Artykuł metodologiczny

IR-TEx: Narzędzie do integracji danych typu open source do transkryptomiki dużych zbiorów danych, przeznaczone dla wektora malarii Anopheles gambiae

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60721

⸱

15 stycznia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2Research Computing Unit, Liverpool School of Tropical Medicine, 3Department of Immunology and Infectious Diseases, Harvard T.H. Chan School of Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

IR-TEx bada profile transkrypcyjne związane z odpornością na insektycydy u gatunku Anopheles gambiae. Poniżej znajdują się pełne instrukcje dotyczące korzystania z aplikacji, modyfikacji do eksploracji wielu zbiorów danych transkryptomicznych oraz wykorzystania frameworka do budowy interaktywnej bazy danych dla zbiorów danych transkryptomicznych z dowolnego organizmu, generowanych na dowolnej platformie.

Streszczenie

IR-TEx to aplikacja napisana w Shiny (pakiet R), która umożliwia eksplorację ekspresji (jak również przypisywanie funkcji) transkryptom, których ekspresja jest związana z fenotypami odporności na insektycydy u komarów Anopheles gambiae. Z aplikacji można korzystać online lub pobrać i używać lokalnie przez każdego. Aplikację lokalną można zmodyfikować w celu dodania nowych zestawów danych dotyczących oporności na insektycydy generowanych z wielu platform -omicznych. W tym przewodniku pokazano, jak dodawać nowe zestawy danych i obsługiwać brakujące dane. Co więcej, IR-TEx można całkowicie i łatwo przekodować w celu wykorzystania zestawów danych omicznych z dowolnych danych eksperymentalnych, co czyni go cennym zasobem dla wielu badaczy. Protokół ilustruje użyteczność IR-TEx w identyfikacji nowych kandydatów na oporność na insektycydy, na przykładzie mikrosomalnej transferazy glutationowej, GSTMS1. Ten transkrypt jest regulowany w górę w wielu populacjach opornych na pyretroidy z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso. Identyfikacja współpowiązanych transkryptów dostarcza dalszych informacji na temat przypuszczalnych ról tego genu.

Wprowadzenie

Możliwość jednoczesnego pomiaru ekspresji dużej liczby transkryptów za pomocą platform mikromacierzy i technologii RNAseq zaowocowała wygenerowaniem ogromnych zbiorów danych kojarzących ekspresję transkryptu z określonym fenotypem zarówno w organizmach modelowych, jak i niemodelowych. Zbiory te są niezwykle bogatym zasobem dla badaczy, którego moc można zwiększyć, łącząc odpowiednie zestawy w podejściu do integracji dużych zbiorów danych. Metodologia ta jest jednak ograniczona do osób o szczególnych umiejętnościach bioinformatycznych. Opisany tutaj jest program IR-TEx (wcześniej opublikowany przez Ingham et al.1), który jest napisany w pakiecie R o nazwie Shiny2 i pozwala użytkownikom z niewielkim przeszkoleniem bioinformatycznym integrować i przeszukiwać te zestawy danych ze względną łatwością.

IR-TEx, znaleziony pod adresem http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx, został napisany w celu zbadania transkryptów związanych z odpornością na insektycydy u Anopheles gambiae, głównego afrykańskiego wektora malarii1. Malaria jest chorobą pasożytniczą wywoływaną przez gatunki Plasmodium, przenoszoną między ludźmi poprzez ukąszenia samic komarów Anopheles. Zwalczanie komarów za pomocą środków owadobójczych okazało się najskuteczniejszym sposobem zapobiegania zachorowalności i śmiertelności związanej z malarią w Afryce. Zwiększenie liczby narzędzi (tj. trwałych siatek owadobójczych) miało również kluczowe znaczenie dla radykalnego zmniejszenia liczby przypadków malarii od 2000 roku3. Przy bardzo ograniczonej liczbie dostępnych środków owadobójczych, istnieje silna presja ewolucyjna na komary, a oporność jest obecnie szeroko rozpowszechniona u afrykańskich wektorów malarii4.

Dodatkowo, mutacje miejsca docelowego5 i metaboliczny clearans insektycydów6,7 pozostają głównymi badanymi mechanizmami oporności, ale obecnie pojawiają się inne silne mechanizmy oporności1. Wiele z tych nowych mechanizmów nie było wcześniej związanych z opornością na insektycydy, ale zostały wykryte poprzez poszukiwanie wspólnych wzorców ekspresji genów w wielu odpornych populacjach za pomocą aplikacji IR-TEx, a następnie zweryfikowane funkcjonalnie za pomocą podejść genomicznych1.

Opisane tutaj jest krok po kroku podejście do korzystania z IR-TEx, zarówno w sieci, jak i po zainstalowaniu lokalnie. Protokół opisuje, w jaki sposób nowe zestawy danych o odporności na insektycydy można zintegrować z istniejącym pakietem i wyjaśnia, jak działać z brakującymi danymi. Na koniec opisano, jak używać tego oprogramowania z innymi zestawami danych -omicznych, które nie są związane z opornością na insektycydy, łącząc w ten sposób dane z różnych podejść -omicznych, jednocześnie operując z brakującymi wartościami i normalizacją, aby dane były porównywalne.

