzej w temperaturze 10 °C przez 30 min na płycie grzejnej.
  9. Zdejmij urządzenie mikroprzepływowe z płyty grzejnej i ostudź do temperatury pokojowej. Połącz wlot kanału PDMS z drenem. Zastosuj próżnię przez 30 min, aby usunąć powietrze z PDMS, który jest niemal nieprzepuszczalny dla płynów, ale przepuszczalny dla gazów.
  10. Przygotuj 10 mL buforu do badania motylości (10 mM fosforanu potasu, 0,1 mM EDTA, uzupełniony o 1% w/v glukozy, pH 7,0) i wstrzyknij 1 mL do urządzenia mikroprzepływowego za pomocą pompy strzykawkowej pracującej z prędkością 10 µL min-1.
    UWAGA: Ponieważ PDMS jest niedasycowany w gazie (ze względu na poprzedni etap próżniowy), pęcherzyki znikną w ciągu ok. 30 min.

3. Przygotowanie urządzenia mikrofluidycznego z poli(metakrylanu metylu)

  1. Zaprojektuj pożądaną geometrię w oprogramowaniu CAD. Jeśli dotyczy, upewnij się, że wymiary są odpowiednie do obserwacji pod mikroskopem (np. wymiary standardowej płytki 96-dołkowej w połączeniu z odpowiednim uchwytem). Urządzenie mikroprzepływowe składa się z podstawy (127 × 127 × 12 mm) oraz pokrywy (127 × 127 × 12 mm) wykonanych z PMMA.
    UWAGA: Zaleca się biegłość w obsłudze oprogramowania CAD. Przykładowy rysunek techniczny znajduje się na Rysunku 1A.
  2. Aby stworzyć komorę z porami, za pomocą precyzyjnego mikrofrezowania (WF31SA, Mikron), usuń 0,5 mm z dolnej warstwy PMMA i wyfrezuj rowek (1,1 × 1,1 mm) na gumowy o-ring. Nawierć 12 otworów gwintowanych (M5). Element ten będzie służył jako podstawa urządzenia mikroprzepływowego.
    UWAGA: Wymiary urządzenia mikroprzepływowego muszą zostać dostosowane do stolika mikroskopu i odległości ogniskowej. Rysunek techniczny znajduje się na Rysunku S1.
  3. Nawierć w górnej części urządzenia mikroprzepływowego dwa otwory gwintowane (typ 1/4-28UNF) dla wlotu i wylotu oraz 12 otworów (5,5 mm) na śruby. Element ten będzie służył jako pokrywa urządzenia mikroprzepływowego.
    UWAGA: Zaleca się doświadczenie w zakresie mikrofrezowania; autorzy korzystali ze wsparcia wyspecjalizowanego warsztatu.
  4. W celu czyszczenia i sterylizacji urządzenia mikroprzepływowego przed i po każdym użyciu, zanurz podstawę i pokrywę urządzenia w 7% HCl, a następnie trzykrotnie przepłucz wodą dejonizowaną.
  5. Skręć podstawę z pokrywą, używając 12 otworów gwintowanych.

4. Konfiguracja automatycznego dozownika

UWAGA: Dostępne w handlu dozowniki cieczy są kosztowne i często nie oferują możliwości bezpośredniego dozowania z odpływu urządzenia fluidycznego. Dlatego zaleca się montaż taniego i elastycznego robotycznego systemu dozującego w oparciu o robota typu XY Plotter (Tabela materiałów).

  1. Aby dozować wypływ z urządzenia płynowego do płytek 96-dołkowych, zamontuj robotyczny dozownik na płycie PMMA i wyfrezuj otwory o wymiarach 85,8 x 128 mm i głębokości 1 mm, aby pomieścić kilka płytek 96-dołkowych.
  2. Podłącz rurkę odpływową urządzenia płynowego do ramienia robotycznego dozownika.
  3. Aby obsłużyć robotyczny dozownik, pobierz program bCNC z github: https://github.com/vlachoudis/bCNC i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji programu.
  4. Pobierz plik dispenser.py z materiałów uzupełniających do niniejszego artykułu.
    UWAGA: Ten kod python dostarcza wtyczkę do bCNC dla prostego układu robotycznego dozownika.
  5. Podłącz robotyczny dozownik do komputera z uruchomionym programem bCNC i zidentyfikuj właściwy port COM.
  6. W programie bCNC kliknij przycisk home, aby zwrócić robotyczny dozownik do pozycji domyślnej.
    UWAGA: Procedura homingu przywraca robotyczny dozownik do znanej pozycji (x=0, y=0), co zwiększa dokładność dozownika.
  7. Przed eksperymentem przygotuj odpowiednią liczbę płytek 96-dołkowych, w których dołki zawierają właściwą ilość utrwalacza (np. stężenie końcowe 3,7% formaldehydu).
    UWAGA: Na przykład, przy szybkości przepływu 0,2 mL min-1, co 30 s do każdego dołka dozowane jest 10 µL. Dlatego do każdego dołka należy dodać 10 µL 37% formaldehydu, aby uzyskać końcowe stężenie formaldehydu między 2 a 4%. Użycie ośmiu płytek 96-dołkowych pozwoli na prowadzenie eksperymentu przez ponad 6 h, co da łącznie 768 punktów danych. Ponadto należy pamiętać, że komórki znakowane GFP mogą utracić sygnał fluorescencyjny po utrwaleniu formaldehydem.

