Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

DOI:

10.3791/60718

⸱

6 marca 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2Department of Pharmacology, Second Military Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiologiczny grzyb Candida albicans może przejść zmianę z kolonizacji komensalnej na zjadliwość, która jest silnie skorelowana z jego zdolnością do przejścia ze wzrostu drożdży na wzrost strzępek. Komórki inicjujące ten proces przylegają zarówno do powierzchni, jak i do siebie nawzajem, w wyniku czego powstaje kolonia biofilmu. Dzieje się tak często nie tylko na powierzchniach tkanek błony śluzowej w infekcjach drożdżakowych, ale także na implantach medycznych, takich jak cewniki. Powszechnie wiadomo, że komórki biofilmu są oporne na leki przeciwgrzybicze, a komórki, które wydzielają się z biofilmu, mogą prowadzić do niebezpiecznych infekcji ogólnoustrojowych. Biofilmy wahają się od mocno przezroczystych do nieprzezroczystych ze względu na niejednorodność refrakcyjną. Dlatego biofilmy grzybów są trudne do zbadania za pomocą mikroskopii optycznej. Aby uwidocznić wewnętrzne cechy strukturalne, komórkowe i subkomórkowe, klarujemy utrwalone nienaruszone biofilmy poprzez stopniową wymianę rozpuszczalnika do punktu optymalnego dopasowania współczynnika załamania światła. W przypadku biofilmów C. albicans wystarczające oczyszczenie uzyskuje się za pomocą salicylanu metylu (n = 1,537), aby umożliwić mikroskopię konfokalną od wierzchołka do podstawy w biofilmach 600 μm przy niewielkim tłumieniu. W tym protokole wizualizacji przedstawiamy refraktometrię z kontrastem fazowym, wzrost biofilmów laboratoryjnych, utrwalanie, barwienie, wymianę rozpuszczalnika, konfigurację do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i reprezentatywne wyniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans to grzyb drobnoustrojowy, który jest typowo komensalny u ludzi. Ma fundamentalne znaczenie dla biologów, ponieważ organizm ma wiele morfologii. Na przykład, w odpowiedzi na pewne sygnały środowiskowe lub stresory, pączkujące komórki tworzące drożdże przełączą się na nitkowaty wzrost jako łańcuchy przegrodowe bardzo wydłużonych komórek znanych jako strzępki. Przejście jest ważne jako przykład fenotypowej ekspresji przejścia między jednokomórkowym i wielokomórkowym programem ekspresji genów. Podobnie C. albicans ma znaczenie biomedyczne, ponieważ organizm ten jest dobrze znanym patogenem oportunistycznym. Jest odpowiedzialny za infekcje drożdżakowe błony śluzowej, takie jak pleśniawki (kandydoza jamy ustnej), infekcje układu moczowo-płciowego oraz jest przyczyną groźnych infekcji inwazyjnych lub ogólnoustrojowych u pacjentów osłabionych immunologicznie.

Potencjał zjadliwości tego organizmu jest ściśle związany z jego licznymi morfotypami i innymi aspektami jego genetycznej wszechstronności1,2,3,4. Wydłużenie cegiełki rozrodczej, pierwszy widoczny etap przejścia do wzrostu strzępek, zachodzi z wystarczającą szybkością, aby umożliwić pochłoniętym komórkom C. albicans wyrwanie się z fagocytów, a tym samym ucieczkę przed wczesną fazą komórkowej odpowiedzi immunologicznej gospodarza5. Dodatkowo filamentacja jest poprzedzona i towarzyszy jej duży wzrost przylegania między komórkami i komórkami do powierzchni, co jest spowodowane regulowaną ekspresją kilku klas białek ściany komórkowej znanych jako adhezyny6,7,8,9. W wielu różnych warunkach połączenie przylegania i filamentacji powoduje dramatyczne przejście od planktonowego, jednokomórkowego wzrostu do związanego z powierzchnią wzrostu kolonialnego, który tworzy biofilm. Biofilmy C. albicans mogą rozwijać się na powszechnie stosowanych urządzeniach medycznych, takich jak cewniki dożylne. Rozsiane infekcje mogą powstawać, gdy takie biofilmy zaczynają pączkować z komórek drożdży i zrzucać je do krążącej krwi. Liczne badania wykazały, że komórki biofilmu są bardziej odporne na leki przeciwgrzybicze niż komórki planktonowe10,11, co może być częściowo spowodowane obniżonym metabolizmem12. Co więcej, wysoka ogólna przylegalność biofilmu może zapewnić zakotwiczenie potrzebne do skutecznego inwazyjnego wzrostu strzępek w tkance gospodarza1.

Optyczne wyjaśnienie biofilmów C. albicans poprzez dopasowanie współczynnika załamania światła miało duży wpływ na naszą zdolność do wizualizacji struktury tej społeczności mikrobiologicznej i odkrycia związków między ekspresją genów a fenotypem. Biofilmy hodowane w laboratorium na powierzchniach testowych pod płynnym podłożem hodowlanym przez 48 godzin pojawiają się jako biaława powłoka, która jest wystarczająco gęsta i wystarczająco gruba, aby była nieprzezroczysta (Rysunek 1). W związku z tym wiele interesujących cech fenotypowych biofilmu jest ukrytych przed wzrokiem. Biofilmy typu dzikiego uprawiane w pożywce YPD, RPMI-1640 lub pająku w temperaturze 37 °C mają grubość do 300 μm, przy czym biofilmy 48 godzin często osiągają 500 μm. Nieprzezroczystość jest spowodowana rozpraszaniem światła, które wynika z niejednorodności refrakcji: ściana komórkowa grzyba jest bardziej załamana niż otaczający ośrodek, a cytoplazma jest nieco bardziej załamana niż ściana komórkowa. Wynikająca z tego wysoka gęstość optyczna natywnego biofilmu zasłania wszystkie struktury o głębokości większej niż 30 μm, gdy są oglądane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu lub nawet skanera konfokalnego (Rysunek 2). Jednak duży stopień klarowania można osiągnąć poprzez infiltrację utrwalonych biofilmów cieczą o wysokim współczynniku załamania światła, która w przybliżeniu odpowiada załamaniu głównych składników komórkowych. Po wyjaśnieniu, obrazowanie w rozdzielczości submikronowej można przeprowadzić za pomocą mikroskopii konfokalnej na całej grubości prawie każdego biofilmu C. albicans13. W osobnikach dzikich łatwo zauważyć, że biofilmy składają się z długich, splątanych splątanych strzępek, skupisk pączkujących komórek w postaci drożdży lub komórek pseudostrzępkowych, pustych przestrzeni i pewnej ilości macierzy zewnątrzkomórkowej. Co więcej, biofilmy są na ogół stratyfikowane, wykazując przestrzennie zróżnicowane różnice morfologiczne w typie komórki, gęstości komórek oraz obecności komórek pączkujących lub rozgałęziających się. Wiele różnic w jednej lub więcej z tych cech zaobserwowano w biofilmach opracowanych przez zmutowane szczepy14,15. Dodatkowo, szczepy reporterowe wykazują in situ przestrzenne różnice w ekspresji genów16,9,13. Zaskakujący stopień wyjaśnienia, jaki można uzyskać za pomocą tego stosunkowo prostego i niedrogiego podejścia, pozwala również zauważyć, że wiele biofilmów zawiera strzępki wierzchołkowe i podstawowe strzępki inwazyjne rozciągające się na milimetrowe odległości.