Protokół

1. Korzystanie z aplikacji internetowej IR-TEx

  1. Uruchamianie aplikacji w przeglądarce internetowej
    1. Otwórz aplikację internetową IR-TEx, korzystając z linku na dole strony znajdującego się pod adresem http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx.
    2. Po zainicjowaniu strony internetowej kliknij przycisk Aplikacja u góry strony, który wyświetli aplikację i powiązane dane wyjściowe.
    3. Odczytaj każde dane wyjściowe związane z domyślnym wpisem AGAP008212-RA (CYP6M2) w polu identyfikatora transkrypcji z następującymi warunkami: Zestawy danych An. coluzzii, które (i) są narażone na działanie insektycydów pyretroidowych lub (ii) nie są narażone na żadną klasę insektycydów, oraz powiązane transkrypty z korelacją |r| >0,98.
  2. Eksplorowanie wyrażania zainteresowania
    1. Aby wybrać interesującą transkrypcję, wprowadź identyfikator transkrypcji w polu Identyfikator transkrypcji, pamiętając, że transkrypcje kończą się na -RX w zależności od interesującej nas izoformy.
    2. Wybierz zestawy danych do przesłuchania, zaznaczając odpowiednie pola dla (i) krajów; (ii) status narażenia, (iii) gatunki będące przedmiotem zainteresowania; oraz (iv) klasa insektycydu będąca przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym zapewnieniu, że kryteria te skutkują >1 zawartym zbiorem danych (patrz tabela uzupełniająca 1 w Ingham et al.1).
      UWAGA: (iii) odnosi się do członka kompleksu gatunków >An. gambiae, którym zainteresowany jest użytkownik. Obecnie dostępne są dane dotyczące An. coluzzii i An. arabiensis.
    3. Kliknij przycisk Aktualizuj widok u dołu menu wyboru lub naciśnij Return, ignorując wartość korelacji bezwzględnej (na razie).
    4. Daj aplikacji czas na zaktualizowanie.
      5. Przeczytaj pierwszy wykres jako: logarytm2-krotna zmiana między populacją oporną a populacją komarów podatnych na badania laboratoryjne w transkrypcji zainteresowania w każdym zbiorze danych, który spełnia kryteria wybrane w kroku 1.2 (Rysunek 1).
    5. Szczegółowe informacje o wszystkich zestawach danych można znaleźć w Ingham et al.1.
    6. Przeczytaj informacje pod wykresem w następujący sposób: zmiany fałdu między odpornymi i podatnymi komarami dla każdego odpowiedniego zestawu danych, oprócz skorygowanych wartości p (Q). Każdy wiersz reprezentuje poszczególne sondy w mikromacierzy. Metodologia wyświetlania graficznego została wcześniej opisana1.
    7. Zapoznaj się z poniższą dodatkową tabelą, w której podajemy liczbę eksperymentów, w których transkrypcja zainteresowania jest istotna, a także łączną liczbę eksperymentów spełniających kryteria wybrane w kroku 1.2.
    8. Aby pobrać dane w formacie rozdzielonym tabulatorami, kliknij przycisk Pobierz pod dwiema tabelami. Dzięki temu użytkownik może w łatwiejszy sposób eksplorować dane za pomocą programu takiego jak Excel.
    9. Zinterpretuj mapę w następujący sposób: każdy punkt reprezentuje przybliżone miejsca zbierania odpornych komarów w każdym zestawie danych, w których transkrypcja zainteresowania jest wyrażona w różny sposób. Kolory są zgodne z systemem sygnalizacji świetlnej, który jest wyjaśniony w aplikacji (Rysunek 2).
    10. W krokach 1.2.5 i 1.2.8 zapisz wyniki graficzne, klikając prawym przyciskiem myszy, klikając Zapisz obraz jako... i wybierając odpowiedni folder.
      UWAGA: W przypadku błędu wyjściowego aplikacji prawdopodobnie żadne zestawy danych nie spełniają wprowadzonych kryteriów. Sprawdź Tabelę Uzupełniającą 1 w Ingham et al.1, jeśli tak się stanie.
  3. Identyfikacja przypuszczalnych funkcji/ścieżek transkrypcji zainteresowania
    1. Korelacje (wprowadzona minimalna wartość r2) wzorców ekspresji transkryptów w wielu zestawach danych można wykorzystać do przewidywania funkcji transkryptu i potencjalnego wyjaśnienia współregulowanych transkryptów z tego samego szlaku. Korzystając z przykładu z Ingham et al.1 (AGAP001076-RA; CYP4G16), wykonaj kroki 1.2.1–1.2.2 w powyższej sekcji, wybierając wszystkie zestawy danych dla maksymalnej mocy.
    2. Przed kliknięciem przycisku Aktualizuj widok przesuń suwak Wartość korelacji bezwzględnej do pozycji 0,85, a następnie kliknij przycisk Aktualizuj widok lub naciśnij Return.
    3. Sprawdź tabelę korelacji (tabela znajdująca się na samym dole), aby znaleźć wiele transkrypcji, które są teraz wyświetlane i są skorelowane (|r| = 0,85) z wprowadzoną transkrypcją.
    4. Manipuluj suwakiem Wartość korelacji bezwzględnej i obserwuj wszelkie zmiany na najniższym wykresie i w tabeli; dane wyjściowe z kroku 1.3.2 pozostaną niezmienione. Jak pokazano w Rysunek 3 (|r| > 0.9, |r| > 0.8), obniżenie rygorystyczności wartości korelacji pokaże więcej transkrypcji, ale wprowadzi więcej szumu.
    5. Zapoznaj się z poniższą tabelą graficzną, która (oprócz parametrów opisanych w kroku 1.2.6) zawiera wartość korelacji dla każdej transkrypcji.
    6. Aby pobrać dane w formacie rozdzielanym tabulatorami, kliknij przycisk Pobierz.
    7. Analizę wzbogacenia funkcjonalnego można przeprowadzić na pobranej liście identyfikatorów transkrypcji za pomocą DAVID analysis8. Po wejściu na stronę internetową DAVID (znajdującej się pod adresem https://david.ncifcrf.gov/) wybierz Analiza funkcjonalna. Wklej pełną listę genów, używając identyfikatorów genów [identyfikator bez -RX, co można zrobić w programie Excel, wstawiając kolumnę po prawej stronie identyfikatora systematycznego i wpisując = LEWO(X1,10), gdzie X1 to komórka identyfikatora systematycznego]. Wybierz identyfikator jako VectorBase_ID i listę genów, a następnie kliknij przycisk Prześlij listę.
    8. Kliknij przycisk Grupowanie adnotacji funkcjonalnych, aby uzyskać przegląd wzbogaceń znalezionych w tej sieci korelacji, co pozwala na przypisanie potencjalnej funkcji do transkrypcji. Zapoznaj się ze szczegółowymi wzbogaceniami, przeglądając różne kategorie i klikając przyciski + dla każdej z nich, a następnie klikając pozycję Wykres.