5. Analiza transportu bakterii z wykorzystaniem urządzeń mikroprzepływowych z PDMS

  1. Umieść urządzenie mikroprzepływowe z PDMS, uprzednio nasycone buforem do badań motywności, na stole mikroskopu. Użyj taśmy do przymocowania rurek, aby zminimalizować zakłócenia przepływu podczas przemieszczania stołu.
  2. Przesuń stół mikroskopu do kanału obserwacyjnego w pobliżu wylotu. Korzystając z mikroskopii w polu jasnym lub kontrastowej, ustaw ostrość na środek kanału obserwacyjnego i dostosuj powiększenie tak, aby widoczne były pojedyncze komórki bakteryjne.
  3. Zmień ustawienia ścieżki światła na mikroskopię fluorescencyjną i dostosuj czas ekspozycji kamery w celu rozdzielenia pojedynczych komórek bakteryjnych (np. 10 ms) lub tak, aby sygnały fluorescencyjne komórek były co najmniej 3x silniejsze niż szum tła.
  4. Następnie wprowadź rurkę wlotową do probówki o pojemności 2 mL zawierającej zawiesinę bakteryjną. Zmień kierunek pompowania i zacznij pobierać zawiesinę z szybkością przepływu 1 µL min-1.
  5. Skanuj przekrój całego kanału obserwacyjnego, rejestrując obraz kompozytowy co 2 min przez cały czas trwania eksperymentu.

6. Podstawy przetwarzania obrazu

UWAGA: Celem tych podstawowych rutyn przetwarzania obrazu jest obliczenie liczby bakterii na zarejestrowanych obrazach. Optymalne procedury przetwarzania zależą od specyfikacji technicznej mikroskopu i kamery, a także od właściwości fluorescencyjnych szczepu bakteryjnego użytego w eksperymencie, a zatem wymagają one odpowiedniego dostosowania.

  1. Najpierw wyeksportuj obrazy w formacie .tiff.
  2. Zaimportuj obrazy do wybranej platformy programistycznej (np. MATLAB, ImageJ, R lub Python).
  3. Usuń szum kamery, który jest losową zmiennością intensywności pikseli w obrazach, oraz skoryguj aberrację optyczną. Można to zrobić, stosując filtr Gaussa do każdego zdjęcia: rozmiar filtra zależy od jakości matrycy kamery (np. CCD lub CMOS). Aberrację optyczną można usunąć poprzez normalizację każdego zdjęcia za pomocą obrazu referencyjnego, wykonanego bez próbki przy tej samej konfiguracji optycznej.
  4. Wytnij z obrazów obszar zainteresowania.
  5. Wyznacz wartość progową (intensywność piksela), tak aby wartości powyżej progu odpowiadały komórkom bakteryjnym.
    UWAGA: W przypadku nierównomiernego oświetlenia obrazów (z powodu aberracji optycznej lub szumu) pomocne może być zastosowanie progu adaptacyjnego, który dobiera wartość progu na podstawie lokalnych średnich intensywności.
  6. Odejmij od każdego zdjęcia zdefiniowany powyżej próg.
  7. Zbinaryzuj otrzymany obraz w taki sposób, aby komórki bakteryjne przyjęły wartość 1, a tło wartość 0.
  8. Usuń klastry o powierzchni mniejszej niż rozmiar najmniejszej komórki bakteryjnej.
  9. Zsumuj zbinaryzowany obraz, aby uzyskać całkowitą liczbę pikseli pozostałych klastrów. Podziel liczbę pikseli przez średnią wielkość (w pikselach) komórki bakteryjnej: pozwoli to na oszacowanie całkowitej liczby komórek.
  10. Znając głębokość ostrości oraz obszar badania, przelicz liczbę komórek na stężenie (cząstki mL-1).
  11. Kluczowe jest określenie stężenia wstrzykniętej zawiesiny bakterii. W tym celu wstrzyknij strzykawką 1 mL zawiesiny kultury bakterii do kanału obserwacyjnego czystego urządzenia mikroprzepływowego. Zapisz obraz i oblicz stężenie bakterii w dopływie (C0) zgodnie z powyższym opisem (punkty 6.1 do 6.10).
  12. Przeanalizuj krzywe przełomu (BTC), normalizując stężenie bakterii w odpływie (C) względem stężenia bakterii w dopływie (C0), a następnie wykreśl zależność C/C0 od czasu.