W tym protokole wizualizacji demonstrujemy utrwalanie, etykietowanie, klarowanie i obrazowanie biofilmu C. albicans za pomocą prostego markera ściany komórkowej jako barwnika. Źródłem obecnej wersji protokołu jest poprawa klarowności, którą zaobserwowaliśmy, gdy biofilmy utrwalone formaldehydem zostały przesączone 97% metakrylanem glikolu (GMA), który następnie został spolimeryzowany w celu osadzenia biofilmu w twardym plastiku o umiarkowanie wysokim współczynniku załamania światła (n = 1,49). Następnie użyliśmy konwencjonalnej mikroskopii z kontrastem fazowym i serii cieczy referencyjnych o indeksie załamania światła, aby dokładniej określić punkt odwrócenia kontrastu (maksymalna przezroczystość) biofilmu (Rysunek 3). W przypadku biofilmów C. albicans wystąpiło to blisko n = 1,530, co było zaskakująco wysokie, biorąc pod uwagę, że gęsta struktura białkowa, taka jak keratyna włosów, jest tylko nieznacznie bardziej załamana (1,54–1,55). Chociaż znajduje się na górnym końcu optymalnego zakresu w Rysunek 3, przyjęliśmy salicylan metylu (olej wintergrinowy, n = 1,537) w obecnym protokole, ponieważ od dawna jest używany jako środek klarujący do mikroskopii w embriologii i histologii, ma niską toksyczność i niską prężność par oraz dał doskonałe wyniki w naszych próbach z użyciem optyki zanurzeniowej z umiarkowaną powłoką olejową NA.

Należy tutaj zwrócić uwagę na cztery punkty:

(1) Z nielicznymi wyjątkami, idealną sytuacją w mikroskopii jest to, że współczynnik załamania światła próbki powinien być równy współczynnikowi załamania płynu zanurzeniowego soczewki obiektywu17,18,13. W przypadku badań obrazowania trójwymiarowego (3D), w których konieczne jest głębokie ogniskowanie, jest to zawsze ważne.

(2) Nasz eksperymentalny wynik dla optymalnego oczyszczania (n = 1,525–1,535) jest nieco wyższy niż standardowe olejki immersyjne (n = 1,515, 1,518) i dlatego narusza punkt (1), a tym samym wprowadza źródło aberracji sferycznej przy użyciu standardowych olejowych optyki immersyjnej. Jednym z rozwiązań tego problemu jest użycie obiektywu zaprojektowanego dla wskaźnika zanurzenia w wyższym zakresie. Ze względu na odrodzenie zainteresowania obrazowaniem oczyszczonych próbek, dostępne stają się specjalistyczne obiektywy z potrzebną korekcją. Innym rozwiązaniem jest obniżenie indeksu pożywki klarującej do 1,515 lub 1,518 poprzez dodanie niewielkiej ilości butanolu (n = 1,399) w celu uzyskania optymalnej wydajności zanurzenia w oleju i zaakceptowania nieznacznie obniżonej klarowności.

(3) Mikroskopia nienaruszonych biofilmów (i innych próbek w tej skali) wymaga znacznej odległości roboczej, aby dostosować się do grubości próbki. Jest to ważny wzgląd praktyczny. Duża odległość robocza ogranicza optykę do umiarkowanej apertury numerycznej (NA = 0,6–1,25), co ogranicza rozdzielczość, ale także ogranicza nasilenie aberracji sferycznej.

(4) Optymalny współczynnik załamania światła dla wyjaśnienia może być różny dla innych typów stałych próbek. Próbki powinny być odpowiednio testowane przy użyciu kontrastu fazowego i serii cieczy odniesienia indeksu załamania światła, jak pokazano na Rysunek 3.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost kultur biofilmu

UWAGA: Candida albicans jest ludzkim patogenem. W niektórych instytucjach hodowla tego organizmu wymaga hermetyzacji BSL-2.

  1. Umieść wybrany szczep na płytce agarowej z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) i hoduj 48 godzin w temperaturze 30 °C.
  2. Wybierz pojedyncze kolonie z płytki, aby zaszczepić 5 ml pożywki YPD w probówkach hodowlanych o pojemności 15 ml w celu nocnego wzrostu tlenowego (rotator karuzelowy, 52–55 obr./min) w temperaturze 30 °C.
  3. Określić gęstość komórek, stosując 40-50-krotne rozcieńczenie nocnej hodowli. Oblicz współczynnik rozcieńczenia potrzebny do doprowadzenia gęstości komórek do 3 x 106 komórek/ml dla substratów silikonowych lub 0,6–1,2 x 106 komórek/ml dla powierzchni szkła nakrywkowego poddanych działaniu konkanawaliny-A (ConA) lub aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) (patrz Dyskusja).
  4. W przypadku wzrostu biofilmu na płytce 12-dołkowej (Rysunek 1) należy dozować 2,0 ml sterylnego podłoża do filamentacji do każdej studzienki i ogrzać płytkę do 37 °C w wilgotnym inkubatorze. Różne podłoża będą indukować filamentację, silniej w podwyższonej temperaturze (37 °C) i z dodatkiem surowicy. Zalecana jest płodowa surowica bydlęca (FBS). Zalecane podłoża to YPD, Spider-Mannitol lub RPMI-1640.
  5. Za pomocą sterylnej pęsety umieść przygotowane podłoże w każdym dołku w podgrzanej płytce i usuń pęcherzyki. Dodać inokulum z hodowli przez noc, aby osiągnąć gęstość komórek zalecaną w kroku 1.3 w każdym dołku. Jedna studzienka bez inokulum służy jako wizualna ślepa próba i kontrola przed zanieczyszczeniem.
  6. Umieść płytkę na mieszalniku orbitalnym o prędkości 60 obr./min w nawilżonym inkubatorze powietrza o temperaturze 37 °C na 90 minut, aby dać czas na przyleganie komórek. Po 90 minutach usunąć pożywkę i nieprzyłączone komórki, przemyć sterylną pożywką lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i umieścić zaszczepione podłoża w szalkach hodowlanych lub innej płytce wielodołkowej zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę do filamentacji. W przypadku płytek wielodołkowych bardzo wygodne jest użycie drugiej płytki do etapu płukania i trzeciej płytki z 2,0 ml wstępnie podgrzanego podłoża na studzienkę, aby otrzymać umyte zaszczepione podłoża. Wysterylizuj pęsetę przed każdym transferem.
  7. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze z nawilżanym powietrzem otoczenia o temperaturze 37 °C i hodować biofilmy do 48 godzin z mieszaniem orbitalnym 60 obr./min w celu napowietrzenia. W każdej kulturze wzrost planktonu powinien być niewielki, chyba że rozwijający się biofilm zrzuca komórki w postaci drożdży. Wyhodowany w ten sposób biofilm jest pokazany na Rysunek 1.

