Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Summary

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Abstract

Antybiotyki fluorescencyjne są uniwersalnymi narzędziami badawczymi, które są chętnie wykorzystywane do badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, ze względu na ich znaczną przewagę nad innymi metodami. Aby przygotować te sondy, syntetyzuje się pochodne azydków antybiotyków, a następnie łączy się je z fluoroforami alkinowymi za pomocą cykloaddycji azydkowo-alkinowej metodą chemii kliknięć. Po oczyszczeniu bada się aktywność antybiotykową antybiotyku fluorescencyjnego poprzez ocenę minimalnego stężenia hamującego. Do badania akumulacji bakterii można zastosować spektrofotometrię lub cytometrię przepływową, co pozwala na znacznie prostszą analizę niż metody oparte na pochodnych antybiotyków promieniotwórczych. Co więcej, mikroskopia konfokalna może być wykorzystana do zbadania lokalizacji w obrębie bakterii, dostarczając cennych informacji na temat sposobu działania i zmian zachodzących u odpornych gatunków. Zastosowanie fluorescencyjnych sond antybiotykowych w badaniu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest potężną metodą o dużym potencjale rozwoju w przyszłości.

Introduction

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) to narastający kryzys, który stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego na całym świecie. Odnotowano oporność na większość antybiotyków i pojawiają się infekcje wywołane przez bakterie oporne na wszystkie klinicznie dostępne leki. Aby przeciwdziałać wzrostowi oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, musimy lepiej zrozumieć to wieloaspektowe zjawisko oraz leżące u jego podstaw mechanizmy i interakcje między antybiotykami a bakteriami. Jednym z aspektów, który był historycznie słabo poznany, jest przenikanie antybiotyków do bakterii, wraz ze zjawiskami akumulacji i odpływu. Wiedza ta ma kluczowe znaczenie w projektowaniu nowych leków i zrozumieniu mechanizmów oporności. W związku z tym odgrywa to kluczową rolę w badaniach nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Istnieją dwa główne podejścia, które mogą być podjęte w celu zmierzenia stężenia antybiotyku: bezpośredni pomiar leku lub oznaczanie za pomocą ugrupowania ułatwiającego kwantyfikację. Chociaż znakowanie antybiotyku poprawia wykrywanie, może to zaburzać aktywność biologiczną leku, taką jak aktywność przeciwdrobnoustrojowa i przepuszczalność. Nie stanowi to problemu w przypadku metod nieoznaczonych; Jednak wykrywanie może być trudne. W ciągu ostatnich kilku lat postęp technologiczny doprowadził do rozkwitu badań wykorzystujących spektrometrię mas (MS) do bezpośredniego pomiaru stężenia antybiotyków w bakteriach1^,2,3,4,5,6,7. Badania te wykazały, że możliwe jest badanie akumulacji wewnątrzkomórkowej u różnych bakterii, przy czym najczęściej badane są bakterie Gram-ujemne. Kwantyfikacja przepuszczalności cząsteczek została następnie powiązana z aktywnością i wykorzystana do informowania o opracowywaniu leków^2,3,4, chociaż należy zachować ostrożność przy bezpośrednim łączeniu akumulacji i aktywności docelowej⁵. Przed opracowaniem stwardnienia rozsianego jedynymi antybiotykami, których stężenie można było bezpośrednio zmierzyć, były te posiadające wewnętrzną fluorescencję, takie jak tetracyklina i chinolony^8,9,10,11. Chociaż oczywiście ograniczony zakres, akumulacja i odpływ zostały zbadane i określone ilościowo, co ilustruje przydatność kwantyfikacji opartej na fluorescencji.

Antybiotyki oznaczone są używane od wielu dziesięcioleci do badania rozkładów, sposobów działania i odporności, przy czym znaczniki radioaktywne i fluorescencyjne są powszechne. Sondy znakowane radiowo mają tę zaletę, że są prawie identyczne ze związkiem macierzystym, stąd jest mało prawdopodobne, aby aktywność biologiczna różniła się znacząco. Izotopy takie jak ³H, ¹⁴C i ¹⁵N były często stosowane ze względu na znaczenie tych pierwiastków w antybiotykach, a także badano różne rusztowania antybiotykowe^1,10,12,13. Chociaż wykrywanie sond radiowych jest proste, istnieje szereg problemów logistycznych (np. bezpieczeństwo, okres półtrwania izotopów), które ograniczyły zastosowanie tego podejścia. Inną strategią są antybiotyki znakowane fluorescencyjnie. Sondy te mogą być używane do badania rozkładu i sposobów działania oraz oporności leku macierzystego, przy użyciu prostszej technologii niż MS i bez problemów logistycznych związanych z promieniowaniem⁸. Główną wadą tego podejścia jest to, że antybiotyki są na ogół stosunkowo małymi cząsteczkami, stąd wprowadzenie ugrupowania fluorescencyjnego powoduje znaczącą zmianę chemiczną. Ta zmiana może wpływać na właściwości fizykochemiczne i aktywność przeciwbakteryjną. Dlatego należy dołożyć starań, aby ocenić te czynniki w celu uzyskania wyników reprezentatywnych dla antybiotyku macierzystego.

W tej pracy opisana jest metoda syntezy, oceny i stosowania antybiotyków fluorescencyjnych, tak jak w naszych poprzednich publikacjach^14,15,16. Dzięki wcześniejszym pracom przygotowano wiele antybiotyków fluorescencyjnych, które były używane do różnych celów (patrz Stone et al.⁸). W celu zminimalizowania prawdopodobieństwa wpływu na aktywność biologiczną w tej pracy stosuje się bardzo małe fluorofory: nitrobenzoksadiazol (NBD, zielony) i 7-(dimetyloamino)-2-okso-2 H-chromen-4-yl (DMACA, niebieski). Ponadto opisano ocenę aktywności przeciwbakteryjnej za pomocą testu rozcieńczenia mikrobulionu przy minimalnym stężeniu inhibicji (MIC), dzięki czemu można zmierzyć wpływ modyfikacji na aktywność. Te fluorescencyjnie znakowane sondy mogą być używane w testach spektrofotometrycznych, cytometrii przepływowej i mikroskopii. Zakres możliwych zastosowań jest tym, w czym tkwi przewaga antybiotyków fluorescencyjnych. Akumulację komórkową można określić ilościowo, skategoryzować i zwizualizować, co nie jest możliwe przy użyciu samego stwardnienia rozsianego. Mamy nadzieję, że wiedza zdobyta dzięki zastosowaniu antybiotyków fluorescencyjnych pomoże nam w zrozumieniu oporności i walce z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Protocol