2. Pobieranie i implementacja IR-TEx lokalnie

  1. Pobieranie i uruchamianie IR-TEx
    1. Przejdź do linku znajdującego się pod adresem http://github.com/LSTMScientificComputing/IR-TEx; i kliknij Klonuj lub pobierz | Pobierz plik zip. Skieruj się do wybranego folderu i rozpakuj plik w tym folderze.
    2. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania R dla odpowiedniego systemu operacyjnego z linku znajdującego się pod adresem http://cran.r-project.org/mirrors.html. Zainstaluj program.
    3. Pobierz i zainstaluj najnowsze oprogramowanie R Studio, ponownie dla odpowiedniego systemu operacyjnego, korzystając z linku znajdującego się pod adresem http://www.rstudio.com/products/rstudio/download/.
    4. Po zainstalowaniu otwórz program R Studio | Kodowanie uzupełniające File 1 i uruchom każdy wiersz, aby skonfigurować system dla IR-TEx.
    5. Po pomyślnym zainstalowaniu i zaktualizowaniu wszystkich pakietów zgodnie z wymaganiami przejdź do punktu menu Plik | Otwórz, znajdź IR-TEx.R, podświetl i otwórz. Powinno to być teraz widoczne w górnym oknie programu R Studio.
    6. Aby uruchomić aplikację, naciśnij przycisk Uruchom aplikację w prawym górnym rogu okna, a pojawi się drugie okno, w którym aplikacja zostanie załadowana. Po zakończeniu ładowania, aby uzyskać pełną funkcjonalność, kliknij Otwórz w przeglądarce znajdujący się w prawym górnym rogu załadowanego okna.
  2. Dodawanie zestawów danych o rezystancji do IR-TEx (generowanych przy użyciu tablicy Anopheles gambiae 15k Agilent)
    1. Aby dodać nowy analizowany zestaw danych wygenerowany na tej samej platformie mikromacierzy (A-MEXP-2196) do dostępnego zestawu danych, pobierz aplikację i znajdź rozpakowany folder pobrany w sekcji 2.1.
    2. Otwórz plik dodatkowy 1, który reprezentuje dane wyjściowe z analizy limma na A-MEXP-2196 1. Korzystając z programu Excel, w kolumnie H1 napisz Fold_Change, a w H2 napisz =2^B2, w którym B2 to zmiana składania dziennika. Zastosuj to w całej kolumnie H, aby uzyskać surowe zmiany zagięcia.
    3. Ułóż plik dodatkowy 1 w taki sposób, aby kolumna A była identyfikatorem, kolumna B była zmianą zagięcia z kolumny H (skopiuj kolumnę H, zaznacz kolumnę B, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wklej wartości), a kolumna C jest skorygowaną wartością p. Usuń wszystkie inne kolumny i zapisz je jako plik rozdzielany tabulatorami.
    4. Otwórz plik kodowania uzupełniającego 2 i uruchom go, korzystając z arkusza rozdzielanego tabulatorami utworzonego w kroku 2.2.3.
      NEWFILE_FC = c('KRAJ','STATUS NARAŻENIA','GATUNEK','INSEKTYCYD')
      NEWFILE_Q = c('KRAJ','STATUS NARAŻENIA','GATUNEK','INSEKTYCYD')
      UWAGA: Pola w pojedynczych cudzysłowach powinny zostać zmienione tak, aby odzwierciedlały informacje z nowego zestawu danych. Status narażenia odnosi się do tego, czy próbki zostały pobrane po narażeniu na insektycydy (narażone/nienarażone). Środek owadobójczy: jeśli jest "nienarażony", nie należy go stosować. Zobacz Fold_Changes.txt. dla metadanych z innych próbek. Upewnij się, że pisownia jest spójna.
    5. Otwórz geography.txt, przewiń do ostatniego zajętego wiersza i wybierz poniżej. Wpisz nazwę zbioru danych, a następnie Q i NEWFILE_Q w kolumnie 1, szerokość geograficzną miejsca pobierania próbek w kolumnie 2 i długość geograficzną w kolumnie 3. Zapisz zmiany.
    6. Jeśli zostaną użyte jakiekolwiek nowe wpisy (np. Gambia), które nie są dostępne do wyboru w zbiorze danych (patrz Ingham et al. Tabela uzupełniająca 11), będą one musiały zostać dodane do kodu. W tym celu otwórz IR-TEx.R w programie RStudio i znajdź wiersz 26 wskazany przez program RStudio, w którym to momencie powinny rozpocząć się następujące czynności:
      'sidebarPanel(....'.
      UWAGA: Każdy z kolejnych wierszy odnosi się do elementu metadanych wprowadzonego do wierszy poniżej nazwy zestawu danych w Fold_Changes.txt w kroku 2.2.5.
    7. Aby dodać nowe metadane, przewiń do końca wiersza wybranych metadanych i znajdź termin "selected=". Bezpośrednio po tym powinien znajdować się przecinek i nawias zamknięty; W tym momencie kliknij kursor w zamkniętym nawiasie kwadratowym. Po ostatnim apostrofie wpisz przecinek, a następnie apostrof, a następnie nowe metadane (np. "Gambia") i zapisz zmiany. Poniżej znajduje się przykład.
      checkboxGroupInput('CountryInput','Wybierz odpowiednie kraje',c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun','Gwinea Równikowa','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun', "Gwinea Równikowa",'Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo'))
    8. Uruchom aplikację. Nowy wpis metadanych powinien być wyświetlany jako niezaznaczone pole wyboru pod odpowiednim nagłówkiem. Jeśli użytkownik chce, aby był zaznaczony, powinien zostać dodany po selected=c(..., jak pokazano poniżej:
      checkboxGroupInput('CountryInput','Wybierz odpowiednie kraje',c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun','Gwinea Równikowa','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun', "Gwinea Równikowa",'Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'))
    9. Aby dodać zestawy danych rezystancji, które nie są wykonywane na A-MEXP-2196, patrz sekcja 3.

