IR-TEx: Narzędzie do integracji danych typu open source do transkryptomiki dużych zbiorów danych, przeznaczone dla wektora malarii Anopheles gambiae

Summary

IR-TEx bada profile transkrypcyjne związane z odpornością na insektycydy u gatunku Anopheles gambiae. Poniżej znajdują się pełne instrukcje dotyczące korzystania z aplikacji, modyfikacji do eksploracji wielu zbiorów danych transkryptomicznych oraz wykorzystania frameworka do budowy interaktywnej bazy danych dla zbiorów danych transkryptomicznych z dowolnego organizmu, generowanych na dowolnej platformie.

Abstract

IR-TEx to aplikacja napisana w Shiny (pakiet R), która umożliwia eksplorację ekspresji (jak również przypisywanie funkcji) transkryptom, których ekspresja jest związana z fenotypami odporności na insektycydy u komarów Anopheles gambiae. Z aplikacji można korzystać online lub pobrać i używać lokalnie przez każdego. Aplikację lokalną można zmodyfikować w celu dodania nowych zestawów danych dotyczących oporności na insektycydy generowanych z wielu platform -omicznych. W tym przewodniku pokazano, jak dodawać nowe zestawy danych i obsługiwać brakujące dane. Co więcej, IR-TEx można całkowicie i łatwo przekodować w celu wykorzystania zestawów danych omicznych z dowolnych danych eksperymentalnych, co czyni go cennym zasobem dla wielu badaczy. Protokół ilustruje użyteczność IR-TEx w identyfikacji nowych kandydatów na oporność na insektycydy, na przykładzie mikrosomalnej transferazy glutationowej, GSTMS1. Ten transkrypt jest regulowany w górę w wielu populacjach opornych na pyretroidy z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso. Identyfikacja współpowiązanych transkryptów dostarcza dalszych informacji na temat przypuszczalnych ról tego genu.

Introduction

Możliwość jednoczesnego pomiaru ekspresji dużej liczby transkryptów za pomocą platform mikromacierzy i technologii RNAseq zaowocowała wygenerowaniem ogromnych zbiorów danych kojarzących ekspresję transkryptu z określonym fenotypem zarówno w organizmach modelowych, jak i niemodelowych. Zbiory te są niezwykle bogatym zasobem dla badaczy, którego moc można zwiększyć, łącząc odpowiednie zestawy w podejściu do integracji dużych zbiorów danych. Metodologia ta jest jednak ograniczona do osób o szczególnych umiejętnościach bioinformatycznych. Opisany tutaj jest program IR-TEx (wcześniej opublikowany przez Ingham et al.¹), który jest napisany w pakiecie R o nazwie Shiny² i pozwala użytkownikom z niewielkim przeszkoleniem bioinformatycznym integrować i przeszukiwać te zestawy danych ze względną łatwością.

IR-TEx, znaleziony pod adresem http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx, został napisany w celu zbadania transkryptów związanych z odpornością na insektycydy u Anopheles gambiae, głównego afrykańskiego wektora malarii¹. Malaria jest chorobą pasożytniczą wywoływaną przez gatunki Plasmodium, przenoszoną między ludźmi poprzez ukąszenia samic komarów Anopheles. Zwalczanie komarów za pomocą środków owadobójczych okazało się najskuteczniejszym sposobem zapobiegania zachorowalności i śmiertelności związanej z malarią w Afryce. Zwiększenie liczby narzędzi (tj. trwałych siatek owadobójczych) miało również kluczowe znaczenie dla radykalnego zmniejszenia liczby przypadków malarii od 2000 roku³. Przy bardzo ograniczonej liczbie dostępnych środków owadobójczych, istnieje silna presja ewolucyjna na komary, a oporność jest obecnie szeroko rozpowszechniona u afrykańskich wektorów malarii⁴.

Dodatkowo, mutacje miejsca docelowego⁵ i metaboliczny clearans insektycydów^6,7 pozostają głównymi badanymi mechanizmami oporności, ale obecnie pojawiają się inne silne mechanizmy oporności¹. Wiele z tych nowych mechanizmów nie było wcześniej związanych z opornością na insektycydy, ale zostały wykryte poprzez poszukiwanie wspólnych wzorców ekspresji genów w wielu odpornych populacjach za pomocą aplikacji IR-TEx, a następnie zweryfikowane funkcjonalnie za pomocą podejść genomicznych¹.

Opisane tutaj jest krok po kroku podejście do korzystania z IR-TEx, zarówno w sieci, jak i po zainstalowaniu lokalnie. Protokół opisuje, w jaki sposób nowe zestawy danych o odporności na insektycydy można zintegrować z istniejącym pakietem i wyjaśnia, jak działać z brakującymi danymi. Na koniec opisano, jak używać tego oprogramowania z innymi zestawami danych -omicznych, które nie są związane z opornością na insektycydy, łącząc w ten sposób dane z różnych podejść -omicznych, jednocześnie operując z brakującymi wartościami i normalizacją, aby dane były porównywalne.