1. Synteza alkino-fluoroforów

1. Synteza NBD-alkiny (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-ylo)benzo[c][1,2,5]oksadiazol-4-aminy)
   1. Rozpuścić 1,031 mg 4-chloro-7-nitro-benzofuranu (5,181 mmol) w 60 ml tetrahydrofuranu (THF). Dodaj 1,857 mg CsCO₃ (5,696 mmol), a następnie 0,39 ml propargyloaminy (6,1 mmol). Podgrzewaj reakcję do 50 °C przez 2 godziny, która zmieni kolor z brązowego na zielony, a następnie schładzaj do temperatury pokojowej (RT).
   2. Przefiltrować reakcję za pomocą środka filtrującego (patrz tabela materiałów) i przepłukać octanem etylu (EA). Zagęścić filtrat pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie rozpuścić pozostałość w 150 ml EA i przenieść do rozdzielacza o pojemności 500 ml.
   3. Przemyć roztwór EA 100 ml odpowiednio wodą i solanką. Następnie połącz fazy wodne i przemyj 2x 100 ml EA.
   4. Wysuszyć połączone fazy organiczne na bezwodnym siarczanie magnezu, a następnie przefiltrować i zagęścić pod zmniejszonym ciśnieniem.
   5. Oczyść surowy produkt za pomocą chromatografii błyskawicznej na żelu krzemionkowym (20–30% EA w eterze naftowym [PE]), sprawdzając czystość za pomocą chromatografii cieczowej spektrometrii mas (LCMS, [M+H]⁺ = 219,1) i/lub spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), zmiany chemiczne w następujący sposób:
      ¹H NMR (CD₃OD, 600 MHz) δ 8,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,7 Hz, J = 2,5 Hz, 2H), 2,43 (t, J = 2,5 Hz, 1H); ¹³C NMR (CD₃OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.
      UWAGA: Podczas oczyszczania metodą chromatografii z żelem krzemionkowym należy przygotować kolumnę przy użyciu mniej polarnego z wymienionych rozpuszczalników. Surowy związek może być albo załadowany jako stężony roztwór, albo zaadsorbowany na krzemionce, jeśli rozpuszczalność na to nie pozwala. Po dodaniu związku do wierzchu krzemionki przepuść przez 1-2 objętości kolumny tego samego rozpuszczalnika, który jest używany do zwilżania krzemionki. Następnie zacznij od podanego stosunku rozpuszczalnika, przechodząc przez co najmniej 1 objętość kolumny każdego rozpuszczalnika i upewniając się, że nie robisz dużych skoków w składzie rozpuszczalnika. Zebrać frakcje i sprawdzić czystość/tożsamość za pomocą LCMS lub TLC (chromatografia cienkowarstwowa). Połącz czyste frakcje i zagęść pod zmniejszonym ciśnieniem przez odparowanie rotacyjne.
2. Synteza DMACA-alkiny (2-(7-(dimetyloamino)-2-okso-2 H-chromen-4-ylo)-N-(prop-2-yn-1-ylo)acetamid).
   1. Rozpuścić 5,02 g 3-(dimetyloamino)fenolu (36,6 mmol) w 30 ml etanolu, a następnie dodać 6,7 ml dietylo-1,3-acetonodikarboksylanu (36 mmol). Dodać 10,5 g ZnCl₂ (77,2 mmol), a następnie płukać czerwony roztwór przez 42 godziny. Dodać dodatkowe 9,20 g ZnCl₂ (67,6 mmol), a następnie odstawić na 8 godzin.
   2. Schłodzić reakcję i skoncentrować pod zmniejszonym ciśnieniem. Powstałe czerwone ciało stałe rozpuścić w 200 ml EA, przefiltrować, a następnie przenieść do rozdzielacza o pojemności 500 ml.
   3. Umyj EA po 200 ml wody i solanki, a następnie wysusz na bezwodnym siarczanie magnezu. Przefiltrować wysuszoną fazę organiczną i zagęścić pod zmniejszonym ciśnieniem.
   4. Oczyścić czerwone ciało stałe (octan 2-(7-(dimetyloamino)-2-okso-2-2 H-chromen-4-ylo)etylu) metodą chromatografii błyskowej na żelu krzemionkowym (0–100% EA w PE), sprawdzając czystość za pomocą LCMS ([M+H]⁺ = 275,1) i/lub NMR, przesuwając skład chemiczny w następujący sposób:
      ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7,30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
   5. Rozpuścić 488 mg octanu 2-(7-(dimetyloamino)-2-okso-2 H-chromen-4-ylo)octanu etylu (1,18 mmol) w 10 ml THF, a następnie dodać roztwór 157 mg LiOH·H₂O (3,74 mmol) w 15 ml wody. Mieszać reakcję w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, następnie przenieść do rozdzielacza i rozcieńczyć dodatkowymi 50 ml wody.
   6. Przemyć mieszaninę reakcyjną 2x 50 ml eteru dietylowego (Et₂O), a następnie przemyć połączoną fazę organiczną 2x 25 ml wody. Weź dowolny żółty osad z warstwą organiczną. Zagęścić fazę organiczną pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.
   7. Zakwasić fazę wodną do pH = 2 stężonym HCl i schłodzić do 4 °C przez noc. Przefiltrować zakwaszoną fazę wodną i dodać żółte ciało stałe do zagęszczonej fazy organicznej.
      UWAGA: Kwas 2-(7-(dimetyloamino)-2-okso-2 H-chromen-4-ylo)octowy może być stosowany bez dalszego oczyszczania, ale można to sprawdzić za pomocą LCMS ([M+H]⁺ = 247,1) i/lub NMR, przesunięcia chemiczne w następujący sposób:
      ¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7,41 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 9,2 Hz, J = 2,8 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J = 0,9 Hz, 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109,3, 109,1, 108,8, 98,3, 40,2, 18,5.
   8. Rozpuścić 466 mg kwasu 2-(7-(dimetyloamino)-2-okso-2 H-chromen-4-ylo)octowego (1,89 mmol) w 7 ml suchego N,N-dimetyloformamidu (DMF) i umieścić w atmosferze azotu.
   9. Rozpuścić 0,33 ml propargyloaminy (5,1 mmol) w 7 ml suchego DMF w azocie. Dodać 1,30 ml di-izopropyloetyloaminy (DIPEA, 7,50 mmol) do roztworu barwnika, a następnie 535 mg heksafluorofosforanu O-(1H-6-chlorobenzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloironium (HCTU, 1,29 mmol). Mieszaj aktywowany roztwór barwnika przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodawaj roztwór aminy kroplami i pozostaw na noc do wymieszania.
   10. Następnego dnia rozcieńczyć reakcję 35 ml wody, a następnie zagęścić pod zmniejszonym ciśnieniem.
   11. Powstałą pomarańczową substancję stałą podzielić między EA i solankę (po 100 ml każdy) w rozdzielaczu o pojemności 250 ml. Rozdzielić warstwy (umieścić obie warstwy w różnych kolbach) i przemyć fazę wodną 100 ml EA.
   12. Zagęścić połączone fazy organiczne pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie ponownie rozpuścić pomarańczową substancję stałą w 3 ml acetonitrylu (ACN) w stosunku 1:1/wody (v/v). Oczyść surowy produkt poprzez wstrzyknięcie do systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej (MPLC) z odwróconymi fazami, wyposażonego w kolumnę z wkładem C18 (rozpuszczalnik A: woda, rozpuszczalnik B: ACN).
   13. Sprawdź frakcje pod kątem czystości za pomocą LCMS ([M + H] ⁺ = 284,1, przesunięcia chemiczne NMR podane poniżej), a następnie połącz i liofilizuj odpowiednie frakcje, aby uzyskać 2-(7-(dimetyloamino)-2-okso-2 H-chromen-4-ylo)-N-(prop-2-yn-1-ylo)acetamid, chemiczne przesunięcia NMR w następujący sposób:
       ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 8,65 (t, J = 5,4 Hz, 1 H), 7,52 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 6,72 (dd, J = 9,1, 2,6 Hz, 1 H), 6,55 (d, J = 2,6 Hz, 1 H), 6,00 (s, 1 godzina), 3,88–3,87 (m, 2 godziny), 3,62 (s, 2 godziny), 3,13 (t, J = 2,5 Hz, 1 godzina), 3,01 (s, 6 godzin); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108,1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,4, 28,2.

