Artykuł metodologiczny

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

DOI:

10.3791/60712

⸱

25 stycznia 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi", INGM

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym pytaniem w biologii komórki jest organizacja genomu w przestrzeni jądrowej i jak architektura chromatyny może wpływać na procesy takie jak ekspresja genów, tożsamość komórki i różnicowanie. Wiele podejść opracowanych do badania architektury 3D genomu można podzielić na dwie uzupełniające się kategorie: technologie oparte na konformacji chromosomów (technologie C) i obrazowanie. Podczas gdy pierwsza z nich opiera się na uchwyceniu konformacji chromosomów i interakcji proksymalnego DNA w populacji stałych komórek, druga, oparta na fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (FISH) na jądrach zakonserwowanych w 3D, umożliwia współczesną wizualizację wielu loci na poziomie jednej komórki (wielokolorowej), badając ich interakcje i rozmieszczenie w jądrze (3D multicolor DNA FISH). Technika 3D wielokolorowego DNA FISH ma ograniczenie polegające na wizualizacji tylko kilku z góry określonych loci, co nie pozwala na kompleksową analizę architektury jądrowej. Jednak biorąc pod uwagę solidność wyników, wielokolorowe DNA 3D FISH w połączeniu z mikroskopią 3D i rekonstrukcją obrazu jest możliwą metodą walidacji wyników opartych na technologii C oraz jednoznacznego badania położenia i organizacji określonych loci na poziomie pojedynczej komórki. Tutaj proponujemy krok po kroku metodę 3D wielokolorowego DNA FISH, odpowiednią dla szerokiej gamy ludzkich komórek pierwotnych i omawiamy wszystkie praktyczne działania, kluczowe kroki, pojęcia obrazowania 3D i analizę danych potrzebnych do uzyskania udanego i pouczającego wielokolorowego DNA 3D FISH w różnych kontekstach biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyższe eukarionty muszą systematycznie kondensować i kompaktować ogromną ilość informacji genetycznej w maleńkiej przestrzeni 3D jądra1,2,3,4. Dziś wiemy, że genom jest przestrzennie uporządkowany w przedziałach i topologicznie powiązanych domenach5 i że wiele poziomów fałdowania DNA generuje kontakty między różnymi regionami genomu, które mogą obejmować tworzenie pętli chromatyny6,7. Dynamiczna pętla chromatyny 3D może wpływać na wiele różnych procesów biologicznych, takich jak transkrypcja8,9, różnicowanie i rozwój10,11, naprawa DNA12,13, podczas gdy jego perturbacje są związane z różnymi chorobami14,15,16 i wady rozwojowe15,17,18.

Opracowano wiele podejść do badania organizacji genomu 3D. Technologie oparte na wychwytywaniu konformacji chromosomów (technologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C i pochodne) zostały opracowane w celu badania organizacji genomu w komórkach stałych3,4,19,20. Takie podejścia opierają się na zdolności do uchwycenia częstotliwości kontaktu między loci genomu w fizycznej bliskości. Technologie C, w zależności od ich złożoności, wychwytują globalną organizację genomu 3D i topologię jądrową populacji komórek3,4,19,20. Niemniej jednak, interakcje 3D są dynamiczne w czasie i przestrzeni, bardzo zmienne między poszczególnymi komórkami składającymi się z interakcji multipleksowych i są bardzo heterogeniczne21,22.

3D wielokolorowa fluorescencyjna fluorescencyjna DNA hybrydyzacja in situ (FISH) to technika, która pozwala na wizualizację specyficznych loci genomowych na poziomie pojedynczej komórki, umożliwiając bezpośrednie badanie architektury jądrowej 3D w sposób komplementarny do technologii C. Jest to technologia stosowana obecnie do jednoznacznej walidacji wyników C-scores. Wielokolorowe DNA 3D FISH wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie sondy uzupełniające genomowe loci będące przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie różnych fluoroforów i odpowiedniego sprzętu mikroskopowego pozwala na współczesną wizualizację wielu celów w przestrzeni jądrowej23,24. W ostatnich latach FISH został połączony z postępem technologicznym w mikroskopii w celu uzyskania wizualizacji struktur o drobnej skali w wysokiej rozdzielczości25,26 lub z podejściami CRISPR-Cas do wizualizacji kwasów nukleinowych w obrazowaniu na żywo27,28. Pomimo szerokiego zastosowania, podejście 3D multicolor DNA FISH jest nadal uważane za trudne w wielu laboratoriach, ponieważ używany materiał biologiczny musi zostać dostosowany.