Protocol

1. Korzystanie z aplikacji internetowej IR-TEx

1. Uruchamianie aplikacji w przeglądarce internetowej
   1. Otwórz aplikację internetową IR-TEx, korzystając z linku na dole strony znajdującego się pod adresem http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx.
   2. Po zainicjowaniu strony internetowej kliknij przycisk Aplikacja u góry strony, który wyświetli aplikację i powiązane dane wyjściowe.
   3. Odczytaj każde dane wyjściowe związane z domyślnym wpisem AGAP008212-RA (CYP6M2) w polu identyfikatora transkrypcji z następującymi warunkami: Zestawy danych An. coluzzii, które (i) są narażone na działanie insektycydów pyretroidowych lub (ii) nie są narażone na żadną klasę insektycydów, oraz powiązane transkrypty z korelacją |r| >0,98.
2. Eksplorowanie wyrażania zainteresowania
   1. Aby wybrać interesującą transkrypcję, wprowadź identyfikator transkrypcji w polu Identyfikator transkrypcji, pamiętając, że transkrypcje kończą się na -RX w zależności od interesującej nas izoformy.
   2. Wybierz zestawy danych do przesłuchania, zaznaczając odpowiednie pola dla (i) krajów; (ii) status narażenia, (iii) gatunki będące przedmiotem zainteresowania; oraz (iv) klasa insektycydu będąca przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym zapewnieniu, że kryteria te skutkują >1 zawartym zbiorem danych (patrz tabela uzupełniająca 1 w Ingham et al.¹).
      UWAGA: (iii) odnosi się do członka kompleksu gatunków >An. gambiae, którym zainteresowany jest użytkownik. Obecnie dostępne są dane dotyczące An. coluzzii i An. arabiensis.
   3. Kliknij przycisk Aktualizuj widok u dołu menu wyboru lub naciśnij Return, ignorując wartość korelacji bezwzględnej (na razie).
   4. Daj aplikacji czas na zaktualizowanie.
   Przeczytaj pierwszy wykres jako: logarytm_2-krotna zmiana między populacją oporną a populacją komarów podatnych na badania laboratoryjne w transkrypcji zainteresowania w każdym zbiorze danych, który spełnia kryteria wybrane w kroku 1.2 (Rysunek 1).
   5. Szczegółowe informacje o wszystkich zestawach danych można znaleźć w Ingham et al.¹.
   6. Przeczytaj informacje pod wykresem w następujący sposób: zmiany fałdu między odpornymi i podatnymi komarami dla każdego odpowiedniego zestawu danych, oprócz skorygowanych wartości p (Q). Każdy wiersz reprezentuje poszczególne sondy w mikromacierzy. Metodologia wyświetlania graficznego została wcześniej opisana¹.
   7. Zapoznaj się z poniższą dodatkową tabelą, w której podajemy liczbę eksperymentów, w których transkrypcja zainteresowania jest istotna, a także łączną liczbę eksperymentów spełniających kryteria wybrane w kroku 1.2.
   8. Aby pobrać dane w formacie rozdzielonym tabulatorami, kliknij przycisk Pobierz pod dwiema tabelami. Dzięki temu użytkownik może w łatwiejszy sposób eksplorować dane za pomocą programu takiego jak Excel.
   9. Zinterpretuj mapę w następujący sposób: każdy punkt reprezentuje przybliżone miejsca zbierania odpornych komarów w każdym zestawie danych, w których transkrypcja zainteresowania jest wyrażona w różny sposób. Kolory są zgodne z systemem sygnalizacji świetlnej, który jest wyjaśniony w aplikacji (Rysunek 2).
   10. W krokach 1.2.5 i 1.2.8 zapisz wyniki graficzne, klikając prawym przyciskiem myszy, klikając Zapisz obraz jako... i wybierając odpowiedni folder.
       UWAGA: W przypadku błędu wyjściowego aplikacji prawdopodobnie żadne zestawy danych nie spełniają wprowadzonych kryteriów. Sprawdź Tabelę Uzupełniającą 1 w Ingham et al.¹, jeśli tak się stanie.
3. Identyfikacja przypuszczalnych funkcji/ścieżek transkrypcji zainteresowania
   1. Korelacje (wprowadzona minimalna wartość r²) wzorców ekspresji transkryptów w wielu zestawach danych można wykorzystać do przewidywania funkcji transkryptu i potencjalnego wyjaśnienia współregulowanych transkryptów z tego samego szlaku. Korzystając z przykładu z Ingham et al.¹ (AGAP001076-RA; CYP4G16), wykonaj kroki 1.2.1–1.2.2 w powyższej sekcji, wybierając wszystkie zestawy danych dla maksymalnej mocy.
   2. Przed kliknięciem przycisku Aktualizuj widok przesuń suwak Wartość korelacji bezwzględnej do pozycji 0,85, a następnie kliknij przycisk Aktualizuj widok lub naciśnij Return.
   3. Sprawdź tabelę korelacji (tabela znajdująca się na samym dole), aby znaleźć wiele transkrypcji, które są teraz wyświetlane i są skorelowane (|r| = 0,85) z wprowadzoną transkrypcją.
   4. Manipuluj suwakiem Wartość korelacji bezwzględnej i obserwuj wszelkie zmiany na najniższym wykresie i w tabeli; dane wyjściowe z kroku 1.3.2 pozostaną niezmienione. Jak pokazano w Rysunek 3 (|r| > 0.9, |r| > 0.8), obniżenie rygorystyczności wartości korelacji pokaże więcej transkrypcji, ale wprowadzi więcej szumu.
   5. Zapoznaj się z poniższą tabelą graficzną, która (oprócz parametrów opisanych w kroku 1.2.6) zawiera wartość korelacji dla każdej transkrypcji.
   6. Aby pobrać dane w formacie rozdzielanym tabulatorami, kliknij przycisk Pobierz.
   7. Analizę wzbogacenia funkcjonalnego można przeprowadzić na pobranej liście identyfikatorów transkrypcji za pomocą DAVID analysis⁸. Po wejściu na stronę internetową DAVID (znajdującej się pod adresem https://david.ncifcrf.gov/) wybierz Analiza funkcjonalna. Wklej pełną listę genów, używając identyfikatorów genów [identyfikator bez -RX, co można zrobić w programie Excel, wstawiając kolumnę po prawej stronie identyfikatora systematycznego i wpisując = LEWO(X1,10), gdzie X1 to komórka identyfikatora systematycznego]. Wybierz identyfikator jako VectorBase_ID i listę genów, a następnie kliknij przycisk Prześlij listę.
   8. Kliknij przycisk Grupowanie adnotacji funkcjonalnych, aby uzyskać przegląd wzbogaceń znalezionych w tej sieci korelacji, co pozwala na przypisanie potencjalnej funkcji do transkrypcji. Zapoznaj się ze szczegółowymi wzbogaceniami, przeglądając różne kategorie i klikając przyciski + dla każdej z nich, a następnie klikając pozycję Wykres.