3. Modyfikowanie IR-TEx do użytku z różnymi zestawami danych

  1. Używaj na wielu platformach -omics i kontynuuj z brakującymi danymi
    1. Aby kontynuować z "0" w zestawach danych: skonsultuj się ze źródłem zestawu danych, aby uzyskać szczegółowe znaczenie "0". Zaleca się (konserwatywnie) zamianę "0" na "NA". Podobnie jak w przypadku surowych zmian krotności (B/A), "0" oznacza niewykryty sygnał w warunkach eksperymentalnych B. W przypadku, gdy warunek eksperymentalny A wykazuje wyrażenie substancjalne, użytkownik może zastosować małą wartość zmiany krotności.
    2. Otwórz Additional File 2.txt, plik RNAseq zaadaptowany z Uyhelji et al.9. Ten plik reprezentuje szablon, na którym powinny opierać się nowe dane: kolumna A = identyfikator, kolumna B = nieprzetworzona zmiana zagięcia, a kolumna C = skorygowana wartość p. Użyj tego pliku, aby wykonać poniższe kroki.
    3. Uruchom kod języka R, aby dopasować identyfikatory do jednego pliku rozdzielanego tabulatorami na różnych platformach, a następnie uporządkuj i znormalizuj dane (Supplemental Coding File 2). Instrukcje są zawarte w pliku. Każda ścieżka do pliku będzie oddzielona znakiem "/" dla systemu MacOS lub "//" dla systemu Windows (zmień je z "\", tak jak się pojawią).
    4. Wyślij plik utworzony na końcu dodatkowego pliku kodowania 2 do wybranej lokalizacji do użycia w kroku 3.1.5. Supplemental Coding File 2 wygeneruje nowy plik Fold_Changes.txt. Utwórz kopię zapasową oryginalnego pliku.
    5. Wykonaj kod zawarty w dodatkowym pliku kodowania 3. Znajdź plik wyjściowy o nazwie FC_distribPlot.png w folderze określonym jako FILEPATH. Sprawdź rozkłady zmian logarytmu2-krotności, aby sprawdzić, czy rozkłady zmian logarytmu2-krotności są prawie identyczne w zestawach danych.
    6. Postępuj zgodnie z instrukcjami z kroku 2.2.6, aby edytować dodatkowe pliki i zapewnić zgodność nowego Fold_Changes.txt.
  2. Modyfikowanie IR-TEx do użytku z zupełnie nowymi zestawami danych
    1. Otwórz IR-TEx.R w programie RStudio i znajdź wiersze (23–34) zaczynające się od:
      'tabPanel('
      i kończące się na:
      submitButton("Aktualizuj widok", icon("odśwież"))<br /> ),
    2. Zmień AGAP008212-RA znaleziony w poniższych wierszach na transkrypcję zainteresowania nowymi danymi.
      textInput('textInput','ID transkrypcji',value='AGAP008212-RA'),
    3. Znajdź cztery opcje zaczynające się od:
      checkboxGroupInput(
      Te opcje można modyfikować tak, aby reprezentowały ważne metadane, według których użytkownik chce filtrować nowe dane. W każdym przypadku użytkownik powinien zmienić opcję Wybierz odpowiednie kraje; Wybierz stan ekspozycji; wybrać odpowiednie gatunki; i wybierz klasę insektycydu, która ma być reprezentatywna dla danych (tj. wybierz typ tkanki; Wybierz płeć; Wybierz przedział wiekowy; Wybierz Stan choroby).
    4. Zidentyfikuj metadane skojarzone z zestawem danych i danymi wejściowymi, aby zastąpić istniejące opcje natychmiast po pierwszym c('. W każdym przypadku opcje będą zawarte w znakach mowy i oddzielone od następnego zaznaczenia przecinkiem. Po ostatecznym wyborze nawias powinien zostać zamknięty. Przykładem Select Disease Status jest:
      c('Zakażony', 'Niezainfekowany', 'Nieznany')
    5. Wybierz, które z tych metadanych zostaną wybrane po otwarciu aplikacji. Można je zmienić, modyfikując opcje po selected=c('. Przykładem Select Disease Status jest:
      selected=c('Zainfekowany', 'Niezainfekowany')
      Spowoduje to poinstruowanie aplikacji, aby wybrała tylko zestawy danych spełniające te kryteria podczas początkowego ładowania.
    6. Aby utworzyć nową tabelę danych, postępuj zgodnie z układem znajdującym się w Fold_Changes.txt i instrukcjami w sekcji 2. Zmień metadane na każdą odpowiednią zmianę opisaną w kroku 3.2.4, dokładnie tak, jak została zapisana w kodzie (w języku R rozróżniana jest wielkość liter). Do kolumny detoksykacji wprowadź nazwy genów, a w kolumnie typu transkryptu wprowadź opisy genów dla każdego transkryptu. Postępuj zgodnie z sekcją 3.2 podczas dodawania nowych zestawów danych.
    7. Jeśli mapowanie nie jest istotne dla wymagań eksperymentalnych, znajdź następujące wiersze kodu i umieść "#" z przodu:
      Wiersze 49–51:
      br(),br(),
      withSpinner(plotOutput("Geografia")),
      textOutput('Geography_legend'),
      Linie 493 zaczynające się:
      output$Geography <- renderPlot({
      Do końca wiersza 602:
      output$Geography_legend <- renderText({
      paste("Tylko znaczące transkrypcje (p", as.expression("<="),"0.05): FC > 5 = Czerwony, FC > 1 = Bursztynowy, FC < 1 = Zielony",sep="")
      })