2. Przetwarzanie próbek do obrazowania

UWAGA: Utrwalacze aldehydu są lotne i niebezpieczne. Rozcieńczenia utrwalające należy przygotować w dygestorium, a nie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nie należy umieszczać utrwalaczy w inkubatorach przeznaczonych do żywych komórek. Pracuj z rozcieńczonymi utrwalaczami w przykrytych naczyniach pod wyciągiem lub w dobrze wentylowanym blacie stołowym. Utrwalacze i roztwory myjące po utrwaleniu należy utylizować jako odpady niebezpieczne.

  1. Przygotować świeży utrwalacz, 4% formaldehydu lub paraformaldehydu w PBS, opcjonalnie z dodatkiem do 2% aldehydu glutarowego. Formalina rozcieńczona do 4% może być stosowana do rutynowych prac.
    nuta: W szczególności aldehyd glutarowy zwiększa autofluorescencję szerokopasmową i może osłabiać fluorescencję wyrazalnych znaczników, takich jak dTomato.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z próbki i zastąpić PBS w celu rozcieńczenia białek surowicy lub przenieść biofilm na jego podłożu do PBS na kilka minut.
  3. Przenieś próbkę do utrwalacza i ustaw przykryte naczynie na wolnym mikserze orbitalnym na 20 minut. Wydłuż czas przetwarzania grubszych próbek (patrz Dyskusja). Do każdej potrawy należy dodać wystarczającą objętość utrwalacza, aby zanurzyć cały wzrost biofilmu, w tym wszelkie po wewnętrznej stronie naczynia.
  4. Usuń utrwalacz i ponownie napełnij naczynie PBS, aby wypłukać pozostały utrwalacz. Utrwalacz należy usunąć jako odpad niebezpieczny. Powtórz kilka krótkotrwałych płukań, a następnie dłuższych płukań, aby dać czas na dyfuzję resztkowego utrwalacza z biofilmu lub bloku agaru. Okres prania zależy od czasu przeznaczonego na utrwalenie (patrz Dyskusja).
  5. Potrzebna ilość plamy będzie zależeć od masy biofilmu. Przed barwieniem należy usunąć cały biofilm z obszarów naczynia hodowlanego, które nie są próbkami, lub przenieść utrwaloną próbkę do nowego naczynia przed barwieniem. Nie pozwól, aby biofilm spłynął lub wyschł. Trzymaj go zanurzony w PBS.
  6. Dodaj plamę do naczynia (patrz Dyskusja) i ustaw przykryte naczynie na noc na wolnym mikserze orbitalnym (patrz Dyskusja). Chronić przed światłem.
  7. Rano usuń roztwór barwiący i ponownie napełnij naczynie PBS, aby rozcieńczyć niezwiązaną plamę. Ustaw naczynia na wolnym mikserze orbitalnym do odplamienia na kilka godzin.

3. Protokół Wyjaśnienia: Biofilmy na podłożach niezabezpieczonych

  1. Oczyszczone biofilmy są trudne do rozpoznania wizualnie. Dlatego, jeśli jest to pożądane, oznacz jedną stronę każdego podłoża zadrapaniem, aby wyznaczyć stronę do zaszczepienia.
  2. Używaj oznakowanych długich pipet Pasteura do wszystkich późniejszych transferów odpadów i rozpuszczalników, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego rozpuszczalników.
  3. Za pomocą pęsety przenieś utrwalony biofilm z PBS do 5 ml metanolu w proporcji 50:50 PBS:metanol w szklanej fiolce o pojemności 20 ml z biofilmem skierowanym do góry. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5 minut (patrz Dyskusja).
  4. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady, uważając, aby uniknąć kontaktu pipety z biofilmem lub biofilmu z fiolką. Delikatnie uzupełnij 3 ml czystego metanolu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 3 minuty.
  5. Usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij 5 ml metanolu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5–10 minut. Usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij 3 ml metanolu. Biofilmy często wyglądają na bardziej nieprzezroczyste w tym momencie niż ich początkowy wygląd.
  6. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę 5 ml 50:50 metanolu: salicylanu metylu. Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5–10 minut. Biofilm powinien być półprzezroczysty w tym zmieszanym rozpuszczalniku.
  7. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady. Delikatnie napełnić fiolkę 3 ml czystego salicylanu metylu (MS). Ręcznie mieszaj z ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 3 minuty.
  8. Usuń rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast napełnij ją 5 ml czystego MS. Ręcznie mieszaj ruchem orbitalnym w odstępach 1-minutowych przez 5-10 minut. W tym momencie biofilm powinien być przezroczysty. Usunąć rozpuszczalnik do butelki na odpady i natychmiast ponownie napełnić fiolkę 3 ml czystego MS. Przetworzony biofilm jest stabilny w tym rozpuszczalniku.
  9. W przypadku biofilmów na agarze (patrz Dyskusja) należy wydłużyć wszystkie okresy wymiany, aby umożliwić dyfuzję wody i rozpuszczalnika przez agar. Niezbędne okresy czasu można oszacować za pomocą mikroskopu preparacyjnego o małej mocy z oświetleniem ciemnego pola, aby zobaczyć przepływ rozpuszczalnika do agaru. Protokół zapewnia dobre klarowanie i brak większych efektów skurczu, gdy używany jest 2% agar, ale oczyszczony agar skondensuje się, jeśli zostanie ściśnięty podczas obchodzenia się z pęsetą. Zaleca się użycie szpatułki.