2. Synteza antybiotyków fluorescencyjnych

1. Przygotuj pochodną azydku antybiotyku zgodnie z wcześniejszym opisem^14,15,16.
   UWAGA: Procedura jest specyficzna dla każdego antybiotyku i wymaga dokładnego zbadania zależności struktura-aktywność (SAR) cząsteczki macierzystej, aby upewnić się, że funkcjonalizowany antybiotyk zachowuje aktywność porównywalną z rodzicem. (np. ciprofloksacyna¹⁶, linezolid¹⁴ i trimetoprim¹⁵). Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z przykładami opublikowanych antybiotyków fluorescencyjnych i ogólnym schematem syntezy.
2. Procedura reakcji kliknięcia A
   UWAGA: W przypadku większości antybiotyków należy postępować zgodnie z procedurą opisaną tutaj dla katalizowanej miedzią cykloaddycji Huisgenu [2+3] azydku (krok 2.1) i fluorescencyjnego alkinu (przygotowanego w kroku 1).
   1. Umieścić antybiotyk azydekowy w kolbie okrągłodennej i dodać tert-butanol (^tBuOH) i wodę (1:1 v/v, po 25 ml na mmol azydku).
   2. Dodać fluorofor-alkinis przygotowany w kroku 1.1 (3 eq) i podgrzać reakcję do 50 °C. Następnie dodaj siarczan miedzi (100 mM w wodzie, 0,6 eq) do reakcji, a następnie kwas askorbinowy (500 mM w wodzie, 2,4 eq).
   3. Mieszać reakcję w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę lub do czasu analizy przez LCMS po wskazaniu zakończenia reakcji (całkowite zużycie początkowego azydku).
   4. Schłodzić reakcję i oczyścić rusztowanie z antybiotykiem, a następnie przejść do oczyszczania zgodnie z krokiem 2.3 lub 2.4.
      UWAGA: Możliwych jest kilka różnych metod oczyszczania, w zależności od biegunowości i stabilności rusztowania.
3. Procedura reakcji kliknięcia B
   UWAGA: Postępuj zgodnie z tą procedurą w przypadku antybiotyków na bazie peptydów, aby zapewnić silniejsze warunki reakcji (niepublikowana praca, Phetsang, 2019).
   1. Umieścić antybiotyk peptydowy w kolbie okrągłodennej i dodać tyle DMF (750 ml/mmol azydku) do rozpuszczenia.
   2. Dodać alkin-fluorofor przygotowany w kroku 1 (5 eq) i podgrzewać reakcję do temperatury 50 °C przez 1 godzinę.
   3. Dodać jodek miedzi (I) (20 eq.), następnie DIPEA (120 eq.), a następnie kwas octowy (240 eq.).
   4. Mieszać reakcję w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę lub do momentu, gdy analiza za pomocą LCMS wykaże zakończenie reakcji (tj. całkowite zużycie początkowego azydku). Schłodzić reakcję i przejść do oczyszczania metodą 1 (patrz krok 2.3).
4. Metoda oczyszczania 1 (stosowana w przypadku cyprofloksacyny, trimetoprimu i linezolidu)
   1. Wstrzyknąć schłodzoną reakcję kliknięcia bezpośrednio do kolumny wkładu MPLC C18.
   2. Na początku cyklu należy przeprowadzić długą fazę płukania (około 10 minut) (100% rozpuszczalnika A), następnie przeprowadzić gradient do 100% rozpuszczalnika B, a następnie powrócić do rozpuszczalnika A.
      UWAGA: Rozpuszczalnik A można wybrać z wody, 0,05–0,1% kwasu mrówkowego (FA) w wodzie, 0,05–0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w wodzie, w zależności od rozpuszczalności, stabilności i najlepszej rozdzielczości pików. Rozpuszczalnik B można wybrać spośród acetonitrylu (ACN), 0,05–0,1% FA w ACN, 0,05–0,1% TFA w ACN, w celu dopasowania do rozpuszczalnika A. Jeśli elucja okaże się trudna, zamiast ACN można użyć metanolu.
   3. Zebrać i połączyć odpowiednie frakcje, zgodnie ze wskazaniami LCMS i kolor (widoczna prawidłowa masa, pojedynczy pik), a następnie liofilizować, aby uzyskać (pół)czysty antybiotyk fluorescencyjny.
   4. W razie potrzeby należy dodatkowo oczyścić produkt. Ocenić czystość za pomocą NMR i/lub LCMS i wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC), stosując kolumnę i metodę odpowiednią dla rusztowania.
5. Metoda oczyszczania 2
   UWAGA: Jeśli pozwala na to rozpuszczalność, wstępne oczyszczanie można przeprowadzić za pomocą roztworu wodnego (stosowane do makrolidów, praca niepublikowana, Stone 2019).
   1. Rozcieńczyć schłodzoną reakcję kliknięcia wodą i Et₂O (1:1 v/v, około 10-krotne rozcieńczenie od początkowej objętości reakcji), przenosząc do rozdzielacza o odpowiedniej wielkości.
   2. Oddzielić warstwy i dwukrotnie przemyć fazę wodną Et₂O.
   3. Połączone fazy organiczne przemyć 2x wodą (taka sama objętość jak faza organiczna), a następnie wysuszyć nad Na₂SO₄.
   4. Przefiltrować wysuszoną fazę organiczną i zagęścić pod zmniejszonym ciśnieniem.
   5. Oczyścić produkt surowy za pomocą MPLC i/lub HPLC zgodnie z opisem w kroku 2.4.4.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z przykładami niekompletnych, kompletnych i oczyszczonych śladów LCMS reakcji na kliknięcie. Typowa wydajność po oczyszczeniu w reakcjach klikania antybiotyku i fluoroforu waha się od 30 do 80%.
      UWAGA: Większość substancji chemicznych używanych w tych syntezach wiąże się ze szczególnymi zagrożeniami bezpieczeństwa. Przez cały czas należy zachować ostrożność, w tym stosować środki ochrony osobistej. Et₂O, ^tBuOH, FA, kwas octowy, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargyloamina i HCTU są łatwopalne; Unikaj kontaktu ze źródłami ciepła lub iskier. THF, propargyloamina, DIPEA, ^tBuOH, FA, DMF i PE są toksyczne; Unikaj ekspozycji. Propargilamina, CsCO₃, ZnCl₂, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, kwas octowy i HCl są; Unikaj kontaktu i uważaj na kontakt z powierzchnią. ZnCl₂, CuSO₄, CuI i PE stanowią zagrożenie dla środowiska; Należy pamiętać o warunkach utylizacji. THF może tworzyć wybuchowe nadtlenki; Uważaj na warunki przechowywania. Azydki organiczne są wybuchowe; Zachowaj ostrożność zwłaszcza przy produkcji na dużą skalę.

3. Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej

UWAGA: Wszystkie prace związane z bakteriami powinny być wykonywane w sterylnych warunkach, aby uniknąć zanieczyszczenia zarówno testu, jak i laboratorium. Wszystkie podłoża powinny być sterylizowane w autoklawie przed użyciem, a plastikowe naczynia i sprzęt, taki jak pipety, muszą być utrzymywane w sterylności. Zaleca się wykonywanie prac w kapturze zabezpieczającym biologicznie (typ 2).

1. Szczepy bakterii zawierających glicerol, odpowiednie dla rusztowania antybiotykowego, należy przenieść na agar z bulionu lizogenicznego (LB, przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Wybór bakterii do badania aktywności przeciwbakteryjnej musi być dokonany na podstawie używanego rusztowania antybiotykowego. Reprezentatywny zakres 5–10 bakterii powinien zostać wybrany spośród gatunków, o których wiadomo, że są podatne na antybiotyk, z uwzględnieniem możliwości logistycznych laboratorium. Jeśli to możliwe, należy również przebadać oporne bakterie. Poniższy protokół będzie działał na większość bakterii, ale sprawdź, czy wymagane są specjalne warunki (np. CO₂ , specjalne pożywki) i w razie potrzeby wprowadź zmiany. Bakterie, które z powodzeniem oznaczono przy użyciu tych warunków, obejmują Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus faecium.
2. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i hodować przez noc w 5 ml bulionu Muellera-Hintona z adiunkcją (CAMHB, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta) w temperaturze 37 °C.
3. Rozcieńczyć nocne kultury ~ 40-krotnie w CAMHB i rozebrać do środkowej fazy logarytmicznej, gęstość optyczna przy 600 nm (OD₆₀₀) = 0,4–0,8, objętość 5 ml).
4. Przygotować roztwory podstawowe każdego antybiotyku fluorescencyjnego w stężeniu 1,28 mg/ml w sterylnej wodzie i odpipetować 10 μl antybiotyku do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej.
5. Dodać 90 μl CAMHB do pierwszej kolumny i 50 μl do wszystkich pozostałych studzienek. Następnie wykonaj seryjne 2-krotne rozcieńczenie na płytce.
6. Dokładnie wymieszaj, a następnie rozcieńcz kultury w środkowej fazie logarytmu do ~10⁶ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml i dodaj 50 μl do wszystkich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie ~5 x 10⁵ CFU/ml.
   
   objętość kultury (ml) = (objętość pożywki w ml)/(OD₆₀₀ x 1,000)
   
   np. dla OD₆₀₀ = 0,5 kultury w żądanej objętości pożywki 12 ml, dodaj (12/(0,5 x 1,000) = 0,024 ml kultury do 12 ml pożywki
7. Przykryć płytki pokrywkami i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18–24 godziny bez wstrząsania.
8. Oględziny należy sprawdzić płytki, przy czym wartość MIC jest studzienką o najniższym stężeniu bez widocznego wzrostu.
   UWAGA: W Tabeli 1 przedstawiono kilka przykładów aktywnych i nieaktywnych antybiotyków fluorescencyjnych.

4. Analiza akumulacji sondy za pomocą spektrofotometrii i cytometrii przepływowej

UWAGA: Te czasy wirowania zostały zoptymalizowane dla E. coli, więc mogą być potrzebne niewielkie zmiany dla innych gatunków. Reprezentatywne dane dotyczące akumulacji sondy są podane dla sondy cyprofloksacyny znakowanej NBD.