Wyniki

Wykorzystując plik Fold_Changes.txt dołączony do IR-TEx, porównaliśmy transkrypty wykazujące istotną różnicę w ekspresji w zbiorach danych dla osobników opornych Anopheles coluzzii oraz Anopheles gambiae w stosunku do kontroli podatnych z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso. Pozwoliło to na wyłonienie 18 interesujących transkryptów (Tabela 1; wyszukiwania tego można dokonać za pomocą programu Excel, R lub innych programów). Dwa z nich, ATPase (AGAP06879) oraz α-krystalina (AGAP07160), były raportowane wcześniej, przy czym ten pierwszy wywiera znaczący wpływ na oporność na pyretroidy1. Oprócz tych dwóch transkryptów obecne były dwa transkrypty związane z detoksykacją, GSTMS1 (FCµ = 1.95 oraz 1.85) oraz UGT306A2 (FCµ = 2.29 oraz 2.28).

Walidacja qPCR dwóch z tych transkryptów (GSTMS1, transkryptu detoksykacyjnego oraz AGAP0910-RA, nieznanego transkryptu specyficznego dla komarów, zawierającego domenę wiążącą β-1,3-glukan) została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem1. Analizę wykonano przy użyciu zestawów starterów opisanych w Dodatkowym Pliku 3, która wykazała, że transkrypty te były znacznie silniej ekspresjonowane w populacjach wielolekowej z Wybrzeża Kości Słoniowej (Tiassalé) oraz z Burkina Faso (Banfora) w porównaniu do laboratoryjnej populacji podatnej N'Gousso (Rycina 4A).

Ponieważ oba transkrypty wykazały znaczną nadekspresję w każdej z populacji opornych, przeprowadzono wyciszenie indukowane przez RNAi u komarów z kolonii Tiassalé w laboratorium LSTM. Kolonia ta pochodzi z Côte D'Ivoire i jest oporna na wszystkie główne klasy insektycydów stosowanych w zdrowiu publicznym, co opisano wcześniej1,10. Osłabienie ekspresji GSTMS1 doprowadziło do istotnego wzrostu (p = 0,021) śmiertelności po ekspozycji na deltametrynę w porównaniu z grupą kontrolną wstrzykniętą GFP, co dowodzi znaczenia tego transkryptu w oporności na pyretrydy (Rysunek 4B). Z kolei wyciszenie AGAP00910-RA nie spowodowało istotnej (p = 0,082) zmiany śmiertelności po ekspozycji (Rysunek 4B).

GSTMS1 jest mikrosomalną GST i jest jednym z trzech takich enzymów znalezionych u komarów A. gambiae1. Chociaż członkowie klas epsilon i delta GST byli wcześniej powiązani z detoksykacją insektycydów12,13,14, są to według naszej wiedzy pierwsze dowody na rolę mikrosomalnych GST w oporności na pyretrynowe środki owadobójcze15. Aby zbadać domniemaną funkcję tego transkryptu u komarów Anopheles gambiae sl, zidentyfikowano ekspresję i korelację w IR-TEx. GSTMS1 był znacząco nadmiernie ekspresyjny w 20 z 21 zbiorów danych dostępnych dla tych gatunków, z wyjątkiem wyspy Bioko. W każdej lokalizacji nadekspresja była mniejsza niż pięciokrotna w porównaniu z populacjami podatnymi (Rysunek 5).

Ponieważ mikrosomalne GST były w dużej mierze pomijane jako potencjalne enzymy detoksykacyjne insektycydów, niewiele wiadomo o ich roli w oporności na insektycydy15. Poprzez badanie współkorelacji innych transkryptów można wyjaśnić przypuszczalne funkcje, zakładając współregulację lub udział w tych samych szlakach. Aby zmaksymalizować moc w sieci korelacji, wybrano wszystkie zbiory danych z mikromacierzy dostępne w IR-TEx oraz przyjęto wartość |r| >0,75. Tabela 2 przedstawia wyniki uzyskane z IR-TEx.

