Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60742

⸱

11 marca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

W tym artykule

Podsumowanie

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Streszczenie

Organoidy oferują samoorganizujące się, trójwymiarowe struktury tkankowe, które podsumowują procesy fizjologiczne w wygodny sposób potrawy. Mysi gruczoł sutkowy składa się z dwóch odrębnych przedziałów komórek nabłonkowych, pełniących różne funkcje: zewnętrznego, kurczliwego przedziału mioepitelialnego i wewnętrznego, wydzielniczego przedziału świetlnego. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której komórki tworzące te przedziały są izolowane, a następnie łączone w celu zbadania ich indywidualnego wkładu w morfogenezę i różnicowanie gruczołu sutkowego. Metoda jest prosta i wydajna i nie wymaga zaawansowanych technologii separacji, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Zamiast tego zbieramy i enzymatycznie trawimy tkankę, wysiewamy nabłonek na przylegających szalkach do hodowli tkankowych, a następnie stosujemy trypsynizację różnicową, aby oddzielić komórki mioepitelialne od komórek luminalnych o czystości ~90%. Komórki są następnie siane w macierzy zewnątrzkomórkowej, gdzie organizują się w dwuwarstwowe, trójwymiarowe (3D) organoidy, które można różnicować w celu wytworzenia mleka po 10 dniach w hodowli. Aby przetestować efekty mutacji genetycznych, komórki mogą być zbierane z dzikich lub genetycznie modyfikowanych modeli myszy, lub mogą być genetycznie manipulowane przed hodowlą 3D. Technika ta może być wykorzystana do generowania organoidów mozaikowych, które umożliwiają badanie funkcji genów w szczególności w przedziale luminalnym lub mioepitelialnym.

Wprowadzenie

Gruczoł sutkowy (MG) to drzewiasta, rurkowata struktura nabłonkowa osadzona w zrębie bogatym w adipocyty. Dwuwarstwowy nabłonek przewodowy składa się z zewnętrznej, podstawowej warstwy kurczliwych komórek mioepitelialnych (MyoECs) i wewnętrznej warstwy luminalnych, wydzielniczych komórek nabłonkowych (LEC), otaczających centralny lumen1. W okresie laktacji, gdy zewnętrzne MyoEC kurczą się, aby wycisnąć mleko z wewnętrznych pęcherzyków płucnych, MG ulega licznym zmianom, które są pod kontrolą czynników wzrostu (np. EGF i FGF) i hormonów (np. progesteronu, insuliny i prolaktyny). Zmiany te powodują różnicowanie wyspecjalizowanych struktur, pęcherzyków płucnych, które syntetyzują i wydzielają mleko w czasie laktacji1. Nabłonkiem sutka można eksperymentalnie manipulować za pomocą technik, w których fragmenty tkanki nabłonkowej, komórki, a nawet pojedyncza komórka podstawna są przeszczepiane do poduszeczek tłuszczowych sutka gospodarza, wstępnie oczyszczane z endogennego miąższu sutka i pozostawiane do wyrośnięcia, aby odtworzyć całe, funkcjonalne drzewo nabłonkowe2,3,4,5. Przeszczep jest potężną techniką, ale jest czasochłonny i niemożliwy, jeśli mutacja powoduje wczesną śmiertelność zarodka (przed E14), która uniemożliwia uratowanie przeszczepialnej brodawki sutka. Co więcej, badacze często chcą zbadać role dwóch różnych przedziałów, które pochodzą z komórek progenitorowych ograniczonych do linii. Chociaż technologia Cre-lox umożliwia różnicową manipulację genetyczną MyoEC i LEC, jest to również czasochłonne i kosztowne przedsięwzięcie. Tak więc od lat pięćdziesiątych XX wieku badacze stosowali organoidy sutka in vitro jako stosunkowo łatwy i skuteczny sposób rozwiązywania problemów dotyczących struktury i funkcji tkanek sutka6,7.