2. Pobieranie i implementacja IR-TEx lokalnie

1. Pobieranie i uruchamianie IR-TEx
   1. Przejdź do linku znajdującego się pod adresem http://github.com/LSTMScientificComputing/IR-TEx; i kliknij Klonuj lub pobierz | Pobierz plik zip. Skieruj się do wybranego folderu i rozpakuj plik w tym folderze.
   2. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania R dla odpowiedniego systemu operacyjnego z linku znajdującego się pod adresem http://cran.r-project.org/mirrors.html. Zainstaluj program.
   3. Pobierz i zainstaluj najnowsze oprogramowanie R Studio, ponownie dla odpowiedniego systemu operacyjnego, korzystając z linku znajdującego się pod adresem http://www.rstudio.com/products/rstudio/download/.
   4. Po zainstalowaniu otwórz program R Studio | Kodowanie uzupełniające File 1 i uruchom każdy wiersz, aby skonfigurować system dla IR-TEx.
   5. Po pomyślnym zainstalowaniu i zaktualizowaniu wszystkich pakietów zgodnie z wymaganiami przejdź do punktu menu Plik | Otwórz, znajdź IR-TEx.R, podświetl i otwórz. Powinno to być teraz widoczne w górnym oknie programu R Studio.
   6. Aby uruchomić aplikację, naciśnij przycisk Uruchom aplikację w prawym górnym rogu okna, a pojawi się drugie okno, w którym aplikacja zostanie załadowana. Po zakończeniu ładowania, aby uzyskać pełną funkcjonalność, kliknij Otwórz w przeglądarce znajdujący się w prawym górnym rogu załadowanego okna.
2. Dodawanie zestawów danych o rezystancji do IR-TEx (generowanych przy użyciu tablicy Anopheles gambiae 15k Agilent)
   1. Aby dodać nowy analizowany zestaw danych wygenerowany na tej samej platformie mikromacierzy (A-MEXP-2196) do dostępnego zestawu danych, pobierz aplikację i znajdź rozpakowany folder pobrany w sekcji 2.1.
   2. Otwórz plik dodatkowy 1, który reprezentuje dane wyjściowe z analizy limma na A-MEXP-2196 ¹. Korzystając z programu Excel, w kolumnie H1 napisz Fold_Change, a w H2 napisz =2^B2, w którym B2 to zmiana składania dziennika. Zastosuj to w całej kolumnie H, aby uzyskać surowe zmiany zagięcia.
   3. Ułóż plik dodatkowy 1 w taki sposób, aby kolumna A była identyfikatorem, kolumna B była zmianą zagięcia z kolumny H (skopiuj kolumnę H, zaznacz kolumnę B, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wklej wartości), a kolumna C jest skorygowaną wartością p. Usuń wszystkie inne kolumny i zapisz je jako plik rozdzielany tabulatorami.
   4. Otwórz plik kodowania uzupełniającego 2 i uruchom go, korzystając z arkusza rozdzielanego tabulatorami utworzonego w kroku 2.2.3.
      NEWFILE_FC = c('KRAJ','STATUS NARAŻENIA','GATUNEK','INSEKTYCYD')
      NEWFILE_Q = c('KRAJ','STATUS NARAŻENIA','GATUNEK','INSEKTYCYD')
      UWAGA: Pola w pojedynczych cudzysłowach powinny zostać zmienione tak, aby odzwierciedlały informacje z nowego zestawu danych. Status narażenia odnosi się do tego, czy próbki zostały pobrane po narażeniu na insektycydy (narażone/nienarażone). Środek owadobójczy: jeśli jest "nienarażony", nie należy go stosować. Zobacz Fold_Changes.txt. dla metadanych z innych próbek. Upewnij się, że pisownia jest spójna.
   5. Otwórz geography.txt, przewiń do ostatniego zajętego wiersza i wybierz poniżej. Wpisz nazwę zbioru danych, a następnie Q i NEWFILE_Q w kolumnie 1, szerokość geograficzną miejsca pobierania próbek w kolumnie 2 i długość geograficzną w kolumnie 3. Zapisz zmiany.
   6. Jeśli zostaną użyte jakiekolwiek nowe wpisy (np. Gambia), które nie są dostępne do wyboru w zbiorze danych (patrz Ingham et al. Tabela uzupełniająca 1¹), będą one musiały zostać dodane do kodu. W tym celu otwórz IR-TEx.R w programie RStudio i znajdź wiersz 26 wskazany przez program RStudio, w którym to momencie powinny rozpocząć się następujące czynności:
      'sidebarPanel(....'.
      UWAGA: Każdy z kolejnych wierszy odnosi się do elementu metadanych wprowadzonego do wierszy poniżej nazwy zestawu danych w Fold_Changes.txt w kroku 2.2.5.
   7. Aby dodać nowe metadane, przewiń do końca wiersza wybranych metadanych i znajdź termin "selected=". Bezpośrednio po tym powinien znajdować się przecinek i nawias zamknięty; W tym momencie kliknij kursor w zamkniętym nawiasie kwadratowym. Po ostatnim apostrofie wpisz przecinek, a następnie apostrof, a następnie nowe metadane (np. "Gambia") i zapisz zmiany. Poniżej znajduje się przykład.
      checkboxGroupInput('CountryInput','Wybierz odpowiednie kraje',c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun','Gwinea Równikowa','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun', "Gwinea Równikowa",'Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo'))
   8. Uruchom aplikację. Nowy wpis metadanych powinien być wyświetlany jako niezaznaczone pole wyboru pod odpowiednim nagłówkiem. Jeśli użytkownik chce, aby był zaznaczony, powinien zostać dodany po selected=c(..., jak pokazano poniżej:
      checkboxGroupInput('CountryInput','Wybierz odpowiednie kraje',c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun','Gwinea Równikowa','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Wybrzeże Kości Słoniowej','Kamerun', "Gwinea Równikowa",'Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'))
   9. Aby dodać zestawy danych rezystancji, które nie są wykonywane na A-MEXP-2196, patrz sekcja 3.