4. Konfiguracja obrazowania dla mikroskopii konfokalnej

  1. Poniższe kroki dotyczą korzystania z mikroskopu odwróconego. Użyj naczynia odpornego na rozpuszczalniki, które ma szklane dno nakrywkowe, aby przytrzymać odwróconą próbkę na stoliku mikroskopu (patrz Dyskusja).
  2. Przygotuj przekładki do podparcia odwróconej próbki. Używaj małych prostokątów wyciętych ze szkiełek mikroskopowych (o grubości 1 000 μm), szkieł nakrywkowych (170 μm) lub silikonowych pierścieni o średnicy 13 mm (330 μm, patrz tabela materiałów), które można układać w stosy w zależności od potrzeb. Namocz pierścienie w salicylanie metylu przez 1 godzinę, aby zminimalizować dryf ostrości spowodowany obrzękiem.
  3. W przypadku biofilmu na kwadracie silikonowym klasy medycznej, odwróć kwadrat (tj. obróć go biofilmem w dół) i umieść go na przekładce w kałuży salicylanu metylu w naczyniu (Rysunek 2). Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza pod próbką.
  4. Mocno zamontuj naczynie na stoliku mikroskopu i zetknij się z obiektywem zanurzonym w oleju (patrz Dyskusja).
  5. Dostosuj ilość stwardnienia rozsianego w naczyniu tak, aby menisk mocno przytrzymywał próbkę na przekładce za pomocą napięcia powierzchniowego. Umieść kroplę MS na odwróconym kwadratowym podłożu, aby zmniejszyć rozproszenie światła z matowego wykończenia, i przykryj naczynie szklaną płytką, aby ograniczyć parowanie. Przed obrazowaniem odczekaj kilka minut, aż próbka osiądzie na przekładkach.
  6. Użyj światła przechodzącego, aby wizualnie sprawdzić pole widzenia i zlokalizować aktualną pozycję ostrości względem wierzchołkowych i podstawowych obszarów odwróconego biofilmu. Ustaw przysłonę numeryczną podświetlającą kondensator (INA) na minimum (zamknij przysłonę kondensatora), aby zwiększyć kontrast, w przeciwnym razie oczyszczony biofilm będzie prawie niewidoczny. Po zakończeniu wyłącz źródło światła przechodzącego.
  7. Przełącz się na fluorescencję konfokalną i ustaw dolną i górną granicę stosu obrazów o szeregowej ostrości potrzebnej do objęcia biofilmu. Zalecane stopniowanie napędu ostrości w górę najpierw pokaże przemieszczone komórki, które osiadły na szkle nakrywkowym i bardzo długie strzępki wierzchołkowe, które spoczywają na szkle. Na górnym końcu sekwencji powinny być widoczne komórki założycielskie przylegające do podłoża u podstawy biofilmu. Ustaw średnicę otworka, odstępy między pikselami w płaszczyźnie obrazu i przyrost kroku ostrości, korzystając z ogólnych kryteriów opisanych w dyskusji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy, takie jak ten w Rysunek 1 są mocno przezroczyste do nieprzezroczystych, ale są rutynowo klarowane i obrazowane za pomocą powyższego protokołu. Rysunek 2 pokazuje silne tłumienie fluorescencji z głębokością ostrości w stałym biofilmie w PBS, w porównaniu do tego samego biofilmu po dopasowaniu indeksu. Jak pokazano na Rysunek 3, używając szeregowo mieszalnych rozpuszczalników o rosnącym współczynniku załamania światła, można szybko oszacować maksymalną klarowność. Jest to udoskonalane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii z kontrastem fazowym, aby znaleźć punkt minimalnego kontrastu (maksymalnej przezroczystości). Oczywiste jest, że tego optimum nie osiąga się poprzez jednorodne dopasowanie indeksu. Dzieje się tak, ponieważ struktury subkomórkowe różnią się nieznacznie współczynnikiem załamania światła. W tym przypadku odwrócenie kontrastu nastąpiło w ścianie komórkowej przy nieco niższym indeksie rozpuszczalnika niż w cytoplazmie. W przypadku biofilmów Candida albicans optimum występuje w pobliżu n = 1,530. 48 h zmutowane biofilmy typu dzikiego i cak1 DX w Rysunek 4A miały grubość 500 μm, ale komórki drożdży u podstawy były obrazowane prawie tak ostro jak komórki wierzchołkowe. Podobnie, jak pokazano na rysunku Rysunek 4C, tłumienie fluorescencji nie było silnie skorelowane z głębokością ostrości. Rysunek 5 pokazuje inwazyjne strzępki w agarze setki mikrometrów pod powierzchniowym biofilmem. Dojrzałe strzępki inwazyjne konsekwentnie wytwarzają boczne pączkujące drożdże proksymalnie do przegród w łańcuchu strzępek, powodując powstawanie podkolonii komórek drożdżopodobnych w regularnych odstępach czasu wzdłuż inwazyjnej strzępki.