1. Umieść zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych na agarze LB i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i hodować ją przez noc w LB w temperaturze 37 °C.
3. Rozcieńczyć kultury na noc ~50-krotnie w pożywce i wyrosnąć do fazy środkowej (OD₆₀₀ = 0,4–0,8).
4. Odwirować kultury o sile 1,470 x g przez 25 minut i zdekantować pożywkę.
5. Zawiesić bakterie w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie odwirować przy 1,470 x g przez 15 minut.
6. Zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić umyte granulki w PBS do końcowej średnicy zewnętrznej₆₀₀ = 2.
7. W razie potrzeby dodać 10,1 μl 3-chlorofenylohydrazonu cyjanku karbonylu (CCCP, 10 mM w PBS) do 1 ml bakterii (końcowe stężenie 100 μM) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min.
   UWAGA: CCCP jest inhibitorem pompy wypływowej. Dodanie CCCP pozwoli na zbadanie wpływu odpływu.
8. Odwirować kultury w temperaturze 18 000 x g przez 4 minuty w temperaturze 20 °C i zdekantować pożywkę.
9. Dodać 1 ml fluorescencyjnego roztworu antybiotyku (10–100 μM w PBS) do osadu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
10. Odwirować kultury przy 18 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C i zdekantować pożywkę.
11. Ponownie zawiesić bakterie w 1 ml zimnego PBS i powtórzyć krok 4.9.
12. Powtórz krok 4.10 w sumie 4 razy.
13. W razie potrzeby poddać bakterie lizie, dodając 180 μl buforu do lizy (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 2 mM EDTA sodu), a następnie 70 μl lizozymu (72 mg/ml w H₂O).
14. Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min, następnie zamrażać i rozmrażać 3x (−78 °C przez 5 min, następnie 34 °C przez 15 min).
15. Sonikować próbki przez 20 minut, a następnie podgrzewać do temperatury 65 °C przez 30 minut.
16. Odwirować zlizane próbki (18 000 x g, 8 min), a następnie przefiltrować przez membranę filtracyjną o mocy 10 kDa.
17. Umyj filtr 4x 100 μl wody.
18. Przenieść lizat na płaskodenną czarną 96-dołkową płytkę i zmierzyć intensywność fluorescencji na czytniku płytek o długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednich dla fluoroforu (tj. DMACA: λ_ex = 400 nm, λ_em = 490 nm; NBD: λ_ex = 475 nm, λ_em = 545 nm).
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3 dla przykładów analiz spektrofotometrycznych bakterii przy użyciu fluorescencyjnego antybiotyku cyprofloksacyny znakowanego NBD.
19. Do analizy metodą cytometrii przepływowej można zastosować te same warunki wzrostu i barwienia (etapy 4.1–4.17), ze zmianami wyłącznie w końcowym preparowaniu.
    1. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml PBS.
    2. Odczytać próbki na cytometrze przepływowym przy natężeniu przepływu około 60 μl/min, wykorzystując amplifikację logarytmiczną do pozyskiwania danych (wzbudzenie F1 = 488 nm; emisja = 525/20 nm).
    3. Zarejestruj łącznie 10 000 zdarzeń, a następnie przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    4. Wykreśl intensywność fluorescencji z F1 w stosunku do liczby zliczeń zdarzeń, szacując medianę intensywności fluorescencji na podstawie pików histogramu po zabarwieniu bakterii.
       UWAGA: Zobacz Rysunek 4 dla przykładów analiz cytometrii przepływowej bakterii przy użyciu antybiotyku cyprofloksacyny znakowanego NBD.

5. Przygotowanie do analizy mikroskopowej

1. Hoduj subkultury do OD₆₀₀ = 0,4, jak w przypadku oceny MIC, a następnie podziel na 1 ml porcji i odwiruj przy 18 000 x g przez 3-5 minut.
2. Zdekantować i wyrzucić pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad bakteryjny w 500 μl HBSS.
3. Wirować przy 18 000 x g przez 3 minuty, następnie zdekantować i wyrzucić pożywkę.
4. Przygotować roztwory sond antybiotykowych w HBSS w stężeniach 1–100 μM.
5. Zawiesić umyte bakterie w 500 μl roztworu sondy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
6. Powtórz krok 5.3. W przypadku eksperymentu z wielokrotnym etykietowaniem ponownie zawieś osad w 500 μl ortogonalnie zabarwionego barwnika kwasu nukleinowego. W przypadku koloru zielonego użyj Syto9 (5 μM w HBSS); w przypadku koloru niebieskiego użyj Hoechst 33342 (20 μg/ml w HBSS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15–30 minut.
7. Powtórzyć krok 5.3, a następnie ponownie zawiesić w 500 μl FM4-64FX (5 μg/ml w HBSS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
8. Powtórzyć krok 5.3, a następnie ponownie zawiesić w 500 μl HBSS i powtórzyć krok 5.3 jeszcze raz.
9. Powtórzyć krok 5.8, a następnie na koniec zawiesić umyte, barwione bakterie w 15 μl podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów).
10. Podłoże do mocowania pipet na szkiełku mikroskopowym i przykryć wysokowydajnym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie uszczelnić krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 5 dla przykładów obrazów mikroskopii konfokalnej wykonanych antybiotykami cyprofloksacyny i trimetoprimu znakowanymi NBD, oraz Rysunek 6 dla antybiotyku znakowanego DMACA oksazolidynonem (linezolidem).

Results

Rysunek 1 Ilustruje kluczową reakcję chemiczną kliknięcia (A) dla przygotowania antybiotyków fluorescencyjnych, oraz (B) przykłady struktur naszych opublikowanych antybiotyków fluorescencyjnych opartych na cyprofloksacynie (cipro), trimetoprimie (TMP) i linezolidze. Wszystkie te sondy zostały zsyntetyzowane z odpowiednich antybiotyków za pomocą produktu pośredniego azydku. Następnie sprzężono je z fluoroforami NBD i DMACA, z których każdy był funkcjonalizowany alkinem.