Tutaj oferujemy kompleksowy protokół dla 3D wielokolorowego DNA FISH (od przygotowania komórki/sondy do analizy danych) mający zastosowanie do szerokiego zakresu ludzkich komórek pierwotnych, umożliwiając wizualizację wielu loci genomowych i zachowanie struktury 3D jąder. Aby badać architekturę jądrową, musi zostać zachowana trójwymiarowa struktura jąder. Z tego powodu, w przeciwieństwie do innych istniejących protokołów29,30,31, unikamy stosowania gradientu alkoholowego i przechowywania szkiełek nakrywkowych w alkoholu, które mogą wpływać na strukturę chromatyny32. Metoda jest zaadaptowana z zachowanych protokołów 3D DNA FISH 24,33 do zastosowania do szerokiej gamy ludzkich komórek pierwotnych, zarówno izolowanych ex vivo, jak i hodowanych in vitro. Istnieją parametry przenikania i deproteinizacji dla różnych morfologii jądra i cech cytologicznych (np. różne stopnie zagęszczenia jądra, obfitość cytoszkieletu)34. Parametry te są często ogólnie opisane w innych protokołach24,33, bez wyraźnego rozróżnienia procedury w różnych typach komórek. Ponadto opracowaliśmy specjalne narzędzie o nazwie NuCLεD (nuclear contacts locator in 3D)16, dostarczające zasad analizy danych, które poprawią bliskość 3D między różnymi loci i ich topologiczną dystrybucję jądrową w przestrzeni jądrowej w zautomatyzowany sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Procedury przygotowania sondy DNA i znakowania z tłumaczeniem nicków

  1. Oczyścić i oczyścić sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC), plazmidy lub produkty PCR za pomocą specjalnych zestawów (tabela materiałów), ponownie zawiesić w ddH2O, sprawdzić elektroforezą na żelu agarozowym i określić ilościowo.
  2. Przeprowadzić translację nacięcia na 1,5−2 μg DNA z kroku 1.1 w końcowej objętości 50 μl, mieszając wszystkie odczynniki w probówce o niskim poziomie wiązania DNA o 0,5 ml zgodnie z tabelą 1.
    UWAGA: Bezpośrednio oznakowane sondy mogą poprawić stosunek sygnału do szumu. Zestawy do produkcji pośrednio i bezpośrednio znakowanych sond z różnymi fluorochromami Alexa metodą translacji nicków są dostępne na rynku.
  3. Inkubować mieszaninę translacji nacięć w mieszalniku termicznym w temperaturze 16 °C przez czas zależny od długości wyjściowego materiału DNA: 45 minut w przypadku produktów PCR (pula produktów PCR po 2 000 pz każdy) i do 4 godzin w przypadku DNA BAC i plazmidów.
  4. Sprawdź rozmiar sond wytworzonych w kroku 1.3 za pomocą elektroforezy na 2,2% żelu agarozowym.
    UWAGA: Optymalny rozmiar sondy to <200 pz (Rysunek 1A).
    1. Jeśli DNA nie jest wystarczająco strawione, dodać 5 U polimerazy DNA I i 0,05 U DNazy I do reakcji i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 16 °C, a następnie ponownie sprawdzić. Zatrzymać reakcję za pomocą 0,5 mM EDTA (stężenie końcowe). Przechowuj sondy w temperaturze -20 °C.
  5. Dla każdego eksperymentu DNA FISH wytrącić następujące ilości sond w zależności od wyjściowego materiału DNA, z którego produkowane są sondy: 200 ng z produktów PCR z translacją nicka, 100 ng z BAC z translacją nicka lub 300 ng z plazmidu z translacją nicka. Dodać ddH2O do 150 μl, 20 μg nieznakowanego DNA plemników łososia, 3,5 μg specyficznego dla gatunku DNA Cot-1, 3 objętości 100% EtOH i 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2. Wytrącać się w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
  6. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyć granulkę dwukrotnie 70% EtOH.
  7. Zawiesić osad w 2 μl 100% formamidu o pH 7,0, wstrząsać w temperaturze 40 °C przez 30 minut (może to potrwać do kilku godzin), a następnie dodać równą objętość 4x cytrynian soli fizjologicznej (SSC)/20% siarczanu dekstranu.
    1. Przygotować 20x SSC, mieszając 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu w końcowej objętości 1 lH2O. Autoklaw, przefiltrować i przygotować podwielokrotności.
      UWAGA: W przypadku wielokolorowych DNA FISH różne sondy mogą być wytrącane razem, z wyjątkiem sond, które mogą wyżarzać się ze sobą. W tych szczególnych przypadkach należy traktować je oddzielnie, wytrącić i ponownie zawiesić sondy, dzieląc odczynniki wymienione w krokach 1.5−1.7 w odniesieniu do liczby sond. Połączyć próbki dopiero po ponownym zawieszeniu w formamidzie. Jeśli używane są szkiełka nakrywkowe o średnicy większej niż 10 mm lub mniejszej niż 10 mm, należy zwiększyć / zmniejszyć objętość odczynników użytych w krokach 1,5−1,7 proporcjonalnie do rozmiaru szkiełka. Sondy hybrydyzacyjne mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez długi czas (do dwóch miesięcy).