figure-results-1
Rysunek 1: Hodowle biofilmu przed klarowaniem. 24-godzinny biofilm wyhodowany z izolatu uzupełnionego szczepu efg1 ∆/∆ C. albicans na 12-dołkowej płytce na kwadracie silikonowym w płynnym podłożu RPMI-1640 uzupełnionym 10% FBS. Sterylny ślepy półfabrykat znajduje się w studzience C4. Wstawka przedstawia przekroj poprzeczny 96-godzinnego biofilmu typu dzikiego wyhodowanego na 6-dołkowej płytce na podstawie agaru o średnicy 3,75 mm w tym samym podłożu, na którym widoczne są inwazyjne strzępki. Oba panele są w tej samej skali. Podziałka = 2,0 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Poprawa głębokiego obrazowania poprzez dopasowanie indeksu. Rysunek przedstawia projekcje boczne stosów obrazów konfokalnych z 48-godzinnego biofilmu typu dzikiego, który został utrwalony i wybarwiony ConA-Alexafluor 594. (A) Próbka została zobrazowana w PBS przy użyciu obiektywu 63x 1.0 NA do bezpośredniego zanurzenia w wodzie. Tłumienie było poważne przy głębokości ogniskowania 30 μm. (B) Po wyjaśnieniu w krokach protokołu 3.3–3.8, ten sam biofilm zobrazowano w salicylanie metylu z minimalnym tłumieniem przy użyciu obiektywu zanurzeniowego w oleju 40x 0,85 NA. Po odjęciu tła i projekcji bocznej stosów obrazów 3D, dane 40x zostały przeskalowane przestrzennie, aby dopasować je do danych 63x w celu porównania. (C) Schemat ideowy przedstawiający odwrócone mocowanie oczyszczonej próbki (z MS) poprzez przeniesienie do MS w naczyniu z anodyzowanego na czarno aluminium z cementowanym dnem ze szkła pokrywowego (patrz Dyskusja). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Refraktometria z kontrastem fazowym pokazuje odwrócenie kontrastu cech komórkowych w zakresie optymalnego dopasowania wskaźnika. Utrwalone biofilmy na szkłach nakrywkowych wymieniono z PBS na metanol, a następnie na ksylen (n = 1,496). Te biofilmy zostały następnie wymienione po jednym z ksylenu na zestaw cieczy referencyjnych o indeksie załamania światła (seria E, Cargille Laboratories, patrz tabela materiałów) i wizualnie zbadane obok siebie w celu określenia zakresu indeksu zapewniającego najwyższą przezroczystość. (górny panel) Obrazy kontrastu fazowego: Jeden biofilm był seryjnie wymieniany między ksylenem a wąskim zestawem cieczy referencyjnych w tym zakresie. Po każdej wymianie to samo pole było przenoszone i oglądane przez szkło nakrywkowe za pomocą obiektywu z kontrastem fazowym 40x 0,85 NA Ph2 i kondensatora Ph2. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przy tym samym ustawieniu lampy i ekspozycji aparatu, aby dokładnie wyświetlić zmiany. Wraz ze wzrostem indeksu, odwrócenie kontrastu jest najpierw widoczne przy n = 1,530 dla ściany komórkowej, a następnie cytoplazma przy n = 1,535. Podziałka = 10 μm. (dolny panel) Wykres przedstawiający minimalną średnią jasność biofilmu w punkcie maksymalnej przezroczystości. Silne rozproszenie światła w obrębie biofilmu powoduje, że średnia jasność przekracza puste pole. Izolowane komórki wydają się ciemniejsze niż puste pole, aż do odwrócenia kontrastu w zakresie 1,530–1,535. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Głębokie obrazowanie zmutowanych i dzikich biofilmów C. albicans. Szczep typu dzikiego (DAY185) i szczep o zmniejszonej ekspresji kinazy białkowej związanej z cyklem komórkowym (cak1 DX) 14 hodowano w temperaturze 37 °C przez 48 godzin na podłożach silikonowych w płynnym podłożu YPD. Biofilmy utrwalono, wybarwiono ConA-Alexafluorem 594 i sklarowano przy użyciu protokołu wymiany rozpuszczalnika do salicylanu metylu. Mikroskopia konfokalna 3D wykazała, że oba biofilmy miały grubość ~500 μm. Dane obrazu zostały przekonwertowane do formatu 32-bitowego w formacie ImageJ lub Fiji (https://imagej.nih.gov/ij/ lub http://fiji.sc), a następnie przetworzone za pomocą funkcji Odejmij tło z promieniem 50-pikselowej toczącej się kuli, progowaniem w celu ustawienia pikseli ujemnych na zero, ponownym krojeniem i wykorzystaniem projekcji o maksymalnej intensywności w celu uzyskania widoków z boku. (A) Projekcje osiowe i boczne: Biofilm typu dzikiego urósł do grubości 502 μm, jak widać w projekcji bocznej stosu obrazów konfokalnych w 558 płaszczyznach. Pasek skali = 100 μm. (lewy panel) 40-płaszczyznowe rzuty osiowe od wierzchołka (góra) do podstawy (dół) pokazują różnice w typach komórek w różnych warstwach biofilmu. Ten przykład pokazał charakterystyczną strukturę typu dzikiego: przylegające komórki u podstawy dają początek strzępkom, które wznoszą się do gęstej środkowej strefy komórek pseudostrzępkowych i drożdżopodobnych. Powyżej strefy środkowej strzępki ponownie się wyłoniły i dały początek skupiskom pączkujących drożdży. Długie strzępki widoczne w strefie wierzchołkowej prawdopodobnie rozciągały się do pożywki hodowlanej w żywym biofilmie, ale składały się na powierzchnię biofilmu podczas przetwarzania próbki. Biofilm cak1 DX urósł do grubości 500 μm, co widać w projekcji bocznej stosu obrazów w 556 płaszczyznach. Ten mutant, o którym wiadomo, że ulega nitkowatemu wzrostowi przy braku indukujących naprężeń14, wytworzył dramatycznie inną architekturę. Jak widać zarówno w rzucie bocznym, jak i osiowym (panele po prawej stronie), wiele rozgałęzionych komórek dało początek promienistym wyrostkom. (B) Przykłady rozgałęzionych strzępek w biofilmie cak1 DX. Podziałka liniowa = 10 μm. (C) Tłumienie fluorescencji wraz z głębokością w oczyszczonym biofilmie typu dzikiego określono ilościowo poprzez maskowanie pikseli tła, a następnie obliczenie średniego sygnału cyfrowego dla wszystkich pikseli innych niż tło na każdej płaszczyźnie obrazu. Z wyjątkiem strzępek wierzchołkowych, które są jaskrawo oznaczone przez lektynę, nie było silnego trendu tłumienia przy głębi ostrości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Inwazyjne strzępki w agarze Strzępki C. albicans w biofilmie powierzchniowym przenikają przez podłoże agaru na milimetrowe odległości (patrz Rysunek 1). Po wyjaśnieniu, struktury inwazyjne mogą być oglądane w dół przez biofilm lub w górę od dolnej strony agaru. To ostatnie wymaga większej odległości roboczej. Alternatywnie, po utrwaleniu, ale przed barwieniem i wymianą rozpuszczalnika, agar można pociąć pionowo za pomocą skalpela lub żyletki na kawałki o średnicy 1–2 mm, które następnie można obrócić na bok i zobrazować bezpośrednio w widoku z boku po barwieniu i klarowaniu. Ta procedura jest zalecana. W tym rzucie kwadratowego pola widzenia o wielkości 213 μm użyto tęczowej skali kolorów do zakodowania położenia osiowego w zakresie 75 μm: niebieskie obiekty znajdują się blisko, a czerwone głębiej w płaszczyźnie strony. Pogląd ten pokazuje, że długie strzępki wyrastają z bocznych komórek drożdży w półregularnych odstępach czasu, które dają początek podkoloniom. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w mikroskopii fluorescencyjnej w zakresie przekroju optycznego, rozdzielczości, szybkości, unikania lub kompensacji aberracji, akwizycji wielokanałowej oraz mocy obliczeniowej spowodowały odrodzenie obrazowania nienaruszonych próbek. W przypadku próbek utrwalonych duży wpływ miały zarówno klasyczne, jak i nowatorskie metody klarowania i ekspandowania 19,20,21,22,23,24. W tym przypadku zastosowaliśmy szybkie i proste podejście oparte na dopasowywaniu indeksów opartych na rozpuszczalnikach, aby zbadać strukturę biofilmów grzybów, które są mocno przezroczyste lub nieprzezroczyste.