Rysunek 2 pokazuje przykładowe ślady LCMS z reakcji kliknięcia ciprofloksacyny-N₃ i NBD-alkinu, gdzie azydek został wymyty w 3,2 min, a produkt w 3,8 min. Porównanie 1 i 2 pokazuje, jak postęp reakcji kliknięcia może doprowadzić do zaniku piku azydku (za pomocą detektora UV lub MS). Widma 3 pokazują wpływ oczyszczania, z błędnymi pikami znikającymi ze śladów MS i UV. Zarówno czystość, jak i postęp reakcji można określić ilościowo poprzez integrację piku produktu i wszelkich pików zanieczyszczeń.

Rysunek 3 przedstawia typowe wyniki oceny akumulacji wewnątrzkomórkowej za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej w obecności i bez wypływu. W tym eksperymencie E. coli traktowano TMP-NBD z dodatkiem lub bez dodatku CCCP, który załamuje siłę napędową protonów (PMF). Fluorescencja wewnątrzkomórkowa bakterii była znacznie wyższa po wstępnym potraktowaniu CCCP, co wskazuje, że wypływ zmniejszył akumulację w tych bakteriach. Eksperyment ten powtórzono przy użyciu bakterii z niedoborem tolC, wykazując zdolność tego testu do badania wpływu poszczególnych elementów pompy wypływowej. W tym przypadku, mimo że nastąpił wzrost fluorescencji wewnątrzkomórkowej w porównaniu z bakteriami typu dzikiego, akumulacja CCCP nadal rosła. Wyniki te wskazują, że tolC bierze udział w wypływie TMP, ale nie jest jedyną pompą napędzaną PMF.

Rysunek 4 pokazuje wynik tego samego eksperymentu co Rysunek 2, ale z akumulacją mierzoną za pomocą cytometrii przepływowej, a nie spektroskopii. Zaobserwowano te same trendy danych, co pokazuje, że każda z tych technik może być wykorzystana do badania zjawiska akumulacji wewnątrzkomórkowej za pośrednictwem wypływu.

Rysunek 5 pokazuje reprezentatywne obrazy z mikroskopii konfokalnej bakterii Gram-dodatnich (S. aureus) i Gram-ujemnych (E. coli) znakowanych odpowiednio za pomocą sond fluorescencyjnych TMP-NBD (1) i cipro-NBD (2 + 3). W obu przypadkach dodano czerwony barwnik membranowy FM4-64FX w celu porównania kolokalizacji. W przypadku TMP-NBD zastosowano również niebieski barwnik kwasu nukleinowego Hoechst-33342. Nakładając te obrazy, zwizualizowano lokalizację antybiotyku w bakteriach. Porównanie paneli 2 i 3 pokazuje, w jaki sposób badano wpływ wypływu, przy czym inhibitor wypływu CCCP zastosowano w 2, co spowodowało akumulację wewnątrzkomórkową. W panelu 3 nie dodano CCCP. W związku z tym wypływ jest aktywny i nie zaobserwowano akumulacji sondy.

Rysunek 6 pokazuje reprezentatywne obrazy mikroskopii konfokalnej bakterii Gram-dodatnich (S. aureus) znakowanych sondą oksazolidynonową znakowaną DMACA Lz-NBD. Dodano czerwony barwnik membranowy FM4-64FX w celu porównania kolokalizacji, a także użyto zielonego barwnika kwasu nukleinowego Hoechst-33342. Nakładając te obrazy, zwizualizowano lokalizację antybiotyku w bakteriach, pokazując wewnętrzną lokalizację odmienną od błony i kwasu nukleinowego.

Tabela 1 pokazuje wartości MIC dla trzech serii antybiotyków fluorescencyjnych, cyprofloksacyny, trimetoprimu (TMP) i linezolidu (Lz), z danymi przedstawionymi dla antybiotyku macierzystego, pochodnych NBD i DMACA każdego z nich. Wybrano gatunki reprezentatywne dla każdego antybiotyku, w tym zarówno Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne. W przypadku serii cyprofloksacyny obie sondy fluorescencyjne straciły aktywność antybiotykową w porównaniu z lekiem macierzystym, ale zachowały pewną aktywność wobec wszystkich gatunków. Podobnie, sondy linezolidu straciły pewną aktywność, ale pozostały umiarkowanym lub słabym antybiotykiem. Sondy TMP straciły prawie całą aktywność przeciwko bakteriom typu dzikiego, ale były aktywne przeciwko E. coli z niedoborem wypływu, co wskazuje, że utrata aktywności przeciwbakteryjnej była spowodowana brakiem akumulacji.