Transkrypty te są wzbogacone pod kątem aktywności oksydoreduktazy oraz metabolizmu glukozy/węglowodanów w narzędziu do adnotacji funkcjonalnych DAVID8. Zarówno dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, jak i cystationy gamma-lyaza utrzymują poziom glutationu w komórkach ssaków16,17, a tym samym wiążą się bezpośrednio z GSTMS1, która jest transferazą S-glutationową. Katalaza jest szybko działającym respondorem na stres oksydacyjny, który chroni komórki przed uszkodzeniami wywołanymi przez reaktywne formy tlenu, będące produktem ubocznym ekspozycji na pyretrynoidy. Hydrolaza walacyklowiru to hydrolaza, która może odgrywać rolę w detoksykacji w komórkach ssaków18. W sieci korelacji obecny jest również CYP4H17. Cytochromy P450 są bezpośrednimi metabolizerami insektycydów pyretrynoidowych, a produkty ich rozkładu mogą być dalej metabolizowane przez GST. Wreszcie, CYP4H17 został powiązany z opornością na pyretrynoidy u A. funestus19. Wspólnie dane te silnie wspierają rolę GSTMS1 w detoksykacji ksenobiotyków.

Wykres liniowy ekspresji genów, zmiana logarytmiczna (Log2 fold change) w różnych próbkach; wizualizacja analizy danych.
Rysunek 1: Log2 zmiana krotności (fold change) AGAP02865-RA we wszystkich zbiorach danych. Oś x przedstawia poszczególne zbiory danych, których informacje znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1 w poprzedniej publikacji1, a oś y przedstawia logarytm2 zmiana krotności (fold change) w transkrypcie będącym przedmiotem zainteresowania. Jasnoszare linie przerywane wskazują przybliżone progi istotności, przyjęte w tym przypadku jako zmiana krotności wynosząca <0,8 lub krotność zmiany >1.2. Przerywana czarna linia oznacza krotność zmiany równą 1 (t. j. brak różnic w ekspresji między populacjami opornymi a podatnymi). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Mapa przedstawiająca skupiska incydentów w Afryce z kolorowymi znacznikami wskazującymi poziomy dotkliwości.
Rysunek 2: Rozkład macierzy mikroarray wykazujących istotną różnicową ekspresję AGAP02865-RA w populacjach opornych. Zmiany krotności (fold changes) przedstawiono w systemie sygnalizacji świetlnej: zielony kolor oznacza zmianę krotności o <1, pomarańczowa krotność zmiany dla >1, a czerwony kolor krotności zmiany (fold change) dla >5. Przedstawiono wyłącznie zestawy danych z istotną (p ≤ 0,05) różnicową ekspresją. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy ekspresji genów, Log2 Fold Change, dane porównawcze, kwantyfikacja transkrypcyjna.
Rycina 3: Sieci korelacji AGAP01076-RA (CYP4G16). Korelacje parowe są obliczane dla wszystkich transkrypty we wszystkich 31 zbiorach danych z mikromacierzy, z zastosowaniem zdefiniowanego przez użytkownika progu odcięcia. Przedstawiono tutaj (A) |r| > 0,9 i (B) |r| > 0.8. Wszystkie transkrypty przedstawione na wykresie spełniają to kryterium i wykazują zmiany ekspresji zgodne z AGAP01076-RA. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający wskaźniki śmiertelności dla AGAP0165, AGAP09110; analiza wstrzyknięcia GFP w Tiassale, Banfora.
Rycina 4: Ekspresja mRNA i fenotyp po osłabieniu GSTMS1 oraz AGAP09110-RA. (Aekspresja mRNA genów GSTMS1 i AGAP0910-RA w dwóch wieloodpornych An. coluzzii populacje z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso, odpowiednio. Poziomy porównano z populacją laboratoryjną wrażliwą An. coluzzii N'Gousso. Poziomy istotności obliczone za pomocą analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Dunnetta. (B) Osłabienie ekspresji obu transkryptów indukowane przez RNAi w porównaniu z kontrolami po wstrzyknięciu GFP. GSTMS1 osłabienie wykazuje istotny wzrost śmiertelności po narażeniu na deltametrynę (obliczone za pomocą analizy ANOVA z testem post-hoc Tukeya; *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mapa przedstawiająca lokalizacje geograficzne obszarów badawczych w Afryce Zachodniej i Środkowej.
Rysunek 5: Ekspresja GSTMS1 w Anopheles gambiae i Anopheles coluzzii populacje. Mapa przedstawiająca istotne różnice w ekspresji GSTMS1 w dostępnych zbiorach danych mikromacierzy. GSTMS1 stwierdzono istotną różnicę w 20 z 21 zbiorów danych z mikromacierzy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Id transkryptuOpisBurkina FasoWybrzeże Kości Słoniowej
AGAP06879-RAATPaza27.9443.05
AGAP07160-RBa-krystalina1.4910.58
AGAP07160-RCa-krystalina1.1410.38
AGAP07160-RAa-krystalina9.789.84
AGAP0910-RANieznane9.265.96
AGAP00780-RADehydrogenaza NADH10.493.7
AGAP06383-RApodjednostka beta kompleksu oligosacharylotransferazy3.695.57
AGAP007249-RBFlightina4.613.86
AGAP00357-RAbiałko podobne do białka 1 aktywującego RAG14.314.05
AGAP07249-RAFlightina4.483.46
AGAP01998-RAmRpS103.462.85
AGAP007589-RAUGT306A22.292.28
AGAP0165-RAGSTMS11.951.85
AGAP02101-RAizoleucylo-tRNA syntetaza0.570.59
AGAP02969-RAasparaginylo-tRNA syntetaza0.450.45
AGAP0419-RArodzina transporterów solutowych 5 ( transporter monokarboksylanów zależny od sodu), członek 80.350.48
AGAP04684-RAbiałko CGR1 przetwarzające rRNA0.360.2
AGAP06414-RACht80.0240.36