Poprzednie protokoły zostały przetestowane na różnych próbkach. W naszym laboratorium biofilmy Candida albicans są najczęściej hodowane na kwadratach o średnicy 14 mm wyciętych z arkusza kauczuku silikonowego klasy medycznej (patrz Tabela Materiałów). Podłoże to jest wykorzystywane, ponieważ wzrost na PDMS (polidimetylosiloksan) zanurzony w płynnej pożywce hodowlanej został uznany za ważny model in vitro dla zakażeń związanych z implantami medycznymi, w szczególności cewnikami na stałe. Zestresowane komórki inicjujące filamentację szybko przylegają do powierzchni niepolarnych, takich jak PDMS. W praktyce zużyte kwadraty, które zostały oczyszczone i ponownie wysterylizowane w autoklawie (cykl suchy), dają najbardziej spójne biofilmy dla każdego konkretnego szczepu. Biofilmy są również powszechnie hodowane na szkłach nakrywkowych, w naczyniach hodowlanych ze szkła nakrywkowego, w standardowych naczyniach z polistyrenu klasy bakteriologicznej oraz na agarze . Ponieważ komórki C. albicans nie przylegają dobrze do szkła, szkła nakrywkowe powinny być traktowane lektyną, która wiąże polisacharydy ściany komórkowej. Na każdą powierzchnię szkiełka nakrywkowego nakładamy 40 μl 1 mg/ml ConA lub WGA w sterylnej wodzie. Po wyschnięciu szkła nakrywkowe są poddawane działaniu 40 μl 1% aldehydu glutarowego przez 3 minuty w celu usieciowania białka w nierozpuszczalny film. Następnie przemywa się je sterylną wodą destylowaną w celu usunięcia utrwalacza i rozpuszczalnej lektyny i suszy na powietrzu. W razie potrzeby poddane obróbce szkła lub naczynia nakrywkowe są ponownie sterylizowane pod bakteriobójczą lampą UV przez 10 minut.

Grubość próbki będzie miała wpływ na wymagane okresy inkubacji w protokołach. Dyfuzja utrwalająca do biofilmu o wielkości 300 μm wymaga kilku minut do zrównoważenia. Okres ten zwiększa się wraz z kwadratem grubości próbki i powinien być wydłużony do godziny lub więcej w przypadku bardzo grubych biofilmów lub próbek bloków agarowych, które mogą mieć grubość 2–3 mm. Okres równowagi barwienia zależy również od grubości próbki zgodnie z opisem dla utrwalania i wymłukiwania. Ponieważ jednak lektyny dyfundują wolniej niż utrwalacze o niskiej MW, zwłaszcza w żelu agarowym, barwienie powinno być przedłużone z dnia na dzień. To samo należy zrobić z wypłukaniem nadmiaru plamy.

Do protokołów mogą być włączane różnego rodzaju plamy. Do obrazowania strukturalnego używamy barwienia ściany komórkowej, najczęściej Calcofluor White M2R (Fluor. Rozjaśniacz #28) lub lektyna oznaczona barwnikiem, taka jak ConA-Alexafluor 594 lub WGA-Alexafluor 594. Należy zwrócić uwagę na wartościowość białka. Tetramer ConA może powodować sieciowanie wysoce elastycznych strzępek w okolicy wierzchołkowej biofilmu. Jest to mniej widoczne w przypadku dimera WGA. Specyfika kanoniczna tych markerów to Calcofluor dla chityny, ConA dla reszt mannozy oraz WGA dla reszty N-acetylo-D-glukozaminy i kwasu sjalowego.

Ponieważ protokół wymiany rozpuszczalnika jest klasyfikowany z PBS lub wody przez metanol do salicylanu metylu, pojemniki na próbki muszą być odporne na rozpuszczalniki. Salicylan metylu (MS) szybko zmiękczy wyroby z polistyrenu i powoli zmiękczy inne tworzywa sztuczne. Zgodnie z protokołem, stosowanie czystego metanolu może odbywać się w wyrobach z tworzyw sztucznych, ale w tym momencie protokołu zazwyczaj przechodzimy na standardowe szklane fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 ml z nakrętkami odpornymi na rozpuszczalniki. Fiolki są wygodne w przypadku biofilmów na silikonowych kwadratowych podłożach, ponieważ kwadraty można podnosić i przenosić za pomocą cienkiej pęsety. Fiolkę można również opróżnić i ponownie napełnić płaskim kwadratem spoczywającym na wewnętrznej zakrzywionej powierzchni, tak aby biofilm nie stykał się ze szkłem. Podłoże powinno być poddane biofilmowi, gdy jest zanurzone w pionowej fiolce. Fiolki doskonale nadają się do długotrwałego przechowywania próbek.

W protokole klarowania bardziej stopniowane etapy wymiany rozpuszczalnika minimalizują ryzyko deformacji próbki w wyniku mieszania rozpuszczalników. Aby zapewnić szybkość i wygodę w podstawowym protokole, istnieją cztery kroki: 1) krok 3.3, PBS do 50:50 PBS: metanol; 2) kroki 3.4 i 3.5, PBS: metanol do czystego metanolu, 3) krok 3.6, czysty metanol do 50:50 metanol: MS; oraz 4) kroki 3.7 i 3.8, metanol:MS do czystego MS. Metanol zapewnia mieszalność przejściową. Ponieważ jednak woda i stwardnienie rozsiane są prawie niemieszające się, ważne jest, aby cała woda została wyparta przez metanol przed wprowadzeniem jakiegokolwiek stwardnienia rozsianego. Podobnie, ponieważ metanol jest bardzo lotny, ważne jest, aby wyprzeć cały metanol przez stwardnienie rozsiane. W przeciwnym razie ciągłe parowanie resztkowego metanolu spowoduje zmiany współczynnika załamania światła w próbce. W ramach czteroetapowej sekwencji wskazane jest powtórzenie drugiego i czwartego kroku poprzez dodanie kolejnej zmiany czystego rozpuszczalnika, a nawet trzeciej zmiany. W przypadku szczególnie delikatnych próbek zmiany rozpuszczalnika można formułować w mniejszych krokach procentowych.