3. Modyfikowanie IR-TEx do użytku z różnymi zestawami danych

1. Używaj na wielu platformach -omics i kontynuuj z brakującymi danymi
   1. Aby kontynuować z "0" w zestawach danych: skonsultuj się ze źródłem zestawu danych, aby uzyskać szczegółowe znaczenie "0". Zaleca się (konserwatywnie) zamianę "0" na "NA". Podobnie jak w przypadku surowych zmian krotności (B/A), "0" oznacza niewykryty sygnał w warunkach eksperymentalnych B. W przypadku, gdy warunek eksperymentalny A wykazuje wyrażenie substancjalne, użytkownik może zastosować małą wartość zmiany krotności.
   2. Otwórz Additional File 2.txt, plik RNAseq zaadaptowany z Uyhelji et al.⁹. Ten plik reprezentuje szablon, na którym powinny opierać się nowe dane: kolumna A = identyfikator, kolumna B = nieprzetworzona zmiana zagięcia, a kolumna C = skorygowana wartość p. Użyj tego pliku, aby wykonać poniższe kroki.
   3. Uruchom kod języka R, aby dopasować identyfikatory do jednego pliku rozdzielanego tabulatorami na różnych platformach, a następnie uporządkuj i znormalizuj dane (Supplemental Coding File 2). Instrukcje są zawarte w pliku. Każda ścieżka do pliku będzie oddzielona znakiem "/" dla systemu MacOS lub "//" dla systemu Windows (zmień je z "\", tak jak się pojawią).
   4. Wyślij plik utworzony na końcu dodatkowego pliku kodowania 2 do wybranej lokalizacji do użycia w kroku 3.1.5. Supplemental Coding File 2 wygeneruje nowy plik Fold_Changes.txt. Utwórz kopię zapasową oryginalnego pliku.
   5. Wykonaj kod zawarty w dodatkowym pliku kodowania 3. Znajdź plik wyjściowy o nazwie FC_distribPlot.png w folderze określonym jako FILEPATH. Sprawdź rozkłady zmian logarytmu_2-krotności, aby sprawdzić, czy rozkłady zmian logarytmu_2-krotności są prawie identyczne w zestawach danych.
   6. Postępuj zgodnie z instrukcjami z kroku 2.2.6, aby edytować dodatkowe pliki i zapewnić zgodność nowego Fold_Changes.txt.
2. Modyfikowanie IR-TEx do użytku z zupełnie nowymi zestawami danych
   1. Otwórz IR-TEx.R w programie RStudio i znajdź wiersze (23–34) zaczynające się od:
      'tabPanel('
      i kończące się na:
      submitButton("Aktualizuj widok", icon("odśwież"))<br /> ),
   2. Zmień AGAP008212-RA znaleziony w poniższych wierszach na transkrypcję zainteresowania nowymi danymi.
      textInput('textInput','ID transkrypcji',value='AGAP008212-RA'),
   3. Znajdź cztery opcje zaczynające się od:
      checkboxGroupInput(
      Te opcje można modyfikować tak, aby reprezentowały ważne metadane, według których użytkownik chce filtrować nowe dane. W każdym przypadku użytkownik powinien zmienić opcję Wybierz odpowiednie kraje; Wybierz stan ekspozycji; wybrać odpowiednie gatunki; i wybierz klasę insektycydu, która ma być reprezentatywna dla danych (tj. wybierz typ tkanki; Wybierz płeć; Wybierz przedział wiekowy; Wybierz Stan choroby).