We wczesnych protokołach opisujących izolację i hodowlę pierwotnych komórek nabłonka sutka, badacze odkryli, że matryca błony podstawnej (BME), złożona z skrzepu osocza i ekstraktu z zarodka kurczaka, była wymagana dla fragmentów MG hodowanych na szalce6. W kolejnych dekadach opracowano macierze zewnątrzkomórkowe (ECM, kolagen i galaretowatą matrycę białkową wydzielaną przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm) w celu ułatwienia hodowli 3D i lepszego naśladowania środowiska in vivo7,8,9,10. Hodowla komórek w matrycach 3D ujawniła na podstawie wielu kryteriów (morfologia, ekspresja genów i reakcja hormonów), że takie mikrośrodowisko lepiej modeluje procesy fizjologiczne in vivo9,10,11,12. Badania z wykorzystaniem pierwotnych komórek mysich zidentyfikowały kluczowe czynniki wzrostu i morfogeny niezbędne do przedłużonego utrzymania i różnicowania organoidów13. Badania te przygotowały grunt pod przedstawiony tutaj protokół oraz dla hodowli ludzkich komórek piersi jako organoidów 3D, która jest obecnie nowoczesnym narzędziem klinicznym, pozwalającym na odkrywanie leków i testowanie leków na próbkach od pacjentów14. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla organoidów podkreśla zdolności komórek pierwotnych do samoorganizacji oraz ich wkład w morfogenezę i różnicowanie.

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli nabłonka mysiego, który można podzielić na acini produkujące mleko. Technika trypsynizacji różnicowej jest stosowana do izolowania MyoEC i LEC, które składają się na dwa odrębne przedziały komórek MG. Te oddzielone frakcje komórkowe mogą być następnie genetycznie manipulowane w celu nadekspresji lub obniżenia funkcji genu. Ponieważ samoorganizacja jest wrodzoną właściwością komórek nabłonka sutkowego15,16,17, rekombinacja tych frakcji komórek pozwala badaczom na generowanie dwuwarstwowych, mozaikowych organoidów. Zaczynamy od enzymatycznego trawienia tkanki tłuszczowej, a następnie inkubacji fragmentów sutka na szalce do hodowli tkankowej przez 24 godziny (ryc. 1). Fragmenty tkanek osadzają się na płytkach polistyrenowych jako dwuwarstwowe fragmenty z ich organizacją in vivo: zewnętrzna warstwa mioepitelialna otaczająca wewnętrzne warstwy światła. Ta organizacja komórkowa pozwala na izolację zewnętrznych MyoEC przez leczenie trypsyną-EDTA (0,05%) przez 3-6 minut, a następnie drugą rundę leczenia trypsyną-EDTA (0,05%), która odłącza pozostałe wewnętrzne LEC (Figura 2). W ten sposób te typy komórek o różnej wrażliwości trypsyny są izolowane, a następnie mogą być mieszane i siane w ECM (ryc. 3). Komórki ulegają samoorganizacji, tworząc dwuwarstwowe kule, składające się z zewnętrznej warstwy MyoEC otaczających wewnętrzne LEC. Tworzenie się światła zachodzi, gdy komórki rosną w pożywce zawierającej koktajl czynników wzrostu (zobacz przepisy na pożywkę wzrostową)13. Po 5 dniach organoidy można różnicować w acini produkujące mleko, przechodząc na pożywkę alweorologenezy (patrz przepisy i rysunek 3F) i inkubować przez kolejne 5 dni. Alternatywnie, organoidy będą nadal się rozwijać i rozgałęziać w pożywce wzrostowej przez co najmniej 10 dni. Organoidy mogą być analizowane za pomocą immunofluorescencji (ryc. 3D-F) lub uwalniane z ECM za pomocą roztworu odzysku (patrz tabela materiałów) i analizowane innymi metodami (np. immunoblot, RT-qPCR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz.