2. Utrwalanie komórek, obróbka wstępna i przepuszczalność

UWAGA: Przejścia przepuszczalności i deproteinizacji są kluczowymi krokami. Czas reakcji i stężenie odczynników silnie zależą od typu komórki, obfitości cytoplazmy i morfologii jądra.

  1. Utrwalanie komórek, obróbka wstępna i przepuszczalność ludzkich pierwotnych limfocytów T
    UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla małych komórek, z małymi jądrami i małą ilością cytoplazmy.
    1. Stosować szkiełka nakryte szklane (10 mm, grubość nr 1,5H).
    2. Umyj szklankę z ddH2O, a następnie z 70% EtOH i pozostaw do wyschnięcia. Użyj jednej szklanki na każdy dołek z 24-dołkowej płytki.
    3. Dodaj 200 μl 0,1% poli-L-lizyny (w/v) (tabela materiałów) bezpośrednio na szkło, aby utworzyć kroplę. Zwróć uwagę, ponieważ kropla musi pozostać na szklanej powierzchni bez dotykania studzienki przez 2-5 minut. Ostrożnie wylej kroplę i pozostaw szklankę do wyschnięcia na 30 minut.
    4. Wykonaj krok 2.1.3 jeszcze dwa razy.
    5. Umieścić 200 μl komórek zawiesinowych (2 x 106/ml, zawiesina PBS pierwotnych limfocytów T ex vivo) bezpośrednio na szkle, pozostawić komórki do wysiewu w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.
    6. Szybko usuń kroplę. Dodać świeżo przygotowany 4% PFA (przygotowany w PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7,0, przefiltrowany) przez 10 minut i utrwalić wysiane komórki w temperaturze RT.
    7. Umyć trzykrotnie po 5 minut 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) w temperaturze RT. Filtrować 0,5% TPBS przez 10 minut w temperaturze RT.
    8. Przeprowadzić leczenie RNazą, dodając 2,5 μl koktajlu RNazy (tabela materiałów) do 250 μl PBS/studzienkę na 24-dołkowej płytce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    9. Wypłukać w PBS, dodać 20% glicerolu/PBS i inkubować przez noc (ON) w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ten krok może trwać od 1 godziny do ON. Szkiełka można przechowywać w 20% glicerolu/PBS w temperaturze 4 °C do 7 dni.
    10. Zamrozić na suchym lodzie (15−30 s), stopniowo rozmrażać w temperaturze pokojowej i moczyć w 20% glicerolu/PBS. Powtórz krok 2.1.9 jeszcze trzy razy.
    11. Prać w 0,5% TPBS przez 5 min w RT. Prać w 0,05% TPBS, dwa razy przez 5 min w RT. Inkubować w 0,1 N HCl przez 12 min w RT. Płukać w 2x SSC.
    12. Inkubować w 50% formamidzie o pH 7,0/2x SSC ON w RT.
      UWAGA: Czas inkubacji można zoptymalizować i ostatecznie skrócić. Preparaty można przechowywać w 50% formamidzie/2x SSC przez kilka dni.
  2. Utrwalanie komórek, obróbka wstępna i przepuszczalność ludzkich mioblastów pierwotnych
    UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla dużych komórek z dużą ilością cytoplazmy.
    1. Hoduj ludzkie pierwotne mioblasty bezpośrednio na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach w pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM), 20% płodowa surowica bydlęca (FBS), 25 ng/ml czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), 10 ng/ml naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), 10 μg/ml insuliny ludzkiej, 1x glutamina, 1x penicylina/streptomycyna) przez co najmniej 24 godziny (osiągając 50−70% konfluencji).
      UWAGA: Aby ułatwić przyczepność, żelatynę lub kolagen lub poli-L-lizynę można użyć do pokrycia szkiełka nakrywkowego przed siewem.
    2. Przepłukać komórki w 2−3 zmianach PBS. Dodaj świeżo przygotowane 4% PFA i utrwalaj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Prać trzy razy po 3 minuty w 0,01% TPBS w RT. Przepuszczalnie w 0,5% TPBS przez 10 min w RT.
    4. Przeprowadzić leczenie RNazą, dodając 2,5 μl koktajlu RNazy (tabela materiałów) do 250 μl PBS/studzienkę na 24-dołkowej płytce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    5. Wypłukać w PBS, dodać 20% glicerolu/PBS i inkubować w temperaturze RT.
      UWAGA: Ten krok może trwać od 1 godziny do ON. Szkiełka można przechowywać w 20% glicerolu/PBS w temperaturze 4 °C do 7 dni.
    6. Zamrozić na suchym lodzie (15−30 s), stopniowo rozmrażać w temperaturze pokojowej i moczyć w 20% glicerolu/PBS. Powtórz ten krok trzy razy.
    7. Umyj trzy razy po 10 minut w PBS. Inkubować w 0,1 N HCl przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płukać w 2x SSC.
    8. Inkubować w 50% formamidzie o pH 7,0/2x SSC ON w RT.
      UWAGA: Czas inkubacji można zoptymalizować i ostatecznie skrócić. Preparaty można przechowywać w 50% formamidzie/2x SSC przez kilka dni.
    9. Preparaty równowagowe (utrzymywane w 50% formamidzie/2x SSC) w 2x SSC przez 2 min. Następnie równoważ w PBS przez 3 minuty.
    10. Stosuj 0,01 N HCl/0,0025% pepsyny przez kilka sekund do 5 minut, w zależności od typu komórki. Na tym etapie obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym i zatrzymaj reakcję (krok 2.2.11), gdy tylko jądra zostaną wolne od cytoplazmy, zachowując nienaruszoną ich strukturę (np. jąderka są nadal widoczne i nienaruszone).
    11. Dezaktywować pepsynę, przemywając ją dwukrotnie przez 5 minut w 50 mM MgCl2/PBS.
    12. Postfix w 1% PFA/PBS przez 1 min. Myć przez 5 min w PBS. Umyć dwa razy po 5 minut w 2x SSC, a następnie dodać 50% formamidu/2x SSC przez co najmniej 30 min.