   4. Zidentyfikuj metadane skojarzone z zestawem danych i danymi wejściowymi, aby zastąpić istniejące opcje natychmiast po pierwszym c('. W każdym przypadku opcje będą zawarte w znakach mowy i oddzielone od następnego zaznaczenia przecinkiem. Po ostatecznym wyborze nawias powinien zostać zamknięty. Przykładem Select Disease Status jest:
      c('Zakażony', 'Niezainfekowany', 'Nieznany')
   5. Wybierz, które z tych metadanych zostaną wybrane po otwarciu aplikacji. Można je zmienić, modyfikując opcje po selected=c('. Przykładem Select Disease Status jest:
      selected=c('Zainfekowany', 'Niezainfekowany')
      Spowoduje to poinstruowanie aplikacji, aby wybrała tylko zestawy danych spełniające te kryteria podczas początkowego ładowania.
   6. Aby utworzyć nową tabelę danych, postępuj zgodnie z układem znajdującym się w Fold_Changes.txt i instrukcjami w sekcji 2. Zmień metadane na każdą odpowiednią zmianę opisaną w kroku 3.2.4, dokładnie tak, jak została zapisana w kodzie (w języku R rozróżniana jest wielkość liter). Do kolumny detoksykacji wprowadź nazwy genów, a w kolumnie typu transkryptu wprowadź opisy genów dla każdego transkryptu. Postępuj zgodnie z sekcją 3.2 podczas dodawania nowych zestawów danych.
   7. Jeśli mapowanie nie jest istotne dla wymagań eksperymentalnych, znajdź następujące wiersze kodu i umieść "#" z przodu:
      Wiersze 49–51:
      br(),br(),
      withSpinner(plotOutput("Geografia")),
      textOutput('Geography_legend'),
      Linie 493 zaczynające się:
      output$Geography <- renderPlot({
      Do końca wiersza 602:
      output$Geography_legend <- renderText({
      paste("Tylko znaczące transkrypcje (p", as.expression("<="),"0.05): FC > 5 = Czerwony, FC > 1 = Bursztynowy, FC < 1 = Zielony",sep="")
      })

Results

Korzystając z pliku Fold_Changes.txt dołączonego do IR-TEx, porównaliśmy transkrypty, które były znacząco inaczej wyrażane w odpornych zestawach danych Anopheles coluzzii i Anopheles gambiae, z podatnymi kontrolami z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso. W ten sposób uzyskano 18 interesujących transkrypcji (Tabela 1; wyszukiwanie można przeprowadzić za pomocą Excela, R lub innych programów). Dwa z nich, ATPaza (AGAP006879) i α-krystalina (AGAP007160), zostały wcześniej zgłoszone, przy czym pierwsza z nich ma znaczący wpływ na oporność na pyretroidy¹. Oprócz tych dwóch transkryptów obecne były dwa transkrypty detoksykacyjne, GSTMS1 (FC_μ = 1,95 i 1,85) i UGT306A2 (FC_μ = 2,29 i 2,28).

qPCR walidacja dwóch z tych transkryptów (GSTMS1, transkrypt detoksykacyjny; i AGAP009110-RA, nieznany, specyficzny dla komarów transkrypt zawierający domenę wiążącą β-1,3-glukan) została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem¹. Analiza została przeprowadzona przy użyciu zestawów starterów opisanych w pliku dodatkowym 3 i wykazała, że te transkrypty były znacznie podwyższone w wieloopornej populacji z Wybrzeża Kości Słoniowej (Tiassalé) i innej z Burkina Faso (Banfora), w porównaniu z podatnym na labilarność N'Gousso (Rysunek 4A).