1. Dzień 1: Trawienie gruczołu sutkowego

  1. Przygotuj się do zbioru MG od dojrzałych samic myszy w wieku 10-14 tygodni.
    1. Zbiór należy wykonywać na otwartej ławce w warunkach aseptycznych.
    2. Wysterylizuj wszystkie materiały chirurgiczne, tablice korkowe i szpilki poprzez autoklawowanie i moczenie w 70% alkoholu przez 20 minut przed zabiegiem.
    3. Znieczulenie zwierząt pentobarbitalem sodu (2 razy większa dawka znieczulająca 0,06 mg/g masy ciała) podawanym we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.
    4. Monitoruj poziom znieczulenia, ściskając palce u nóg zwierzęcia, aby sprawdzić reakcję odruchową i rozpocznij protokół dopiero po całkowitym znieczuleniu zwierzęcia.
    5. Połóż zwierzę na grzbiecie, przypnij jego wyrostki do tablicy korkowej i przetrzyj brzuch i klatkę piersiową etanolem.
  2. Aby zebrać #2, 3, 4 i 5 MG od jednej myszy (tj. 8 MG, Rysunek 1A), zidentyfikuj linię środkową między dwiema tylnymi nogami i wykonaj małe nacięcie (1 cm) na skórze brzucha ostrymi nożyczkami, a następnie przedłuż cięcie aż do szyi18.
  3. Następnie wykonaj małe nacięcia bocznie w kierunku nóg i ramion, aby umożliwić uwolnienie skóry za pomocą bawełnianego wacika. Odciągnij skórę i rozciągnij ją mocno, zanim przyciśniesz ją z jednej strony (Rysunek 1B, krok 1)18. Usuń MG, przecinając je pod nimi, i usuń węzły chłonne z gruczołów #4 (Rysunek 1B, kroki 2, 3)18. Powtórz procedurę po drugiej stronie ciała.
  4. Zebrać tkankę MG w 50 ml 4 °C Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych F12 (F12) uzupełniona 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1X Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (Anty-Anty)18.
  5. Posiekaj gruczoły w naczyniu o średnicy 35 mm lub na płytce ceramicznej za pomocą żyletki lub rozdrabniacza do tkanek. Obracaj płytkę co pięć ręcznych siekań lub co rundę na rozdrabniaczu do tkanek, aż kawałki tkanki z łatwością zmieszczą się w końcówce mikropipety o pojemności 1 ml (~0,1 mm/fragment, Rysunek 1C).
  6. Trawić MG w pożywce wytrawiającej (patrz Tabela 1) przez 14 godzin w 6-dołkowym naczyniu o niskiej przyczepności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Dzień 2: Izolacja fragmentów tkanki nabłonkowej sutka

  1. Po 14 godzinach trawienia delikatnie wymieszać, pipetując strawioną tkankę 10X za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, aby rozbić pozostały zrąb lub tkankę tłuszczową, upewniając się, że nie powstają pęcherzyki ani nadmierna siła mechaniczna.
    UWAGA: Jeśli po 14 godzinach trawienie jest niepełne, może to być spowodowane nagromadzeniem ściętego DNA. W takim przypadku należy dodać 1 μl 1 mg/ml deoksyrybonukleazy I (DNazy I) na 2 ml pożywki wytrawiającej. Inkubować przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Zbierz tkankę do probówki o pojemności 15 ml i przepłucz studzienkę używaną do trawienia 2-3 ml soli fizjologicznej klasy 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) wolnej od Ca2+ i Mg2+. Wirować przy 600 x g przez 10 min.
  3. Usunąć supernatant zawierający warstwę lipidową i pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad w 5 ml DPBS i przełączyć na nową probówkę o pojemności 15 ml. Wirować przy 600 x g przez 10 min.
  4. Podczas wirowania umieścić sitko o proporcjach 70 μm z komórek nylonowych w probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilżyć sitko za pomocą 10 ml DMEM/F12 o temperaturze 37 °C.
  5. Ponownie zawiesić fragmenty tkanek z kroku protokołu 2.4 za pomocą 5 ml DPBS i przepuścić zawiesinę przez wstępnie zwilżone sitko do komórek nylonowych o grubości 70 μm w celu usunięcia komórek zrębu i pojedynczych komórek (Rysunek 1D).
  6. Zbierz fragmenty tkanek na sitku do komórek. Przepłukać 4X 10 ml 37 °C DMEM/F12 (Rysunek 1D).
    UWAGA: Niepełne płukanie spowoduje zanieczyszczenie kultur komórkami nienabłonkowymi.
  7. Uwolnij fragmenty tkanki, przytrzymując zakładkę sitka palcami w rękawiczkach, odwracając sitko nad naczyniem do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i przepuszczając 1 ml porcji pożywki konserwacyjnej (patrz Tabela 1) przez dno sitka 4X (Rysunek 1E).
  8. Sprawdź sitko pod kątem resztek fragmentów tkanek, które będą widoczne gołym okiem, i przepłucz sitko 1X więcej 1 ml pożywki konserwacyjnej, jeśli jakiekolwiek fragmenty nadal przylegają do sitka. Wypłukane fragmenty tkanek powinny być teraz wolne od komórek zrębu.
  9. Szybko zbadaj 60-milimetrową szalkę zawierającą fragmenty MG z kroku 2.9 protokołu pod odwróconym mikroskopem (obiektyw 4X lub 10X, Rysunek 1F). Typowe przygotowanie ośmiu MG daje ~500 fragmentów. Poszukaj pojedynczych komórek lub kropelek tłuszczu i poszukaj komórek zanieczyszczających.
    UWAGA: Jeśli znajdują się komórki zanieczyszczające, powtórzyć etap filtracji, zbierając pożywkę i fragmenty z naczynia o średnicy 60 mm za pomocą pipety o pojemności 5 ml i ponownie filtrując fragment przez świeże sitko o średnicy 70 μm, powtarzając kroki protokołu 2.6, 2.8-2.10.
  10. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , pozwalając fragmentowi tkanki przylegać i generować dwuwarstwowe fragmenty (Rysunek 2A).
    UWAGA: Jeśli fragmenty nie osiądną do 24 godzin, kontynuuj inkubację, aż do przylegania. Jeśli fragmenty nie przylegają dobrze, oddzielenie przedziałów komórek nie zadziała. Jeśli badacze obawiają się adhezji, płytki do hodowli tkankowej można poddać obróbce w celu pobudzenia przyczepiania fragmentów (np. poli-L-lizyny).