7. Analiza transportu bakterii w skali porów

  1. Aby przeanalizować lokalne prędkości i trajektorie bakterii transportowanych przez matrycę porowatą, przesuń stolik mikroskopu do obszaru zainteresowania i ustaw ostrość na środek urządzenia mikrofluidycznego.
  2. Ustaw mikroskop w trybie jasnego pola lub kontrastu fazowego.
    UWAGA: Stosować wyłącznie w przypadku, gdy sygnał fluorescencyjny komórek bakteryjnych nie pozwala na rejestrację obrazów przy czasie ekspozycji krótszym niż średni czas ruchu bakterii; w przeciwnym razie należy zastosować mikroskopię fluorescencyjną.
  3. Rejestruj obrazy w trybie poklatkowym, stosując czas ekspozycji umożliwiający uchwycenie przemieszczenia się bakterii (krótszy niż średnie przemieszczenie obejmujące liczbę pikseli mniejszą niż rozmiar obiektu) oraz optymalizujący detekcję komórek bakteryjnych (np. ekspozycja 20 ms i obrazy rejestrowane co 50 ms). Rejestruj obrazy przez wystarczająco długi czas, aby utrwalić statystycznie reprezentatywną liczbę najwolniejszych trajektorii (np. 3 min).
    UWAGA: Należy upewnić się, że komputer posiada wystarczającą ilość miejsca na dysku.
  4. Aby usunąć szum tła, należy od każdego obrazu odjąć średnią ze wszystkich zarejestrowanych obrazów. W tym celu należy utworzyć macierz będącą sumą intensywności wszystkich obrazów dla każdego piksela, a następnie podzielić ją przez liczbę obrazów.
  5. Z przetworzonego obrazu (Im) wyznacz moduł gradientu numerycznego Symbol nabla, równanie części urojonej, koncepcja rachunku wektorowego. i znormalizować ją przez jej wartość maksymalną (maks.), zgodnie z poniższą definicją.
    Wzór na wektor gradientu, ∇A, pochodne cząstkowe, pojęcie matematyczne, równanie rachunku wektorowego. 
    Równanie równowagi statycznej B=sqrt((∂A/∂x)²+(∂A/∂y)²)/max do analizy matematycznej.
  6. Zbinaryzuj macierz B poprzez progowanie intensywności, patrz kroki 6.7-6.8.
  7. Dla każdego punktu czasowego zapisz współrzędne bakterii (x, y w pikselach lub mm) oraz czas wykonania zdjęcia w pliku trzykolumnowym.
  8. Na koniec zastosuj skrypt do śledzenia cząsteczek w celu przetworzenia zarejestrowanych danych i obliczenia trajektorii bakterii. Można w tym celu wykorzystać uznany protokół19or z ogólnodostępnego kodu Matlab do śledzenia cząstek (Particle Tracking Code): (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/). 

8. Badanie filtracji bakterii za pomocą profili osadzania

  1. Aby uzyskać profile depozycji komórek P. putida KT2440 znakowanych GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy zarejestrować kompozytowy obraz całego kanału porowatego przed wstrzyknięciem zawiesiny bakteryjnej przez urządzenie mikroprzepływowe (tło) oraz po jego wstrzyknięciu. Należy zastosować czas ekspozycji pozwalający na zarejestrowanie fluorescencyjnego sygnału bakterii (np. 10 ms), który nie spowoduje wybielenia sygnału.
  2. Wyeksportuj obrazy i zaimportuj je do wybranej platformy programowej (patrz 6.1-6.2).
  3. Usuń tło z obrazów zarejestrowanych po wstrzyknięciu bakterii.
  4. Zintegruj całkowity sygnał fluorescencji zatrzymanych bakterii wzdłuż przekrojów poprzecznych kanału porowatego.
  5. W celu obliczenia profilu depozycji, wykreśl zintegrowany sygnał fluorescencji w funkcji długości kanału porowatego.