Tabela 1: Transkrypty wykazujące istotne różnice w tym samym kierunku zmiany krotności (fold change) w populacjach z Burkina Faso i Wybrzeża Kości Słoniowej. Id transkryptu, opis genu oraz średnia zmiana krotności dla każdego zestawu danych z dwóch krajów reprezentujących populacje An. coluzzii i An. gambiae.

KorelacjaNazwa systematycznaTyp transkrypcji
1AGAP00165-RAGSTMS1
0.82AGAP04904-RAKatalaza
0.76AGAP07243-RApodjednostka regulacyjna 8 proteazy 26S
0.79AGAP08358-RACYP4H17
0.76AGAP09436-RAHydrolaza walacyklowiru
0.75AGAP010739-RAGlukozo-6-fosforan-1-dehydrogenaza
0.85AGAP01172-RAcystationina gamma-lyaza
0.76AGAP012678-RAGlukozo-6-fosforan-1-dehydrogenaza

Tabela 2: Transkrypty skorelowane z GSTMS1. Tabela przedstawia wyniki sieci korelacji dla GSTMS1 w bazie IR-TEx z wartością |r| >0,75. Tabela zawiera korelację Spearmana, identyfikator transkryptu oraz opis genu dla każdego skorelowanego transkryptu.

Dodatkowy plik 1: Plik wynikowy z macierzy A-MEXP-2196 przeanalizowanej za pomocą limma. Plik pochodzi z macierzy porównującej wyciszenie genu Met z kontrolą GFP, opisanej bardziej szczegółowo w ArrayExpress (E-MTAB-4043) oraz w innej wcześniejszej publikacji1. Kolumny reprezentują identyfikator AGAP (SystematicName), logarytmiczną zmianę krotności (logFC), logarytmiczne wartości ekspresji (AveExpr), statystykę t (t), niepoprawioną wartość p (P.Value), skorygowaną wartość p (adj.P.Val) oraz statystykę B (B)20. Na potrzeby tego pliku wykorzystano komary Anopheles coluzzi z Wybrzeża Kości Słoniowej, nieeksponowane na insektycydy, zebrane przy szerokości geograficznej -5,4 i długości geograficznej 6,0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowy plik 2: Plik wynikowy z eksperymentu RNAseq. Analiza RNAseq pochodząca z pracy Uyhelji i wsp.9, opisująca zmiany w transkryptomie komarów z rodzaju Anopheles po wystawieniu na 50% zasolenie. Plik ten jest adaptacją Tabeli S2 z publikacji i zawiera identyfikator AGAP (SystematicID), surową krotność zmiany (Fold_Change) oraz skorygowaną wartość p (q_value). Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowy plik 3: Lista starterów dla reprezentatywnych wyników. Identyfikator AGAP, nazwa genu, zestawy starterów dsRNA forward, dsRNA reverse, qPCR forward oraz qPCR reverse dla każdego transkryptu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Uzupełniający plik z kodem 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowy plik z kodem 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowy plik z kodem 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Transkryptomika dużych zbiorów danych tworzy listy tysięcy transkryptów, które są różnie wyrażane dla każdego warunku eksperymentalnego. Wiele z tych eksperymentów przeprowadza się na pokrewnych organizmach i fenotypach i są one prawie wyłącznie analizowane jako niezależne eksperymenty. Wykorzystanie tych bogatych źródeł danych poprzez całościowe badanie danych i bez założeń teoretycznych 1) doprowadzi do identyfikacji nowych kandydujących transkryptów i 2) zapobiegnie odrzuceniu cennych danych tylko dlatego, że jest zbyt wiele informacji do walidacji in vivo1.

IR-TEx zapewnia użytkownikom z ograniczonym zapleczem bioinformatycznym możliwość łatwego badania wielu zestawów danych, wizualizacji zmian w zestawach danych i pobierania powiązanych informacji1. Chociaż IR-TEx nie obsługuje wyszukiwania więcej niż jednej transkrypcji w każdym wyszukiwaniu, użytkownicy mogą sprawdzić skojarzone pliki Fold_Changes.txt po prostu za pomocą programu Excel, R lub innych odpowiednich programów. Dalsza użyteczność IR-TEx wynika z wykorzystania sieci korelacji do przewidywania funkcji transkryptu, wprowadzania hipotetycznych białek lub transkryptów o nieznanych funkcjach oraz wykorzystania oprogramowania do wyszukiwania wzbogaceń1.