Rysunek 1: Synteza i struktura sond pochodzących z antybiotyków. (A) Ogólny schemat reakcji syntezy fluorescencyjnych sond antybiotykowych z antybiotyków azydkowych i fluoroforów alkinowych. (B) Struktury naszych opublikowanych sond opartych na cyprofloksacynie, trimetoprimie i linezolidze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Pomiar czystości sondy pochodzącej z antybiotyku za pomocą LCMS. Analityczne ślady LCMS z (1) niekompletnych, (2) kompletnych i (3) oczyszczonych metodą HPLC reakcji kliknięcia cyprofloksacyny-N₃ + NBD-alkinu wykazujące zanik materiału wyjściowego po zakończeniu reakcji i różne piki po oczyszczeniu. A = ślad UV-Vis (absorbancja przy 250 nm), B = ślad MS (tryb dodatni i ujemny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Pomiar akumulacji sondy pochodzącej z antybiotyku za pomocą czytnika płytek. Spektroskopowy pomiar fluorescencji akumulacji komórkowej TMP-NBD (50 μM) w typie dzikim (1, ATCC 25922) i ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli inkubowanych (A) z i (B) bez dodatku CCCP (100 μM). Istotność statystyczna (**p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,001) występuje między nieobecnością lub obecnością CCCP a typem dzikim a ΔtolCE. coli. Przedstawione dane są średnimi ± SD dla trzech eksperymentów. Ten rysunek jest zaczerpnięty z naszej poprzedniej publikacji¹⁵ i ilustruje zastosowanie spektroskopii do wyjaśnienia roli wypływu w akumulacji wewnątrzkomórkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Pomiar cytometrii przepływowej akumulacji sondy pochodzącej z antybiotyku. Pomiar akumulacji komórkowej metodą cytometrii przepływowej przy użyciu TMP-NBD w E. coli typu dzikiego (1, ATCC 25922) i ΔtolC (2, ATCC 25922) inkubowanych z dodatkiem CCCP (100 μM) i bez niego. Mediana aktywności fluorescencyjnej jest pokazana na podstawie 10 000 zdarzeń bakteryjnych, Istotność statystyczna (***, p ≤ 0,001; ****, p ≤ 0,0001) jest pokazana między brakiem a obecnością CCCP oraz między typem dzikim a ΔtolCE. coli. Przedstawione dane są średnimi ± SD dla trzech eksperymentów. Ten rysunek jest zaadaptowany z naszej poprzedniej publikacji¹⁵ i ilustruje zastosowanie cytometrii przepływowej w celu wyjaśnienia roli wypływu w akumulacji wewnątrzkomórkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Wizualizacja lokalizacji sondy NBD za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy z mikroskopii konfokalnej 1) żywego S. aureus znakowanego Hoechst-33342 (niebieski, kwas nukleinowy), TMP-NBD (zielony), FM4-64FX (czerwony, błona) i nałożony; 2) żywe bakterie E. coli leczone CCCP (inhibitorem wypływu) znakowane cipro-NBD (kolor zielony), FM4-64FX (kolor czerwony, błona) i nakładane; 3) żywe E. coli oznaczone cipro-NBD (zielony), FM4-64FX (czerwony, membranowy) i nałożone. Ten rysunek jest zaczerpnięty z naszych poprzednich publikacji^15,16 i ilustruje zastosowanie mikroskopii do badania lokalizacji sondy, w tym wpływu wypływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 6: Wizualizacja lokalizacji sondy DMACA za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy z mikroskopii konfokalnej żywych S. aureus znakowanych sondą oksazolidynonową Lz-DMACA (niebieski), Sytox zielony (zielony, kwas nukleinowy) i FM4-64FX (czerwony, błona). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: ) ) ) ) ) pkt. pkt.

			MIC (μg/ml)
Gatunek		naprężać	Cipro	Cipro-NBD	Cipro-DMACA	Tmp	TMP-NBD	TMP-DMACA	Linezolid (Lz)	Lz-NBD	Lz-DMACA
Staphylococcus aureus		ATCC 25923 (wersja angielska	0,125 - 0,5	32 - ≥64	16	1	16	>64
		Zobacz materiał ATCC 43300							1	16	>64
Streptococcus pneumoniae		700677 ATCC							1	4	Rozdział 64
Enterococcus faecium		ATCC 35667 (Zobacz materiał ATCC	1 - 8	Rozdział 32	32 - ≥64
		ATCC 51559 (wersja angielska							cyfra arabska	16	Rozdział 32
Klebsiella pneumoniae		ATCC 13883 (wersja angielska	0,015 - 0,06	8 - 16	8 - 32
Pseudomonas aeruginosa		ATCC 27853 (Kontroler ATCC) 27853	0,25 - 1	32 - ≥64	32 - ≥64
Escherichia coli		ATCC 25922 (wersja angielska	≤0,004	8	cyfra arabska	0,5	>64	>64
		Zmutowany ΔtolC				0,125	0,25	cyfra arabska

Tabela 1. Aktywność antybiotykowa fluorescencyjnych sond antybiotykowych opartych na cyprofloksacynie, trimetoprimie i linezolidze w stosunku do odpowiednich klinicznie istotnych szczepów bakterii, mierzona za pomocą testów MIC mikrorozcieńczenia bulionu. W większości przypadków sondy straciły część aktywności w porównaniu z lekiem macierzystym, ale zachowały pewną mierzalną siłę działania antybiotyku (wystarczającą, aby była przydatna w dalszych badaniach).

Discussion

Stworzenie skutecznej fluorescencyjnej sondy antybiotykowej musi rozpocząć się od starannego planowania i rozważenia SAR leku macierzystego. Jeśli SAR nie jest znany lub w pełni zbadany, może być konieczne przetestowanie kilku opcji w celu znalezienia miejsca, które może być selektywnie modyfikowane bez znoszenia aktywności biologicznej. Po zidentyfikowaniu miejsca lub miejsc, instalacja ugrupowania łącznikowego jest często niezbędna w celu zapewnienia sterycznych odstępów między biologicznym miejscem działania a nieaktywnym fluoroforem. Należy zwrócić uwagę, aby reakcja zastosowana do przyłączenia łącznika do antybiotyku pozostawiła biologicznie stabilną grupę funkcyjną, unikając na przykład estrów, które są podatne na rozszczepienie przez esterazy in vivo. W zależności od profilu farmakodynamicznego i farmakokinetycznego antybiotyku można zastosować prosty łącznik alkilowy lub rozważyć opcję mniej lipofilową, taką jak łącznik z glikolem polietylenowym (PEG). Po dołączeniu łącznika należy ocenić aktywność przeciwbakteryjną, aby upewnić się, że wartości MIC przeciwko odpowiednim bakteriom są podobne do związku macierzystego.

W tej pracy zalecamy stosowanie dipolarnej cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huigsena [3+2] (kliknij chemia, patrz rysunek 1) do podwiązania fluoroforu do antybiotyku, z wielu powodów. Reakcje Click są wysoce selektywne, co oznacza, że ochrona grup reaktywnych na antybiotyku nie jest konieczna, a ponadto reakcja pozostawia stabilną, biokompatybilną cząstkę triazolową. Składnik azydkowy jest wprowadzany do części antybiotykowej w naszych procedurach, ponieważ jest to na ogół łatwiejsze do osiągnięcia przy różnych typach strukturalnych niż wprowadzenie alkinu. Opisano tutaj syntezy dwóch fluoroforów derywatyzowanych alkinami, chociaż w razie potrzeby można zbadać inne. NBD i DMACA zostały wybrane ze względu na ich niewielkie rozmiary, minimalizujące możliwość ingerencji w penetrację komórek i interakcję docelową. Samą reakcję kliknięcia przeprowadza się za pomocą katalizy miedziowej, gdzie jako odczynnik wyjściowy można zastosować^Cu2+ (CuSO₄ ze środkiem redukującym kwas askorbinowy) lub Cu⁺ (CuI). Po oczyszczeniu (rysunek 2) wartości MIC należy następnie przetestować tak, jak w przypadku azydku. Nawet przy dokładnym rozważeniu wyboru fluoroforu i miejsca przyłączenia, możliwe jest, że zostanie zaobserwowana słaba aktywność antybiotykowa. Nie oznacza to jednak, że nieaktywna sonda jest bezużyteczna. Jak wykazano w przypadku sond TMP, związki o słabej aktywności przeciwbakteryjnej mogą nadal wiązać się z tym samym celem, co lek macierzysty. Może to umożliwić badania nad sposobem działania i badanie zjawisk prowadzących do oporu, takich jak wypływ.