3. 3D wielokolorowa hybrydyzacja DNA FISH

  1. Denaturować sondy w temperaturze 80 °C przez 5 minut, a następnie szybko umieścić na lodzie.
  2. Załaduj sondy hybrydyzacyjne na czyste szkiełko mikroskopowe. Odwróć szkiełko nakrywkowe z komórkami do góry nogami na kropli sond hybrydyzacyjnych.
  3. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe cementem gumowym. Pozostaw cement kauczukowy do całkowitego wyschnięcia. Następnie umieść szkiełka na bloku grzewczym i denaturuj w temperaturze 75 °C przez 4 min.
    UWAGA: Czas denaturacji i temperaturę denaturacji można zwiększyć do 80 °C.
  4. Hybrydyzować w temperaturze 37 °C ON w metalowym pudełku unoszącym się w łaźni wodnej.
    UWAGA: Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, temperatura hybrydyzacji może wzrosnąć do 42 °C.
  5. Odkleić cement kauczukowy, zanurzyć szkiełka w 2x SCC, zdjąć szklane szkiełko nakrywkowe i przenieść je do 2x SSC w płytce 6-dołkowej.
  6. Przemyć w 2x SSC trzy razy przez 5 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 90 obr./min w wytrząsarce inkubatora. Przemyć w 0,1x SSC trzy razy przez 5 minut w temperaturze 60 °C, wstrząsając z prędkością 90 obr./min w wytrząsarce inkubatora. Spłucz krótko w 4x SSC/0,2% TWEEN 20.

4. 3D wielobarwne wykrywanie DNA FISH

UWAGA: Dla sond bezpośrednio oznaczonych, pomiń kroki 4.1 i 4.2.

  1. Blokować 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 20 minut w temperaturze 37 °C na 24-dołkowej płytce, wstrząsając z prędkością 20 obr./min w wytrząsarce inkubatora.
  2. Inkubować z odpowiednim stężeniem antydigoksygeniny (1:150) i/lub streptawidyny (1:1 000) (tabela materiałów) rozcieńczonych w 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA przez 35 minut w ciemnej i mokrej komorze w temperaturze 37 °C.
  3. Umyć w 4x SSC/0,2% TWEEN 20 trzy razy po 5 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 90 obr./min na 6-dołkowej płytce w inkubatorze.
  4. Równowaga w PBS i post-fix w 2% formaldehydzie/PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na płytce 24-dołkowej.
    UWAGA: Sondy znakowane bezpośrednio nie wymagają mocowania po utrwaleniu.
  5. Umyć 5x krótko w PBS. Barwieć 1 ng/ml DAPI (4,6-diamidyn-2-fenyloindol)/PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umyć 5x krótko w PBS. Zamontuj za pomocą roztworu zapobiegającego blaknięciu (tabela materiałów).