W przypadku próbek bloków agarowych, kroki 3.4 i 3.5 (czysty metanol) mogą powodować pojawienie się kryształów soli w agarze z powodu nierozpuszczalności pozostałości soli PBS w metanolu. Można tego uniknąć, stosując wodę destylowaną (DW) w pierwszym etapie mieszania rozpuszczalnika zamiast PBS do rozcieńczania soli podczas wymiany woda-metanol. Alternatywna sekwencja wymiany rozpuszczalnika dla utrwalonych biofilmów składa się z następujących etapów: 1) etap 3.3, przenieść próbkę z PBS do 50:50 DW:metanol (należy odczekać dodatkowy czas na dyfuzję przez agar); 2) krok 3.4, przenieść próbkę z 50:50 DW: metanol do czystego metanolu (powtórzyć 2x z metanolem, jak w kroku 3.5); 3) Krok 3.6, przenieś próbkę z metanolu do 50:50 metanol: salicylan metylu; i 4) krok 3.7, przenieść próbkę z 50:50 metanol:MS do czystego MS (powtórzyć 2x z MS, jak w kroku 3.8).

Ponieważ salicylan metylu szybko zmiękcza tworzywa polistyrenowe, używamy naczynia z anodyzowanego aluminium ze szklanym dnem do utrzymywania oczyszczonego biofilmu na stoliku mikroskopu odwróconego. Szkło nakrywkowe jest utrzymywane na miejscu za pomocą cementu optycznego utwardzanego promieniami UV (Norland Optical Adhesive #61, patrz Tabela materiałów). Pod warunkiem, że stwardnienie rozsiane zostanie usunięte pod koniec dnia poprzez umycie naczynia izopropanolem, a następnie wodą z mydłem i spłukanie, cementowane szkło nakrywkowe będzie służyć przez wiele miesięcy.

Dobór obiektywu jest niezwykle ważny w wielkoskalowym obrazowaniu oczyszczonych próbek ze względu na znaczenie minimalizacji aberracji sferycznej i potrzebę wystarczającej odległości roboczej. Mamy doświadczenie z trzema celami w tych badaniach. W konfiguracji mikroskopu odwróconego używamy oleju obiektywowego o dużej odległości roboczej i umiarkowanej aperturze numerycznej (NA) zanurzonego pod szkłem nakrywkowym z biofilmem zanurzonym w salicylanie metylu w naczyniu nad szkłem nakrywkowym. Większość naszych prac została wykonana przy użyciu obiektywu achromatycznego z serii Zeiss Universal, typu 461708, 40x 0,85NA Oel 160/1,5, używanego z adapterem o ogniskowej ujemnej 160 mm w celu zapewnienia nominalnej kompatybilności z konjugatem nieskończonym (IC). Obiektyw ten został pierwotnie zaprojektowany do oglądania zanurzonego w oleju przez szkiełka mikroskopowe 1,5 mm z odległością roboczą 0,35 mm25. W przypadku stosowania ze standardowym szkłem nakrywkowym (0,17 mm) odległość robocza jest znacznie większa: 1,5 + 0,35–0,17 = 1,68 mm = 1 680 μm. Używamy również nowego obiektywu wielofunkcyjnego Zeiss, typu 420852, planapochromatu 25x 0,8 NA LD LCI o odległości roboczej przekraczającej 540 μm, z korekcją zanurzenia ustawioną na wysoką stronę "oleju". Ten obiektyw jest wysoce skorygowany i zapewnia doskonały obraz. Na pionowym statywie mikroskopowym zastosowaliśmy nowy obiektyw multiimmersyjny firmy Nikon, typ MRD71120, planapochromat 10x 0,5NA CFI o odległości roboczej przekraczającej 5 000 μm (5 mm), również z korekcją zanurzenia ustawioną na wysoką stronę "oleju" (n = 1,518). Chociaż ten cel ma niższy poziom NA niż inne, ma tę zaletę, że można go bezpośrednio zanurzyć w salicylanie metylu.

Aby zoptymalizować akwizycję danych pod względem szybkości i rozdzielczości, ustawienia mikroskopu konfokalnego powinny idealnie spełniać zarówno poprzeczne, jak i osiowe gęstości próbkowania Nyquista18. Korzystając z konwencjonalnych kryteriów, ustaw średnicę otworu konfokalnego nominalnie na 1 jednostkę Airy. W powiększonych współrzędnych,

dP (μm) = 1,22 x powiększenie x (długość fali emisji w μm) / NA

Próbkowanie poprzeczne (odstępy między pikselami) nie powinno przekraczać (1/2) x limit rozdzielczości Abbego. We współrzędnych przestrzeni obiektu,

∆x, ∆y = (długość fali emisji w nm) / (4 NA)

Próbkowanie osiowe (przyrost ogniska) nie powinno przekraczać odwrotnej szerokości pasma osiowego,

∆z = (wskaźnik zanurzenia) x (długość fali emisji w nm) / (NA2)

Konfokalny układ optyczny rozszerza pasmo mikroskopu i wyostrza zarówno rozdzielczość poprzeczną, jak i osiową o co najmniej 1/√2.

Dla najczęściej używanego przez nas obiektywu 40x 0,85 NA, w tabeli 1 przedstawiono wyniki tych wzorów dla długości fali emisji 600 nm (Alexa Fluor 594).

formułax 1/√2zestaw (typowy)
dP (μm)34,5 μm-25 lub 50 μm
∆x, ∆y176 nm125 nm161 nm
∆z1200 nm848 nm900 nm

Tabela 1: Konfokalna średnica otworka, poprzeczne pobieranie próbek i osiowe wartości próbkowania dla długości fali emisji 600 nm.

Korzystając ze skanera konfokalnego z wirującym dyskiem z tymi ustawieniami i polem skanowania o wymiarach 1 392 x 1 040 pikseli, dane z próbek biofilmu można uzyskać z rozsądną szybkością i rozdzielczością. Typowe jednokolorowe stosy obrazów 3D mają pojemność od 0,35 do 1,55 GB.

Media klarujące w szerokim zastosowaniu obejmują znaczny zakres współczynnika załamania światła. Dzięki oświetleniu ciemnego pola i oględzinom stwierdziliśmy, że utrwalone biofilmy C. albicans były najbardziej przezroczyste powyżej n = 1,5. Zostało to uściślone za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym do n = 1,530–1,535. Z wielu praktycznych powodów stosujemy salicylan metylu (n = 1,537) jako końcowy rozpuszczalnik pasujący do indeksu. Chociaż wymiana rozpuszczalnika niesie ze sobą ryzyko deformacji próbki lub innych artefaktów, komórki w stałych, oczyszczonych próbkach mają podobne wymiary ciała komórki, średnicę strzępki i wymiary długości międzyprzegrodowej jak żywe próbki.