9. Analiza transportu bakterii z wykorzystaniem mikroprzepływowych urządzeń z PMMA i cytometrii przepływowej

  1. Połącz pompę perystaltyczną z wlotem za pomocą wężyka o długości 50 cm (średnica wewnętrzna 1 mm), a wylot z automatycznym dozownikiem za pomocą takiego samego wężyka (50 cm, patrz sekcja 4).
    UWAGA: Pompy należy używać do dozowania pożywki hodowlanej oraz do wstrzykiwania komórek bakteryjnych. Użyj złączy Luer-lock i zaworów trójdrożnych, aby przełączać się między pożywką a zawiesiną bakteryjną podczas uwalniania ze stałą prędkością.
  2. Przepompuj pożywkę hodowlaną przez urządzenie mikroprzepływowe. Zwróć uwagę na dotarcie pożywki do wężyka wylotowego przymocowanego do robota dozującego.
  3. Zacznij wstrzykiwać zawiesinę bakteryjną przez urządzenie mikroprzepływowe z PMMA z prędkością przepływu 0,2 mL min-1,
  4. Gdy bakterie dotrą do wlotu urządzenia mikroprzepływowego, włącz automatyczny dozownik.
  5. Aby wykonać wtrysk impulsowy, wstrzykuj zawiesinę bakteryjną przez określoną liczbę objętości porów (np. 30), a następnie przełącz wtryskiwanie na pożywkę hodowlaną aż do zakończenia eksperymentu.
    UWAGA: Objętość porów urządzenia mikroprzepływowego wynosi około 0,2 mL, zatem przy proponowanej prędkości przepływu w każdej minucie wymieniana jest jedna pełna objętość porów.
  6. Po wypełnieniu płytki 96-dołkowej przykryj ją, aby ograniczyć parowanie, i przechowuj w temperaturze 4 °C.
  7. Przeanalizuj liczebność bakterii za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z ustalonymi protokołami20.
    UWAGA: Na przykład dodaj do każdego dołka 25 µL zielono-fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych (Tabela materiałów) w stężeniu 0,025 mM (w wodzie ultrapurej). Barwnik ten barwi bakteryjne DNA, umożliwiając ilościowe określenie liczebności bakterii za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki inkubuj przez 15 min w ciemności, a następnie przeanalizuj za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser 48 nm i detektory przy 515 nm.
  8. Przed analizą BTC weź pod uwagę rozcieńczenie próbki wynikające z dodania utrwalacza i barwnika. Skoryguj liczebność bakterii o współczynnik 1,35, aby uwzględnić utrwalacz i barwnik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować funkcjonalność przedstawionego schematu działania, przeprowadziliśmy eksperymenty z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych bakterii Pseudomonas putida KT240, będących gram-ujemnymi, ruchliwymi bakteriami o dużym znaczeniu dla bioremediacji i biotechnologii. Komercyjnie dostępne są genetycznie zmodyfikowane wersje tego szczepu wykazujące produkcję GFP. Dostępny jest również nieruchliwy szczep P. putida KT240, któremu brakuje odpowiednich genów struktur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu proponujemy dwa sposoby badania transportu drobnoustrojów przez porowate systemy na poziomie pojedynczej komórki i populacji. Chociaż badanie zjawisk transportowych przy użyciu modelowania BTC dostarczyło cennych informacji na temat rozprzestrzeniania się patogenów lub zanieczyszczeń w skali ekosystemu, nadal istnieją trudności z przejściem od eksperymentów laboratoryjnych do warunków terenowych. Opisane tu narzędzia pozwalają naukowcom na eksperymentalne rozdzielenie skali przestrzennej i czasowej w celu l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Antoine'owi Wiedmerowi za pomoc w konfiguracji automatycznego dozownika i skryptu dispenser.py.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EDTASigma
Elastomer Sylgard 184Dowsil101697
Cytometr przepływowy NovoCyteAcea
GlucoseSigmahttps://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB bulionBD
Dozownik płynów, zestaw robota do plotera XYmakeblock
Mikroskop Axio ImagerMikroskop Zeiss
AxioZoom v16Szkiełka mikroskopowe
, 75 mm i razy 25 mmPompa
Minipuls 3Gilson
Plasma bonder Corona SBBlackHole Lab
Fosforan potasuSigma
Pompa strzykawkowa New Era NE 4000New Era
Syto 13 Zielone fluorescencyjne sondy molekularne do barwienia kwasami nukleinowymiInvitrogen
TygonFrezarka uniwersalna Ismatec
WF31SAMikron
Zeiss perystaltyczna Corning , rurki

Bibliografia

  1. Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
  2. Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
  3. Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
  4. Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
  5. Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
  6. Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
  7. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
  8. Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
  9. Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075(2019).
  10. Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046(2020).
  11. Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
  12. Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102(2019).
  13. Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
  14. Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
  15. Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
  16. Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
  17. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
  18. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
  19. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
  20. del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transport bakteriiurz dzenia mikroprzep ywowemikroskopia optycznaprzetwarzanie obrazukrzywe prze omuskala por wautomatyczny dozownikwytwarzanie z PDMS
Połączenie urządzeń fluidycznych z mikroskopią i cytometrią przepływową w celu badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych w skalach przestrzennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.