Jak opisano w sekcji dotyczącej protokołów, możliwa jest analiza znakowania bakterii przez antybiotyki fluorescencyjne przy użyciu prostego testu spektrofotometrycznego (ryc. 3) lub cytometrii przepływowej (ryc. 4). Obie metody są w stanie określić ilościowo akumulację komórkową, a poprzez lizę komórek i badanie lokalizacji fluorescencji w lizacie możliwa jest ocena akumulacji wewnątrzkomórkowej. W tym protokole opisano zastosowanie lizozymu do lizy komórek, ponieważ jest to szybka, uniwersalna technika. Z powodzeniem stosowano również inne warunki lizy, takie jak nocne leczenie glicyną-HCl⁷. Za pomocą tej techniki możliwe jest zbadanie wpływu wypływu na akumulację komórkową antybiotyku, która jest głównym mechanizmem oporności. Jeśli wypływ jest rzeczywiście obecny w bakteriach, zaobserwuje się brak akumulacji wewnątrzkomórkowej, chociaż można to uratować za pomocą inhibitora wypływu, takiego jak CCCP.

Mikroskopia może być również przeprowadzona w celu wizualnego sprawdzenia lokalizacji sondy u różnych bakterii, uzyskując informacje na temat sposobu działania, a potencjalnie także oporności (patrz rysunek 5 dla reprezentatywnych przykładów). Aby zobaczyć lokalizację w obrębie bakterii, wymagany jest mikroskop konfokalny o wysokiej rozdzielczości, wyposażony w takie funkcje, jak SIM (mikroskopia oświetlenia strukturalnego), SR-SIM (superrozdzielczość-SIM), Airyscan lub STED (wymuszone zubożenie emisji). Ponadto należy stosować szkiełka nakrywkowe o wysokiej wydajności, a analizę po obrazowaniu przeprowadzać na odpowiednim oprogramowaniu (np. FIJI, Zen lub Imaris). Lokalizacja sond jest porównywana z barwnikami, które barwią określone architektury, takie jak Hoechst-33342 (niebieski, kwas nukleinowy), Syto-9 (zielony, kwas nukleinowy) i FM4-64FX (czerwony, membrana). Wybór barwników powinien być dopasowany do antybiotyku fluorescencyjnego, tak aby każdy użyty kolor miał minimalne nakładanie się widmowe. W celu uzyskania jak najlepszych obrazów może być wymagana optymalizacja. Na przykład, jeśli bakterie są zbyt stłoczone na szkiełku, weź tylko część zawieszonego osadu, a następnie rozcieńcz go większą ilością środka montażowego. W przeciwieństwie do tego, jeśli bakterie są zbyt rzadkie na szkiełku, po prostu zacznij od większej liczby bakterii. W tym protokole do obrazowania żywych komórek zaleca się stosowanie termoodwracalnego żelu, który jest kompatybilny z żywymi komórkami (np. Cygel), ponieważ unieruchamia on bakterie (w tym bakterie ruchliwe), ale z powodzeniem zastosowano również inne podłoża montażowe lub agarozę.

Ogólnie rzecz biorąc, pomimo wyzwań, jakie mogą pojawić się w przygotowaniu biologicznie aktywnych fluorescencyjnych pochodnych antybiotyków, prostota ich stosowania i uniwersalność sprawiają, że sondy te są atrakcyjnymi narzędziami do badań nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Przyszłe prace nad antybiotykami fluorescencyjnymi mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów oporności na antybiotyki, lepiej zrozumieć, jak działają obecne antybiotyki, i pomóc w opracowaniu lepszych leków.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(dimetyloamino)fenol	Alfa-Aesar	B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran	Sigma-Aldrich	163260-5G
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0.5 z membraną Ultracel-10	Merck	UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)	Wody	186008205
kolumna Atlantis T3 (100 A, 5 uM, 2.1 i razy; 50 mm)	Wody	186003734
Spektrometr Bruker Avance 600 MHz	Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Kartridż	Buchi	BUC145152103
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Celite 545	Sigma-Aldrich	22140-5KG-F
Cygel	ABCAM	Ab109204
Elyra Mikroskop konfokalny PS,1 SIM/STORM	Zeiss
FM4-64FX, naprawialny analog FM™ 4-64 barwienie membranowe	Life Technologies Australia Pt	F34653
Cytometr przepływowy Galliosa	Beckman Coulter
Gamma 2-16 Liofiliza LSCplus	CHRIST
Gilson HPLC 2020	Gilson
Zbilansowany roztwór soli Hanksa, modyfikowany, z wodorowęglanem sodu, bez czerwieni fenolowej, chlorku wapnia i siarczanu magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych	Sigma-Aldrich	H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32	Hettich
Szkiełka nakrywkowe o wysokiej wydajności #1,5 (18 x 18 mm)	Schott/Zeiss	474030-9000-000
Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - Fluo	Life Technologies Polska	Pt H21492
LB	AMRESCO	J106
Mikroskop Leica STED 3X Super Resolution z białym światłem Wzbudzenie laserowe	Leica
z liofilizowanego proszku z białka jaja kurzego	Sigma-Aldrich	L6876
Mueller Hinton II Dostosowany kation bulionowy	Becton Dickinson	212322
Propargylamine	Sigma-Aldrich	P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC	Buchi
Shimadzu LCMS-2020	Shimadzu
Sigma 1-15 Mikrowirówka	Sigma-Aldrich
Żel krzemionkowy 60 (0,040-0,063 mm) do chromatografii kolumnowej (230-400 mesh ASTM)	Merck
SYTO 9 Zielony fluorescencyjny kwas nukleinowy Stain	Life Technologies Australia Pt	S34854
TECAN Infinite M1000 PRO	TECAN