Możliwych jest wiele wariantów procesu wymiany rozpuszczalnika (np. przy użyciu innego rozpuszczalnika przejściowego lub innego rozpuszczalnika końcowego). Metanol został wybrany ze względu na jego wysoką polarność i szybką dyfuzję, ale wykazano, że etanol lepiej zachowuje wydajność kwantową białka czerwonej fluorescencji (RFP)26 jako rozpuszczalnik przejściowy. Salicylan metylu został wybrany ze względu na jego indeks, umiarkowaną polarność, niską prężność pary i kompatybilność z wieloma barwnikami, barwnikami i białkami fluorescencyjnymi. Jednak końcowy rozpuszczalnik o nieco niższym indeksie lub mieszanina salicylanu metylu i rozpuszczalnika o niższym indeksie, takiego jak butanol, może służyć lepiej.

Nieoczekiwanie zdolność widzenia przez biofilm ujawnia nie tylko jego uwarstwione cechy wewnętrzne, ale także pomaga w zobaczeniu pochodzenia rozszerzonych struktur, takich jak długie, niesplątane strzępki wierzchołkowe i inwazyjne strzępki podstawy na niektórych podłożach. Oportunistyczna zjadliwość C. albicans zależy od jego genetycznej wszechstronności (tj. przejścia na wzrost strzępek, regulacji w górę podłoża komórkowego i przylegania do komórek komórkowych, wytwarzania osmolitów do pączkowania i wydłużania komórek oraz stosowania alternatywnych składników odżywczych). Rozszerzenie strzępek umożliwia wyrwanie pojedynczych komórek C. albicans z fagocytarnych komórek odpornościowych, ale jest również niezbędne do inwazji. Wydaje się, że adhezja biofilmu i splątanie strzępek zapewniają zakotwiczenie powierzchni potrzebne do skutecznego zaatakowania podłoża przez strzępki. Gdy tym podłożem jest tkanka gospodarza, może dojść do zwiększonej zjadliwości.

Obrazowanie nienaruszonych biofilmów umożliwia przeprowadzenie ogromnej liczby eksperymentów informacyjnych z wykorzystaniem szczepów reporterowych do ekspresji genów, modelowych substratów tkanek oraz włączenia innych organizmów, takich jak bakterie znajdujące się w naturalnych biofilmach. Nawet w najprostszym przypadku obrazowania czysto strukturalnego z barwieniem ściany komórkowej, ujawniają się fenotypy in situ, które następnie mogą być określone ilościowo i przeanalizowane genetycznie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez granty NIH R01 AI067703, R21 AI100270 i R21 AI135178 dla A.P. Mitchella. Autorzy są wdzięczni Greenfieldowi "Kipowi" Sluderowi za dostarczenie obiektywu do zanurzania w oleju na duże odległości robocze użytego w tej pracy, a także Danielowi Shiwarskiemu za mikroskopię konfokalną z bezpośrednim zanurzeniem w salicylanie metylu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pojemnik na odpady niebezpieczne biologicznie Komora
bezpieczeństwa biologicznego z bakteriobójczą lampą
Calcofluor White M2R (2,5 mg/ml w metanolu)
Konkanawalina A - Alexafluor-594 lub inna sprzężona
WodaDW
Woda destylowana, sterylna
Etanol, absolutnyEtOH
Płodowa surowica bydlęca (FBS), sterylna
Butelka na odpady utrwalające w wtórnym zabezpieczeniu
Formaldehyd 20% w wodzie, ampułkiMikroskopia elektronowa Nauki Alternatywy
dla formaldehydu: proszek paraformaldehydu, formalina 37%Nauki o mikroskopii elektronowej
Dygestorium
Aldehyd glutarowy 25% w wodzie, ampułkiMikroskopia elektronowa
Inkubator Naukowy - 30 & deg; C, z mieszalnikiem obrotowym (60 obr./min) do probówek hodowlanych
Inkubator - 37 ° C, z mieszalnikiem orbitalnym do płytek
Isopropanol 70%iPrOH 70%
Longwave (365 nm) Lampa UV, 5 WCole-Parmer Scientificdo utwardzania cementu NOA-61
Arkusz silikonowy klasy medycznej, grubość 0,060 cala (1,52 mm)Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/Niewzmocniona folia silikonowa klasy medycznej
Metanol 99,9% MeOH
Salicylan metylu 99%MS
Millipore Swinnex 13 mm białe silikonowe uszczelki pierścienioweMillipore Corp.
Norland Klej optyczny utwardzany promieniami UV - typ NOA-61Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.comNOA-61
Mieszalnik orbitalny, stołowy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), sterylne
ciecze o standardowym indeksie załamania światła, n = 1,500 do 1,640 (29 cieczy, przyrost 0,005)Cargille Laboratories, https://cargille.comSeria ECedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 podłoże bazowe, buforowane HEPES, sterylne
fiolki scyntylacyjne, 20 ml - Wheaton, wkładka do stożka PE z nasadką mocznikowąFisher Scientific Co.03-341-25Hdo przetwarzania i przechowywania próbek
Butelka na odpady rozpuszczalnikowe w wtórnym zabezpieczeniu
Pożywka pająka z mannitolem, sterylna (1% bulion odżywczy Difco, 0,2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Aglutynina z kiełków pszenicy - Alexafluor-594 lub inny koniugat
Płytki agarowe z drożdżowo-peptonowo-dekstrozowymi (YPD), sterylne (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton baktowy, 2% dekstroza, 2% agar bakto)
pożywka YPD, płynna, sterylna (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton bakto, 2% dekstroza)
UV destylowana hodowlanychSX0001301

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
  2. Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144(2017).
  3. Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
  4. Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
  5. Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226(2018).
  6. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
  7. Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525(2012).
  8. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
  9. Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
  10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
  11. Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  12. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
  13. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  14. Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487(2016).
  15. Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787(2019).
  16. Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
  17. Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, Reprinted in 9, 154-166, 1992 1601-1613 (1991).
  18. Lanni, F., Keller, H. E. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. Yuste, R. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-55 (2011).
  19. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  20. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  21. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  22. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
  23. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
  24. Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
  25. Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , Oberkochen, West Germany. archive CZO-Mi 823, ed. 1967 48(1971).
  26. Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113(2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Klarowanie biofilmusalicylan metylumikroskopia konfokalnawymiana rozpuszczalnikautrwalanie biofilmubarwienie biofilmurefraktometria fazowo kontrastowamieszanie orbitalneprzetwarzanie obrazu

Powiązane artykuły