5. 3D wielobarwna mikroskopia i analiza DNA FISH

  1. Pozyskiwanie obrazów 3D za pomocą systemu mikroskopowego.
    UWAGA: W tym przypadku używany jest mikroskop szerokokątny o odległości osiowej 0,2−0,25 μm między kolejnymi sekcjami (Rysunek 1B).
  2. Analizuj stosy obrazów 3D za pomocą różnych programów i narzędzi (tutaj, NuCLεD lub Nuclear Contacts Locator w 3D).
    UWAGA: Narzędzie NuCLεD zostało opracowane w celu automatycznej analizy wielokolorowego DNA FISH 3D w stosach z-obrazów komórek fluorescencyjnych. NuCLεD rekonstruuje jądra ze stosów obrazów komórkowych w 3D, a także wykrywa i lokalizuje fluorescencyjne plamki 3D. Mierzy względne położenie plamek w jądrze (np. odległość od środka ciężkości jąder i/lub obrzeża jąder) oraz maksymalny promień dla każdego jądra i odległości między plamkami. Użyte narzędzie i algorytm są w pełni opisane w Cortesi et al.16.
  3. Przeanalizuj dane (np. odległości 3D między określonymi loci genomowymi a centroidem jądrowym i częstotliwościami kontaktów) uzyskane przez NuCLεD.
    UWAGA: W przypadku odległości 3D między określonymi loci genomowymi a centroidem jądrowym, należy znormalizować odległości na maksymalnym promieniu dla każdego jądra i przedstawić te dane jako rozkłady częstości znormalizowanych odległości od centroidu jądrowego. W przypadku badań oddziaływań dalekiego zasięgu przyjmuje się, że częstości kontaktu mieszczą się w zakresie 10−20%21 z progową odległością, która może się różnić i może wynosić około 2 μm35.
    1. Aby przeprowadzić analizę statystyczną, przeanalizuj około 100 jąder na replikę biologiczną. Przedstaw odległości 3D między określonymi loci genomowymi jako skumulowane rozkłady częstości odległości, które są poniżej wybranego progu między odległościami i użyj testu t, aby ocenić znaczenie różnic w rozkładach. Oblicz również procent jąder dodatnich dla oddziaływań, które są poniżej wybranego progu odległości między odległościami, i użyj dokładnego testu Fishera, aby ocenić znaczenie różnic w procentach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda 3D wielokolorowego DNA FISH opisana w tym artykule pozwala na współczesną wizualizację różnych loci genomowych w zachowanych jądrach 3D (Rysunek 1B). Protokół ten pozwala na pomiar odległości między allelami i różnymi loci genomowymi w celu oceny ich bliskości przestrzennej oraz oceny ich lokalizacji w przestrzeni jądrowej (np. odległości loci od środka ciężkości lub obrzeża jąder)16. Istnieje jednak wiele kluczowych kroków, które należy dokładnie i konk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna metoda opisuje krok po kroku protokół do wykonywania 3D wielokolorowego DNA FISH na szerokiej gamie ludzkich komórek pierwotnych. Chociaż DNA FISH jest technologią znajdującą się w szerokim zastosowaniu, wielobarwne 3D DNA FISH na zachowanych jądrach interfazowych 3D jest nadal trudne do wykonania w wielu laboratoriach, głównie ze względu na charakterystykę użytych próbek23,24.

Translacja nacięć sondy jest podstawowym krokiem do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za pomoc techniczną ze strony INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Mediolan, Włochy), w szczególności C. Cordiglieri, za pomoc podczas pozyskiwania wielokolorowych obrazów 3D DNA FISH. Prace te zostały wsparte następującymi grantami dla B.B.: EPIGEN Italian flagship program, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) oraz Giovani Ricercatori, włoskie Ministerstwo Zdrowia (GR-2011-02349383). Praca ta została wsparta następującym grantem dla F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweThermo Fisher Scientific142475
Płytki 6-dołkoweThermo Fisher Scientific140675
Anty-Digoxigenina 488DBADI7488
b-MerkaptoetanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotyna 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (albumina surowicy bydlęcej)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidyn-2-fenyloindol)Thermo Fisher ScientificD21490
Kwasy dezoksyrybonukleinowe jednoniciowe z jąder łososiaSigmaD7656
Siarczan dekstranu (proszek)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500 ml
polimerazy DNA IThermo Fisher Scientific18010-017
DNaza ISigmaAMPD1
dNTP (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EtanolSigma02860-1L
FBS HyclonThermo Fisher ScientificSH30109
Roztwór formaldehyduSigmaF8775-25mL
FormamidSigmaF9037
GlutaminaThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GlycerolSigmaG5516-100mL
GlikogenThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
InsulinaHuman SigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (octan sodu, pH 5,2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydSigma158127-25G
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)SigmaP4417
Pennycylina/StreptawidynaThermo Fisher Scientific15070-063 100 ml
pepsynyBioradP6887
PhasePrep Zestaw DNA BACSigmaNA0100-1KT
Roztwór poli-L-lizynySigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Szybka ekstrakcja żelu i Zestaw do oczyszczania PCRThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Szybki zestaw do miniprzygotowania plazmiduThermo Fisher ScientificK210010
Koktajl RNAzaThermo Fisher ScientificAM2288
Bostikgumowo-cementu
VWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Cytrynian Tri-SoduSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL
Prowadnice z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772(2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47(2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773(2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15(2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147(2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584(2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872(2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie sond DNAfluorescencyjna hybrydyzacja in situobrazowanie 3Dorganizacja chromatynywizualizacja loci genomicznychpepsynizacja cytoplazmytraktowanie formamidem

Powiązane artykuły