3. Dzień 3: Trypsyna różnicowa komórek nabłonka mięśniowego i luminalnego

  1. Aby oddzielić MyoEC od LEC, opróżnij pożywkę z naczynia, przepłucz 1x 1 ml DPBS i dodaj 1 ml świeżej trypsyny-EDTA (0,05%) i uważnie monitoruj trawienie pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 10X lub 20X, Rysunek 2B, C, F). Oderwanie zewnętrznej warstwy MyoEC będzie wymagało 3-6 minut, w zależności od siły trypsyny-EDTA (0,05%.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 2, aby zobaczyć reprezentatywne obrazy pokazujące ten proces. W jasnym polu oświetlonym, MyoEC wydają się zaokrąglone i mają jaśniejszy wygląd w porównaniu do LEC, które pozostają przylegające w środku i wydają się ciemniejsze.
  2. Zebrać frakcję MyoEC w 15 ml probówce zawierającej 2 ml 10% FBS/DPBS. Nie naruszając LECs, delikatnie przepłucz naczynie o średnicy 60 mm 2 ml DPBS, a następnie wyrzuć DPBS (Rysunek 2H-I).
    UWAGA: Typowy odzysk dla MyoEC mieści się w zakresie (3,5 x 10 6-1,5 x 106) w zależności od wielkości MG.
  3. Aby usunąć frakcję LEC, ponownie dodaj 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%) do naczynia i inkubuj 7-15 minut, uważnie monitorując, aby zapobiec nadmiernemu strawnieniu. Ugasić trypsynę-EDTA (0,05%) na talerzu za pomocą 2 ml 10% FBS/DPBS. Zbierz frakcję LEC do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Zwykły odzysk dla LEC mieści się w zakresie (2 x 10 6-4,2 x 106) w zależności od wielkości MG. Rutynowo czystość obu frakcji oznaczona za pomocą immunohistochemii wynosi ~90%19 (Rysunek 2E).
  4. Odwirowywać każdą frakcję przez 5 minut przy 300 x g, aby usunąć trypsynę-EDTA (0,05%). Zawiesić osad w 250 μl pożywki konserwacyjnej i policzyć każdą populację komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Umieść komórki na lodzie podczas liczenia.
    UWAGA: Jeśli pożądana jest manipulacja genetyczna frakcjami komórek, komórki pierwotne mogą być hodowane na szalkach o niskiej przyczepności i zakażone lentiwirusem20.