W przykładzie przedstawionym w tym protokole IR-TEx jest używany zgodnie ze swoją pierwotną funkcją. W tym przypadku umożliwia eksplorację transkryptów związanych z odpornością na insektycydy i wizualizację rozkładu nadekspresji i niedostatecznej ekspresji za pomocą grafiki mapowania. Interesujące nas transkrypty są weryfikowane in vivo w celu określenia, czy nadmierna lub niedostateczna ekspresja danych transkryptów przyczynia się do obserwowanego fenotypu1 (np. Oporności na insektycydy). Wykazano tutaj, jak wcześniej informowaliśmy1, że zestaw danych może być wykorzystany w podejściu opartym na hipotezach w celu identyfikacji interesujących transkrypcji na podstawie specyficznych dla danego kraju. IR-TEx może być następnie wykorzystany do 1) zbadania ekspresji transkryptu i 2) kontekstualizacji funkcji transkryptu poprzez zastosowanie sieci korelacji parami we wszystkich transkryptach zawartych w każdym zbiorze danych -omicznych. W tym przypadku wykazano, że GSTMS1 jest skorelowany z wieloma innymi transkryptami zaangażowanymi w detoksykację. Dane te (wraz z knockdownem transkryptu, który spowodował znaczny wzrost śmiertelności po ekspozycji na insektycydy) pokazują znaczenie tego transkryptu w klirensie ksenobiotyków.

IR-TEx stanowi cenne źródło informacji na temat transkryptów związanych z opornością na insektycydy w Internecie lub przy użyciu aplikacji lokalnych. Protokół ten pokazuje, jak modyfikować IR-TEx dla różnych platform -omicznych, a także dla zupełnie nowych danych. Przewodnik ilustruje, jak używać IR-TEx do integrowania danych z wielu platform -omicznych i zestawów danych z brakującymi danymi, a także jak w prosty sposób rekodować IR-TEx, aby był przydatny dla każdego, kto bada zestawy danych transkryptomicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez MRC Skills Development Fellowship dla V.I. (MR/R024839/1) oraz Royal Society Challenge Grant (CH160059) dla H.R.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laptop z przeglądarkąDowolny
program - R ProjektR do obliczeń statystycznych-https://www.r-project.org/
R StudioR Studio-https://www.rstudio.com/

Bibliografia

  1. Ingham, V. A., Wagstaff, S., Ranson, H. Transcriptomic meta-signatures identified in Anopheles gambiae populations reveal previously undetected insecticide resistance mechanisms. Nature Communications. 9 (1), 5282(2018).
  2. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. , (2017).
  3. Bhatt, S., et al. The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015. Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).
  4. Ranson, H., Lissenden, N. Insecticide Resistance in African Anopheles Mosquitoes: A Worsening Situation that Needs Urgent Action to Maintain Malaria Control. Trends in Parasitology. 32 (3), 187-196 (2016).
  5. Donnelly, M. J., et al. Does kdr genotype predict insecticide-resistance phenotype in mosquitoes. Trends in Parasitology. 25 (5), 213-219 (2009).
  6. Stevenson, B. J., et al. Cytochrome P450 6M2 from the malaria vector Anopheles gambiae metabolizes pyrethroids: Sequential metabolism of deltamethrin revealed. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41 (7), 492-502 (2011).
  7. Müller, P., et al. Field-Caught Permethrin-Resistant Anopheles gambiae Overexpress CYP6P3, a P450 That Metabolises Pyrethroids. PLoS Genetics. 4 (11), 1000286(2008).
  8. Huang, D., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183(2007).
  9. Uyhelji, H. A., Cheng, C., Besansky, N. J. Transcriptomic differences between euryhaline and stenohaline malaria vector sibling species in response to salinity stress. Molecular Ecology. 25 (10), 2210-2225 (2016).
  10. Edi, C. V., Benjamin, K. G., Jones, C. M., Weetman, D., Ranson, H. Multiple-Insecticide Resistance in Anopheles gambiae Mosquitoes, Southern Côte d’Ivoire. Emerging Infectious Diseases. 18 (9), 1508-1511 (2012).
  11. Ding, Y., Ortelli, F., Rossiter, L., Hemingway, J., Ranson, H. The Anopheles gambiae glutathione transferase supergene family: annotation, phylogeny and expression profiles. BMC Genomics. 4 (1), 1-16 (2003).
  12. Enayati, A. A., Ranson, H., Hemingway, J. Insect glutathione transferases and insecticide resistance. Insect Molecular Biology. 14 (1), 3-8 (2005).
  13. Ranson, H., et al. Identification of a novel class of insect glutathione S-transferases involved in resistance to DDT in the malaria vector Anopheles gambiae. The Biochemical Journal. 359, 295-304 (2001).
  14. Riveron, J. M., et al. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector. Genome Biology. 15 (2), 27(2014).
  15. Pavlidi, N., Vontas, J., Van Leeuwen, T. The role of glutathione S-transferases (GSTs) in insecticide resistance in crop pests and disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 27, 97-102 (2018).
  16. Salvemini, F., et al. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6-phosphate dehydrogenase expression. Journal of Biological Chemistry. 274 (5), 2750-2757 (1999).
  17. Deplancke, B., Gaskins, H. R. Redox control of the transsulfuration and glutathione biosynthesis pathways. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 5 (1), (2002).
  18. Puente, X. S., López-Otn, C. Cloning and expression analysis of a novel human serine hydrolase with sequence similarity to prokaryotic enzymes involved in the degradation of aromatic compounds. Journal of Biological Chemistry. 270 (21), 12926-12932 (1995).
  19. Riveron, J. M., et al. Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).
  20. Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3 (1), 3(2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

odporność na insektycydydane transkrypcyjneaplikacja IR-TExanaliza ekspresji genówanaliza korelacjidane z mikromacierzyadnotacja funkcjonalnaodporność na pyretroidy
IR-TEx: Narzędzie do integracji danych typu open source do transkryptomiki dużych zbiorów danych, przeznaczone dla wektora malarii Anopheles gambiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.