Ponieważ oba transkrypty wykazały znaczną regulację w górę w każdej z odpornych populacji, na komarach z kolonii Tiassalé z laboratorium LSTM przeprowadzono knockdown wywołany przez RNAi. Kolonia ta pochodzi z Wybrzeża Kości Słoniowej i jest odporna na wszystkie główne klasy insektycydów stosowanych w zdrowiu publicznym, jak opisano wcześniej^1,10. Osłabienie ekspresji GSTMS1 spowodowało znaczny wzrost (p = 0,021) śmiertelności po ekspozycji na deltametrynę w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi GFP, co pokazuje znaczenie tego transkryptu w oporności na pyretroidy (Figura 4B). I odwrotnie, knockdown AGAP009110-RA nie spowodował znaczącej (p = 0,082) zmiany śmiertelności po ekspozycji (Rysunek 4B).

GSTMS1 to mikrosomalny GST i jest jednym z trzech znalezionych u komarów A. gambiae¹¹. Chociaż członkowie klas epsilon i delta GST byli wcześniej zaangażowani w detoksykację insektycydów^12,13,14, jest to pierwszy dowód naszej wiedzy na rolę mikrosomalnych GST w oporności na pyretroidy¹⁵. Aby zbadać przypuszczalną funkcję tego transkryptu u komarów Anopheles gambiae sl, zidentyfikowano ekspresję i korelację w IR-TEx. GSTMS1 ulegał znacznej nadekspresji w 20 z 21 zestawów danych dostępnych dla tych gatunków, z wyjątkiem wyspy Bioko. W każdej lokalizacji nadekspresja była mniejsza niż pięciokrotnie w porównaniu z populacjami podatnymi (Ryc. 5).

Ponieważ mikrosomalne GST były w dużej mierze ignorowane jako potencjalne detoksykatory insektycydów, niewiele wiadomo o ich roli w odporności na insektycydy¹⁵. Badając korelację innych transkryptów, można wyjaśnić przypuszczalne funkcje poprzez założenie koregulacji lub zaangażowania w te same szlaki. Aby zmaksymalizować moc w sieci korelacji, wybrano wszystkie zestawy danych mikromacierzy obecne w IR-TEx, a |r| wybrano >0,75. Tabela 2 przedstawia dane wyjściowe z IR-TEx.

Te transkrypty są wzbogacone o aktywność oksyoreduktazy i metabolizm glukozy/węglowodanów w narzędziu do adnotacji funkcjonalnych DAVID⁸. Zarówno dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, jak i gamma-liaza cythionu utrzymują poziom glutationu w komórkach ssaków^16,17, a tym samym łączą się bezpośrednio z GSTMS1, S-transferazą glutationu. Katalaza jest szybko działającym reagentem na stres oksydacyjny, który chroni komórki przed uszkodzeniem reaktywnych form tlenu, produktem ubocznym ekspozycji na pyretroidy. Hydrolaza walacyklowiru to hydrolaza, która może odgrywać rolę w detoksykacji komórek ssaków¹⁸. CYP4H17 jest również obecna w sieci korelacji. Cytochromy p450 są bezpośrednimi metabolizatorami insektycydów pyretroidowych, a te produkty rozpadu mogą być dalej metabolizowane przez GST. Wreszcie, CYP4H17 został związany z opornością na pyretroidy u A. funestus¹⁹. Podsumowując, dane te zdecydowanie potwierdzają rolę GSTMS1 w detoksykacji ksenobiotyków.