4. Dzień 3: Łączenie i osadzanie frakcji komórkowych w macierzy zewnątrzkomórkowej

UWAGA: Po zebraniu i zliczeniu frakcji MyoEC i LEC, można je połączyć. Typowy stosunek MyoEC/LEC wynosi 1:3 (Rysunek 3A)19. Można przeprowadzić różne badania. Na przykład, aby przeprowadzić badania mozaiki, frakcje można wygenerować z myszy typu dzikiego (WT) i zmutowanego (Mut) oraz połączyć (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/MUT; Mut/WT; Mut/Mut)21, lub ułamki mogą być łączone przy użyciu różnych proporcji MyoECs/LECs19.

  1. Na podstawie liczby komórek oblicz liczbę studzienek (komora z 8 dołkami, patrz tabela materiałów), które należy przygotować na 12 000 komórek/studzienkę (np. 3 000 MyoEC: 9 000 LEC).
  2. Ustal warstwę bazową dla hodowli 3D, dodając 90 μl 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, bez czerwieni fenolowej - patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków, a studzienki są równomiernie pokryte. Aby zestalić warstwę podstawową, inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min.
    UWAGA: ECM musi pozostać lodowaty do tego etapu, w przeciwnym razie ulegnie przedwczesnej polimeryzacji i doprowadzi do nierównej powłoki bazowej i polimeryzacji. Korzystanie z podstawowego ECM zwiększa wzrost organoidów w jednej płaszczyźnie, co pomaga w przechwytywaniu obrazu. Pozwala to również na szybszy wzrost organoidów i mniejsze zużycie ECM22.
  3. Podczas polimeryzacji przygotuj mieszanki komórek. Osadzaj frakcje MyoEC i LEC w 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś każdą frakcję komórkową w 10% pożywce ECM/90% wzrostu, tak aby każda studzienka miała 100 μl (patrz Tabela 1, aby dowiedzieć się, jak zrobić pożywkę wzrostową).
    UWAGA: Dla ułatwienia przygotowania, powtórz studzienki przy użyciu tych samych mieszanek komórek. Można je łączyć i przygotowywać w jednej probówce (np. cztery studzienki tej samej mieszanki komórek można przygotować w 400 μl 10% ECM/90% pożywki wzrostowej).
  4. Dodać 100 μl każdej mieszanki komórek w 10% ECM/90% pożywce wzrostowej do każdej studzienki i pozostawić organoidy na 20 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Gdy komórki się usiądą, delikatnie dodaj 100 μl pożywki wzrostowej, delikatnie pipetując ścianki komory każdej studzienki. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (patrz Rysunek 3A dla całkowitego składu każdej studzienki).
    UWAGA: Inhibitor kinazy Rho, R-spondyna i Nrg1 to czynniki, które zostały zidentyfikowane jako ważne dla długoterminowej hodowli organoidów wyhodowanych zarówno z pierwotnych mysich komórek sutka, jak i ludzkich komórek raka piersi13,14. Ponadto czynniki komórek macierzystych B27 i N2 wydłużają czas, w którym organoidy mogą być hodowane.
  6. Obrazuj komórki co 24 godziny, aby śledzić ich wzrost i delikatnie odnawiaj pożywkę wzrostową co 2-3 dni przy użyciu 100 μL/studzienkę (Rysunek 3B-E).
    UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas odnawiania podłoża. Przechyl szkiełka komory, aby zebrać pożywkę w jednym rogu studzienek. Usunąć ≤100 μl podłoża i ostrożnie uzupełnić, aby pozostawić warstwę ECM nienaruszoną.
  7. Jeśli badacze są zainteresowani badaniem laktacji/alweologenezy, przełącz się na pożywkę alweologenezy (patrz Tabela 1) w 5 dniu i kontynuuj odnawianie pożywki co 2-3 dni do dnia 10 (Rysunek 3F) lub dłużej przez pasażowanie przy użyciu roztworu regeneracyjnego (patrz Tabela materiałów)13.
    UWAGA: W tym momencie organoidy można wyizolować z ECM poprzez inkubację w temperaturze 4 °C w 400 μl roztworu odzysku o temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o protokole i odczynniku).