Rysunek 1: Logarytmiczna_2-krotna zmiana AGAP002865-RA we wszystkich zestawach danych. Oś x zawiera szczegółowe informacje na temat różnych zestawów danych, których informacje można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1 w poprzedniej publikacji¹, a oś y_pokazuje 2-krotną zmianę logarytmu w interesującym nas transkryptie. Jasnoszare linie przerywane wskazują przybliżone progi istotności, rozumiane tutaj jako zmiana krotności <0,8 lub zmiana krotności >1,2. Przerywana linia wskazuje na zmianę krotności równą 1 (tj. brak różnicy w ekspresji między populacjami odpornymi i podatnymi). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Rozkład mikromacierzy wykazujących istotną różnicową ekspresję AGAP002865-RA w opornych populacjach. Zmiany fałdy są reprezentowane w systemie sygnalizacji świetlnej: zielona zmiana fałdy <1, pomarańczowa zmiana fałdy >1 i czerwona zmiana fałdy >5. Wyświetlane są tylko zestawy danych ze znaczącym (p ≤ 0,05) wyrażeniem różnicowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Sieci korelacyjne AGAP001076-RA (CYP4G16). Korelacje parami są obliczane dla wszystkich transkryptów w 31 zestawach danych mikromacierzy, z zastosowaniem zdefiniowanego przez użytkownika punktu odcięcia. Pokazane tutaj jest (A) |r| > 0,9 oraz (B) |r| > 0.8. Wszystkie transkrypcje wyświetlane na wykresie spełniają to kryterium i są zgodne ze zmianami wyrażenia AGAP001076-RA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: ekspresja i fenotyp mRNA po osłabieniu GSTMS1 i AGAP009110-RA. (A) ekspresja mRNA GSTMS1 i AGAP009110-RA w dwóch wieloopornych populacjach An. coluzzii odpowiednio z Wybrzeża Kości Słoniowej i Burkina Faso. Poziomy porównano z podatnym na badania laboratoryjne An. coluzzii N'Gousso. Poziomy istotności obliczone za pomocą ANOVA za pomocą testu Dunnetta post-hoc. (B) Tłumienie obu transkryptów wywołane przez RNAi w porównaniu z kontrolami wstrzykniętymi GFP. Tłumienie GSTMS1 wykazuje istotny wzrost śmiertelności po ekspozycji na deltametrynę (obliczone za pomocą ANOVA z testem Tukeya post hoc; *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ekspresja GSTMS1 w populacjach Anopheles gambiae i Anopheles coluzzii. Mapa przedstawiająca istotnie zróżnicowaną ekspresję GSTMS1 w dostępnych zestawach danych mikromacierzy. Stwierdzono, że GSTMS1 jest znacząco zróżnicowany w 20 z 21 zestawów danych mikromacierzy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Identyfikator transkrypcji	opis	Burkina Faso	Wybrzeże Kości Słoniowej
AGAP006879-RA	ATPaza	Godzina 27,94	Godzina 43.05
AGAP007160-RB	A-krystalina	Godzina 11.49	Godzina 10,58
AGAP007160-RC	A-krystalina	Godzina 11.14	Godzina 10,38
AGAP007160-RA	A-krystalina	9,78	9,84
AGAP009110-RA	nieznany	Godzina 9,26	Klasa 5,96
AGAP007780-RA	Dehydrogenaza NADH	Godzina 10.49	Rejon 3,77
AGAP006383-RA	Podjednostka beta kompleksu oligosacharylotransferazy	Rejon 3,69	Klasa 5,57
AGAP007249-RB	Lot w	Norma 4,61	3,86
AGAP003357-RA	Białko aktywujące RAG1 Białko podobne do białka 1	Godzina 4,31	Godzina 4.05
AGAP007249-RA	Lot w	Godzina 4,48	Klasa 3,46
AGAP001998-RA	mRpS10	Klasa 3,46	Godzina 2,85
AGAP007589-RA	UGT306A2	Informacja o tym, że 2,29	Pytanie 2,28
AGAP000165-RA	Certyfikat GSTMS1	1,95	1,85
AGAP002101-RA	syntetaza izoleucylo-tRNA	0,57	0,59
AGAP002969-RA	syntetaza asparaginylo-tRNA	0,45	0,45
AGAP004199-RA	Rodzina nośników substancji rozpuszczonych 5 (transporter monokarboksylanu sprzężony z sodem), członek 8	0,35	0,48
AGAP004684-RA	Białko przetwarzające rRNA CGR1	0,36	0,22
AGAP006414-RA	Kanał chłodniczy Cht8	0,024	0,36

Tabela 1: Transkrypcje znacząco różniące się w tym samym kierunku zmiany w populacjach Burkina Faso i Wybrzeża Kości Słoniowej. Identyfikator transkryptu, opis genu i średnia zmiana krotności dla każdego zestawu danych z dwóch krajów reprezentujących populacje An. coluzzii i An. gambiae.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

korelacja	Nazwa systematyczna	Typ transkrypcji
1	AGAP000165-RA	Certyfikat GSTMS1
0,82	AGAP004904-RA	Katalazy
0,76	AGAP007243-RA	Podjednostka regulatorowa proteazy 26S 8
0,79	AGAP008358-RA	CYP4H17
0,76	AGAP009436-RA	Hydrolaza walacyklowiru
0,75	AGAP010739-RA	1-dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa
0,85	AGAP011172-RA	gamma-liaza cytioniny
0,76	AGAP012678-RA	1-dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

Tabela 2: Transkrypcje skorelowane z GSTMS1. Tabela przedstawia dane wyjściowe sieci korelacji dla GSTMS1 na IR-TEx z |r| wynoszącej >0,75. Tabela przedstawia korelację Spearmana, identyfikator transkryptu i opis genu dla każdego współskorelowanego transkryptu.

Dodatkowy plik 1: Plik wyjściowy z tablicy A-MEXP-2196 analizowany na limmie. Plik pochodzi z knockdownu Met w porównaniu z tablicą kontrolną GFP, opisaną bardziej szczegółowo w ArrayExpress (E-MTAB-4043) i innej poprzedniej publikacji¹. Kolumny reprezentują identyfikator AGAP (SystematicName), zmianę logarytmu (logFC), wartości wyrażeń logarytmicznych (AveExpr), statystykę t (t), nieskorygowaną wartość p (P.Value), skorygowaną wartość p (adj. P.Val) i B statystyka (B)²⁰. Do celów niniejszego pliku komary to Anopheles coluzzi z Wybrzeża Kości Słoniowej i nie są narażone na działanie środków owadobójczych, a ich szerokość i długość geograficzna wynosi odpowiednio -5,4 i 6,0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowy plik 2: Plik wyjściowy z eksperymentu RNAseq. Analiza RNAseq zaczerpnięta z Uyhelji et al.⁹ opisująca zmiany w transkryptomie komarów Anopheles po wystawieniu na 50% zasolenie. Plik ten został zaadaptowany z tabeli S2 publikacji i zawiera identyfikator AGAP (SystematicID), nieprzetworzoną zmianę zagięcia (Fold_Change) i skorygowaną wartość p (q_value). Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowy plik 3: Lista podkładowa dla reprezentatywnych wyników. Identyfikator AGAP, nazwa genu, zestawy starterów dsRNA do przodu, dsRNA do tyłu, qPCR do przodu i do tyłu qPCR dla każdego transkryptu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowe kodowanie Plik 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowe kodowanie Plik 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dodatkowe kodowanie Plik 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Discussion

Transkryptomika dużych zbiorów danych tworzy listy tysięcy transkryptów, które są różnie wyrażane dla każdego warunku eksperymentalnego. Wiele z tych eksperymentów przeprowadza się na pokrewnych organizmach i fenotypach i są one prawie wyłącznie analizowane jako niezależne eksperymenty. Wykorzystanie tych bogatych źródeł danych poprzez całościowe badanie danych i bez założeń teoretycznych 1) doprowadzi do identyfikacji nowych kandydujących transkryptów i 2) zapobiegnie odrzuceniu cennych danych tylko dlatego, że jest zbyt wiele informacji do walidacji in vivo¹.

IR-TEx zapewnia użytkownikom z ograniczonym zapleczem bioinformatycznym możliwość łatwego badania wielu zestawów danych, wizualizacji zmian w zestawach danych i pobierania powiązanych informacji¹. Chociaż IR-TEx nie obsługuje wyszukiwania więcej niż jednej transkrypcji w każdym wyszukiwaniu, użytkownicy mogą sprawdzić skojarzone pliki Fold_Changes.txt po prostu za pomocą programu Excel, R lub innych odpowiednich programów. Dalsza użyteczność IR-TEx wynika z wykorzystania sieci korelacji do przewidywania funkcji transkryptu, wprowadzania hipotetycznych białek lub transkryptów o nieznanych funkcjach oraz wykorzystania oprogramowania do wyszukiwania wzbogaceń¹.

W przykładzie przedstawionym w tym protokole IR-TEx jest używany zgodnie ze swoją pierwotną funkcją. W tym przypadku umożliwia eksplorację transkryptów związanych z odpornością na insektycydy i wizualizację rozkładu nadekspresji i niedostatecznej ekspresji za pomocą grafiki mapowania. Interesujące nas transkrypty są weryfikowane in vivo w celu określenia, czy nadmierna lub niedostateczna ekspresja danych transkryptów przyczynia się do obserwowanego fenotypu¹ (np. Oporności na insektycydy). Wykazano tutaj, jak wcześniej informowaliśmy¹, że zestaw danych może być wykorzystany w podejściu opartym na hipotezach w celu identyfikacji interesujących transkrypcji na podstawie specyficznych dla danego kraju. IR-TEx może być następnie wykorzystany do 1) zbadania ekspresji transkryptu i 2) kontekstualizacji funkcji transkryptu poprzez zastosowanie sieci korelacji parami we wszystkich transkryptach zawartych w każdym zbiorze danych -omicznych. W tym przypadku wykazano, że GSTMS1 jest skorelowany z wieloma innymi transkryptami zaangażowanymi w detoksykację. Dane te (wraz z knockdownem transkryptu, który spowodował znaczny wzrost śmiertelności po ekspozycji na insektycydy) pokazują znaczenie tego transkryptu w klirensie ksenobiotyków.

IR-TEx stanowi cenne źródło informacji na temat transkryptów związanych z opornością na insektycydy w Internecie lub przy użyciu aplikacji lokalnych. Protokół ten pokazuje, jak modyfikować IR-TEx dla różnych platform -omicznych, a także dla zupełnie nowych danych. Przewodnik ilustruje, jak używać IR-TEx do integrowania danych z wielu platform -omicznych i zestawów danych z brakującymi danymi, a także jak w prosty sposób rekodować IR-TEx, aby był przydatny dla każdego, kto bada zestawy danych transkryptomicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laptop z przeglądarką	Dowolny
program - R Projekt	R do obliczeń statystycznych	-	https://www.r-project.org/
R Studio	R Studio	-	https://www.rstudio.com/