5. Dzień 5 lub 10: Utrwalanie i barwienie immunologiczne organoidów

  1. Ostrożnie usuń pożywkę, delikatnie pipetując pożywkę (najlepiej sprawdza się pipeta z gruszką). Wypłucz każdą studzienkę za pomocą 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS, patrz przepisy).
  2. Utrwalić organoidy za pomocą zimnego (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA, patrz przepisy) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: PFA jest niebezpieczny. Nosić środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne). Ten krok należy wykonać wewnątrz dygestorium.
    UWAGA: ECM jest rozpuszczany przez obróbkę PFA. Niepełne usunięcie ECM może prowadzić do barwienia tła, gdy organoidy są analizowane za pomocą immunofluorescencji.
  3. Usunąć 4% PFA i dodać 200 μl 0,2% (w/v) glicyny/DPBS (patrz Tabela 1) do każdego dołka. Szkiełka należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub 4 °C przez noc na kołyszącej się powierzchni ustawionej na wolne ustawienie.
    UWAGA: Organoidy można przechowywać przez 1-3 dni w DPBS w temperaturze 4 °C przed następnym etapem.
  4. Przepuszczalność organoidów za pomocą DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, patrz Tabela 1) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zablokuj organoidy za pomocą 5% surowicy osła (DS) (lub innej surowicy pasującej do gatunku przeciwciała drugorzędowego) w DPBS przez 1 godzinę na kołyszącej się powierzchni.
    UWAGA: Ten krok można wykonać przez noc w temperaturze 4 °C na kołyszącej się powierzchni.
  6. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w 1% DS/DPBS. Użyj 125-200 μl na każdą studzienkę. Barwienie immunologiczne należy przeprowadzić przez inkubację organoidów w przeciwciałie pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na kołyszącej się powierzchni.

6. Dzień 11: Pełna immunofluorescencja

  1. Przemyj każdą studzienkę 2X 200 μL PBST przez 5 minut. Dodaj przeciwciało wtórne w 1% DS/DPBS, używając 125-200 μL dla każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej na kołyszącej się powierzchni przez 45 minut.
  2. Przemyj każdą studzienkę 2X przy użyciu 200 μL PBST na studzienkę.
  3. Wybarwić jądra za pomocą barwnika DNA Hoechst w DPBS (1:2 000 w DPBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń cały płyn pozostały na studzience, delikatnie odsysając próżnię.
  5. Ostrożnie wyjmij komory i uszczelkę, umieść jedną kroplę (~30 μL) podłoża montażowego (patrz Tabela Materiałów) na każdym dołku i szkiełku nakrywkowym, uważając, aby usunąć pęcherzyki. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w ciemnym miejscu na 1-2 dni. Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Zobrazuj organoidy pod mikroskopem konfokalnym (Ryc. 3E-F).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania specyficznych wkładów linii komórkowych komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z wykorzystaniem organoidów mozaikowych. Aby uzyskać pierwotne komórki mysie do hodowli organoidów, należy najpierw wyizolować nabłonek gruczołu mlekowego z otaczającego go zrębu bogatego w adipocyty (Rysunek 1). Proces ten został tutaj krótko opisany, a szczegóły znajdują się w wcześniej opublikowanej pracy18

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono metodę szczegółowo opisującą, w jaki sposób naukowcy mogą generować hodowle organoidów 3D przy użyciu pierwotnych komórek MG. Różnica między tym a innymi protokołami polega na tym, że szczegółowo opisujemy metodę oddzielania dwóch, odrębnych przedziałów komórek MG: zewnętrznych podstawowych MyoEC i wewnętrznych LEC. Nasza metoda wykorzystuje dwuetapowe leczenie trypsyną-EDTA (0,05%), które nazywamy trypsynizacją różnicową19. Procedura ta pozwala naukowcom na izolację My...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Benowi Abramsowi za pomoc techniczną i wsparcie ze strony Instytutu Biologii Komórek Macierzystych (IBSC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz (UCSC). Dziękujemy Susan Strome i Billowi Saxtonowi za korzystanie z mikroskopu konfokalnego Solamere Spinning Disk. Praca ta była częściowo wspierana przez granty dla UCSC z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa za pośrednictwem programu James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), z NIH (NIH GM058903) na inicjatywę na rzecz maksymalizacji rozwoju studentów (HM) oraz z National Science Foundation na stypendium badawcze dla absolwentów (O.C. DGE 1339067) oraz przez grant (A18-0370) z UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml polipropylenowa probówka stożkowa o wysokiej przejrzystości (BD Falcon)Fisher Scientific352096
24-dołkowa płytka mocująca o bardzo niskiej temperaturze (Corning)Fisher ScientificCLS3473-24EA
35 mm naczynie do hodowli komórkowych Easy-Grip Style z powłoką TC (BD Falcon)Fisher Scientific353001
50 ml Probówka stożkowa z polipropylenu o wysokiej przejrzystości (BD Falcon)Fisher Scientific
60 mm naczynie do hodowli komórkowych Easy-Grip Style z powłoką TC (BD Falcon)Fisher Scientific353004
70 µ M nylonowe sitko do komórek (Corning)Fisher Scientific08-771-2
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Pen/Strep działa również
suplement B27 bez witaminy A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
B6 ACTb-EGFPmyszy The Jackson Laboratory003291
BD Strzykawka insulinowa 0,5 mlThermo Fisher Scientific14-826-79
Klasa 2 Dyspaza (Roche)Millipore Sigma4942078001
Klasa 3 KolagenazaWorthington BiochemicalLS004206
Corning Cell Recovery SolutionFisher Scientific354253Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkowania – Ekstrakcja struktur trójwymiarowych
z Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-dołkowyFisher ScientificCLS3471
MaksametazonMillipore SigmaD4902-25MG
DMEM/F12, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific11039-021
DNaza (dezoksyrybonukleaza I)Worthington BiochemicalLS002007
Donkey anti-Goat 647Thermo Fisher ScientificA21447Stosować w 1:500, Partia: 1608641, zapas 2 mg / mL, RRID:AB_2535864
Osioł anty-Myszy 647Jackson ImmunoResearch715-606-150Użyj w 1:1000, Partia: 140554, zapas 1,4 mg / ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12)Thermo Fisher Scientific11330-057
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermoFisher Scientific14190-250Bez Mg2+/Ca2+
EGFFisher ScientificAF-100-15-100ug
Surowica bydlęcapłodu VWR97068– 085100% Pochodzenie z USA, klasa premium, Partia: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)Fisher Scientific0100-01Określany jako nośnik montażowy w tekście
GentamynaThermo Fisher Scientific15710064
GlicynaFisher ScientificBP381-5
Koza anty-WAPSanta Cruz BiotechSC-14832Użyj w 1:250, partia: J1011, zapas 200 i mikro; g / mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342AnaSpecAS-83218Użyj 1:2000, stan magazynowy to 20mM
InsulinaMillipore SigmaI6634-100mg
KClFisher ScientificP217-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
KRT14– CreERtam, The Jackson Laboratory5107
Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR); Bez czerwieni fenolowej; 10 mlFisher ScientificCB-40230CPartia: 8204010, stężenie standardowe 8,9 mg/ml
MillexGV Jednostka filtrująca 0,22 i mikro; mMillipore SigmaSLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-dołkowe szkło, sterylneMillipore SigmaPEZGS0816Te szkiełka komorowe świetnie nadają się do usuwania uszczelek, ale dobrze mogą działać inne marki (np. Lab Tek II).
Mysz anty-SMAMilliporeSigma A2547Użyj w 1:500, Lot: 128M4881V, zapas 5,2 mg / mL, RRID:AB_476701
Suplement N-2 (100x)Thermo Fisher Scientific17502048
NaCl FisherScientificS671-3
NaH2PO4Fisher ScientificS468-500
Nrg1R& D5898-NR-050
Krajowy program hormonów i peptydówprolaktyny przysadki owczejzakupiony od dr Parlowa w Instytucie Badań i Edukacji Harbor-UCLA
Inhibitor Rho Y-27632Tocris1254
R-spondynaPeprotech120-38
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-500
Sterylne filtrowane serum osłaEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Sterylne filtrowane serum osłaEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Triton X-100Millipore Sigmax100-500MLTrypsyna klasy laboratoryjnej
EDTA 0,05%Thermo Fisher Scientific25300-062
352098, Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3 Pentobarbital Millipore Sigma P3761 R26R-EYFP Laboratorium Jacksona 6148

Bibliografia

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message? Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207(2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179(2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079(2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661(2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki mioepitelialnekomórki luminalnetrawienie tkankiizolacja komórekmacierz pozakomórkowamikroskopia fluorescencyjnahodowla komórkowaekspresja genów
Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.